CN102000264B - 治疗更年期综合症的组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗妇女更年期综合症的药物组合物及制备方法和质量控制方法。本发明的药物组合物原料药组成为：女贞子、覆盆子、菟丝子、何首乌、地骨皮、南沙参、麦冬、黄芩、地黄、白芍、赤勺、当归、珍珠母、白薇组成，制备方法为：选取上述原料药，粉碎成细粉，过筛，混匀；每100g粉末加炼蜜42g及水适量，泛丸，低温干燥，制成。本发明采用高效液相色谱法对芍药苷进行含量测定。本发明药物组合物用于治疗妇女更年期综合症具备很好的疗效。

Description

治疗更年期综合症的组合物的检测方法

本发明为分案申请，原案申请号为200710098771.9，原案申请日为2007年4月26日，原案名称为治疗更年期综合症的组合物及其制备方法和质量控制方法。 

技术领域

本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法，特别是涉及一种治疗妇女更年期综合症的中药组合物及其制备方法和质量控制方法。 

背景技术

妇女更年期综合症是指妇女在绝经前后，由于卵巢功能衰退，导致内分泌失调，植物神经功能紊乱所产生的一系列的症候群，如潮热，潮红，出汗，焦躁不安，抑郁失眠，有时情绪异常，喜怒无常，无端哭笑，有似精神病者。中医认为本病的发生，是由于妇女年届七七，肾气渐衰，冲任亏虚，精血不足，或因情志抑郁，营阴暗耗，致使肾之阴阳失调，进而影响心、肝、脾脏诸功能紊乱，从而出现更年期综合症的种种征象。 

西医在治疗此类疾病时采用补充雌激素，由于更年期综合症是因为妇女卵巢功宫减退或丧失引起的，所以，这时如果补充雌激素代替人体缺乏的雌激素发挥作用，它可以减缓或是完全治愈更年期妇女因雌激素缺乏而引发的一系列症状。通过给妇女补充性激素可以“恢复”卵巢的功能，从而缓解更年期的各种症状。但是，有些妇女因为种种原因，如子宫肌瘤等不能使用雌激素替代疗法，子宫肌瘤患者使用雌激素有可能变成癌症。其它缓解更年期症状的西药，也都会对患者身体产生副作用，不可长期使用。 

中医治疗此类疾病总的来说是以肾阴、肾阳平衡失调为纲，辨证要点是阴阳属性要分清。在选择药物方面，以具有滋阴补肾、益气养血、活血调经、健脾去湿作用的药物为主，对更年期的女性极为有益，能促进更年期女性的内分泌调节，帮助身体迅速建立新的平衡，恢复正常的生理状态。如滋阴补 肾，可改善更年期女性出现的怀疑不稳定的情况；活血调经、益气养血，对更年斯女性的易出汗、潮热、失眠多梦、头晕头痛等症具有针对性的治疗作用。中药在治疗妇女更年期综合症方面，不仅疗效比较好，而且避免了使用雌激素所带来的不良后果。 

发明内容

本发明目的在于提供一种治疗妇女更年期综合症的中药组合物； 

本发明目的还在于提供一种治疗妇女更年期综合症的中药组合物制备方法； 

本发明目的还在于提供一种治疗妇女更年期综合症的中药组合物的质量控制方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的： 

