CN101606991A - 微生物发酵法制备附桂骨痛复方的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物发酵法制备附桂骨痛复方的工艺，其是由以下步骤完成：按照附桂骨痛复方的比例称取各味药材，用蒸馏水浸湿药材后灭菌，接种黑曲霉，连续培养，将发酵后的药材加热回流提取，过滤所得提取液，离心，浓缩并定容。根据本工艺制备复方附桂骨痛可以提高药物疗效，降低药物毒副作用，且成本低廉，适于大规模生产。

Description

微生物发酵法制备附桂骨痛复方的工艺

技术领域

本发明属于中药制药领域，具体涉及一种中药复方附桂骨痛复方(FGGTDecoction)的生物发酵工艺和应用。

背景技术

附桂骨痛是我国拥有自主知识产权的复方，传统的制备工艺主要是：除肉桂粉碎成细粉外，其余七味药加水煎煮二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏，加入肉桂粉，混匀，减压干燥而成。其功效为温阳散寒，益气活血，消肿止痛，用于阳虚寒湿型颈椎及膝关节增生性关节炎。症状表现为：局部骨节疼痛，屈伸不利、麻木或肿胀，遇热则减，畏寒肢冷等。

附桂骨痛生产中存在的主要问题是：提取工艺落后，患者服药量大(一次服用6片，一天3次)；有效成分不明确，有效成分含量低。另外复方中君药附子、川乌的主要成分双酯型二萜类生物碱，如乌头碱，既是有效成分，也是毒性成分。因此，传统提取工艺所制附桂骨痛副作用大，用药禁忌较多，限制了药物应用。

双酯型生物碱经转化可分解成毒性较小的单酯类生物碱。通过优化工艺达到减毒增效作用，是本发明要解决的要点。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种低毒高效、质量可控的附桂骨痛复方的生产工艺。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种微生物发酵法制备附桂骨痛复方的工艺，由以下步骤完成：

1)按照附桂骨痛复方的比例称取各味药材，除淫羊藿为全草外，其余为10～20目粗粉；

2)用蒸馏水浸湿药材后，121℃灭菌20min；

3)接种10ml 1.8*104个/ml黑曲霉，连续培养7天；

4)将发酵后的药材加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10，8，6倍，提取时间依次为1.5h，0.75h，0.75h；

5)过滤步骤4)中所得提取液，4000r/min离心20min，合并上清液，浓缩并定容至150mL。

所述的黑曲霉为由以下步骤制得的黑曲霉菌悬液：

1)按照营养琼脂45g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml的比例配制培养基，加热煮沸，全部溶解后高压蒸汽灭菌，分装于于灭菌培养皿，凝固得到平板培养基；

2)按照牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml的比例配制培养液，加热煮沸，全部溶解后高压蒸汽灭菌，得到菌悬液培养液；

3)将黑曲霉接种于平板培养基上，30℃恒温倒置，活化培养3-4天；

4)平板培养基长满黑曲霉孢子后，在无菌条件下，将单个健康菌落接入到三角瓶中的斜面培养基上，30℃恒温，扩大培养6-7天；

5)扩大培养后，在无菌条件下，向三角瓶中加入菌悬液培养液，用玻璃棒摩擦菌落表面，将孢子打散成茶状菌液，菌液转于无菌试管，振荡8-10分钟，静置30-40分钟，上层1/2菌液转于另一无菌试管，震荡1-2分钟，用滤纸过滤除去短菌丝，将所得滤液振荡混匀1-2分钟，得到黑曲霉菌悬液；

6)在无菌条件下，将黑曲霉菌悬液吸取一滴至血球计数板，进行计数。

所述的附桂骨痛复方为：附子14.5g、川乌7.5g、乳香7.5g、党参11.1g、白芍11.1g、淫羊藿11.1g、当归11.1g，共计74.0g。

由所述方法制得的附桂骨痛复方中药。

本发明的有益效果为：

1、借鉴中医药理论，首次运用生物工程技术发酵附桂骨痛复方，给出了有毒中药减毒增效的新方法。

2、提取工艺的评价以复方中主要有效成分乌头总生物碱、芍药苷和干浸膏得率三个指标，结合毒理、药理试验评价工艺的药效及安全性，综合指标避免了唯成分论。

3、项目所用黑曲霉菌种易得，培养条件容易，培养成本低，发酵处理后提取液澄清度高，脱色明显，杂质含量明显降低。且复方中的主要有效成分乌头总生物碱、芍药苷含量明显增高，浸膏得率提高，说明其中的杂质明显降低。毒理试验证明复方毒性降低、药理试验证明药效高于传统方法。

