CN101612312A - 一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用，该中药组合物通过改善神经传导速度，降低山梨醇含量，增加神经血流量，增加血管开放的数量，对糖尿病并发肾、眼、神经病理改变有明显减轻的功能。

Description

一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用

技术领域

本发明涉及到一种中药组合物的新用途，具体的，涉及一种中药组合物在制备治疗糖尿病及糖尿病并发症药物中的应用，属于中药应用领域。

背景技术

糖尿病是一个发病过程复杂，难于控制的代谢性疾病，其发展到一定程度，会并发多种并发症，糖尿病的主要危险是糖尿病慢性并发症(DCC)的发生。这些并发症常累及肾脏、心脏、视网膜、神经等，是糖尿病致死、致残的主要原因。治疗糖尿目前其治疗主要表现为控制血糖及对症治疗。对糖尿病合并症，尤其是微血管合并症还缺少有效的药物进行调节。奥地利在1971年，开发出世界上第一个醛糖还原酶抑制剂导升明(Doxium)，主要用于治疗糖尿病微血管合并症中眼合并症，但其活性较弱，而用药时间常常较晚，所以效果不甚显著；1984年，日本开发出另一个醛糖还原酶抑制剂：依帕司他(epalrestat)，用于糖尿病微血管合并症中的神经合并症的治疗，虽然它的醛糖还原酶抑制活性不强，对晚期病症无显著效果，但对于早期控制糖尿病微血管合并症的发展有积极作用的，因此也广泛用于临床；九十年代初美国又上市醛糖还原酶抑制活性很强的新药托瑞司他(tolrestat)，此药对多种糖尿病微血管合并症的早期，中期都有显著疗效，但其肝毒性太大，FDA不得不宣布停止使用。国内尚未开发出类似产品。

目前中药降糖力度和速度虽然还不能与西药相提并论，但从对糖尿病血管病变及其它慢性并发症的综合防治，对代谢紊乱的整体调节等方面已显不出其良好的应用前景。[中国中医药现代远程教育.第5卷第02期2007年02月.肖元]

糖尿病的并发症可达百种以上，据世界卫生组织统计，糖尿病患者死亡率最高的为心脑血管病变占50％，其次是肾病为10％以上，糖尿病患者95％以上并发视网膜病变，是四大致盲原因之一。糖尿病造成的截肢占非外伤性截肢的85％以上。糖尿病患者长期高血糖状态使山梨醇在细胞内大量积聚，造成神经组织对肌醇摄取减少，最终使Na⁺-K⁺-ATP酶活性下降，神经细胞肿胀、变性、生理功能降低，传导速度减慢，节段性脱髓鞘和轴突消失，感觉神经损伤先于运动神经。外周神经中含有醛糖还原酶，它将葡萄糖转化为山梨醇，此酶活性受血糖浓度的影响，血糖升高则活性增强，因此糖尿病时神经内的山梨醇大量积累，直接或间接引起神经损害

本发明是在第02146570.3号的基础上进行的改进发明，在此全文引用该专利文件记载的内容。上述专利未公开该中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。

发明内容

本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，涉及一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。本发明所述中药可以被有相同或相似功效的中药代替，并且这些药材均可按照《全国中药炮制规范》或《中药大辞典》进行炮制。

本发明提供了一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参42-160、黄精50-200、苍术30-100、苦参20-60、茯苓35-100、麦冬50-200、制何首乌35-100、地黄50-120、山茱萸50-200、黄连20-60、佩兰30-60、荔枝核75-150、淫羊藿30-60、知母30-100、丹参35-120、葛根50-200、地骨皮30-100；

优选的，该中药组合物由如下重量份的原料药制成：

人参42、黄精200、苍术30、苦参60、茯苓35、麦冬200、制何首乌35、地黄120、山茱萸50、黄连60、佩兰30、荔枝核150、淫羊藿30、知母100、丹参35、葛根200、地骨皮30。

或：

人参102、黄精136、苍术68、苦参56、茯苓83、麦冬136、制何首乌83、地黄102、山茱萸136、黄连56、佩兰56、荔枝核136、淫羊藿56、知母68、丹参89、葛根136、地骨皮83。

或：

人参160、黄精50、苍术100、苦参20、茯苓100、麦冬50、制何首乌100、地黄50、山茱萸200、黄连20、佩兰60、荔枝核75、淫羊藿60、知母30、丹参120、葛根50、地骨皮100。