本发明所述的治疗妇女更年期综合症的中药组合物是由如下重量比的原料药制成的： 

女贞子(酒炙)10-60重量份        覆盆子          10-50重量份 

菟丝子      10-50重量份        何首乌(黑豆酒炙)10-50重量份 

地骨皮      10-60重量份        南沙参          10-60重量份 

麦冬        10-50重量份        黄芩            10-60重量份 

地黄        10-60重量份        白芍            20-100重量份 

赤勺        10-60重量份        当归            10-50重量份 

珍珠母      20-100重量份       白薇            10-60重量份； 

上述原料优选配比为： 

女贞子(酒炙)40重量份        覆盆子          30重量份 

菟丝子      30重量份        何首乌(黑豆酒炙)30重量份 

地骨皮      30重量份        南沙参          30重量份 

麦冬        20重量份        黄芩            30重量份 

地黄        30重量份        白芍            60重量份 

赤勺        30重量份        当归            30重量份 

珍珠母      60重量份        白薇            40重量份； 

本发明所述的治疗妇女更年期综合症的中药组合物可由如下重量比的原料药制成的： 

女贞子(酒炙)10-60重量份        覆盆子          10-50重量份 

菟丝子      10-50重量份        何首乌(黑豆酒炙)10-50重量份 

地骨皮      10-60重量份        南沙参          10-60重量份 

麦冬        10-50重量份        黄芩            10-60重量份 

地黄        10-60重量份        白芍            20-100重量份 

赤勺        10-60重量份        当归            10-50重量份 

珍珠母      20-100重量份       白薇            10-60重量份 

知母        10-60重量份        龟甲            10-60重量份 

鸡血藤      20-100重量份       枸杞子          10-50重量份； 

上述原料优选配比为： 

女贞子(酒炙)40重量份        覆盆子          30重量份 

菟丝子      30重量份        何首乌(黑豆酒炙)30重量份 

地骨皮      30重量份        南沙参          30重量份 

麦冬        20重量份        黄芩            30重量份 

地黄        30重量份        白芍            60重量份 

赤勺        30重量份        当归            30重量份 

珍珠母      60重量份        白薇            40重量份 

知母        30重量份        龟甲            15重量份 

鸡血藤      50重量份        枸杞子          20重量； 

本发明所述的治疗妇女更年期综合症的中药组合物可由如下重量比的原料药制成的： 

女贞子(酒炙)10-60重量份        覆盆子          10-50重量份 

菟丝子      10-50重量份        何首乌(黑豆酒炙)10-50重量份 

地骨皮      10-60重量份        南沙参          10-60重量份 

麦冬        10-50重量份        黄芩            10-60重量份 

地黄        10-60重量份        白芍            20-100重量份 

赤勺        10-60重量份        当归            10-50重量份 

珍珠母        20-100重量份        白薇    10-60重量份 

知母          10-60重量份         龟甲    10-50重量份 

鸡血藤        20-100重量份        枸杞子  10-50重量份 

石斛          10-60重量份         菊花    10-60重量份 

墨旱莲        20-100重量份        桑叶    10-50重量份 

酸枣仁(炒)    10重量份； 

本发明所述的组合物可按常规工艺加入辅料制成片剂、胶囊、口服液、滴丸、喷雾剂、颗粒剂等临床可接受的剂型；所述辅料包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、基质等。 

本发明所述的中药组合物制剂的制备方法为： 

选取所述原料药，部分或全部粉碎成细粉，其余药味经水提取，提取液浓缩，干燥，粉碎成细粉，再与上述直接粉碎的药味细粉混合均匀，过筛，加入适量辅料，制成临床可以应用的制剂。 

本发明所述的中药组合物丸剂制剂的制备方法可以为： 

制法：选取所述原料药，粉碎成细粉，过70-90目筛，混匀；90-110重量份蜂蜜在116-118℃时，炼制密度为1.37，即得炼蜜；每100重量份粉末加炼蜜35-55重量份及5-20重量份的水，泛丸，60-80℃干燥，即得。 

本发明药物组合物质量控制方法包括如下鉴别方法和/或含量测定：鉴别： 

A.取相当所述组合物原料药11-13g的制剂，加乙醚20ml，超声处理10-25分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取当归对照药材1g，加乙醚10ml，超声处10-25分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-12∶1-2石油醚(60～90℃)-醋酸乙脂为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点； 

B.取相当所述组合物原料药3.5-4.5g的制剂，加乙醚35ml，超声提取20-40分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液；再取地黄对照药材1.0g，加20ml乙醚，超声提取20-40分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚 溶解制成每1ml含1.0g的对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7-11∶1-3∶1-2氯仿-甲醇-氨水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 

C.取相当所述组合物原料药1.5-2.5g的制剂，研细，加乙醚20ml，超声处理15-25分钟，滤过，弃去乙醚，残渣置水浴上挥尽乙醚，加醋酸乙脂30ml，加热回流0.5-2小时，取出，放冷，滤过，药渣挥干醋酸乙脂，加甲醇20ml，超声处理10-25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加浓氨试液3滴，滤过，滤液加盐酸3滴，离心，弃去上清液，沉淀加甲醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以4-7∶2-5∶1-2∶1-2醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 

含量测定： 

照高效液相色谱法测定：色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；8-12∶85-95乙腈-水为流动相；检测波长为230nm；对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品5mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备：取相当所述组合物原料药3-4.5g的制剂，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理25-40分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 

本发明药物组合物质量控制方法优选如下鉴别方法和/或含量测定： 

鉴别： 

A.取相当所述组合物原料药11-13g的制剂，加乙醚20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取当归对照药材1g，加乙醚10ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，制成对照药材溶液；照薄层色谱 法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以9∶1石油醚(60～90℃)-醋酸乙脂为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点； 

B.取相当所述组合物原料药3.5-4.5g的制剂，加乙醚35ml，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液；再取地黄对照药材1.0g，加20ml乙醚，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚溶解制成每1ml含1.0g的对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8∶2∶1氯仿-甲醇-氨水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 

