CN101578101B - 青藤碱衍生物的制备和应用 - Google Patents

Abstract

这个发明里，我们描述了与化学结构式I相关的青藤碱衍生物的制备和在药物学上的用途。这里介绍的方法是，通过置换R基来改变D环。别的环的置换方法也在此进行了介绍。与其先导体青藤碱相比，青藤碱的衍生物具有明显增强的抗炎生物活性。

Description

青藤碱衍生物的制备和应用

本专利申请是，基于中国专利申请第200610038862.9号(在2006年3月15日提交)，中国专利申请第200510123089.1号(在2005年12月15日提交)，中国专利申请第200510123090.4号(在2005年12月15日提交)的优先权。，我们将以上3个专利内容合并在本专利申请里。

本专利申请，我们参考和引述了众多的文献，以便全面清楚地阐明本发明的所在水平。

技术领域

本发明涉及一种化合物的制备及其应用，特别是青藤碱衍生物的制备和应用。

背景技术

炎症反应是机体损伤后，机体为了恢复和维持组织的结构和功能，从而进行防御的一部分。大部分的机体防御物质处于血液之中。炎症特指，防御细胞和物质离开血液进入受损部位，进一步进入损伤和受侵犯组织和周围组织的过程。虽然炎症反应从本质上来说是一个有益的过程，但过量或长期的炎症活动可以导致严重的疼痛，对组织产生有害的影响。

青藤碱，是一类在化学结构上与吗啡类类似的化学物质，可从青风藤中提取得到。据报道，它具有抗炎，镇痛，降血压和抗心律失常的作用。[Wang，Naiqin，et al.Yao Xue Xue Bao 1992，23(2)，81；Zhou，Jinhuang et al.《Zhongyao Yaoli Yanjiu Yu Jinzhan》，Chinese Science and TechnologyPublisher，1993，66；Liu，Q.；Zhou，L.-l.；Li，R.Chinese Traditional and HerbalDrugs 1997，28，247.]。在中国，青藤碱及其盐酸盐已在临床上用于治疗类风湿关节炎(RA)。不过，它们药性缓慢，还存在一些副作用，如皮疹等。这些研究的目的是，在两个C-ring2的结合部，删减青藤碱的羰基组和加氢双键，而其他化学修饰主要集中在青藤碱-金属的螯合上。(Pang，Zhigong；Wang，Baoqi.Faming Zhuanli Shenqing Gongkai Shuomingshu(1997)，CN1153171.Chem.Abstr.131：356078.Kang，Jun；Xue，Chunxia；Dong，Yaling.Xibei Yaoxue Zhazhi 2000，16(4)，137.)。然而，它们在提高青藤碱活性上，一直收效甚微。

除了上述所描述的生物活性以外，还发现了青藤碱及其衍生物的一些新的治疗用途，比如在动物实验模型，可以改善脑痴呆等。(Qin Guo-Wei，etal.PCT Int.Appl.(2004)，WO 2004/048340，Chem.Abstr.131：179808)。

本发明中，我们使用了与前人截然不同的思路和方法去修饰青藤碱的化学构造，从而得到青藤碱的众多新衍生物。具体来说，用不同的化学基团替代D环上的甲基。从而使衍生物的活性强于先导化合物青藤碱。经过实验证明，它们的生物活性和抗炎作用都有所改善。

发明内容

本发明里所阐述的化合物，是对青风藤中所含的活性成分青藤碱修饰而得。这些衍生化合物的具体化学结构，在下图表示。

这个发明里所运用的各个化合物，是将图中所示的青藤碱的17位碳所连接的氮上的R基团用不同的基团取代，得到17-取代化合物。青藤碱的天然化合物，R1和R2是氢，R3是甲氧基，R4是羟基，R是一个甲基集团。这个化学结构式，包括了我们所制造的所有成分或药理学可接受的盐化合物。

化学结构式I的苯环上R¹，R²，R³，R⁴的取代物，从H，卤素(F，Cl，Br或I)，-OH，-NH₂，-NO₂，-CN，酰基，烷基，烷氧基，烷氨基，环基，杂环基，杂环烷基，烯基，杂芳基，杂芳巯基和杂芳氨基中分别选择。这些取代基包含一到二十个碳原子。

