CN101657546A - 低密度脂蛋白（ldl）胆固醇测定方法以及ldl胆固醇测定用试验片 - Google Patents

低密度脂蛋白（ldl）胆固醇测定方法以及ldl胆固醇测定用试验片 Download PDF

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Abstract

提供了一种可应用于试验片的LDL胆固醇测定方法。一种测定样品中的LDL胆固醇的LDL胆固醇测定方法，其特征在于，具有：(A)准备总胆固醇测定部以及测定低密度脂蛋白(LDL)胆固醇之外的胆固醇、即非LDL胆固醇的非LDL胆固醇测定部的工序；(B)在上述总胆固醇测定部中测定上述样品中的总胆固醇的工序；(C)在上述非LDL胆固醇测定部中测定上述样品中的非LDL胆固醇的工序；以及(D)从上述(B)工序的上述总胆固醇测定值中减去上述(C)工序的上述非LDL胆固醇测定值，求得上述样品中的LDL胆固醇量的工序。

Description

低密度脂蛋白(LDL)胆固醇测定方法以及LDL胆固醇测定用试验片
技术领域
本发明涉及低密度脂蛋白(LDL)胆固醇测定方法以及LDL胆固醇测定用试验片。
背景技术
LDL是运送胆固醇的脂蛋白中的一种。医学上已明确：作为LDL和胆固醇的复合体的LDL胆固醇是导致动脉硬化的物质之一。2008年4月起，新追加了LDL胆固醇的量作为基于劳动安全卫生法的健康诊断中的检查项目。
LDL胆固醇的测定方法有例如如下的方法：用超离心分离将LDL与其它脂蛋白(例如，高密度脂蛋白(HDL)、超低密度脂蛋白(VLDL)等)分离后，使用酶仅测定LDL胆固醇的方法。此外，还有通过电泳分离LDL后，对脂质进行染色，测定其显色强度的方法。这些方法是常规的测定方法，但存在操作复杂，难以处理大量待测物的问题。因此这些方法在临床检查等中无法利用。
因此，正在开发各种使用酶试剂的液态的LDL胆固醇测定方法，其中一部分正在被实施。上述使用酶试剂的测定方法可以应用于自动分析装置，因此在需要处理大量待测物的临床检查中有用。上述使用酶试剂的测定方法有：直接测定LDL胆固醇自身的直接法以及除去法等，所述除去法通过在第一反应中使LDL胆固醇之外的胆固醇(非LDL胆固醇)反应并将其除去，在第二反应中使剩下的LDL胆固醇反应来测定LDL胆固醇量。
上述直接法中，例如有通过环糊精及表面活性剂提高酶试剂对LDL胆固醇的特异性，从而直接测定LDL胆固醇的方法(专利文献1)。另外，上述除去法中有使用聚阴离子与2价金属离子(专利文献2)、聚阴离子(专利文献3)、磺化杯芳烃(专利文献4)或胺(专利文献5)，抑制LDL胆固醇与酶试剂的反应，或提高非LDL胆固醇与酶试剂的反应性的方法。而且各制造商均有销售使用上述直接法及上述除去法的液态试剂。
专利文献1：日本专利第3091230号公报
专利文献2：日本专利第3193634号公报
专利文献3：日本专利第3767232号公报
专利文献4：日本专利第3822340号公报
专利文献5：日本专利第3058602号公报
发明内容
然而，现有的测定方法需要大型的自动分析装置。大型的自动分析装置需要放置空间并花费成本。因此，这种测定装置能引入到大规模的医院中，但难以引入一般的医院。而且，现有的测定方法不适用于将试剂保持在干燥状态下的试验片(干燥状态)，用途只限于液态的测定。利用液态的测定需要大量洗涤水，洗涤会排出废液。
因此，本发明的目的在于提供一种可通过小型且结构简单的测定装置测定LDL胆固醇、并且能应用于试验片的LDL胆固醇测定方法以及使用其的LDL胆固醇测定用试验片。
为了实现上述目的，本发明的测定方法是测定样品中的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的LDL胆固醇测定方法，其特征在于包括下述(A)工序至(D)工序：
(A)准备总胆固醇测定部、以及测定LDL胆固醇以外的胆固醇、即非LDL胆固醇的非LDL胆固醇测定部的工序；
(B)在上述总胆固醇测定部中测定上述样品中的总胆固醇的工序；
(C)在上述非LDL胆固醇测定部中测定上述样品中的非LDL胆固醇的工序；
(D)从上述(B)工序的上述总胆固醇测定值减去上述(C)工序的上述非LDL胆固醇测定值获得上述样品中LDL胆固醇的量的工序。
本发明的试验片是用于本发明的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇测定方法的LDL胆固醇测定用试验片，其特征在于：包括总胆固醇测定部、以及测定LDL胆固醇以外的胆固醇量、即非LDL胆固醇量的非LDL胆固醇测定部，从上述总胆固醇测定部的总胆固醇测定值中减去上述非LDL胆固醇测定部的非LDL胆固醇测定值，求得LDL胆固醇量。
本发明人等为了实现上述目的进行了一系列的研究。在此过程中，还对使用现有的除去法的测定方法进行了讨论。如上所述，使用上述除去法的LDL胆固醇测定液态试剂(湿化学法)，在第一反应中使非LDL胆固醇反应并将其除去，在第二反应中使剩下的LDL胆固醇反应。即，在该反应体系中，必然需要获得除去非LDL胆固醇的待测物或者含有除去非LDL胆固醇的待测物的反应液的前处理工序。因此，已知将使用上述除去法的LDL胆固醇测定液态试剂直接试验片化在测定原理上是不可能实现的。因此，进一步研究的结果发现，假如分别独立地准备上述总胆固醇测定部及上述非LDL胆固醇测定部，在上述总胆固醇测定部中测定总胆固醇，在上述非LDL胆固醇测定部中测定非LDL胆固醇，从上述总胆固醇测定值中减去非LDL胆固醇测定值，求得LDL胆固醇值，采用这种方式则可以实现试验片化，由此完成本发明。依据本发明可简化测定装置的结构，且能使测定装置小型化，并实现装置低成本化以及节约空间。因此，依据本发明，例如不仅可将LDL胆固醇测定装置引入大规模医院中，也可引入一般医院中。而且，本发明的测定方法基于应用试验片的简单原理。因而，使用本发明的试验片，不需要洗涤水且不会产生废液，因此可以对环境方面以及测定的简化作出贡献。
附图说明
图1的(A)是本发明的试验片的一个例子的透视图。图1的(B)是向图1的(A)的A-A方向上看的截面图。
图2是本发明的试验片的其他例子的截面图。
图3是本发明的试验片的另一个例子的截面图。
图4是本发明的试验片的另一个例子的截面图。
图5的(A)是本发明的试验片的另一个例子的截面图。图5的(B)是图5的(A)示出的试验片的平面图。
图6是示出在本发明的测定方法的一个例子中的K/S值的时间过程的图。
图7是示出测定方法的比较例与本发明的测定方法的一个例子的K/S值的时间过程的图。
图8是示出本发明的测定方法的其他例子中的测定值、与测定方法的其他比较例中的测定值的相关关系的图。
图9是示出本发明的测定方法的另一个例子中的测定值、与测定方法的另一个比较例中的测定值的相关关系的图。
具体实施方式
如上所述本发明的测定方法优选适用于试验片，但本发明并不限于此，也适用于液态。
在本发明的测定方法中，上述(B)工序和上述(C)工序的顺序没有特别限制，可以先进行任意一个工序，也可以同时进行。
本发明的测定方法优选以下方案：
在上述(A)工序中，上述总胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂；
上述非LDL胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂、非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂；
在上述(B)工序中，通过上述胆固醇测定用酶试剂测定上述总胆固醇；
在上述(C)工序中，在非LDL胆固醇增溶用表面活性剂及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂作用下，通过上述胆固醇测定用酶试剂选择性测定上述非LDL胆固醇。现有技术很难分别测定LDL胆固醇和VLDL胆固醇，但根据本方案可以进行上述分别测定，并提高LDL胆固醇测定的精度和可靠性。