优选的，所述中药组合物所用原料药中，苍术为麸炒苍术，地黄为生地黄，淫羊藿为炙淫羊藿，黄精为制黄精。

本发明还提供了所述中药组合物的活性成分由以下步骤制成：

a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术加5-9倍量水提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；

c、山茱萸用5-9倍量50-90％乙醇浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90％乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80％，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；

步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏与步骤b所得挥发油共同构成该中药组合物的活性成分。

本发明药物的剂型为胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、软胶囊、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。

其中颗粒剂的制备方法，是由以下步骤制成：

a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术合并，加5-9倍量水，水蒸汽法提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；

c、山茱萸用5-9倍量50-90％乙醇浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90％乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80％，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；

f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎，加入适当药学上可接受的辅料制粒；

g、步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤f所得的颗粒，混匀，密闭，分装，即得。

优选制备方法为：

a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术加6倍量水，提取挥发油，提油时间为5小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用，残渣弃去；

c、山茱萸用7倍量75％乙醇浸渍24小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加8倍量70％乙醇，回流提取3次，每次2小时。提取液过滤，回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加9倍量水，煎煮2次，每次2小时，提取液过滤，与佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩至60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加95％乙醇调解醇浓度为60％，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇，并浓缩至60℃时测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎；

g、将干步骤f所得干膏粉与乳糖粉、糊精按4∶5∶1混合均匀，用60％乙醇为黏合剂，制软材，14目筛网制颗粒，55-60℃烘干，12-60目筛网整粒，筛出部分细粉，喷入步骤b所得的挥发油，混匀，密闭半小时，分装，即得。

本发明药物的其他剂型按比例称取原料药后，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。

本发明药物组合物性质稳定、质量可控、疗效显著、毒性极低，具有改善神经传导速度，降低山梨醇含量，增加神经血流量，增加血管开放的数量，抑制血管基底膜的增厚，逆转糖尿病引起的谷胱甘肽降低，过氧化脂质升高，且能够升高Na⁺-K⁺-ATP酶活力，对糖尿病合并症引起的肾、眼、神经病理改变明显减轻的功能。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术和惯用手段，在不脱离本发明上述基本思想的前提下，还可以作出其他多种形式的修改、替换与变更。

以下通过具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1：

原料药配方为：

人参102g、黄精136g、苍术68g、若参56g、茯苓83g、麦冬136g、制何首乌83g、地黄102g、山茱萸136g、黄连56g、佩兰56g、荔枝核136g、淫羊藿56g、知母68g、丹参89g、葛根136g、地骨皮83g。

制备方法为：

a、按照处方量称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术加6倍量水，提取挥发油，提油时间为5小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用，残渣弃去；

c、山茱萸用7倍量75％乙醇浸渍24小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加8倍量70％乙醇，回流提取3次，每次2小时。提取液过滤，回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加9倍量水，煎煮2次，每次2小时，提取液过滤，与佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩至60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加95％乙醇调解醇浓度为60％，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇，并浓缩至60℃时测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎；

g、将步骤f所得干膏粉与乳糖粉、糊精按4∶5∶1混合均匀，用60％乙醇为黏合剂，制软材，14目筛网制颗粒，55-60℃烘干，12-60目筛网整粒，筛出部分细粉，喷入步骤b所得挥发油，混匀，密闭半小时，即得556克颗粒，以下简称KL。

实施例2：

原料药配方为：

人参42g、黄精200g、苍术30g、苦参60g、茯苓35g、麦冬200g、制何首乌35g、地黄120g、山茱萸50g、黄连60g、佩兰30g、荔枝核150g、淫羊藿30g、知母100g、丹参35g、葛根200g、地骨皮30g。制备方法为：

a、按处方量称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术加5倍量水，提取挥发油，提油时间为3小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用，残渣弃去；

c、山茱萸用5倍量50％乙醇浸渍12小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，力加6倍量5％乙醇，回流提取2次，每次1小时。提取液过滤，回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7倍量水，煎煮1小时，提取液过滤，与佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩至60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加95％乙醇调解醇浓度为50％，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇，并浓缩至60℃时测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎，制成颗粒；

g、将步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤f所得颗粒，按常规制剂方法制成片剂即得，以下简称PJ。