每一个酰基，烷基，烷氧基，烷氨基，环基，杂环基，杂环烷基，烯基，杂芳基，杂芳巯基和杂芳氨基，自身可各自独立地被一个或更多的基团所取代，它们可包括卤素，N，O，-S，-CN，-N₃，-SH，硝基，oxo，酰基，烷基，烷氧基，烷氨基，烯基，芳基，杂环烷基和杂环基。这些取代基包含一到二十个碳原子。

R可是一个饱和的或非饱和的烷基集团，它们或者是直链，或者是带有侧链，或者是环状的，有1到20碳原子。R也可是R⁵-X-CO-，这里X是一个化学键，或是NH，或是O；而R⁵可以是氢原子，或是一个饱和的或非饱和的烷基集团，它们或者是直链，或者带有侧链，或者是环状的，有1到20碳原子。或是一个芳香族集团，比如未替换的或者是替换的苯，萘，吡啶或呋喃系。每个烷基和芳基，可选择地被或不被一个或更多的基团所替换。这些基团可以包括卤素，-S-，-CN，-N₃，硝基，oxo，酰基，烯基，烷氧基，烷基，烷氨基，氨基，芳基，环基，环烷基，杂环基，杂环烷和羟基。

R也可是磺酰基R⁵S(O₂)-，R5可以是一个饱和的或非饱和的烷基集团，它们或者是直链，或者带有侧链，或者是环状的，有1到20碳原子；或者是一个芳香族集团，比如是未替换的或者是替换的苯，萘，吡啶或呋喃系。每个烷基和芳基，可选择地被或不被一个或更多的基团所替换。

R可是磺酰氨基R⁵NS(O₂)-，R⁵可以是一个饱和的或非饱和的烷基集团，它们或者是直链，或者带有侧链，或者是环状的，有1到20碳原子；或者是一个芳香族的集团，比如未替换的，或者是替换的苯、萘、吡啶或呋喃系。每个烷基和芳基，可选择地被或不被一个或更多的基团所替换。这些基团可以包括卤素，-S-，-CN，-N₃，硝基，oxo，酰基，烯基，烷氧基，烷基，烷氨基，氨基，芳基，环基，环烷基，杂环基，杂环烷基和羟基；这里R⁵可以是R⁶CO-或者R⁶SO₂-，R⁶可以是一个饱和的或非饱和的烷基集团，它们或者是直链，或者带有侧链，或者是环状的，有1到20碳原子；或者是一个芳香族集团，比如是未替换的或者是替换的苯、萘、吡啶或呋喃系。

上述的各种化合物，具体地包括了制药学上可能使用的盐化合物。更加详细的就是在化合物里添加相应的酸，如无机酸和有机酸。可以列举作为例证的，但决非仅限于这些酸盐的酸集团是，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、富马酸、酒石酸、乙酸、三氟醋酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、丙酮酸、丙二酸或者戊二酸。

在另外一个的具体例子中，R有着如下的化学结构式；

这里，R⁷可以是一个氢原子或，一个饱和的或不饱和的烷基集团，被取代或没被取代，它们或者是直链，或者带有侧链，或者是环状的，含有1到20个碳原子；或是可以是取代的或未被取代的醚，酯，氨基化合物，胺，硫醚或硫代酸酯，含有1到20碳原子；R⁸可以包含一个氢原子，一个取代或未取代的含有1到20个碳原子的烷基团体，或者是一个取代或未取代的醚，酯，氨基化合物，胺，硫醚或硫代酸酯，含有1到20个碳原子。

另外的例子具体显示如下：

可以改变或者替换以上相关的R集团，从而提供有治疗用途的化合物.因此，这个发明里所包含了化学结构式I的大量的具体衍生物，尽管这些衍生物不可能在此被明确地发表。

上述的青藤碱衍生物，可能通过添加一个或多个适当的载体和赋形剂的方式，来配方成为药物。因此，本发明还包括适合在体内传输的有效药物成分的各种制剂，配方，用以通过多种给药方式把有效剂量的一个或多个青藤碱衍生物送达到体内。这些化合物或者药物成分的投药途径包括经口投药，肠道给药，口腔吸收，结肠直肠吸收，静脉注射，肌肉注射，皮下注射，吸入和鼻内给药.因此，在这里论述的含有青藤碱衍生物的各种药物可以是药丸，药片，囊片，液体，糖浆，滋补品，菱形，口香糖，喷雾，喷雾状的，面霜，洗面液，药膏，乳剂包括微乳液和纳米乳液，栓剂和透皮吸收片剂。