C.取相当所述组合物原料药1.5-2.5g的制剂，研细，加乙醚20ml，超声处理20分钟，滤过，弃去乙醚，残渣置水浴上挥尽乙醚，加醋酸乙脂30ml，加热回流1小时，取出，放冷，滤过，药渣挥干醋酸乙脂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加浓氨试液3滴，滤过，滤液加盐酸3滴，离心，弃去上清液，沉淀加甲醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5∶3∶1∶1醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 

含量测定： 

照高效液相色谱法测定：色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；10∶90乙腈-水为流动相；检测波长为230nm；对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品5mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备：取相当所述组合物原料药3-4.5g的制剂，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，功率250W，频率40KHz超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇 匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 

本发明组合物具有很好的药效，相比现有制剂更年舒片表现出很好的药效。在临床上用于妇女更年期综合症，肝肾阴虚引起的月经紊乱，潮热多汗，失眠健忘，心烦易怒，头晕耳鸣，咽干口渴，四肢酸楚，关节疼痛等症疗效明确。 

本发明所提供的中药组合物的质量控制方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性很好，而且方法经济适用、结果快速，并且对不同的薄层板都能应用。含量测定方法中通过对供试品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得含量测定方法可以很有效的对产品进行质量控制，并且用该方法测定的产品要相比其他方法测定的产品在药理效果上表现的更为稳定。 

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。 

实验例1药效试验 

实验药物：药物1(按实施例1方法制备成丸剂) 

女贞子(酒炙)    40g    覆盆子    30g    菟丝子    30g 

何首乌(黑豆酒炙)30g    地骨皮    30g    南沙参    30g 

麦冬            20g    黄芩      30g    地黄      30g 

白芍            60g    赤勺      30g    当归      30g 

珍珠母          60g    白薇      40g； 

药物2(按实施例2方法制备成丸剂) 

女贞子(酒炙)    40g    覆盆子    30g    菟丝子    30g   

何首乌(黑豆酒炙)30g    地骨皮    30g    南沙参    30g 

麦冬            20g    黄芩      30g    地黄      30g 

白芍            60g    赤勺      30g    当归      30g 

珍珠母          60g    白薇      40g    知母      30g 

龟甲            15g    鸡血藤    50g    枸杞子    20g； 

药物3(按实施例6方法制备成丸剂) 

女贞子(酒炙)30g    覆盆子    20g    菟丝子    20g 

枸杞子      20g    何首乌(黑豆酒炙)           20g 

龟甲        15g    地骨皮    30g    南沙参    30g 

麦冬        20g    酸枣仁(炒)10g    黄芩      30g 

地黄        30g    白芍      60g    赤勺      30g 

当归        20g    鸡血藤    60g    珍珠母    60g 

石斛        30g    菊花      30g    墨旱莲    40g 

桑叶        20g    白薇      30g    知母      30g 

阳性对照药物市售更年舒片 

(一)滋补肝肾作用： 

取Wistar大白鼠随机分成正常组、肝肾阴虚组、肝肾阴虚本发明药物治疗1、2、3组及阳性对照组共6组。正常组10只，肝肾阴虚组16只，本发明药物组和阳性对照组，每组15只。肝肾阴虚组、本发明药物组和阳性对照组于实验第1天和以后每3天皮下注射四氯化碳花生油(50％)0.3ml/100g体重，且肝肾阴虚组于实验第1天每天灌服肝肾阴虚等于造型药物(利血平0.015mg，甲状腺素1mg/100g体重)，正常组给等量生理盐水灌胃，21天结束，本发明药物组和阳性药物对照组实验第二天灌服本发明药物及阳性对照药物0.5g/100g体重，共20天。六组均进行生态观察，21天后结束，剖腹，心脏取血，并取主要内脏做病理组织学检查。 

1、血清总胆固醇、血清甘油三酯、血清高密度脂蛋白胆固醇酯分别采用国产酶快速测定法、酶法、磷钨酸钠镁微量法。结果如下： 

与肝肾阴虚组比较△△P＜0.01，△P＜0.05；与阳性药物对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05 

结果表明：本发明药物和阳性对照组药物对肝肾阴虚大鼠的血清中总胆固醇、甘油酸酯含量有显著降低作用，对高密度脂蛋白胆固醇含量有提高。本发明药物与阳性对照组药物比较对降低总胆固醇和甘油酸脂含量及升高高密度脂蛋白胆固醇含量有显著差异，效果更好。而本发明药物之间，药物2的作用优于药物1，药物1的作用优于药物3，但各组无显著性差异。 

2、血清过氧化脂质采用法入木氏硫代巴比妥酸测定法。结果见下表： 

与肝肾阴虚组比较△△P＜0.01；与阳性药物对照组比较*P＜0.05结果表明：本发明药物组和阳性药物对照组与肝肾阴虚组比较血清过氧化酯质含量有极显著性降低，本发明药物组与阳性对照组比较有显著性影响，本发明组药物之间没有显著性差异，但药物2的作用优于药物1，药物1的作用优于药物3。 