实施例3：

原料药配方为：

人参160g、黄精50g、苍术100g、苦参20g、茯苓100g、麦冬50g、制何首乌100g、地黄50g、山茱萸200g、黄连20g、佩兰60g、荔枝核75g、淫羊藿60g、知母30g、丹参120g、葛根50g、地骨皮100g。

制备方法为：

a、按处方量称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术加9倍量水，提取挥发油，提油时间为6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用，残渣弃去；

c、山茱萸用9倍量90％乙醇浸渍48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加10倍量90％乙醇，回流提取3次，每次3小时。提取液过滤，回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加11倍量水，煎煮2次，每次3小时，提取液过滤，与佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩至60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加95％乙醇调解醇浓度为80％，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇，并浓缩至60℃时测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，65-70℃烘干，粉碎，备用；

f、将步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤e所得干膏粉中，按常规制剂方法制成丸剂即得，以下简称WJ。

实施例4：

本发明药物组合物对链脉霉素大鼠糖尿病合并症的影响

实验方法：

实验动物：SD大鼠，雄性，体重250-300g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2002-0003。大鼠饲料为全价颗粒饲料，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2003-2-001，大鼠保持充足的饮水。适应性饲养3天。

糖尿病大鼠模型的制备：将链脲佐菌素STZ溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.4)中，避光条件下迅速配成浓度为1％的STZ溶液。动物禁食12h后，受试动物按照60mg/kg剂量，予以腹腔注射，72h后，大鼠尾静脉采血，测定空腹血糖，空腹血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病大鼠成模标准。

分组及处理：根据空腹血糖值、体重随机分组，将造模动物分成模型组、受试物高、中、低组，另设对照组。大鼠以1ml/kg灌胃给药，给药组按5.1g生药/kg、10.2g生药/kg、20.4g生药/kg(分别为临床人用量的4、8、16倍)给予受试物，对照组和模型组给予同体积的0.5％CMC-Na灌胃，每日1次，连续给药8周。

1、大鼠尾神经传导速度测定：大鼠戊巴比妥钠麻醉后，置于37℃恒温水浴上固定，用电刺测定尾神经传导速度，将刺激电极放在尾部近端、记录电极插在尾部远端，用Pclab生物信号采集处理系统给出刺激并记录电位信号，刺激采用5伏方波刺激，波宽O.55ms，刺激间隔3.75ms，计算刺激信号到电位信号的传导时间，用刺激电极到记录电极之间的距离除以传导时间求出神经传导速度。再插上另一记录电极，量取两记录电极间距离，用刺激信号通过两电极的时间除电极间距离求出神经传导速度。以两种方式计算取得的均值作为该动物的神经传导速度。

2、坐骨神经山梨醇含量的测定：取大鼠坐骨神经，称重后置匀浆管中，加蒸馏水2.0ml制备匀浆，离心后取上清液，煮沸20min，加入0.2mol/L ZnSo₄ 0.2ml 0.2mol/L Ba(OH)₂ 0.2ml，离心沉淀，取上清液于清洁试管中快速浓缩干燥，加入吡啶0.1ml溶解残留物，再加入硅烷化试剂BSTFA 20μl，摇匀，加热15min，冷却，加入内储备液0.3ml。尔后取0.5ul进行气相色谱分析，用垂直切割峰面积定量。色谱条件：色谱柱：DB-624石英毛细管柱，30m×533um×3.00um；柱温：155℃；气化室温度：250℃；检测室温度：250℃；N₂流速：10ml/min，H₂流速：20ml/min；AIR流速：20ml/min；衰减指数：3；进样量：0.3μl。以山梨醇计算理论塔板数为393。山梨醇的检测限为45.23ng。回归方程式为：Y＝0.0077X-0.0527，r＝0.9994(n＝6)。浓度范围：0.0167--0.1667ug范围内线性良好，变异系数：1.75％。日内变异系数为1.19％，日间变异系数2.34％。回收率为100.8％。