在本发明的测定方法中，上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂含有选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚中的至少一种表面活性剂；上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂含有选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐以及烷基苯磺酸盐构成的组中的至少一种表面活性剂。
在本发明的测定方法中，上述酶试剂可以为含有胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的形态。
在本发明的测定方法中，上述酶试剂可以为含有胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶的形态。
本发明的测定方法优选以下方案：在上述(A)工序中，上述非LDL胆固醇测定部还含有LDL胆固醇凝聚剂；在上述(C)工序中，在上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂的作用下，通过上述胆固醇测定用酶试剂选择性测定上述非LDL胆固醇。现有技术很难分别测定LDL胆固醇及VLDL胆固醇，但根据本方案可以进行上述分别测定，且可进一步提高LDL胆固醇测定的精度和可靠性。上述LDL胆固醇凝聚剂优选为聚乙烯硫酸盐。
在本发明的测定方法中，上述非LDL胆固醇可以为高密度脂蛋白(HDL)胆固醇及超低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇。
根据与上述相同的理由，本发明的试验片优选以下方案：
上述总胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂；
上述非LDL胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂、非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂。
在本发明的试验片中，上述酶试剂可以为含有胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的形态。
在本发明的试验片中，上述酶试剂可以为含有胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶的形态。
在本发明的试验片中，上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂含有选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚中的至少一种表面活性剂；上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂含有选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐以及烷基苯磺酸盐构成的组中的至少一种表面活性剂。
根据与上述相同的理由，本发明的试验片优选以下方案：上述非LDL胆固醇测定部还含有LDL胆固醇凝聚剂。上述LDL胆固醇凝聚剂优选为聚乙烯硫酸盐。
在本发明的试验片中，上述非LDL胆固醇可以为高密度脂蛋白(HDL)胆固醇以及超低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇。
本发明的试验片可以为以下形态：
具有支撑体、第一试剂层及第二试剂层；
上述第一试剂层及上述第二试剂层设置在上述支撑体上；
上述第一试剂层是上述总胆固醇测定部；
上述第二试剂层是上述非LDL胆固醇测定部。
本发明的试验片可以为以下形态：
具有第一支撑体和第二支撑体、以及第一试剂层和第二试剂层；
上述第一试剂层设置在上述第一支撑体上；
上述第二试剂层设置在上述第二支撑体上；
上述第一试剂层是上述总胆固醇测定部；
上述第二试剂层是上述非LDL胆固醇测定部。
接下来，举出实施例详细说明本发明。此外，在本发明中，样品使用时的占总成分的配合比例指的是样品(待测物)在用于上述总胆固醇测定部(例如上述第一试剂层)或上述非LDL胆固醇测定部(例如上述第二试剂层)时占总成分的比例，总成分指的是在使用样品时存在的上述样品、上述胆固醇测定用酶试剂、上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂等全部成分。通常，待测物的量可以根据其种类进行预测或确定。
本发明的试验片可以为以下结构：例如在一个支撑体上设置上述总胆固醇测定部及上述非LDL胆固醇测定部。而且，本发明的试验片可以为以下结构：在第一支撑体上设置上述总胆固醇测定部、以及在第二支撑体上设置上述非LDL胆固醇测定部。
在本发明的试验片中，上述总胆固醇测定部可以采取以下结构：例如，在支撑体上形成第一试剂层，且上述第一试剂层含有胆固醇测定用酶试剂。此外，上述第一试剂层优选还含有胆固醇增溶用表面活性剂。上述第一试剂层可以为以下结构：具有反应层和检测层，上述反应层含有上述胆固醇增溶用表面活性剂，上述检测层含有上述胆固醇测定用酶试剂。另外，优选上述反应层含有上述胆固醇测定用酶试剂中的一部分和上述胆固醇增溶用表面活性剂，上述检测层含有上述胆固醇测定用酶试剂的剩余部分。
在本发明的试验片中，上述非LDL胆固醇测定部可以采取以下结构：例如，在支撑体上形成第二试剂层，上述第二试剂层含有胆固醇测定用酶试剂、上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂。上述第二试剂层可以为以下结构：具有反应层和检测层，上述反应层含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂，上述检测层含有胆固醇测定用酶试剂。此外，在上述反应层内部，在其上部(上层)含有上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂，在其下部(下层)含有上述非胆固醇增溶用表面活性剂。而且，优选为以下结构：上述反应层含有上述胆固醇测定用酶试剂的一部分、上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂，上述检测层含有上述胆固醇测定用酶试剂的剩余部分。
此外，上述第二试剂层优选还含有上述LDL胆固醇凝聚剂。还可以为以下结构：上述第二试剂层含有反应层及检测层，上述反应层含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述检测层含有胆固醇测定用酶试剂。此外，更优选具有以下结构：在上述反应层内部，在其上部(上层)含有上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂，在其下部(下层)含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂。另外，更优选具有以下结构：上述反应层含有上述胆固醇测定用酶试剂的一部分、上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述检测层含有上述胆固醇测定用酶试剂的剩余部分。