3、肝胆固醇含量采用剖腹取2块肝脏，磨成匀浆后，用氯仿一甲醇(1∶1)混合抽取，酶法测定胆固醇。结果见下表： 

组别	例数	肝脏固醇含量(mg/dl)
			正常组	10	86.48±30.40

肝肾阴虚组	16	162.0±31.64
			药物1	15	98.7±24.83△△*
药物2	15	93.6±24.83△△*
			药物3	15	105.04±24.83△
阳性对照药物	15	124.04±24.83△

与肝肾阴虚组比较△△P＜0.01，△P＜0.05；与阳性药物对照组比较*P＜0.05 

结果表明：本发明药物组和阳性药物对照组与肝肾阴虚组比较肝胆固醇含量有显著性降低，本发明药物组与阳性对照组比较有显著性影响，本发明组药物之间没有显著性差异，但药物2的作用优于药物1，药物1的作用优于药物3。 

(二)镇静安神作用： 

取昆明种小鼠50只，体重18-22g，雌雄兼用，随机分为5组，每组10只。生理盐水对照组(阴性对照组)：给予生理盐水0.2ml/10g灌胃，每日1次，共3天。本发明药物组及阳性药物对照组(药物1、药物2、药物3、阳性对照药物)：取制备好的本发明药物药品溶液和阳性对照药品溶液0.2ml/10g灌胃，每日1次，共3天。各组最末次灌胃后1h，将小鼠放入自发活动仪中适应3分钟后，开始测定自发活动次数及睡眠超过2小时的睡眠时间。结果见下表： 

与阴性对照组比较△△P＜0.01，△P＜0.05；与阳性药物对照组比较*P＜0.05 

结果表明：本发明药物组和阳性药物对照组与阴性对照组比较镇静安神 作用有显著性提高，本发明药物组与阳性对照组比较有显著性差异，本发明组药物之间镇静安神作用为药物2的作用优于药物1，药物1的作用优于药物3。 

(三)养血作用： 

取体重18～21g小鼠90只，雌性，随机均匀分为9组，其中8组造失血虚模型。9组动物于实验前尾部取血，先测Hb、RBC水平，造模型8组分别尾部放血0.5ml，使动物失血，于失血后24h再尾部取血测Hb、RBC观察造成血虚的程度，然后分别灌服大、小剂量的本发明药物制剂5g/kg、1.7g/kg，分别相当于临床用量的30倍、10倍)，阳性对照药物(2.5g/kg，相当于成人剂量的30倍)及生理盐水(20ml/kg)，空白对照组灌服同体积的生理盐水，每天给药1次，连续给药7天，于最后1次给药2h，再尾部取血测Hb、RBC，结果见下表： 

*表示与模型组比P＜0.05，**表示与模型组比P＜0.01，△表示与阳性对照药物比P＜0.05 

结果表明：本发明药物和阳性对照药物均可显著提高Hb、RBC水平。本发明药物大、小剂量均有显著效果，本发明药物与阳性对照药物比较效果有显著性提高，说明发明药物具有良好的养血作用，本发明药物间没有显著性差异，但其中药物2的作用优于药物1，药物1的作用优于药物3。 

(四)通络作用： 

取家兔36只，随机分为6组，右耳脱毛，第一组为空白对照组；第二组仅在每只大鼠右后肢给予蜡热疗；第三、四、五组分别给予药物1、药物2、药物3，加蜡热疗；第六组给予阳性对照药物，加蜡热疗。每天1次，连续7天。7天后将右耳置于-10℃乙醇中冷冻2分钟，在解剖镜下测量定点细动脉直径，计算冻前冻后定点细动脉直径改变。结果见下表： 

组别	肿胀百分率
		空白对照组	46.7±10.3
蜡热疗组	33.1±16.0
		药物1	16.8±8.2*
药物2	15.2±10.1*
		药物3	19.2±6.4*
阳性对照药物+蜡热疗组	23.2±5.8

注：*与蜡热疗组比P＜0.05 

结果表明：本发明药物加蜡热疗组与蜡热疗组比较预防冷冻所致的细动脉收缩有显著性提高，本发明药物的通络作用高于阳性对照药物。 

实验例2鉴别筛选实验 

1、当归的薄层鉴别 

①供试品溶液提取时间的考察 

取本发明药物丸剂15g，研碎，加乙醚20ml，超声处理，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取当归对照药材1g，加乙醚10ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙脂(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。比较提取不同时间供试品溶液与对照品溶液在薄层板上的显色效果，结果见下表： 