实验结果：

a、本发明药物组合物对链脲霉素大鼠神经传导速度的影响：

用Pclab系统的刺激电极施加刺激后，记录装置的一通道记录到电位信号，二通道指示刺激信号，记录神经传导速度。在本发明药物组合物给药前后分别测定大鼠尾神经传导速度，结果表明，链脉霉素造型后尾神经传导速度比空白对照组显著减慢，即P＜0.01。并随造型时间的延长而加剧，在此基础上给本发明药物组合物，神经传导速度随给药时间的延长而改善，本发明药物组合物KL对大鼠的神经传导速度几乎达到正常对照组水平，提示本发明药物组合物对糖尿病引起的神经功能损害有显著的对抗作用。

b、本发明药物组合物对链脲霉素大鼠坐骨神经山梨醇含量的影响：

气相色谱法测定大鼠坐骨神经山梨醇含量的标准图谱和样品测定图谱，以此系统测定本发明药物组合物给药结束时大鼠坐骨神经山梨醇含量，结果表明，链脉霉素模型大鼠坐骨神经山梨醇含量明显升高，本发明药物组合物KL、PJ、WJ三个剂量组均可显著降低山梨醇水平，且呈一定的剂量反应关系。

实施例5：

本发明药物组合物对链脲霉素大鼠微循环功能的影响

实验方法

1、大鼠坐骨神经血流量的测定：大鼠用35mg/kg戊巴比妥钠麻醉，分离左腿坐骨神经，将神经嵌入塑料凹槽中，在国窝上1cm处用多普勒血流仪测定暴露的坐骨神经干内的血流量。连续一记录10次血流量的变化，取其平均值作为该大鼠的神经血流量数值。

2、大鼠肠系膜微循环测量：大鼠用35mg/kg戊巴比妥钠麻醉，拉出上段空肠，将空肠肠系膜第一个拌的中央对准显微镜的镜头，在显微镜下观察不同组大鼠的肠系膜循环，计数每平方毫米内可见的血管条数。

实验结果：

a、本发明药物组合物对链脲霉素大鼠坐骨神经血流量的影响：

用多谱勒血流仪测定暴露的坐骨神经干内的血流量，记录瞬时血流量的变化，取其平均值作为每只动物的血流量数据，再经统计处理计算神经血流量。测定结果表明：链脉霉素糖尿病模型大鼠坐骨神经血流量明显减少，本发明药物组合物KL、PJ、WJ三个剂量均可显著增加神经血流量。

b、本发明药物组合物对链脲霉素大鼠肠系膜微循环的影响：

在显微镜下观察不同组大鼠的肠系膜微循环，计数每平方毫米内可见的血管条数，反映毛细血管开放的频度。结果表明糖尿病模型大鼠血管开放的条数明显减少，本发明药物组合物KL、PJ、WJ三个剂量均可显著增加糖尿病大鼠血管开放的数量。

c、本发明药物组合物对链脲霉素模型大鼠坐骨神经血管基底膜的影响：

糖尿病大鼠坐骨神经HE染色片上可见身件轴索及神经内的微血管，模型组血管壁较厚，血管闭塞。本发明药物组合物PJ、WJ组还可见微血管壁增厚，KL组未出现血管闭塞现象。对照组的HE染色体上可见血管壁轻度增厚，也见闭塞现象。

为进一步观察坐骨神经内微血管的形态学变化，采用6胺银染色法选择性着色血管基底膜，可以清楚观察微血管基底膜的变化。选择直径在10微米大50微米之间的微血管，每组选S只动物的坐骨神经6胺银染色片，观察其中10根血管，在显微镜下协根血管按X-Y轴的交点取4个点，量取微血管基底膜的厚度，取其平均值作为该血管基底膜的厚度。结果可见正常对照组微血管基底膜处染成微微的黑色，其厚度在0.2-0.8微米之间，以0.8微米为界，0.8微米以下认为是正常基底膜厚度，0.8微米以上认为是基底膜增厚。模型对照组血管大面积染成黑色，血管基底膜比对照组明显增厚，正常血管只占5％，与正常组比p＜0.01，血管出现血栓，血管壁厚度不均，血管内膜边界不齐。本发明药物组合物PJ、WJ剂量组微血管基底膜轻度增厚，正常血管占93％，与模型组比p＜0.01，说明血管的状态有显著改善。本发明药物组合物KL组血管基底膜的厚度与正常对照接近，且未见血管闭塞现象。对照组组可见血管壁轻度增厚，基底膜厚度与模型组比较显著减少，正常血管占60％-70％，与模型组比p＜0.01。以上结果说明本发明药物组合物对链脲霉素模型大鼠坐骨神经血管基底膜的增厚有抑制作用。

