CN101658668B - 利用抗菌肽制备细菌菌影的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用抗菌肽制备细菌菌影的方法及应用，将细菌菌株培养至对数生长期(OD₆₀₀为0.4～0.6)时，加入抗菌肽，4℃作用过夜或室温作用2～4h；作用结束后，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，即制备成细菌菌影。用抗菌肽替代传统方法来制备细菌菌影，提供了一种新的细菌菌影制备方法，取得了良好的效果，并且操作简单，可广泛用于细菌的菌影制备，制备的细菌菌影具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗使用。

Description

利用抗菌肽制备细菌菌影的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种利用抗菌肽制备细菌菌影的方法及应用，属于基因工程领域。 

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptides)，广义上是指存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害，清除体内突变细胞的一类小分子多肽，被认为是从细菌到昆虫乃至高等哺乳动物体内均普遍存在的一类防御性多肽，是生物先天免疫防卫系统的一个重要组成部分，称之为“第二防御体系”和“第二免疫体系”。在诱导条件下，动物免疫防卫系统产生一类对抗外源性病原体的防御性阳离子肽类活性物质，是生物先天免疫防卫系统的一个重要组成部分。 

抗菌肽分子量相对较小，一般小于10kDa，由基因编码、核糖体合成，其理化性质稳定、水溶性好、热稳定、广谱抗菌、抗病毒、抗癌能力，并具有活性浓度低，无致畸变作用，无蓄积毒性、不易引起病原产生耐药性等优点，已发现的抗菌肽具有的多种作用机制中，一般认为膜攻击理论是抗菌肽的最主要作用途径，同一种抗菌肽也可能通过多种途径发挥作用，对于抗菌肽作用机制的研究还在深入进行。目前抗菌肽的研究主要集中在替代传统抗生素，开发成一种具有巨大发展潜力的新型抗菌药。 

菌影(bacterial ghost，BG)是一种新型的疫苗及佐剂形式，其实质是一种不含胞浆及核酸等内容物的空细胞体，它最大的特点是保留了和活菌一样的完整内外膜结构，能够有效刺激机体产生特异性和非特异性免疫应答，抵抗病原微生物的侵袭。相对于传统灭活疫苗来说，它的表面抗原结构得到最大程度的保留，免疫原性高，并可在其内部及外膜上负载外源抗原，成为优良的抗原递送载体，同时为联合疫苗的研究提供研究平台，在致病性微生物越来越难以控制的今天，菌影系统开始受到国内外研究者的关注。 

目前传统的细菌菌影的制备方法主要是利用噬菌体PhiX174的E基因作为裂解基因，E基因可表达一种由91个氨基酸编码的膜蛋白，它能融合革兰氏阴性菌内膜和外膜，形成一种大小介于40～200nm的E特异性跨膜裂解通道。在渗透压的作用下，细菌只剩下内外膜结构，其内部空间失去了核酸、核糖体和其他内容物，形成空影细胞，也即菌影。目前，国内外在菌影制备方面已有很多成功的先例。目前，除大肠杆 菌外，很多革兰氏阴性菌均能在裂解基因E作用下产生菌影，如：鼠伤寒沙门氏菌，肺炎克雷伯氏菌、霍乱弧菌、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、幽门螺杆菌等。 

但是传统的菌影制备方法存在以下不足：要制备不同细菌的菌影，就需要构建不同的裂解载体，如果没有相应的载体则无法制备该细菌的菌影；构建裂解载体费时费力，操作繁复；只局限于制备革兰氏阴性菌的菌影，限制了使用范围。 

目前国内外还没有将抗菌肽技术用于制备菌影的报道。 

发明内容：

本发明公开一种利用抗菌肽制备细菌菌影的方法，提供了一种新的细菌菌影制备方法。 

本发明还提供了利用抗菌肽制备细菌菌影的应用，可以作为一种新的候选疫苗使用。 

本发明利用抗菌肽制备细菌菌影的方法，包括以下步骤： 

利用多肽合成或基因工程表达的方法，获得抗菌肽；将细菌菌株培养至对数生长期(OD₆₀₀为0.4～0.6)时，加入抗菌肽，4℃作用过夜或室温作用2～4h；离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，即制备成细菌菌影，冷冻干燥后保存于-20℃或-80℃备用。 