从上表可以看出，当提取时间为15min以上时供试品溶液和对照品溶液在薄层板上显色清晰，已经达到了实验要求。所以从节省实验时间考虑，选择超声提取15min。 

②展开剂的选择 

按照①中所述供试品溶液及对照品溶液的制备方法，制备供试品溶液和对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以不同展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。比较应用不同展开剂展开，供试品溶液和对照品溶液在薄层板上的展开效果，结果见下表： 

从以上实验结果可以看出，展开剂为石油醚(60～90℃)-醋酸乙脂(9∶1)时供试品溶液和对照品溶液在薄层板上展开效果好，没有出现分离不清楚，展开效果不好，有干扰等，符合实验要求。 

③阴性对照试验 

取缺川芎的阴性样品，照上述鉴别方法中供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，展开后在对照药材溶液对应位置上没有出现相应斑点，说明所选取的鉴别实验专属性强。 

2、地黄的薄层鉴别 

①供试品溶液提取时间的考查 

取本发明药物丸剂5g，研细，加乙醚35ml，超声提取，滤过，滤液挥干，加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液。再取地黄对照药材1.0g，同法制成每1ml含1.0g的对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-氨水(8∶2∶1)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。比较提取不同时间供试品溶液与对照品溶液在薄层板上的显色效果，结果见下表： 

从上表可以看出，当提取时间为35min以上时供试品溶液和对照品溶液在薄层板上显色清晰，已经达到了实验要求。 

②展开剂的选择 

吸取上述方法制备的供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水和氯仿-甲醇-氨水不同配比的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。比较提取不同时间供试品溶液与对照品溶液在薄层板上的展开效果，结果见下表： 

从上表可以看出，以氯仿-甲醇-氨水(8∶2∶1)为展开剂，供试品溶液和对照品溶液在薄层板上各斑点展开剂效果好，没有出现脱尾、分离效果差、干扰等。 

③阴性对照试验 

取缺地黄的阴性样品，照上述鉴别方法中供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，展开后在对照药材溶液对应位置上没有出现相应斑点，说明所选取的鉴别实验专属性强。 

3、黄芩的薄层鉴别 

①供试品溶液的制备方法 

方法一、取本发明药物丸剂2g，研细，加乙醚20ml，超声处理20分钟，滤过，弃去乙醚，残渣置水浴上挥尽乙醚，加醋酸乙脂30ml，加热回流1小时，取出，放冷，滤过，药渣挥干醋酸乙脂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加浓氨试液3滴，滤过，滤液加盐酸3滴，离心，弃去上清夜，沉淀加甲醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品。 

方法二、取本发明药物丸剂2g，研细，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇10ml使溶解，作为供试品溶液。 

另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液。比较不同提取方法供试品溶夜的展开及显色效果，结果见下表： 

从上表可以看出，采用方法一制备供试品溶液，展开后，不仅消除了其它杂质的干扰，而且主斑点显色更清析，实验准确度更高。 

在方法1中比较了不同步骤中加乙醚超声提取、加醋酸乙酯回流提取及加甲醇超声提取的时间，在方法2中比较了加甲醇超声提取的时间，结果表明以上实验所选取的实验时间合理、科学，符合实验要求。 

③展开剂配比的选择 

吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水的不同配比的展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液。比较不同配比展开剂下，供试品溶液和对照品溶液在薄层板上的展开效果，结果见下表： 

从上表可以看出，展开剂醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水的配比为5∶3∶1∶1时，供试品溶液和对照品溶液主斑点展开效果均好，供试品没有出现主斑点分离不清析，有干扰等现象，符合实验要求。 

③阴性对照试验 

取缺黄芩的阴性样品，照上述鉴别方法中供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，展开后在对照药材溶液对应位置上没有出现相应斑点，说明所选取的鉴别实验专属性强。 

以上是本发明药物中当归、地黄、黄芩的部分薄层鉴别筛选试验，经验证可以从定性检测方面有效控制本发明药物组合物制剂的质量，使本发明药物组合物制剂的质量得到提高。 

实验例3含量测定筛选实验 

采用高效液相色普法测定本发明药物中的芍药苷的含量，以完善本发明的质量检测方法，部分试验结果见下： 

①供试品溶液的制备 

取本发明药物丸剂4g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，功率250W、频率40KHz超声处理，取出，放冷，再称定重量，用 甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。比较了不同超声时间，供试品溶液中芍药苷的含量，结果如下： 

超声时间	10分钟	20分钟	30分钟	50分钟
					芍药苷含量(mg/g)	1.2307	1.9232	2.5187	2.5517

从上表可以看出，超声提取30分钟已经可以将本发明药物中的芍药苷提取完全，所以供试品溶液的制备选择超声提取30分钟即可。 

②流动相的选择 

取供试品溶夜，分别以乙腈-水和甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液不同配比的流动相，比较供试品溶液色谱图中各峰的分离效果，结果见下表： 