4、采用微生物发酵法具有优势：成本低廉、对环境友好、简单方便，可为开发新药、提高药物疗效、降低药物毒副作用的研究提供新的手段，为中药的发展开辟新的研究空间。

附图说明

图1为不同处理对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

图2为不同处理对二甲苯致小鼠耳肿胀度的影响

图3为不同处理对小鼠热板法痛阈值的影响

图4为不同处理对小鼠扭体次数的影响

图5为不同处理对小鼠扭体潜伏期的影响

具体实施方式

试剂与仪器

黑曲霉(Aspergillus niger)，由北京化工大学微生物教研组提供。

高效液相色谱仪(Waters 600 controller，Waters 600 pump，Waters 2487 Detector，EC2000)；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；DL-5型低速大容量离心机(上海浦东物理化学仪器厂)；DZTW型调温电热套(北京市永光医疗仪器厂)；pHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；MettlerAX105型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

乌头碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：11072-200410)；芍药苷(中国药品生物制品检定所，批号：110736-200731)；乙腈、甲醇(色谱纯)，其他试剂为分析纯。制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿、制乳香由河北省安国长安药材有限公司提供，经北京联合大学制药工程教研室鉴定为正品。

溴甲酚绿(Bromocresol Green，BCG)试液配制：取溴甲酚绿0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml使溶解，再加水稀释至200ml，即得。其他化学试剂均为分析纯。

实施例1发酵法生产附桂骨痛复方的制备工艺

1.黑曲霉菌悬液的制备

1)制备平板培养基：

称取营养琼脂45g，葡萄糖20g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸，同时用玻璃棒搅拌，待营养琼脂和葡萄糖全部溶于水后(加热时可适当补水)，装入三角瓶，用8层纱布做成塞子塞住瓶口，再用4层报纸以及棉线封口，置立式压力蒸汽灭菌器中121℃灭菌20分钟。

迅速倒入培养基约15ml于灭菌培养皿，加盖后摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，平置于桌面上，凝固即为平板培养基。

2)制备菌悬液培养液：

称取牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，氯化钠5g加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸，同时用玻璃棒搅拌，待牛肉膏，蛋白胨，氯化钠和葡萄糖全部溶于水中后(加热时可适当补水)，装入三角瓶，用8层纱布做成塞子塞住瓶口，再用4层报纸以及棉线封口，置立式压力蒸汽灭菌器中121℃灭菌20分钟。待用。

3)黑曲霉的活化培养

在超级洁净工作台中，选用平整、圆滑的接种环，将黑曲霉平板菌种倒置于酒精灯旁，将烧去残菌后的接种环在平板上依“之”字型划线(线条多少应依挑菌量的多少而定)。随即将皿底放入皿盖中。将划线平板倒置，置于30℃恒温培养箱中，活化培养3-4天。

4)黑曲霉的扩大培养

待平板培养基长满孢子后，在无菌条件下，采用划线法将单个健康菌落接入到三角瓶的斜面培养基上，置于30℃恒温培养箱中，扩大培养6-7天。

5)黑曲霉菌悬液的制备及稀释

取30℃条件下培养7天的菌斜面，在无菌操作台中，将三角瓶中加菌悬液培养液，用玻璃棒充分摩擦菌落表面，将孢子振荡打散成茶状菌液。灭菌移液器吸取菌液于无菌试管，振荡10分钟，静置40分钟，吸取1/2上层菌液于另一无菌试管，再震荡1-2分钟。最后用滤纸过滤除去短菌丝，将所得滤液振荡混匀1分钟(过滤时，以4-6ml菌悬液再换一张滤纸为宜，以免菌丝过多堵塞滤孔)。