“人全血”实验模型是一个生理学的评价系统，一般认为，能够在人全血评价系统抑制细胞因子释放的化合物，可能也会在体内发挥同样的作用。(Hartman et al.，Inflamm Res 1995；44：269-274；Hermann et al.，Journal ofImmunological Methods 2003；275：69-79；Zhang Y et al：InternationalImmunopharmacology 2004；4：1845-1857；Zhang Y et al.，J.of Pharmacologyand Experimental Therapeutics 2004；309：348-355；Lagrelius M et al.，Cytokine 2006；33：156-165。)因此，在人全血中鉴定能够有效地抑制细胞因子释放的化合物，一般在体内实验时和用于临床治疗时也能达到同样的效果。

本发明提供了使用青藤碱衍生物抑制人全血中一个或多个细胞因子产生的方法来筛选关键化合物，它包括以下步骤：用一定量的，与化学结构式I相关的化合物，加入到全血培养液中，来抑制全血培养液中的一个或多个细胞因子的产生，通过对细胞因子产生的抑制作用来检测这个化合物的抗炎活性。

通过前人的实验报道，我们认为为了测量待检测的化合物的有效性，首先应该在人的全血中诱导细胞释放细胞因子，再测量化合物对细胞因子的抑制程度。人全血中细胞因子的释放，可以被多个诱导物所刺激：用LPS刺激白血球释放细胞因子，用酵母聚糖A刺激单核细胞释放细胞因子(Hartman DA et al：Inflamm Res 1995；44：269-274)，用“葡萄球菌肠毒素B”(SEB)刺激淋巴细胞释放细胞因子(Hermann et al：Journal of ImmunologicalMethods 2003；275：69-79)。

本发明的另一个意义是，提供了一个方法以确定我们这里所发明的青藤碱衍生物可以用于治疗炎症或改善症状。一个具体的例子是风湿性关节炎。

另外可以治疗的疾病包括：其它的多种炎症和关节炎。关于这些病，这里我们举例如下，但绝非仅限于这些疾病：骨关节炎，全身性红斑性狼疮，痛风和类似退行性疾病，阿兹海默症，帕金森氏症，神经退行性疾病，哮喘，心律不齐和炎症相关疼痛。

除了治疗之外，本发明所阐述的青藤碱衍生物，也可以用于开发预防药物，用来预防和治疗上述疾病。通过改变剂量，组方和服药方式，含有青藤碱衍生物的药物也可被用来抑制炎症相关疾病，以及抑制它们的再发。

这里详细介绍了一些这个发明里所包含的青藤碱衍生物。这些例子仅仅是为了举例的需要，而非意味着我们的发明只仅限于此。它们包括：17-丙基青藤碱，17-丁基青藤碱，17-环丙甲基青藤碱，17-苄基青藤碱，17-(2′-呋喃基-甲基)青藤碱，17-烯丙基青藤碱，17-环己基青藤碱，17-环己基青藤碱，17-(2′-苯基-乙基)青藤碱，17-环庚基青藤碱，17-(2’-氧合-丙基)青藤碱，17-(2′-氧合-3′-苯基-丙基)青藤碱，17-甲磺酰基青藤碱，17-乙磺酰基青藤碱，17-丙磺酰氨基青藤碱，17-对甲苯磺酰基青藤碱，17-(4′-乙酰氨基)苯磺酰基青藤碱，17-(2′-甲基-6′-甲酯基)苯磺酰基青藤碱，17-乙酰基青藤碱，17-丙酰基青藤碱，17-丁酰基青藤碱，17-(苯基)乙酰基青藤碱，17-环丙基甲酰青藤碱，17-(2-苯基-丙酰基)青藤碱，17-苯甲酰基青藤碱，17-(3′-氯苯甲酰基)青藤碱，17-(4′-甲基苯甲酰基)青藤碱，17-(3′，5′-二甲基苯甲酰基)青藤碱，17-(2′-羟基苯甲酰基)青藤碱，17-(3′-羟基-2′-甲基苯甲酰基)青藤碱，17-(3′-吡啶甲酰基)青藤碱，17-呋喃甲酰基青藤碱，17-(3′，4′-二氟苯甲酰基)青藤碱，17-(4′-氟苯甲酰基)青藤碱，17-(4′-羟基苯甲酰基)青藤碱和17-(4’-乙酰氨基-苯甲酰基)青藤碱。