从上表可以看出，流动相为乙腈-水(10∶90)时供试品色谱图中各峰的分离效果好，主峰没有出现干扰。 

③含量检测的方法学考察 

对本发明药物所采用的含量检测方法，从线性关系、稳定性、精密度、重现性、回收率等方面进行了相关方法学考察，具体方法及结果如下：检测仪器(室温检测)：Agilent 1100型高效液相色谱仪色谱柱：(Zorbax C184.6×150mm，5μm)厂家：Agilent Techologies安捷伦科技有限公司(中国)流动相：乙腈-水(10∶90)检测波长：230nm流速：1.0ml/min    柱温：室温对照品来源：芍药苷购于中国药品生物制品检定所批号：0736-9913 测定方法：分别精密吸取阴性对照液、对照品液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 

(1)稳定性试验对照品溶液，分别于配制后0、2、4、6、12、24小时，依法测定，结果表明，其在24小时内基本稳定，结果见下表： 

(2)线性关系考察取对照品溶液(48.5μg/ml)摇匀，分别精密吸取2、4、6、8、10、12μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积，结果见下表，并绘制标准曲线，表明芍药苷在0.097μg-0.582μg间呈线性关系，其回归方程为： 

Area＝1356.2714*Amt+7.7626(r＝0.9998) 

(3)精密度试验精密吸取供试品溶液10μl，重复进样5次，求得相对标准偏差＜2％，结果见下表： 

(4)重现性试验按正文方法，取同一本发明药物丸剂五份，对每份进行测定，求得相对标准偏差＜2％，结果见下表： 

(5)回收率试验精密称取已知含量的同一本发明药物丸剂2.5g再分别精密称取芍药苷对照品50mg，配置成0.5mg/ml的溶液，精密量取10ml，按上述供试品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算其回收率，测定结果见下表： 

(6)空白试验 

按照本发明药物处方中药味的比例，按口服液制剂工艺，制备不含白芍、赤芍的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备并检测，结果阴性样品溶液在于芍药苷对照品相同保留时间处没有色谱峰，所以阴性无干扰。 

由以上方法学考查结果可以看出，本发明药物所采用的含量测定方法 其线性关系、稳定性、精密度、重现性等均良好，能够有效控制本发明药物质量。 

下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果 

具体实施方式

实施例1：丸剂 

女贞子(酒炙)    40g    覆盆子    30g    菟丝子    30g 

何首乌(黑豆酒炙)30g    地骨皮    30g    南沙参    30g 

麦冬            20g    黄芩      30g    地黄      30g 

白芍            60g    赤勺      30g    当归      30g 

珍珠母          60g    白薇      40g； 

以上十四味，粉碎成细粉，过筛(是指全部能通过80目筛)，混匀，得药物粉末。蜂蜜在116-118℃时，炼制密度为1.37，即得炼蜜；每100g粉末加炼蜜42g及水8g，泛丸，低温(60-80℃)干燥，即得。 

实施例2：丸剂 

女贞子(酒炙)    40g    覆盆子    30g    菟丝子    30g 

何首乌(黑豆酒炙)30g    地骨皮    30g    南沙参    30g 

麦冬            20g    地黄      30g    黄芩      30g 

白芍            60g    赤勺      30g    当归      30g 

珍珠母          60g    白薇      40g    知母      30g 

龟甲            15g    鸡血藤    50g    枸杞子    20g； 

以上十八味，粉碎成细粉，过筛(是指全部能通过80目筛)，混匀，得药物粉末。蜂蜜在116-118℃时，炼制密度为1.37，即得炼蜜；每100g粉末加炼蜜42g及水8.5g，泛丸，低温(60-80℃)干燥，即得。 

实施例3：泡腾剂 

女贞子(酒炙)50g    覆盆子    10g    菟丝子    50g 

枸杞子     10g     何首乌(黑豆酒炙)           50g 

龟甲       10g    地骨皮     50g    南沙参    20g 

麦冬       40g    酸枣仁(炒) 10g    黄芩      60g 

地黄    20g    白芍    80g    赤勺    20g 

当归    50g    鸡血藤  50g    珍珠母  80g 

石斛    20g    菊花    60g    墨旱莲  30g 

桑叶    20g    白薇    50g    知母    30g 

以上二十三味，除龟甲、酸枣仁、珍珠母外，其余药味加8倍量水煎煮2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.30(50～55℃)，真空干燥，粉碎成细粉，备用。将龟甲、酸枣仁、珍珠母粉碎至100目以上，过筛，与上述细粉、适量低取代羟丙基纤维素、黄原胶混合均匀，分成两等份。一份中加入16.1％碳酸氢钠混匀，制成碱性颗粒，干燥；另一份加入19.3％柠檬酸及0.05％甜味素混匀，制成酸性颗粒，干燥，将两种干颗粒混匀，喷入香味剂，密封一定时间，即可。 