6)黑曲霉菌悬液的计数

在无菌操作台中，将上述菌悬液用灭菌移液器吸取一滴至血球计数板(规格：16倍*25格)的盖玻片边缘使菌悬液缓缓渗入，多余的菌悬液用吸水纸吸掉，稍待片刻，使孢子全部沉降到血球计数室内。用光学显微镜进行计数。计数时，按对角线取左上、右上、左下、右下4个中格(100个小格)的菌。遇到位于大格线上的菌，一般只计数大方格的上方，右方线上的细胞。在无菌操作台中，黑曲霉菌悬液计数，不少于1.8*104个/ml则为合格黑曲霉菌悬液。

2.复方发酵

按复方中药材的比例称取附子14.5g、川乌7.5g、乳香7.5g、党参11.1g、白芍11.1g、淫羊藿11.1g、当归11.1g，共计74.0g(生产放大按比例加倍)，除淫羊藿为全草外，其余为10～20目粗粉，放入500ml容器。用蒸馏水浸湿药材(浸湿程度为握之成团，松之即散)后，121℃灭菌20min。1.8*104个/ml的黑曲霉液的接种量为10ml，连续培养7天。将发酵后的药材加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10，8，6倍，提取时间依次为1.5h，0.75h，0.75h。提取液过滤，离心(4000r/min，20min)，合并上清液，浓缩并定容至150mL。

实施例2利用离子对萃取分光光度法测定提取物中乌头总生物碱含量

以乌头碱为对照品。精密量取按照实施例1“2.复方发酵”所述方法制得的提取物50mL，加氨试液调节pH值至9，用乙醚萃取4次(25，20，15，10mL)，合并乙醚层，并在水浴上蒸干。残渣加0.01mol/L盐酸溶液适量使溶解，转入10mL量瓶中，再加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

精密量取一定量的乌头碱对照品溶液或供试品溶液于分液漏斗中，加入pH值为3.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液5.0mL，BCG试液2.0mL，蒸馏水3mL，氯仿10.0mL，振摇3min，静置1h，分取氯仿层于装有少量无水硫酸钠的量瓶中，静置30min，在紫外分光光度计412.5nm波长处测定吸光度。结果未发酵组乌头总生物碱含量为10.65(mg/g)，发酵组乌头总生物碱含量为49.47(mg/g)。发酵组乌头总生物碱含量比未发酵组增加38.82(mg/g)，即365％。

实施例3利用高效液相色谱法测定提取物中芍药苷含量

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)为流动相；检测波长为230nm；柱温为40℃。进样量：20μL。

精密称取一定量的芍药苷对照品，加甲醇溶解，并稀释至刻度溶液制成每1mL含0.5μg的溶液，摇匀，得芍药苷对照品溶液。

用移液管精密量取2项下的提取物1.5mL，水浴低温蒸干，残渣加10mL甲醇，超声10分钟，使溶解，离心20分钟(1500r/min)，将上清液转移到25mL的容量瓶中，并用甲醇定容至刻度。即得供试品溶液。分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。结果未发酵组芍药苷含量0.1880(g/g)，发酵组芍药苷含量0.3183(g/g)。发酵组芍药苷含量比未发酵组增加0.1303(g/g)，即69.3％。

实施例4干浸膏含量测定

按照2005年版《中国药典》一部附录X.A浸出物测定法，精密量取按照传统方法及实施例1“2.复方发酵”所述方法制备的2种提取液各10mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃烘3h，转移至干燥器中，冷却30min，即刻精密称重，计算干浸膏含量，浸膏得率计算公式：浸膏得率＝(干燥后浸膏重量-蒸发皿重量)*15倍/药材总重量*100％。

结果：传统提取干浸膏得率为10.15(g/g生药)％，发酵法干浸膏得率23.96(g/g)，发酵组干浸膏得率比未发酵组增加了13.81(g/g)％，即136.1％。

实施例5附桂骨痛复方发酵前后急性毒性

1)黑曲霉发酵提取液的急性毒性：ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，给药前禁食10小时，将50只小鼠随机分为5组，每组10只，取按本发明制备的附桂骨痛提取液(含量)，分别灌胃给予73.4，91.75，114.69，143.96，179.2g/kg，药物组间比为0.80，给药体积为0.2mL/10g体重，给药后连续饲养并观察7天，记录各组小鼠死亡情况，用BLISS法计算小鼠半数致死量。LD₅₀95％133.70g/kg。结果见表1。