实施例6：

本发明药物组合物对链脲霉素大鼠生化指标的影响

实验方法：

1、脑谷胱甘肽含量测定：将大鼠断头处死，取脑0.2g在冰浴中，以0.1mol/LpH8.0的磷酸盐缓冲液和10％三氯乙酸0.8ml制成10％匀浆，室温下4000rpm离心15分钟，分离上清液0.5ml，加入0.1mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液4.5ml稀释，加入0.4g/LDTNB(硫代二硝基苯甲酸)试液0.02ml，混匀，以不加脑匀浆的对照管调零，5分钟后用721分光光度计412nm波长处比色，吸光度值除以脑重得出每克脑组织所含的谷胱甘肽量。

2、脑过氧化脂质(MDA)含量测定：将大鼠断头处死，取脑以0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液制成10％匀浆，依次加入8.1％SDS(十二烷基硫酸钠)0.2ml，pH3.5的醋酸缓冲液1.5ml，1％TBA(硫代巴比妥酸)1.5ml，蒸馏水浴40分钟，冷却后3000rpm离心15分钟，取上清液，721分光光度计532nm波长处测定吸光度，将吸光度除以脑重得出每克脑组织所含的MDA量。

3、脑Na⁺-K⁺-ATP酶含量测定：

将大鼠断头处死，取脑以0.2mmol/LTris-HCL缓冲液(pH7.4)制成匀浆，直接用粗制匀浆加入酶反应管中，反应液中各化合物的浓度NaCl100mmol/L；MgC 122.5mmol/L；KCL10mmol/L；EDTA 1.0mmol/L；ATPNa 21.0mmol/L或哇巴因0.2mmol/L37℃水浴中反应30分钟，速加无机磷显色剂2.5ml(含0.02％孔雀绿，0.55％钼酸铵和0.1％吐温20)再加2.4％柠檬酸钠0.2ml，室温反应30分，721分光光度660nm波长处测定吸光度，计算无机磷含量，Na⁺-K⁺-ATP酶活性为不含哇因与含哇巴因两管之差值，除以脑重得出每克脑组织所含的Na⁺-K⁺-ATP酶活力单位。

实验结果：

a、本发明药物组合物对链脲霉素大鼠脑组谷胱甘肽含量的影响：

链脲霉素糖尿病大鼠末次给药后次日，取大鼠端脑测定各组大鼠谷胱甘肽(GSH)含量。结果表明糖尿病模型大鼠GSH含量明显减少，对照组可阻止GSH的降低，本发明药物组合物KL、PJ、WJ三个剂量均可显著增加糖尿病大鼠GSH含量。

b、本发明药物组合物对链脲霉素大鼠脑组织过氧化脂质含量的影响：

链脲霉素糖尿病大鼠末次给药后次日，取大鼠左侧皮测定过氧化脂质(MDA)含量，结果表明糖尿病模型大鼠MDA含量明显升高，本发明药物组合物KL、PJ、WJ三个剂量均可显著降低糖尿病大鼠MDA含量。

c、本发明药物组合物对链脲霉素大鼠脑组织Na⁺-K⁺-ATP酶活力的影响：

链脲霉素糖尿病大鼠末次给药后次日，取大鼠右侧皮质测定Na⁺-K⁺-ATP酶含量。结果表明糖尿病模型大鼠Na⁺-K⁺-ATP酶含量明显减少，本发明药物组合物KL、PJ、WJ三个剂量均可显著增加糖尿病大鼠Na⁺-K⁺-ATP酶活力。对照组亦可抑制Na⁺-K⁺-ATP酶的降低。

实施例7：

本发明药物组合物对链脲霉素模型大鼠脏器组织病理改变的影响

实验方法：

1、坐骨神经电镜标本的制备：取大鼠坐骨神经，用2.5％戊二醛固定，0.1M磷酸缓冲液(pH7.2-7.4)漂洗3次，每次5分钟，1％O_SO₄(四氧化锇)(PH7.4)固定20min，0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，乙醇一丙酮梯度脱水，Epon812树脂包埋，700A超薄切片，透射电镜下观察坐骨神经的病理变化。