实施例4：滴丸 

女贞子(酒炙)    60g    覆盆子    20g    菟丝子    50g 

何首乌(黑豆酒炙)20g    地骨皮    60g    南沙参    20g 

麦冬            10g    地黄      20g    黄芩      50g 

白芍            90g    赤勺      20g    当归      50g 

珍珠母          50g    白薇      70g    知母      20g 

龟甲            55g    鸡血藤    30g    枸杞子    50g； 

以上十八味，粉碎成细粉，过筛，混匀，细粉与适量熔融的聚乙二醇4000混合均匀，70℃保温，经过一定大小管径的滴头，等速滴入液体石蜡冷却液中，将凝固形成的丸粒取出，洗去冷却液，干燥，即成。 

实施例5：软胶囊 

女贞子(酒炙)    60g    覆盆子    20g    菟丝子    60g 

何首乌(黑豆酒炙)25g    地骨皮    60g    南沙参    20g 

麦冬            60g    黄芩      20g    地黄      30g 

白芍            80g    赤勺      20g    当归      30g 

珍珠母          90g    白薇      40g； 

以上十四味，除龟甲、酸枣仁、珍珠母外，其余药味加8倍量水煎煮2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩，干燥，粉碎成细粉(100目以上)， 备用。将龟甲、酸枣仁、珍珠母粉碎至100目以上，过筛，与上述细粉混合均匀，在与适量植物油及蜂蜡加热混和均匀，压制成软胶囊。软胶囊囊壳由明胶、甘油、水按一定比例制备而成。 

实施例6： 

女贞子(酒炙)30g    覆盆子    20g    菟丝子    20g 

枸杞子      20g    何首乌(黑豆酒炙)           20g 

龟甲        15g    地骨皮    30g    南沙参    30g 

麦冬        20g    酸枣仁(炒)10g    黄芩      30g 

地黄        30g    白芍      60g    赤勺      30g 

当归        20g    鸡血藤    60g    珍珠母    60g 

石斛        30g    菊花      30g    墨旱莲    40g 

桑叶        20g    白薇      30g    知母      30g 

制法：以上二十三味，粉碎成细粉，过筛(是指全部能通过80目筛)，混匀。蜂蜜在116-118℃时，炼制密度为1.37，即得炼蜜；每100g粉末加炼蜜42g及水8.4g，泛丸，(60-80℃)干燥，制成8700粒； 

鉴别： 

(1)取本品，置显微镜下观察：薄壁组织灰棕色至黑棕色，细胞多皱缩，内含棕色核状物；非腺毛多为3细胞，中部细胞较长，有明显疣状突起，顶端细胞急尖而短；纤维表面类圆形细胞中，含细小圆形硅质块，排列成行；具缘纹孔导管大；纤维束周围细胞含草酸钙方晶形成晶纤维；种皮栅状细胞2列，内列较外列长；种皮石细胞淡黄色，壁波状弯曲，胞腔含棕色物；内种皮细胞棕黄色，表面观长方形或类方形，垂周壁连珠状增厚；纤维淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细；纤维常与射线细胞相连接；薄壁细胞含草酸钙砂晶；非腺毛单细胞，壁厚，木化，脱落后残迹似石细胞状； 

(2)取本品1g，研碎，加稀盐酸20ml，即产生大量气泡，滤过，滤液显钙盐的各种鉴别反应； 

(3)取本品15g，研碎，加乙醚20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取当归对照药材1g，加乙醚10ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验， 吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙脂(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点； 

(4)取本品5g，研细，加乙醚35ml，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液；再取地黄对照药材1.0g，同法制成每1ml含1.0g的对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-氨水(8∶2∶1)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 

(5)取本品2g，研细，加乙醚20ml，超声处理20分钟，滤过，弃去乙醚，残渣置水浴上挥尽乙醚，加醋酸乙脂30ml，加热回流1小时，取出，放冷，滤过，药渣挥干醋酸乙脂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加浓氨试液3滴，滤过，滤液加盐酸3滴，离心，弃去上清液，沉淀加甲醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 

含量测定： 

照高效液相色谱法测定：色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(10∶90)为流动相；检测波长为230nm；对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品5mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芍药苷50μg)；供试品溶液的制备：取本品装量差异项下的内容物，研细，精密称定4g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40KHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精 密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品每袋含芍药苷(C₂₃H₂₈O₁₁)，不得少于6.0mg。 