在本发明中，只要上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂对非LDL胆固醇(HDL胆固醇和VLDL胆固醇等)的增溶性较对LDL胆固醇的增溶性更高即可，没有特别的限制。上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂具有对包含于非LDL脂蛋白中的胆固醇或胆固醇酯增溶的作用，其结果是促进胆固醇或其酯与上述酶试剂的反应。如上所述，上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂优选聚氧乙烯亚烷基苯基醚以及聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚，它们可单独使用，也可并用。其中更优选聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚。作为聚氧乙烯亚烷基苯基醚的市售品，例如为商品名“エマルゲンA-60”(花王株式会社制)或商品名“ノニポ一ル40”(三洋化成工业株式会社制)等，作为聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的市售品，例如为商品名“エマルゲンB 66”(花王株式会社制)或商品名“ブラウノンTBP-15-95”(青木油脂工业株式会社制)等。
在本发明中，用于上述总胆固醇测定部的胆固醇增溶用表面活性剂只要可增溶全部脂蛋白即可，没有特别的限制，例如可使用脱氧胆酸钠、聚氧乙烯(n)辛基苯基醚(例如商品名“Triton X-100”(和光纯药公司制))。
在本发明中，上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂只要可抑制LDL胆固醇溶解即可，没有特别限制。上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂通过抑制LDL胆固醇的溶解，从而抑制LDL胆固醇或其酯与上述酶试剂的反应。如上所述，上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂优选聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及烷基苯磺酸盐，它们可单独使用，也可两种以上并用。其中优选聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物。聚氧乙烯烷基醚优选聚氧乙烯十六烷基醚(例如商品名“エマルゲン220”(花王株式会社制))。聚氧乙烯烷基苯基醚优选聚氧乙烯壬基苯基醚(例如商品名“ブラウノンN-502”(青木油脂工业株式会社制))。聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物优选商品名“プルロニツクF-88”(株式会社ADEKA公司制)。聚氧乙烯烷基醚硫酸盐优选聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠(例如商品名“エマ一ル20C”(花王株式会社制))。烷基苯磺酸盐优选十二烷基苯磺酸钠。这些可单独使用或两种以上并用。
在本发明的试验片中的上述总胆固醇测定部(例如第一试剂层)中，样品使用时的上述胆固醇增溶用表面活性剂占总成分的比例例如为0.05～3.0重量％的范围，优选为0.1～1.0重量％的范围，更优选为0.3～0.7重量％的范围。
在本发明的试验片中的上述非LDL胆固醇测定部(例如第二试剂层)中，样品使用时的上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂占总成分的配合比例例如为1～15重量％的范围，优选为2～10重量％的范围，更优选为4～8重量％的范围。而且，样品使用时上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂占总成分的配合比例例如为1～15重量％的范围，优选为1.5～10重量％的范围，更优选为2～6重量％的范围。上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂(A)与上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂(B)的重量比(A/B)例如为1/1～4/1的范围，优选为1.1/1～3/1的范围，更优选为1.2/1～2.5/1的范围。
在本发明中，上述LDL胆固醇凝聚剂没有特别限制，可举出例如聚乙烯硫酸盐、阴离子性水溶性聚合物、植物来源的凝集素、聚乙二醇(PEG)、磷钨酸、硫酸葡聚糖酯、葡聚糖硫酸酯、肝素等，如上所述，优选聚乙烯硫酸盐。
上述聚乙烯硫酸盐例如是聚乙烯硫酸钾、聚乙烯硫酸钠、聚乙烯硫酸锂、聚乙烯硫酸铵等，这些可单独使用，也可二种以上并用。其中优选聚乙烯硫酸钾。上述聚乙烯硫酸盐优选为侧链上含有70％以上的硫酸基的物质。而且，上述聚乙烯硫酸盐的酯化度优选为80％以上，更优选为90％以上。另外，优选在上述聚乙烯硫酸盐中添加聚乙二醇甲基醚或聚乙烯吡咯烷酮，从而更好地进行LDL凝集反应。
上述阴离子性水溶性聚合物没有特别限制，可举出例如丙烯酸(2-磷-1，1-二甲基乙酰胺)、2-丙烯酰氨基羟基乙酸、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸-CO-2-丙烯酰胺羟基乙酸等单体的均聚物、上述单体的共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯等。上述阴离子性水溶性聚合物的具体例子例如为聚丙烯酸-(2-磷-1，1-二甲基乙酰胺)(PAP)、聚-2-丙烯酰胺羟基乙酸(PAAG)、聚-(2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸)(PAMPS)、聚-(2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸-CO-2-丙烯酰胺羟基乙酸)(P(AMPS-AAG))等。
上述植物来源的凝集素没有特别限制，可举出例如蓖麻(Ricinus communis)的果实、大豆等来源的凝集素。
上述聚乙二醇(PEG)、磷钨酸、硫酸葡聚糖酯及肝素可单独使用，也可与例如镁离子、锰离子、钙离子、锂离子、镍离子等阳离子一并使用。
在本发明的试验片中，样品使用时上述LDL胆固醇凝聚剂占总成分的配合比例例如为0.01～0.30重量％的范围，优选为0.02～0.20重量％的范围，更优选为0.04～0.15重量％的范围。在本发明的试验片中，样品使用时上述聚乙二醇甲基醚占总成分的配合比例例如为3～12重量％的范围，优选为3.5～11重量％的范围，更优选为4～10重量％。
如上所述，上述胆固醇测定用酶试剂优选胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的组合、或胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶的组合。更优选前者组合。
在本发明的试验片中，样品使用时胆固醇酯酶占总成分的比例例如为5～1000U/mL的范围，优选为10～100U/mL的范围，更优选为30～70U/mL的范围。而且，在本发明的试验片中，样品使用时胆固醇氧化酶占总成分的比例例如为5～1000U/mL的范围，优选为10～100U/mL的范围，更优选为20～50U/mL的范围。另外，在本发明的试验片中，样品使用时胆固醇脱氢酶占总成分的比例例如为5～1000U/mL的范围，优选为10～100U/mL的范围，更优选为30～70U/mL的范围。
上述胆固醇测定用酶试剂例如可使用市售品，优选使用不含干扰一系列反应的杂质等的纯正品、基因重组制品等。
上述胆固醇酯酶没有特别限制，可举出例如假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)等微生物来源的酶。上述酶没有特别限制，可举出例如具有下表中示出的底物特异性的物质。而且，上述酶中例如可添加BSA等，没有特别限制。
(酶的底物特异性)
底物                比活性(％)的范围
                                      