2)传统水提取液的急性毒性：ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，给药前禁食10小时，将50只小鼠随机分为5组，每组10只，取按本发明实例1方法1制备的附桂骨痛提取液(含量)，分别灌胃给予72.2，90.2，112.8，140.9，176.0g/kg，药物组间比为0.80，给药体积为0.2mL/10g体重，给药后连续饲养并观察7天，记录各组小鼠死亡情况，用BLISS法计算小鼠半数致死量。LD₅₀95％118.16g/kg，结果见表2。

表1不同剂量的发酵附桂骨痛对小鼠口服给药的结果

LD₅₀95％133.70g/kg，95可靠度置信限为114.73-166.67g/kg

表2不同剂量的附桂骨痛对小鼠口服给药的结果

LD₅₀95％118.16g/kg，95可靠度置信限为101.77-139.53g/kg

实施例6本发明附桂骨痛复方提取物对小鼠抗炎性的影响

ICR小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2007-0001。

对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

ICR小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为6组：生理盐水(NS)对照组，FGGT(4.0，6.8g/kg)，发酵后FGGT(4.0，6.8g/kg)，地塞米松(0.002g/kg)。各组均每天灌胃给药1次，连续7d。末次给药后30min，ip醋酸(0.6％，0.20ml/20g体重)，30min后尾静脉注射0.5％伊文斯蓝生理盐水溶液10mg/kg，30min后脱颈椎处死，切开腹腔，用5ml生理盐水洗涤腹腔，吸管吸出洗涤液4ml加入生理盐水至10ml，3000r·min-1离心15min，取上清液于590nm比色测定，读取吸光度值，比较给药组和对照组的差异。

由图1可见，FGGT(4.0，6.8g/kg)，发酵后FGGT(4.0，6.8g/kg)，地塞米松(0.002g/kg)组的吸光度值与正常对照组比较明显降低，表明FGGT发酵前后能抑制小鼠腹腔毛细血管通透性增高，但相同剂量的FGGT发酵前后并无显著差异。

对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

ICR小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g。适应性饲养后，随机分成6组：对照组用蒸馏水灌服，地塞米松组2mg/kg，FGGT(4.0，6.8g/kg)，发酵后FGGT(4.0，6.8g/kg)。各组小鼠灌胃给药，每天1次，连续7d。末次给药1h后，以二甲苯0.02ml/只均匀涂于左耳前后两面，右耳作为对照。致炎后1h将小鼠处死，沿耳廓线剪下两耳，用直径8mm的不锈钢打孔器在同一部位分别打下耳片，用电子分析天平(sartorius，BP211D)称重，以左右耳片的重量之差为肿胀度。

由表3和图2可见，FGGT(4.0，6.8g/kg)，发酵后FGGT(4.0，6.8g/kg)，地塞米松(0.002g/kg)组对小鼠耳廓肿胀都有明显的抑制作用，但相同剂量的FGGT发酵前后并无显著差异。

表3附桂骨痛对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的治疗效果(x±s)

与对照组比较，▲▲P＜0.01

实施例7本发明附桂骨痛复方提取液的镇痛作用

1.对小鼠热板法痛阈值的影响

将大烧杯置于恒温(55±0.5)℃水浴槽，预热10min，以放置于热板上小鼠首次舔后足所需时间为该鼠正常痛阈值。痛阈值＜5s或＞30s或跳跃的小鼠弃用。选择正常痛阈值在5～30s内合格雌性小鼠50只。按痛阈值分层随机分为5组，每组10只，分别为阿司匹林组(0.2g/kg)，FGGT(4.0，6.8g/kg)，发酵后FGGT(4.0，6.8g/kg)，各组小鼠灌胃给药，每天1次，连续7d。给药前和末次给药后1，2，2.5，3，4，5，7，9，12，14，16小时时测定小鼠舔后足所需时间。

由表4和图3可见(表4附于说明书最后一页)，本发明附桂骨痛复方发酵提取液6.8g/kg灌胃给药，药后小鼠舔后足所需时间与给药前比较均明显延长，FGGT发酵后与同剂量传统水提取液比较起效时间明显提前，在相同时间点小鼠舔后足所需时间延长。