本发明的利用抗菌肽制备细菌菌影的应用，包括以下步骤：制备细菌菌影，免疫实验动物，可刺激机体产生特异的体液免疫和细胞免疫，与灭活苗相比有相同的保护率，具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗。 

本发明的积极效果在于： 

按照传统的细菌菌影的制备方法，要制备不同细菌的菌影，就需要构建不同的裂解载体，如果没有相应的载体则无法制备该细菌的菌影；构建裂解载体费时费力，只局限于制备革兰氏阴性菌的菌影。本发明用抗菌肽替代传统方法来制备细菌菌影，提供了一种新的细菌菌影制备方法，取得了良好的效果，并且操作简单，可广泛用于制备不同细菌的菌影，制备的细菌菌影具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗使用。 

附图说明

图1.正常猪胸膜肺炎放线杆菌的TEM照片(13000×)； 

图2.利用抗菌肽Tachyplesin I制备的猪胸膜肺炎放线杆菌菌影的TEM照片(13000×)； 

图3.利用抗菌肽Catesbeianin-1制备的猪胸膜肺炎放线杆菌菌影的TEM照片(13000×)； 

图4.利用抗菌肽MAP制备的猪胸膜肺炎放线杆菌菌影的TEM照片(13000×)； 

图5.正常枯草杆菌的TEM照片(13000×)； 

图6.利用抗菌肽Tachyplesin I制备的枯草杆菌菌影的TEM照片(13000×)； 

图7.正常大肠杆菌O₁₃₈的TEM照片(13000×)； 

图8.利用抗菌肽Tachyplesin I制备的大肠杆菌O₁₃₈菌影的TEM照片(13000×)； 

图9.利用抗菌肽Catesbeianin-1制备的大肠杆菌O₁₃₈菌影的TEM照片(13000×)； 

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。 

实施例1 

利用抗菌肽Tachyplesin I分别制备猪胸膜肺炎放线杆菌、枯草杆菌和大肠杆菌O₁₃₈的菌影 

本实施例选用的抗菌肽为Tachyplesin I；选用的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(革兰氏阴性菌)、枯草杆菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌O₁₃₈(革兰氏阴性菌)，以上细菌均为本研究室保存。 

Tachyplesin I的DNA序列为： 

aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t                     51 

Tachyplesin I的氨基酸序列为： 

Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys Arg 

1.抗菌肽的合成与表达 

用自动多肽合成仪APEX396合成抗菌肽Tachyplesin I的全序列，N-端为游离，C-端为α-酰胺化修饰，通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化；利用酵母表达系统对抗菌肽Tachyplesin I进行真核表达。 

2.细菌菌影的制备 

将细菌菌株过夜增菌后，按0.5％转接种于培养基中，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.4～0.6时，加入合成或表达的抗菌肽Tachyplesin I至终浓度为3.5ug/mL，4℃作用过夜 或室温作用2～4h；作用结束后，4℃，5000rpm离心10min，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，制备成细菌菌影；对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。 

3.菌影的保存 

将离心收集菌影细胞弃尽上清，最后溶于适当体积生理盐水，计算菌影浓度，分装于1.5mL疫苗瓶，每瓶800μL左右(含菌影5.0×10¹⁰个/mL)，高度不超过0.5cm，冷冻干燥后保存于-20℃或-80℃。 

实施例2 

利用抗菌肽Catesbeianin-1分别制备猪胸膜肺炎放线杆菌和大肠杆菌O₁₃₈的菌影 

本实施例选用的抗菌肽为Catesbeianin-1；选用的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(革兰氏阴性菌)和大肠杆菌O₁₃₈(革兰氏阴性菌)，以上细菌均为本研究室保存。 