胆固醇醋酸酯        0.1～50
胆固醇丙酸酯        0～50
胆固醇丁酸酯        1～50
胆固醇棕榈酸酯      1～200
胆固醇硬脂酸酯      0～50
胆固醇油酸酯        1～200
胆固醇亚油酸酯      100
胆固醇辛酸酯        0～100
胆固醇月桂酸酯      0～200
胆固醇肉豆蔻酸酯    0～200
通常，在生物体内，胆固醇可分成游离型状态和与脂肪酸形成酯键的状态这两种。其中，后者通过胆固醇酯酶而水解成胆固醇及脂肪酸。而且，生成的胆固醇与前者游离型胆固醇在胆固醇氧化酶的处理下产生胆甾烯酮和过氧化氢。如果测定过氧化氢，即可求得胆固醇量。过氧化氢的测定可以是电化学测定或化学测定，但优选使用过氧化物酶(POD)、和经氧化而显色的底物(以下称为“氧化显色性底物”)的化学测定。在这种情况下，上述胆固醇测定用酶试剂中将含有POD及上述氧化显色性底物。在本发明的试验片中，样品使用时POD占总成分的比例例如为50～5000U/mL的范围，优选为100～1500U/mL的范围，更优选为700～800U/mL的范围。在本发明的试验片中，样品使用时上述氧化显色性底物占总成分的比例可根据其种类而适宜决定，例如为10～1000mmol/L的范围内，优选为20～200mmol/L的范围，更优选为30～70mmol/L的范围。
上述氧化显色性底物例如为ALPS[N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺，钠盐]、DAOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，钠盐]、MAOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺，钠盐，一水合物]、TOOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺，钠盐，二水合物]、苯酚等，其中可适宜选择呈现适合于测定机器所用波长的显色的底物。
在本发明的试验片中，上述总胆固醇测定部及非LDL胆固醇测定部在样品使用时的pH优选调整在pH6～9的范围内。上述pH的优选范围为pH7～8，最优选地，上述总胆固醇测定部的pH为7.5，上述非LDL胆固醇测定部的pH为7.7。为了调整为上述pH，上述总胆固醇测定部(例如第一试剂层)及非LDL胆固醇测定部(例如第二试剂层)中优选含有缓冲液(buffer)。上述缓冲液可举出例如后述物质。
作为本发明的测定对象的样品没有特别限制，例如为全血、血浆、血清等可能含有LDL胆固醇的待测样品(特别是生物学的液体)。
以下，图1示出了本发明的试验片的一个例子。图1的(A)为本例的试验片的透视图，图1的(B)为向图1的(A)的A-A方向上看的截面图。本例的试验片为以下结构：在细长的长方形板状支撑体1的一端上，设置有试剂层2及试剂层3两者。在上述试剂层2及试剂层3两者中，一者是上述总胆固醇测定部(第一试剂层)，另一者是上述非LDL胆固醇测定部(第二试剂层)。
上述支撑体1可使用例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯、聚酯、醋酸纤维素等树脂制成，其中优选PET。支撑体1的厚度没有特别限制，例如为0.1～1mm的范围，优选为0.1～0.5mm的范围，更优选为0.2～0.3mm的范围。
作为上述非LDL胆固醇测定部的上述试剂层，含有例如上述胆固醇测定用酶试剂、上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂等，优选还含有上述LDL胆固醇凝聚剂。作为上述总胆固醇测定部的上述试剂层含有例如上述胆固醇测定用酶试剂、上述胆固醇增溶用表面活性剂等。
例如可将上述胆固醇测定用酶试剂、上述各种表面活性剂、上述LDL胆固醇凝聚剂等各种试剂及亲水性聚合物在溶剂中溶解并混合，将纤维质结构物等浸渍在该溶液中或将该溶液涂布于其上，随后干燥，从而制得试剂层2及3。
上述亲水性聚合物可举出例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠、聚丙烯酸、明胶、酸水解明胶、聚丙烯酰胺、琼脂糖等。
另外，上述溶剂可举出例如磷酸缓冲液、Good’s缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等。上述总胆固醇测定部中的上述溶剂优选为磷酸缓冲液，上述非LDL胆固醇测定部中的上述溶剂优选为Good’s缓冲液。Good’s缓冲液优选为例如PIPES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、MES等，更优选为TES。为使样品使用时的pH在上述一定的范围内，上述缓冲液的pH优选调整在pH6～9的范围内，更优选调整在pH7～8的范围内，最优选是上述总高胆固醇测定部的pH调整为7.5，上述非LDL胆固醇测定部的pH调整为7.7。上述亲水性聚合物相对于涂布溶液总体的配合比例例如为0～40重量％的范围，优选为10～30重量％的范围，可根据其种类进行适宜调整。上述胆固醇测定用酶试剂、上述各种表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂，可预先调整为上述比例而调配于上述溶剂中。
上述纤维质结构物没有特别限制，纤维的种类只要是不防碍测定的材质即可，构成可以为织物或不织布。上述纤维可举出例如人造丝、尼龙、聚酯等纤维，或者也可以为它们的复合纤维。
上述涂布方法没有特别限制，例如可以是使用刷子的方法、喷涂涂层法、使用辊式涂布机的方法、浸渍法等。
上述试剂层2及3的厚度例如为50～250μm的范围，优选为80～200μm的范围，更优选为100～150μm的范围。而且，上述试剂层2及3的厚度不是涂布干燥后的厚度，而是涂布时的涂布厚度。上述试剂层2及3除了上述成分外，根据需要还可以包含抗氧化剂等添加剂。通过在支撑体1的预定位置上粘贴上述试剂层2及3，可制得本例的试验片。另外，在本发明中，试验片的形状没有特别限制，例如可以是板状或长方形状。在为长方形的情况下其尺寸例如是：全长为50～150mm的范围、宽度为3～15mm的范围，优选全长为60～100mm的范围、宽度为5～10mm的范围。
本例的试验片例如可如下所述使用。并且，在下文中，上述试剂层2是非LDL胆固醇测定部，上述试剂层3是总胆固醇测定部。即，首先，从上述试剂层2及上述试剂层3上方滴加血液等待测物。在上述试剂层2中，在上述试剂层2含有的上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂的作用下，滴加的待测物中仅有非LDL胆固醇与上述胆固醇测定用酶试剂发生反应。若上述试剂层2中还含有上述LDL胆固醇凝聚剂，再加上该试剂的作用，仅非LDL胆固醇与上述胆固醇测定用酶试剂更有效地反应。另一方面，在上述试剂层3的情况下，在试剂层含有的上述胆固醇增溶用表面活性剂的作用下，滴加的待测物中全部胆固醇均与上述胆固醇测定用酶试剂反应。并且，在上述试剂层2及上述试剂层3中含有POD和上述氧化显色性底物的情况下，可通过分光光度计、反射系数仪等光学测定仪器测定上述底物的显色。在测定血浆、血清的样品的显色的情况下，如果上述支撑体1是透光性的，那么既可从上述支撑体1侧进行光照射，也可从上述试剂层2及上述试剂层3侧进行光照射，测定光照射的透过率及反射率等。另外，在上述支撑体1不是透光性的情况下，可从上述试剂层2及上述试剂层3侧进行光照射来测定反射率。此外，如下文所述的，在全血作为样品的情况下，为了防止红细胞着色导致的妨碍测光，优选在上述检测层及上述反应层之间设置血细胞阻挡层及光反射层，使用透光性支撑体，从上述支撑体1侧进行测定。
图2示出了本发明的试验片的其他例子的截面图。在本例的试验片中，在支撑体1之上形成上述非LDL胆固醇测定部的试剂层2以及上述总胆固醇测定部的试剂层3，如同一图所示上述两个试剂层2及3设置有反应层4和检测层5。除此之外，与上述图1示出的试验片相同，并使用相同的方法。在上述试剂层2中，上述反应层4含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述LDL阻止溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述反应层5含有上述胆固醇测定用酶试剂。在上述试剂层3中，上述反应层4含有上述胆固醇增溶用表面活性剂，上述检测层5含有上述胆固醇测定用酶试剂。