2、坐骨神经组织学染色：取大鼠坐骨神经，用福尔马林固定，石蜡包埋，切片后分别作HE染色观察神经组织的一般病理改变：Weil法染色选择正常髓鞘、新镀银法染色选择变形髓鞘，反硝酸银法染色观察轴索；6胺银染色选择微血管基底膜，观察神经轴索、髓鞘和神经内微血管的病理变化。

3、眼和肾组织学染色：取大鼠左眼球及左侧肾脏，用福尔马林固定，石蜡包埋，切片后分别作HE染色观察组织的病理改变。

实验结果：

a、HE染色：肾脏HE染色片上可见肾小球和肾小管，对照组大鼠肾小球上皮细胞排列整齐规则，肾小管上皮细胞亦排列整齐，肾小管排列均匀。模型组大鼠肾小球萎缩，肾小囊内充满大量渗出物，将肾小球挤到一边，肾小球上皮细胞排列紊乱，肾小管上皮细胞肿胀，甚至将管腔封闭，肾小管排列紊乱。本发明药物组合物PJ、WJ剂量组HE染色片上见肾小球上皮细胞轻度肿胀，肾小囊没有渗出，肾小囊增大，肾小管上皮细胞肿胀程度比模型组轻。本发明药物组合物JN组的病理改变明显减轻，肾小球细胞微微肿胀，肾小囊没有渗出，肾小管上皮细胞肿胀的程度明显减轻。对照组组大鼠HF染色体上见肾小球萎缩，肾小囊内充满大量渗出物，肾小球上皮细胞排列紊乱，肾小管上皮细胞肿胀，肾小管排列紊乱。

眼球壁HE染色片上可见眼底的纤维膜，脉络膜和视网膜。对照组大鼠眼球壁各层细胞排列整齐规则。模型组大鼠眼底的纤维膜，脉络膜和视网膜各层细胞肿胀，细胞间充满大量渗出物，使脉络膜和视网膜的厚度明显增加。

本发明药物组合物PJ、WJ剂量组眼底的纤维膜，脉络膜和视网膜的厚度略微增加。本发明药物组合物KL剂量组眼底的纤维膜，脉络膜和视网膜细胞排列规则，几乎看不到细胞肿胀和渗出。对照组大鼠眼底的纤维膜，脉络膜和视网膜细胞排列规则，脉络膜和视网膜各层细胞轻度肿胀，细胞间充满渗出物，脉络膜和视网膜的厚度增加。

HE染色处上可见坐骨神经轴索及神经内的微血管，对照组大鼠坐骨神经横切面上神经束包膜、单根神经纤维排列清晰、整齐，神经纤维的轴索染成深棕色，轴索外面的髓鞘染成浅粉色，着色均匀清晰。神经内的血管亦清晰可见，未见病理性损害。模型组大鼠神经纤维排列紊乱，部分纤维轴索萎缩，甚至消失，部分轴索与髓鞘分离，神经纤维内出现空泡，部分肿胀变形。可见微血管壁较厚，血管闭塞。本发明药物组合物PJ、KL、WJ组个别神经纤维轻度肿胀变形，视野内仅见一个神经纤维髓鞘与纤维膜之间的水肿，多数神经纤维未见病理改变。对照组组大鼠坐骨神经HE染色片上可见神经纤维肿胀变形，髓鞘肿胀挤压神经轴索及间质，也可见少数髓鞘与神经纤维膜之间的水肿。HE染色的纵切面上观察坐骨神经标本，对照组大鼠神经纤维排列清晰、整齐、紧密，神经纤维的轴索染成深棕色，轴索外面的髓鞘染成浅粉色，轴索和髓鞘着色均匀清晰。雪旺细胞核清晰可见，未见明显病理性损害。链脲霉素模型大鼠坐骨神经纵切面上神经纤维排列紊乱，部分纤维轴索萎缩，甚至消失，部分轴索与髓鞘分离，神经纤维内出现空泡，部分纤维肿胀变形。髓鞘内可见棉絮样白班，满视野见不到正常组织。本发明药物组合物各剂量组大鼠神经纤维排列清晰、整齐、紧密，轴索和髓鞘着色均匀清晰。个别神经纤维轻度肿胀变形，髓鞘内棉絮样改变消失。对照组大鼠坐骨神经纵切片上可见神经纤维肿胀变形，神经纤维内出现空泡，部分纤维肿胀变形，弯曲。髓鞘肿胀挤压神经轴索及间质，也见少数髓鞘与神经纤维膜之间的水肿。

b、正常髓鞘染色：采用Weil法选择性染正常髓鞘，对照组大鼠坐骨神经横切面上神经轴索不着色，髓鞘染成蓝黑色，髓鞘成椭圆形蓝黑色、单根神经纤维排列清晰、整齐，髓鞘着色均匀清晰，神经内的血管亦清晰可见。