Catesbeianin-1的DNA序列为： 

atgatgaggg tgatgaggag gaagactaaa gttatttggg aaaaaaagga ctttattgga         60 

ttatacagta ttgattga                                                       78 

Catesbeianin-1的氨基酸序列为： 

Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val Ile Trp Glu Lys Lys 

Asp Phe Ile Gly Leu Tyr Ser Ile Asp 

1.抗菌肽的合成与表达 

用自动多肽合成仪APEX396合成抗菌肽Catesbeianin-1的全序列，N-端为游离，C-端为α-酰胺化修饰，通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化；利用酵母表达系统对抗菌肽Catesbeianin-1进行真核表达。 

2.细菌菌影的制备 

将细菌菌株过夜增菌后，按0.5％转接种于培养基中，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.4～0.6时，加入合成或表达的抗菌肽Catesbeianin-1至终浓度为72.6ug/mL，4℃作用过夜或室温作用2～4h；作用结束后，4℃，5000rpm离心10min，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，制备成细菌菌影；对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。 

3.菌影的保存 

将离心收集菌影细胞弃尽上清，最后溶于适当体积生理盐水，计算菌影浓度， 分装于1.5mL疫苗瓶，每瓶800μL左右(含菌影5.0×10¹⁰个/mL)，高度不超过0.5cm，冷冻干燥后保存于-20℃或-80℃。 

实施例3 

利用抗菌肽MAP制备猪胸膜肺炎放线杆菌的菌影 

本实施例选用的抗菌肽为MAP；选用的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(本研究室保存)。 

MAP的氨基酸序列为： 

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Leu Ala     18 

1.抗菌肽的合成 

用自动多肽合成仪APEX396合成抗菌肽MAP的全序列，N-端为游离，C-端为α-酰胺化修饰，通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化。 

2.细菌菌影的制备 

将细菌菌株过夜增菌后，按0.5％转接种于培养基中，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.4～0.6时，加入合成的抗菌肽MAP至终浓度为41.7ug/mL，4℃作用过夜或室温作用2～4h；作用结束后，4℃，5000rpm离心10min，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，制备成细菌菌影；对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。 

3.菌影的保存 

将离心收集菌影细胞弃尽上清，最后溶于适当体积生理盐水，计算菌影浓度，分装于1.5mL疫苗瓶，每瓶800μL左右(含菌影5.0×10¹⁰个/mL)，高度不超过0.5cm，冷冻干燥后保存于-20℃或-80℃。 

实验例1 

细菌菌影的裂解效率及透射电镜(TEM)观察 

按实施例1、2和3制备细菌菌影，测定裂解效率，经测定裂解效率可达99.9999％以上。 

按实施例1、2和3制备细菌菌影，用2.5％戊二醛固定4h，1％锇酸固定1h，30％乙醇脱水10min，50％乙醇脱水15min，70％醋酸铀作用12h，80％乙醇脱水15min，95％乙醇脱水20min，两次无水乙醇脱水40min，然后用环氧丙烷脱水30min，加入1∶1的环氧丙烷与环氧树脂作用2h，加入纯环氧树脂渗透3h，然后在50℃下环氧树脂包埋12h，最后用环氧树脂继续包埋48h。包埋后超薄切片机制成切片，放 入铜网中。切片进行染色，以醋酸铀作用30min，水洗，然后加入柠檬酸铅作用20min，水洗。于透射电镜(TEM)下观察。 

电镜观察结果见图1-图9，由图可以看出，利用抗菌肽成功制备了猪胸膜肺炎放线杆菌(革兰氏阴性菌)、枯草杆菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌O₁₃₈(革兰氏阴性菌)的菌影，证明此方法不仅可以用于制备革兰氏阴性菌的菌影，也可以用于制备革兰氏阳性菌的菌影。 