此外，在上述试剂层2中，上述反应层4分为上层41及下层42，上述上层41可含有上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述下层42可含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂。这样，样品首先在上述上层41中与上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂接触，其后，移动到上述下层42中，与上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂接触后，在上述检测层5中与上述酶试剂接触。这样根据样品的移动顺序将反应层分成上层和下层这两层，可进一步有效阻止LDL胆固醇的增溶，并提高非LDL胆固醇的测定精度。例如，在纤维质结构物上涂布上述胆固醇测定用酶试剂溶液并干燥，形成上述检测层5之后，在其上涂布在溶剂中溶解上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂及亲水性聚合物而成的溶液，并干燥，在其上涂布在溶剂中溶解上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂、上述LDL胆固醇凝聚剂及亲水性聚合物而成的溶液，并干燥，可形成如上的上述反应层4。这种情况下的亲水性聚合物及溶剂的种类和浓度等与上述相同，涂布的方法也与上述相同。另外，两层结构的上述试剂层3可根据重叠上述试剂层2的溶液的方法而形成。而且，除重叠溶液以形成多层结构的试剂层的方法之外，还可通过在多个纤维质结构物上涂布各试剂溶液并干燥，使其层叠而形成多层结构的试剂层。
图3示出了本发明的试验片的另一个例子的截面图。本例的试验片没有支撑体，上述非LDL胆固醇测定部的试剂层2和上述总胆固醇测定部的试剂层3形成为分别不同的试验片。如该图中所示，上述两个试剂层2及3具有反应层4和检测层5。在上述试剂层2中，如上所述，上述反应层4分为上层41和下层42，上述上层41可含有上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述下层42可含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂。除此之外与上述图1示出的试验片相同，使用方法也相同。在上述试剂层2中，上述反应层4含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述LDL阻止溶解用表面活性剂以及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述检测层5含有上述胆固醇测定用酶试剂。在上述试剂层3中，上述反应层4含有上述胆固醇增溶用表面活性剂，上述检测层5含有上述胆固醇测定用酶试剂。
图4示出了本发明的试验片的另一个例子的截面图。在本例的试验片中，试验片相对于样品使用面垂直地分成两部分，半个部分分别作为上述非LDL胆固醇测定部的试剂层2以及上述总胆固醇测定部的试剂层3。如图所示，上述两个试剂层2及3具有反应层4和检测层5。在上述试剂层2中，如上所述，上述反应层4分为上层41和下层42，上述上层41可含有上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂以及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述下层42可含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂。除此之外，与上述图1示出的试验片相同，使用方法也相同。在上述试剂层2中，上述反应层4含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述LDL阻止溶解用表面活性剂以及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述检测层5含有上述胆固醇测定用酶试剂。在上述试剂层3中，上述反应层4含有上述胆固醇增溶用表面活性剂，上述检测层5含有上述胆固醇测定用酶试剂。
图5的(A)示出了本发明的试验片的另一个例子的截面图。图5的(B)示出了该例的平面图。与图4示出的试验片同样地，在本例的试验片中，试验片从界面7相对于样品使用面垂直地分成两部分，半个部分分别作为上述非LDL胆固醇测定部的试剂层2以及上述总胆固醇测定部的试剂层3。另外，本例的试验片的外缘是嵌入外框6的槽的状态。上述两个试剂层2和3与图4的试验片同样可具有反应层和检测层。在上述试剂层2中，如上所述，上述反应层分为上层和下层，上述上层可含有上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂以及上述LDL胆固醇凝聚剂，上述下层可含有上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂。除此之外，与上述图1示出的试验片相同，使用方法也相同。上述试剂层2的上述检测层含有上述胆固醇测定用酶试剂。在上述试剂层3中，上述反应层可含有上述胆固醇增溶用表面活性剂，上述检测层可含有上述胆固醇测定用酶试剂。
此外，本发明的试验片，根据需要可在上述试剂层之上形成血细胞分离层。其可为能够过滤血细胞的多孔材料，也可根据情况设置反射层。上述多孔材料可使用例如玻璃滤器等公知的血细胞分离材料。这样，如果配备有血细胞分离层，只要直接提供全血，就可以测定血浆或血清中的LDL胆固醇。
如上所述，本发明的测定方法可以适用于液态的测定方法。上述液态的测定方法例如可使用作为总胆固醇测定部的第一反应容器和作为非LDL胆固醇测定部的第二反应容器来实施。上述反应容器没有特别限制，例如可举出小玻璃管(Cuvette)、试管等。
上述液态的测定方法中优选以下方案：
在上述(A)工序中，上述第一反应容器含有上述胆固醇测定用酶试剂，上述第二反应容器含有上述胆固醇测定用酶试剂、上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂；
在上述(B)工序中，通过上述胆固醇测定用酶试剂测定上述总胆固醇；
在上述(C)工序中，在上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂的作用下，通过上述胆固醇测定用酶试剂选择性测定非LDL胆固醇。并且，上述第二反应容器优选还含有上述LDL胆固醇凝聚剂。在上述液态的测定方法中，上述胆固醇测定用酶试剂、上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂及上述LDL胆固醇凝聚剂等测定试剂可使用与上述相同的物质。并且，测定方法没有特别限制，可举出例如通过电化学方法或化学方法测定使用上述酶试剂时产生的过氧化氢的方法等。此外，在使用上述LDL胆固醇凝聚剂等情况下，当反应液出现混浊而不适用化学测定法时，优选采用使用酶电极等的电化学测定法。
实施例
接下来，将实施例与比较例一起进行说明。并且，在下文中，“K/S值”是由下式计算的变量，在将反射率(R)换算成浓度时使用。
(式)K/S＝(1-R)2/2R
[实施例1]
(A)制作非LDL胆固醇测定部
首先，在白色PET膜(厚度125μm)的支撑板上，将下述组成的检测层形成用溶液涂布成厚度150μm后，于40℃干燥10分钟，形成检测层。另一方面，将聚乙烯制的织物(厚250μm)浸渍在下述组成的第一试剂液中，于40℃干燥10分钟。在该聚乙烯制织物的一面上涂布下述组成的第二试剂液，于40℃干燥10分钟，制作样品供给层。接着，在上述检测层表面上喷射层压液。并且，在喷射了上述层压液的上述检测层上再层叠上述样品供给层，使上述第二试剂液的涂布面向上，于40℃干燥10分钟，制作非LDL胆固醇测定部。并且，下述组成示出的各成分的浓度是样品使用时占总成分的配合比例，即供给5μL样品时的最终浓度(酶反应时的浓度)。
(检测层形成用溶液的组成)
成分                                           浓度
                                                         