功能主治：滋补肝肾，镇静安神，养血通络。用于妇女更年期综合症，肝肾阴虚引起的月经紊乱，潮热多汗，失眠健忘，心烦易怒，头晕耳鸣，咽干口渴，四肢酸楚，关节疼痛等症。 

Claims (3)

1.一种治疗妇女更年期综合症的药物组合物的检测方法，其特征在于该检测方法包括如下鉴别方法和含量测定方法：

鉴别：

A.取制剂相当于所述组合物原料药11-13g，加乙醚20ml，超声处理10-25分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取当归对照药材1g，加乙醚10ml，超声处理10-25分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-12∶1-2石油醚-醋酸乙酯为展开剂，石油醚为60～90℃，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；

B.取制剂相当于所述组合物原料药3.5-4.5g，加乙醚35ml，超声提取20-40分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液；再取地黄对照药材1.0g，加20ml乙醚，超声提取20-40分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚溶解制成每1ml含1.0g的对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7-11∶1-3∶1-2氯仿-甲醇-氨水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

C.取制剂相当于所述组合物原料药1.5-2.5g，研细，加乙醚20ml，超声处理15-25分钟，滤过，弃去乙醚，残渣置水浴上挥尽乙醚，加醋酸乙酯30ml，加热回流0.5-2小时，取出，放冷，滤过，药渣挥干醋酸乙酯，加甲醇20ml，超声处理10-25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加浓氨试液3滴，滤过，滤液加盐酸3滴，离心，弃去上清液，沉淀加甲醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以4-7∶2-5∶1-2∶1-2醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

含量测定：

照高效液相色谱法测定：色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；8-12：85-95腈-水为流动相；检测波长为230nm；对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品5mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备：取相当所述组合物原料药3-4.5g的制剂，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理25-40分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

其中，所述药物组合物的原料药组成为：

酒炙女贞子 10-60重量份        覆盆子            10-50重量份

菟丝子     10-50重量份        黑豆酒炙何首乌    10-50重量份

地骨皮     10-60重量份        南沙参            10-60重量份

麦冬       10-50重量份        黄芩              10-60重量份

地黄       10-60重量份        白芍              20-100重量份

赤勺       10-60重量份        当归              10-50重量份

珍珠母     20-100重量份       白薇              10-60重量份

知母       10-60重量份        龟甲              10-50重量份

鸡血藤     20-100重量份       枸杞子            10-50重量份

石斛       10-60重量份        菊花              10-60重量份

墨旱莲     20-100重量份       桑叶              10-50重量份

炒酸枣仁   10重量份；

其中，所述药物组合物的制备方法为：

选取所述原料药，粉碎成细粉，过70-90目筛，混匀；90-110重量份蜂蜜在116-118℃时，炼制密度为1.37，即得炼蜜；每100重量份粉末加炼蜜35-55重量份及5-20重量份的水，泛丸，60-80℃干燥，即得。

2.如权利要求1所述的药物组合物的检测方法，其特征在于该药物组合物的原料药组成为：

   酒炙女贞子  30g    覆盆子  20g    菟丝子  20g

   枸杞子20g  黑豆酒炙何首乌20g

   龟甲15g    地骨皮30g    南沙参30g

   麦冬20g    炒酸枣仁10g  黄芩30g

   地黄30g    白芍60g      赤勺30g

   当归20g    鸡血藤60g    珍珠母60g

   石斛30g    菊花30g      墨旱莲40g

   桑叶20g    白薇30g      知母30g。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物的检测方法，其特征在于该方法包括如下鉴别方法和/或含量测定方法：

鉴别：

A.取制剂相当于所述组合物原料药11-13g，加乙醚20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取当归对照药材1g，加乙醚10ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以9∶1石油醚-醋酸乙酯为展开剂，石油醚为60～90℃，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；

B.取制剂相当所述组合物原料药3.5-4.5g，加乙醚35ml，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液；再取地黄对照药材1.0g，加20ml乙醚，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，加乙醚溶解制成每1ml含1.0g的对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8∶2∶1氯仿-甲醇-氨水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

C.取制剂相当所述组合物原料药1.5-2.5g，研细，加乙醚20ml，超声处理20分钟，滤过，弃去乙醚，残渣置水浴上挥尽乙醚，加醋酸乙酯30ml，加热回流1小时，取出，放冷，滤过，药渣挥干醋酸乙酯，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加浓氨试液3滴，滤过，滤液加盐酸3滴，离心，弃去上清液，沉淀加甲醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5∶3∶1∶1醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

含量测定：

照高效液相色谱法测定：色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；10∶90乙腈-水为流动相；检测波长为230nm；对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品5mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；供试品溶液的制备：取相当所述组合物原料药3-4.5g的制剂，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，功率250W，频率40KHz超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。