实验例2 

细菌菌影的免疫效果评价 

1.细菌菌影的制备 

按实施例制备大肠杆菌O₁₃₈和猪胸膜肺炎放线杆菌的菌影，重悬于适当体积生理盐水，使菌影浓度为5.0×10¹⁰个/mL，充分混匀。 

2.甲醛灭活铝佐剂苗的制备 

将大肠杆菌O₁₃₈和猪胸膜肺炎放线杆菌接种于培养基中，经37℃培养18-24h后制备成种子菌液，接种于液体培养基，37℃培养1g-24h后取出少量进行活菌计数，其余菌液按0.1％加入甲醛，37℃灭活24h，4℃保存备用。使用时5000rpm离心，并用生理盐水洗两次后，按1∶5比例加入氢氧化铝胶，充分振荡即为甲醛灭活铝佐剂苗。 

3.无菌检验 

将所制备大肠杆菌O₁₃₈和猪胸膜肺炎放线杆菌的菌影和甲醛灭活铝佐剂苗随机抽样，接种于LB平板，37℃培养48h，检查有无细菌生长。 

4.安全性检验 

取10只18-22g小鼠，每只腹腔注射细菌菌影，注射剂量约为免疫剂量的10倍，连续观察7-10d；甲醛灭活铝佐剂苗同上。腹腔注射细菌菌影及甲醛灭活铝佐剂苗后小鼠无死亡及发病症状，肝脏组织触片镜检无大肠杆菌O₁₃₈和猪胸膜肺炎放线杆菌，表明细菌菌影及甲醛灭活铝佐剂苗安全合格。 

5.免疫实验 

小鼠随机分组，每组20只，接种不同抗原进行免疫，空白对照组免相同剂量生理盐水，相同条件下分笼饲养，免疫程序见下表。 

免疫实验分组 

6.免疫水平的检测 

间接ELISA法检测抗体效价，脾淋巴细胞转化试验检测细胞免疫水平。 

血清抗体水平检测结果：免疫小鼠后间接ELISA定期检测血清IgG抗体效价，三次免疫后抗体效价达到3000×以上。 

脾淋巴细胞转化试验结果：免疫组较对照组有明显的细胞增值。 

7.攻毒实验 

三免后一周，小鼠腹腔注射3倍最小致死量的活菌进行大剂量感染实验，对小鼠存活情况进行计数，检测疫苗的保护效果。 

三次免疫后免疫保护结果见下表，细菌菌影的保护率与甲醛灭活苗的保护率都达到100％，空白对照组全部死亡。 

疫苗免疫保护测定结果 

结论：由以上结果可以看出，利用抗菌肽制备的细菌菌影可刺激机体产生特异的体液免疫和细胞免疫，与灭活苗相比有相同的保护率，具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗使用。 

序列表 

<110>吉林大学 

<120>利用抗菌肽制备细菌菌影的方法及应用 

<130>22 

<160>5 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>51 

<212>DNA     

<213>人工合成 

<400>1 

aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t              51 

<210>2 

<211>17 

<212>PRT 

<213>人工合成 

<400>2 

Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys 

1               5                   10                  15 

Arg 

<210>3 

<211>78 

<212>DNA 

<213>人工合成 

<400>3 

atgatgaggg tgatgaggag gaagactaaa gttatttggg aaaaaaagga ctttattgga     60 

ttatacagta ttgattga                                                   78 

<210>4 

<211>25 

<212>PRT 

<213>人工合成 

<400>4 

Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val Ile Trp Glu Lys Lys 

1               5                   10                  15 

Asp Phe Ile Gly Leu Tyr Ser Ile Asp 

            20                  25 

<210>5 

<211>18 

<212>PRT 

<213>人工合成 

<400>5 

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 

1               5                   10                  15 

Leu Ala 

Claims (2)

1.一种利用抗菌肽制备细菌菌影的方法，包括以下步骤：将细菌菌株培养至对数生长期OD₆₀₀为0.4～0.6时，加入抗菌肽，4℃作用过夜或室温作用2～4h；作用结束后，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，即制备成细菌菌影。

2.权利要求1所述的利用抗菌肽制备细菌菌影的方法，其特征在于：

涉及的抗菌肽为：Tachyplesin I或Catesbeianin-1或MAP；

涉及的细菌为：猪胸膜肺炎放线杆菌或枯草杆菌或大肠杆菌O₁₃₈。

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