POD(东洋纺株式会社制)                          764U/mL
4-氨基安替比林(キシダ化学株式会社制)           43mmol/L
DAO S(株式会社同仁化学研究所制)                51mmol/L
TE S缓冲液(株式会社同仁化学研究所制，pH7.7)    300mmol/L
(第一试剂液的组成)
成分                                           浓度
                                                          
TES缓冲液(同仁化学研究所制，pH7.7)             30mmol/L
胆固醇酯酶                                     46U/mL
胆固醇氧化酶                                   35U/mL
聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚
(花王株式会社制，商品名：エマルゲンB66)        5重量％
(第二试剂液的组成)
成分                                    浓度
                                                  
聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物
(ADEKA公司制，商品名：プルロニツクF88)  4重量％
聚乙烯硫酸钾                            0.10重量％
聚乙二醇甲基醚                          5重量％
(层压液的组成)
蒸馏水                                  100重量％
(B)总胆固醇测定部的制作
此外，在与上述非LDL胆固醇测定部邻接的上述支撑板上，将下述组成的检测层形成用溶液涂布成厚度150μm后，于40℃干燥10分钟，形成检测层。另一方面，在聚乙烯制织物(厚250μm)上喷射下述组成的层压液。并且，将喷射了上述层压液的聚乙烯制织物层叠于上述检测层上，于40℃干燥10分钟，形成总胆固醇测定部，制得本例的试验片。此外，下述组成示出的各成分的浓度是样品使用时占总成分的配合比例，即供给5μL样品时的最终浓度(酶反应时的浓度)。
(检测层形成用溶液的组成)
成分                                 浓度
                                                   
磷酸缓冲液(pH7.5)                    90mmol/L
胆固醇酯酶                           795U/mL
胆固醇氧化酶                         233U/mL
POD                                  750U/mL
4-氨基安替比林(キシダ化学株式会社制) 44mmol/L
DAOS(株式会社同仁化学研究所制)       53mmol/L
(层压液的组成)
成分                                 浓度
                                                  
磷酸缓冲液(pH7.5)                    17mmol/L
脱氧胆酸钠                           0.5重量％
[实施例2]
除了使非LDL胆固醇测定部中的聚乙烯硫酸钾在样品供给时的最终浓度(样品使用时占总成分的配合比例)为0.05重量％之外，按照与实施例1相同的方法制作实施例2的试验片。
[实施例3]
除了非LDL胆固醇测定部不含有聚乙烯硫酸钾及聚乙二醇甲基醚中任意一种之外，按照与实施例1相同的方法制作实施例3的试验片。
<确认与已知浓度的相关关系>
使用如上得到的实施例1～3的各试验片测定LDL胆固醇量为已知的55份血清样品待测物中的LDL胆固醇量。并且，如下测定上述LDL胆固醇量。即，首先，在各试验片的总胆固醇测定部、非LDL胆固醇测定部上分别滴加血液样品5μL。随后使用专用反射系数仪(商品名スポツトケム、爱科来公司制)测定各测定部的反射率。上述测定中，测定波长为610nm。接着，根据得到的反射率求得LDL胆固醇量(K/S值)。并且，计算出该实验得到的各试验片的LDL胆固醇量与上述已知浓度的相关系数。其结果如下表1所示。
(表1)
实施例     聚乙烯硫酸钾浓度(重量％)    相关系数(r)
                                                      
实施例1    0.10                        0.9651
实施例2    0.05                        0.9640
实施例3    0.00                        0.9457
如表1所示，使用实施例1～3的试验片测定的LDL胆固醇量显示出与已知浓度具有较高的相关系数。特别是，在含有聚乙烯硫酸钾的实施例1及实施例2的试验片中得到了非常高的相关系数。
<K/S值的时间过程的确认>
图6的图示出了由实施例1～3的各试验片得到的上述LDL胆固醇量(K/S值)的时间过程。在该图中，横轴是测定时间(秒)，纵轴是上述K/S值。另外，在该图中，圆点是实施例1的结果，四边形是实施例2的结果，三角形是实施例3的结果。
如图6的图所示，在使用实施例1～3的试验片的LDL胆固醇量的测定中，所有反应均到达了终点。因此，在使用实施例1～3的试验片的上述测定中，可防止LDL胆固醇反应，仅非LDL胆固醇发生反应，可高精度地测定LDL胆固醇量。并且，在使用含有聚乙烯硫酸钾的实施例1及2的试验片的上述测定中，K/S值进一步降低，仅非LDL胆固醇发生反应，可更高精度地测定LDL胆固醇量。
<与液态试剂干燥化而成的试验片的比较>
[比较例1]
比较例1参考了专利文献1(日本专利第3091230号公报)的实施例1中的试剂组成，将由上述直接法得到的LDL胆固醇测定用液态试剂(湿化学法)干燥化制成试验片。将聚乙烯制织物(250μm)浸渍在下述组成的试剂液中，于40℃干燥10分钟，制作比较例1的试验片。下述组成中各成分的浓度是供给5μL样品时的最终浓度(酶反应时的浓度)。
(试剂液的组成)
成分                  浓度
                                   