2.附桂骨痛复方提取物对醋酸致小鼠扭体反应影响

小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为阿司匹林组(0.2g/kg)，FGGT(4.0，6.8g/kg)，发酵后FGGT(4.0，6.8g/kg)和蒸馏水对照组。各组小鼠灌胃给药，每天1次，连续7d。末次给药后30min，腹腔注射冰醋酸(0.6％，0.25ml/只)致痛。观察记录出现扭体反应的潜伏期以及10min内的扭体次数。

由表5可见，本发明附桂骨痛复方发酵提取液6.8g/kg灌胃给药，显著抑制醋酸所致小鼠扭体反应。表明发酵后FGGT有明显的镇痛作用。图4和图5分别为扭体次数和扭体反应潜伏期的统计图。

表5附桂骨痛对醋酸致扭体反应的小鼠的镇痛效果(x±s)

▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与对照组比较；※P＜0.05，※※P＜0.01，发酵FGGT与同剂量未发酵FGGT比较

本发明的附桂骨痛复方发酵提取液，相对于未发酵组总乌头生物碱含量高365％，芍药苷含量高69.3％，干浸膏得率高136.1％；且澄清度高，脱色明显，杂质含量明显降低。

本发明的附桂骨痛复方发酵提取物，小鼠急性毒性试验表明，其半数致死量LD₅₀为133.70g/kg，大于传统水提取物LD₅₀118.16g/kg，说明经过发酵，毒性降低，达到了减毒的作用。

本发明的附桂骨痛复方发酵提取物在小鼠6.8g/kg口服给药，对于毛细管通透性升高及二甲苯所致的耳廓肿胀有很好的抑制作用，其抗炎效果与传统方法无明显区别。

本发明的附桂骨痛复方发酵提取物在小鼠4.0，6.8g/kg口服给药，能明显延长小鼠热痛阀值，减少醋酸致小鼠扭体反应次数，说明发酵提取物有很好的镇痛作用，优于传统方法。

Claims (4)

1.一种微生物发酵法制备附桂骨痛复方的工艺，其特征在于，由以下步骤完成：

1)按照附桂骨痛复方的比例称取各味药材，除淫羊藿为全草外，其余为10～20目粗粉；

2)用蒸馏水浸湿药材后灭菌；

3)每74.0g药材接种10ml浓度为1.8*104个/ml的黑曲霉液，连续培养7天；

4)将发酵后的药材加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10，8，6倍，提取时间依次为1.5h，0.75h，0.75h；

5)过滤步骤4)中所得提取液，4000r/min离心20min，合并3次提取液的上清液，浓缩并定容至150mL。

2.如权利要求1所述的制备附桂骨痛复方的工艺，其特征在于，所述的黑曲霉液为由以下步骤制得的黑曲霉菌悬液：

1)按照营养琼脂45g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml的比例配制培养基，加热煮沸，全部溶解后高压蒸汽灭菌，分别分装于于灭菌培养皿和三角瓶中，凝固得到平板培养基和斜面培养基；

2)按照牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml的比例配制培养液，加热煮沸，全部溶解后高压蒸汽灭菌，得到菌悬液培养液；

3)将黑曲霉接种于平板培养基上，30℃恒温倒置，活化培养3-4天；

4)平板培养基长满黑曲霉孢子后，在无菌条件下，将单个健康菌落接入到三角瓶中的斜面培养基上，30℃恒温，扩大培养6-7天；

5)扩大培养后，在无菌条件下，向三角瓶中加入菌悬液培养液，用玻璃棒摩擦菌落表面，将孢子打散成茶状菌液，菌液转于无菌试管，振荡8-10分钟，静置30-40分钟，上层1/2菌液转于另一无菌试管，震荡1-2分钟，用滤纸过滤除去短菌丝，将所得滤液振荡混匀1-2分钟，得到黑曲霉菌悬液；

6)在无菌条件下，将黑曲霉菌悬液吸取一滴至血球计数板，进行计数，不少于1.8*104个/ml为合格。

3.如权利要求1所述的制备附桂骨痛复方的工艺，其特征在于，所述的附桂骨痛复方为：附子14.5g、川乌7.5g、乳香7.5g、党参11.1g、白芍11.1g、淫羊藿11.1g、当归11.1g，共计74.0g。

4.由权利要求1所述方法制得的附桂骨痛复方中药。

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