模型组大鼠神经纤维排列紊乱，髓鞘模糊不清，髓鞘肿胀，髓鞘内可见淡染区域。纵切面上对照组大鼠神经纤维排列清晰、整齐、紧密，神经纤维的髓鞘染成蓝黑色，髓鞘着色均匀清晰，髓鞘的节段和郎飞清晰可见，未见明显病理性损害。链脲霉素模型大鼠坐骨神经纵切面上神经纤维排列紊乱，神经纤维内出现空泡，散在多数不规则淡染区域。本发明药物组合物KL、PJ、WJ组Weil法染色片上神经髓鞘部位的淡染区域明显减少，髓鞘着色仍然不规则，郎飞清晰可见，神经髓鞘部位仍有少量淡染区域，髓鞘着色不十分规则；对照组的Weil法染色片上髓鞘着色不规则，神经髓鞘的淡染区域较少，但可见节段性和散在淡染区域。

c、变形髓鞘染色：采用变性髓鞘新镀银染色法将正常神经髓鞘染成浅棕色、选择性将变性髓鞘染成黑色，神经轴索不着色。对照组大鼠坐骨神经横切面上单根神经纤维排列清晰、整齐、髓鞘着色均匀清晰。模型组大鼠神经纤维排列紊乱，髓鞘模糊不清。纵切面上对照组大鼠神经纤维排列清晰、整齐、紧密，正常神经髓鞘染成浅棕色，链脲霉素模型大鼠坐骨神经纵切面上神经纤维排列紊乱，显示断续加重的黑色丝状务，髓鞘部位散在不规则淡染区域，髓鞘染色不均匀，提示发生髓鞘病变。本发明药物组合物KL、PJ、WJ组染色片上神经髓鞘部位有黑色丝状物，髓鞘部位散在不规则淡染区域，高剂量组神经髓鞘部位有少量淡染区域，髓鞘着色不十分均匀；对照组组髓鞘着色不规则，可见波浪形黑色丝状物。

d、轴索染色：采用反硝银法染色观察轴索，神经轴索染成棕色、髓革染成浅棕色。对照组大鼠神经纤维排列清晰、整齐，髓鞘着色均匀。模型红大鼠神经纤维排列紊乱，轴索和髓鞘均模糊不清，髓鞘肿胀，髓鞘内可见淡染区域，肿胀的神经纤维边界不清。纵切面上对照组大鼠神经纤维排列清晰整齐、紧密，正常神经髓鞘染成浅棕色，轴索走行平行，轴索着色均匀，散鞘密度均匀。模型组大鼠神经纤维的纵切面上可见多处大块渗出物将轴索和髓鞘挤得混乱，轴索粗细不均，着色深浅不等，髓鞘和神经纤维边界不清。

本发明药物组合物KL、PJ、WJ组可见到神经轴索粗细不均，轴索粗处比正常轴索粗2-3倍，提示轴索肿胀，轴索着色变深浅不等，髓鞘和神经纤维边界不清，髓鞘处有淡染区域。染色片上神经轴索粗细不均，可见轴索肿胀，轴索着色亦深泪不等，髓鞘和神经纤维边界不清，髓鞘处有淡染区域，高剂量组神经髓鞘翻位有多数肿胀，轴索着色深浅不等，渗出物将轴索和髓鞘挤得混乱，髓斡和神经纤维边界不清，髓鞘处有淡染区域，其病理改变的特征和模型组相似。

e、透射电镜观察：电镜下观察正常对照组大鼠的坐骨神经轴索内微丝排列规则，轴索周围没有渗出或髓鞘挤压迹象。髓鞘的密度均匀，髓鞘各析层排列紧密规则，髓鞘与轴索之间没有渗出。雪旺细胞形态正常。模型组大鼠的坐骨神经轴索变形，有的轴索甚模糊不清，被渗透出物挤压使直径变小，轴索内微丝排列紊乱，轴索周围有渗出或髓鞘挤压迹象。髓鞘的密度不均匀，板层剥离，各层髓鞘排列紊乱呈乱麻状，髓鞘剥脱，有的髓鞘部分剥脱，靛鞘与轴索之间有渗出。雪旺细胞胞质有液化溶解区域，呈现空泡变性。本发明药物组合物用药组大鼠的神经状态明显好于模型对照组，低剂量本发明药物组合物组轴索排列规则，髓鞘有部分剥脱，髓鞘的局部有板层分离观察。髓鞘板层间有渗出，髓鞘渗出物使髓鞘明显变粗，雪旺细胞亦可见空泡变性。