α-环糊精             5mmol/L
聚氧乙烯单月桂酸酯    0.5重量％
胆固醇酯酶            0.25U/mL
胆固醇氧化酶          1.25U/mL
POD                      6.25U/mL
4-氨基安替比林           0.55mmol/L
DAOS                     0.83mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH7.0)    30mmol/L
另外，在专利文献1的实施例1中，显色剂使用EMSE(N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-丁二酰-乙二胺)，但在比较例1中使用DAOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺)。
对于如上得到的比较例1及实施例1的试验片，将已知浓度的标准血清作为待测物，与上述同样测定上述试验片的各测定部的反射率(时间过程)，求得LDL胆固醇量(K/S值)。其结果如图7的图所示。在该图中，横轴是测定时间(秒)，纵轴是上述K/S值。另外，在该图中，四边形是实施例1的总胆固醇测定部的结果，圆点是实施例1的非LDL胆固醇测定部，三角形是比较例1的试验片的测定结果。
从图7的图中可以看出，实施例1的总胆固醇测定部以及非LDL胆固醇测定部的反应均到达终点。因此，可知在实施例1的试验片的各测定部中可防止测定对象以外的测定，总胆固醇测定部分仅测定总胆固醇，非LDL胆固醇测定部仅测定非LDL胆固醇。与此相对的，在将液态的LDL胆固醇测定用液态试剂干燥化而制成的比较例1的试验片中，完全没有进行反应，因此无法测定LDL胆固醇。因此，如上所述可知，仅将LDL胆固醇测定用液态试剂单纯地干燥化是无法测定LDL胆固醇的。
<与液态试剂测定值的精度的比较>
[实施例4]
除了使聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的最终浓度为7.5重量％而形成非LDL胆固醇测定部之外，与实施例1同样地制作实施例4的试验片。
[比较例2]
比较例2使用由除去法得到的LDL胆固醇测定用液态试剂，即血清LDL胆固醇测定试剂盒(商品名“コレステストLDL”，积水メデイカル株式会社制)。
使用如此得到的实施例4和比较例2，测定70待测物的血清样品中的LDL胆固醇量。在使用实施例4的试验片的测定中，与上述相同地测定反射率，求得LDL胆固醇量(K/S值)。另一方面，在使用比较例2的市售测定试剂盒的测定中，通过吸收光谱仪测定显色反应后的反应液的吸光度，求得LDL胆固醇量。并且，分析实施例4的测定值和比较例2的测定值之间的相关关系。其结果如图8的图所示。在该图中，纵轴是实施例4的测定值，横轴是比较例2的测定值。
如图8的图所示，实施例4的测定值与比较例2的测定值显示出良好的相关关系，其相关系数r＝0.9834。因此，表明本发明的试验片可以与市售的血清LDL胆固醇试剂盒相同或更高的精度测定LDL胆固醇量。然而，由于比较例2是液态试剂，需要大量洗涤水，而且在测定时将产生废液。与此相对，实施例4的试验片无需洗涤水，当然也不产生废液，可简便地进行测定。
[实施例5]
在实施例5中，除了使用下述组成的检测层形成用溶液、第一试剂液以及层压液，不在上述聚乙烯制织物的一面上涂布第二试剂液来形成非LDL胆固醇测定部之外，与实施例1同样地制作试验片。
(检测层形成用溶液的组成)
成分                                     浓度
                                                      
POD(东洋纺株式会社制)                    764U/mL
4-氨基安替比林(キシダ化学株式会社制)     43mmol/L
DAOS(株式会社同仁化学研究所制)             51mmol/L
TES缓冲液(株式会社同仁化学研究所制，pH7.7) 300mmol/L
(第一试剂液的组成)
成分                                       浓度
                                                      
聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物
(ADEKA公司制，商品名：プルロニツクF88)     4重量％
(层压液的组成)
成分                                       浓度
                                                       
TES缓冲液(同仁化学研究所制，pH7.7)         30mmol/L
胆固醇酯酶                                 46U/mL
胆固醇氧化酶                               35U/mL
聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚
(花王株式会社制，商品名：エマルゲンB66)    5重量％
用如上得到的实施例5及比较例2，测定61份待测物的血清样品中的LDL胆固醇量。在使用实施例5的试验片的测定中，与上述同样地测定反射率，求得LDL胆固醇量(K/S值)。另一方面，在使用比较例2的市售测定试剂盒的测定中，与上述相同地测定吸光度，求得LDL胆固醇量。并且，分析实施例5的测定值与比较例2的测定值的相关关系。图9的图中示出了实施例5的测定值与比较例2的测定值的相关关系。在该图中，纵轴是实施例5的测定值，横轴是比较例2的测定值。
如图9的图所示，实施例5的测定值与比较例2的测定值显示出良好的相关关系，其相关系数r＝0.9780。因此，表明实施例5的试验片可以与市售的血清LDL胆固醇试剂盒相同或更高的精度测定LDL胆固醇量。然而，由于比较例2是液态试剂，需要大量洗涤水，而且在测定时将产生废液，与此相对，实施例5的试验片无需洗涤水，当然也不产生废液，可简便地进行测定。
产业上的可利用性
如果使用本发明的LDL胆固醇测定用试验片，通过结构简单的小型测定装置即可测定LDL胆固醇。因此，本发明的LDL胆固醇测定用试验片能在较广的领域中应用，例如在临床检查等需要测定大量待测物的领域中有用。
1.(删除)
2.(修改后)一种LDL胆固醇测定方法，其为测定样品中的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的LDL胆固醇测定方法，其特征在于具有下述(A)工序至(D)工序：
(A)准备总胆固醇测定部和非LDL胆固醇测定部的工序，
所述总胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂，
所述非LDL胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂、非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂，该测定部测定LDL胆固醇以外的胆固醇、即非LDL胆固醇；
(B)在上述总胆固醇测定部中，通过上述胆固醇测定用酶试剂测定上述样品中的总胆固醇的工序；
(C)在上述非LDL胆固醇测定部中，在上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂的作用下，通过上述胆固醇测定用酶试剂选择性测定上述样品中的非LDL胆固醇的工序；
(D)从上述(B)工序的上述总胆固醇测定值中减去上述(C)工序的上述非LDL胆固醇测定值，求得上述样品中的LDL胆固醇量的工序。
3.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，
在上述(A)工序中，上述非LDL胆固醇测定部还含有LDL胆固醇凝聚剂；
在上述(B)工序中，通过上述胆固醇测定用酶试剂测定上述总胆固醇；
在上述(C)工序中，在上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂以及上述LDL胆固醇凝聚剂的作用下，通过上述胆固醇测定用酶试剂选择性测定上述非LDL胆固醇。
4.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂含有选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚中的至少一种表面活性剂；
上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂含有选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐以及烷基苯磺酸盐构成的组中的至少一种表面活性剂。
5.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶。
6.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇脱氢酶。
7.根据权利要求3所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述LDL胆固醇凝聚剂为聚乙烯硫酸盐。
8.(修改后)一种LDL胆固醇测定方法，其为测定样品中的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的LDL胆固醇测定方法，
其特征在于具有下述(A)工序至(D)工序，下述非LDL胆固醇为高密度脂蛋白(HDL)胆固醇及超低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇：
(A)准备总胆固醇测定部、
以及测定LDL胆固醇以外的胆固醇、即非LDL胆固醇的非LDL胆固醇测定部的工序；
(B)在上述总胆固醇测定部中测定上述样品中的总胆固醇的工序；
(C)在上述非LDL胆固醇测定部中测定上述样品中的非LDL胆固醇的工序；
(D)从上述(B)工序的上述总胆固醇测定值中减去上述(C)工序的上述非LDL胆固醇测定值，求得上述样品中的LDL胆固醇量的工序。
9.(删除)
10.(修改后)一种LDL胆固醇测定用试验片，其为权利要求2所述的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇测定方法中所用的LDL胆固醇测定用试验片，
所述试验片具有总胆固醇测定部、和测定LDL胆固醇以外的胆固醇量、即非LDL胆固醇量的非LDL胆固醇测定部，
从上述总胆固醇测定部的总胆固醇测定值中减去上述非LDL胆固醇测定部的非LDL胆固醇测定值，求得LDL胆固醇量，
上述总胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂，
上述非LDL胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂、非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂。
11.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述非LDL胆固醇测定部还含有LDL胆固醇凝聚剂。
12.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂含有选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚中的至少一种表面活性剂；
上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂含有选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐以及烷基苯磺酸盐构成的组中的至少一种表面活性剂。
13.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶。
14.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇脱氢酶。
15.根据权利要求11所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中上述LDL胆固醇凝聚剂为聚乙烯硫酸盐。
16.(修改后)一种LDL胆固醇测定用试验片，其为测定样品中的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的LDL胆固醇测定方法中所用的LDL胆固醇测定用试验片，
所述试验片具有总胆固醇测定部、和测定LDL胆固醇以外的胆固醇量、即非LDL胆固醇量的非LDL胆固醇测定部，
从上述总胆固醇测定部的总胆固醇测定值中减去上述非LDL胆固醇测定部的非LDL胆固醇测定值，求得LDL胆固醇量，
其中，上述非LDL胆固醇为高密度脂蛋白(HDL)胆固醇以及超低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇。
17.(删除)
18.(修改后)一种LDL胆固醇测定用试验片，其为测定样品中的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的LDL胆固醇测定方法中所用的LDL胆固醇测定用试验片，
所述试验片具有总胆固醇测定部、和测定LDL胆固醇以外的胆固醇量、即非LDL胆固醇量的非LDL胆固醇测定部，
从上述总胆固醇测定部的总胆固醇测定值中减去上述非LDL胆固醇测定部的非LDL胆固醇测定值，求得LDL胆固醇量，
所述试验片具有第一支撑体和第二支撑体、以及第一试剂层和第二试剂层，
上述第一试剂层设置在上述第一支撑体上，
上述第二试剂层设置在上述第二支撑体上，
上述第一试剂层为上述总胆固醇测定部，
上述第二试剂层为上述非LDL胆固醇测定部。

Claims (18)

1.一种LDL胆固醇测定方法，其为测定样品中的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的LDL胆固醇测定方法，其特征在于具有下述(A)工序至(D)工序：
(A)准备总胆固醇测定部、
以及测定LDL胆固醇以外的胆固醇、即非LDL胆固醇的非LDL胆固醇测定部的工序；
(B)在上述总胆固醇测定部中测定上述样品中的总胆固醇的工序；
(C)在上述非LDL胆固醇测定部中测定上述样品中的非LDL胆固醇的工序；
(D)从上述(B)工序的上述总胆固醇测定值中减去上述(C)工序的上述非LDL胆固醇测定值，求得上述样品中的LDL胆固醇量的工序。
2.根据权利要求1所述的LDL胆固醇测定方法，其中，
在上述(A)工序中，上述总胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂；
上述非LDL胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂、非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂；
在上述(B)工序中，通过上述胆固醇测定用酶试剂测定上述总胆固醇；
在上述(C)工序中，在上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂的作用下，通过上述胆固醇测定用酶试剂选择性测定上述非LDL胆固醇。
3.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，
在上述(A)工序中，上述非LDL胆固醇测定部还含有LDL胆固醇凝聚剂；
在上述(B)工序中，通过上述胆固醇测定用酶试剂测定上述总胆固醇；
在上述(C)工序中，在上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂、上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂以及上述LDL胆固醇凝聚剂的作用下，通过上述胆固醇测定用酶试剂选择性测定上述非LDL胆固醇。
4.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂含有选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚中的至少一种表面活性剂；
上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂含有选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐以及烷基苯磺酸盐构成的组中的至少一种表面活性剂。
5.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶。
6.根据权利要求2所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇脱氢酶。
7.根据权利要求3所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述LDL胆固醇凝聚剂为聚乙烯硫酸盐。
8.根据权利要求1所述的LDL胆固醇测定方法，其中，上述非LDL胆固醇为高密度脂蛋白(HDL)胆固醇及超低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇。
9.一种LDL胆固醇测定用试验片，其为用于权利要求1所述的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇测定方法的LDL胆固醇测定用试验片，其特征在于，其具有总胆固醇测定部、和测定LDL胆固醇以外的胆固醇量、即非LDL胆固醇量的非LDL胆固醇测定部，
并且从上述总胆固醇测定部的总胆固醇测定值中减去上述非LDL胆固醇测定部的非LDL胆固醇测定值，求得LDL胆固醇量。
10.根据权利要求9所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述总胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂，上述非LDL胆固醇测定部含有胆固醇测定用酶试剂、非LDL胆固醇增溶用表面活性剂以及抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂。
11.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述非LDL胆固醇测定部还含有LDL胆固醇凝聚剂。
12.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述非LDL胆固醇增溶用表面活性剂含有选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚中的至少一种表面活性剂；
上述抑制LDL胆固醇溶解用表面活性剂含有选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐以及烷基苯磺酸盐构成的组中的至少一种表面活性剂。
13.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶。
14.根据权利要求10所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中上述酶试剂包含胆固醇酯酶以及胆固醇脱氢酶。
15.根据权利要求11所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中上述LDL胆固醇凝聚剂为聚乙烯硫酸盐。
16.根据权利要求9所述的LDL胆固醇测定用试验片，其中，上述非LDL胆固醇为高密度脂蛋白(HDL)胆固醇以及超低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇。
17.根据权利要求9所述的LDL胆固醇测定用试验片，其具有支撑体、第一试剂层及第二试剂层，
上述第一试剂层及上述第二试剂层设置在上述支撑体上，
上述第一试剂层为上述总胆固醇测定部，
上述第二试剂层为上述非LDL胆固醇测定部。
18.根据权利要求9所述的LDL胆固醇测定用试验片，其具有第一支撑体和第二支撑体、以及第一试剂层和第二试剂层，
上述第一试剂层设置在上述第一支撑体上，
上述第二试剂层设置在上述第二支撑体上，
上述第一试剂层为上述总胆固醇测定部，
上述第二试剂层为上述非LDL胆固醇测定部。
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