本发明药物组合物KL、PJ、WJ组多数髓鞘密度均匀，髓鞘板层排列规则，个别髓鞘有略微板层分离现象。雪旺细胞形态基本正常。对照组组轴索排列规则，髓鞘有部分剥脱，髓鞘的局部有板层分离现象。髓鞘板层间有渗出，对照组神经状态显著强于模型对照组。

Claims (9)

1、一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用，其特征在于由下列重量份的原料药制成：

人参42-160、黄精50-200、苍术30-100、苦参20-60、茯苓35-100、麦冬50-200、炙何首乌35-100、地黄50-120、山茱萸50-200、黄连20-60、佩兰30-60、荔枝核75-150、淫羊藿30-60、知母30-100、丹参35-120、葛根50-200、地骨皮30-100。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于由下列重量份的原料药制成：

人参42、黄精200、苍术30、苦参60、茯苓35、麦冬200、制何首乌35、地黄120、山茱萸50、黄连60、佩兰30、荔枝核150、淫羊藿30、知母100、丹参35、葛根200、地骨皮30。

3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于由下列重量份的原料药制成：

人参102、黄精136、苍术68、苦参56、茯苓83、麦冬136、制何首乌83、地黄102、山茱萸136、黄连56、佩兰56、荔枝核136、淫羊藿56、知母68、丹参89、葛根136、地骨皮83。

4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于由下列重量份的原料药制成：

人参160、黄精50、苍术100、苦参20、茯苓100、麦冬50、制何首乌100、地黄50、山茱萸200、黄连20、佩兰60、荔枝核75、淫羊藿60、知母30、丹参120、葛根50、地骨皮100。

5、根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的活性成分由以下步骤制成：

a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术加5-9倍量水提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；

c、山茱萸用5-9倍量50-90％乙醇做溶剂，浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90％乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80％，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；

步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏与步骤b所得挥发油共同构成该中药组合物的活性成分。

6、根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述药物剂型为胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、软胶囊、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。

7、根据权利要求6所述药物颗粒剂的制备方法，其特征在于是由以下步骤制成：

a、按照原料药重量比例称取中药材，净选、碎断；

b、佩兰、苍术合并，加5-9倍量水，水蒸汽法提取挥发油，提取3-6小时，挥发油另器收集，水溶液过滤后备用；

c、山茱萸用5-9倍量50-90％乙醇做溶剂，浸渍12-48小时后，进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，并浓缩成60℃测定相对密度为1.30-1.35的稠膏，烘干，备用；

d、人参、麦冬、淫羊藿、知母、葛根，加6-10倍量50-90％乙醇，回流提取1-3次，每次1-3小时，提取液过滤，回收乙醇，浓缩成稠膏，烘干，备用；

e、黄精、苦参、生地、制何首乌、茯苓、黄连、丹参、荔枝核、地骨皮，加7-11倍量水，煎煮1-2次，每次1-3小时，提取液过滤，与步骤b中佩兰、苍术提油后的水溶液合并，浓缩成清膏，加乙醇调节醇浓度为50-80％，冷藏放置，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干，备用；

f、将步骤c所得山茱萸干膏、步骤d所得醇提干膏、步骤e所得水提醇沉干膏混合均匀，粉碎，加入加入适当药学上可接受的辅料制粒；

g、步骤b所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤f所得的颗粒，混匀，密闭，分装，即得。

8、根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于该中药组合物在制备降低山梨醇含量、改善神经传导速度、增加神经学流量、增加血管开放的数量、抑制血管基底膜增厚、逆转谷胱甘肽降低、逆转过氧化脂质升高、升高Na′-K′-ATP酶活力药物中的应用。

9、根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于该中药组合物在制备对抗糖尿病引起的神经功能损害药物中的应用。