前面所提及的化学结构式I相关的17-替代青藤碱衍生物的合成步骤，具体说明如下面的图解I：

第1步，用青藤碱和4-苄氧苄醇(BnOBnOH)，在Mitsunobu条件下反应生成中间体II。用苯甲酸苄酯代替4-苄氧苄醇与青藤碱反应也可以得到相似结果。

第2步，用用氯甲酸1-氯乙酯来对中间体II实行去甲基化。(Hitotsuyanagi，Y.；Nishimura，K.；Ikuta，H.Takeya，K.；Itokawa，H.J.Org.Chem.，1995，60(14)，4549-58)

第3步，通过对中间体进行烷基化，乙酰化或者磺酰化，来合成中间体IV。

第4步，用三氟乙酸/二氯甲烷(TFA/DCM)溶液，对中间体IV实施去保护化，从而得到化学结构式I所示的化合物。(Hamper，B.C.；et al.TetrahedronLetters，37(21)，3671-3674.Mergler，M.；et al.Tetrahedron Letters 29(32)，4005-8.)。

图解I仅仅是为了举例说明，并非意味仅限于此，具有通常技能的专业人士，可以通过特殊的实验步骤，去合成17-替代青藤碱衍生物。这里我们用选择的试剂和实验条件，举例说明实验方法。

附图说明

图1A.本图显示了第一实验组中的7个所测化合物(浓度：10^-5mol/L)对于人全血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所产生的抑制作用。这7个所测化合物均与脂多糖(LPS：lipopolysaccharide)(浓度：10ng/ml)培养了6个小时。C：对照组(没有与LPS共同培养)，L：LPS单独组。数据以平均值±标准差的形式表示(Mean±SD。n＝2。)第一个实验组是由7个所测化合物所组成，它们可将全血TNF-α的释放浓度抑制到530pg/ml以下。它们分别是：#33，#54，#20，#39，#44，#37和#48号化合物。

图1B.以抑制百分比的形式表示上述结果。这7个化合物对LPS-诱导释放的TNF-α的抑制百分比是以LPS单独组的结果为分母计算而得的。

图2A.本图显示了第二实验组中的5个所测化合物(浓度：10^-5mol/L)对于人全血中TNF-α所产生的抑制作用。这5个所测化合物均与LPS(浓度：10ng/ml)培养了6个小时。C：对照组(没有与LPS共同培养)，L：LPS单独组。数据以平均值±标准差的形式表示(Mean±SD。n＝2。)第二实验组是由5个所测化合物所组成，它们可将全血TNF-α的释放浓度抑制到530±610pg/ml。它们分别是：#18，#42，#43，#46和#49号化合物。

图2B.以抑制百分比的形式表示上述结果。这5个化合物对LPS-诱导释放的TNF-α的抑制百分比是以LPS单独组的结果为分母计算而得的。

图3A.本图显示了第三实验组中的10个所测化合物(浓度：10^-5mol/L)对于人全血中TNF-α所产生的抑制作用。这10个所测化合物均与LPS(浓度：10ng/ml)培养了6个小时。C：对照组(没有与LPS共同培养)，L：LPS单独组。数据以平均值±标准差的形式表示(Mean±SD。n＝2。)第三个实验组是由10个所测化合物所组成，它们可将全血TNF-α的释放浓度抑制到610pg/ml。它们分别是：#1，#2，#5，#9，#10，#14，#15，#28，#36和#47号化合物。

图3B.以抑制百分比的形式表示上述结果。这10个化合物对LPS-诱导释放的TNF-α的抑制百分比是以LPS单独组的结果为分母计算而得的。

图4.5个关键化合物对抑制LPS-诱导的TNF-α释放量的IC₅₀(半数抑制浓度)量效图。

图5.5个关键化合物对抑制LPS-诱导的白介素-1(IL-1)释放量的IC₅₀量效图。

图6.5个关键化合物对抑制LPS-诱导的白介素-6(IL-6)释放量的IC₅₀量效图。

图7.5个关键化合物对抑制LPS-诱导的白介素-8(IL-8)释放量的IC₅₀量效图。

具体实施方式

下面列举了具体的化合物和获得它们的方法。这个说明仅仅是为了例证，请勿认为这个发明的意义仅限于以下的阐述。有着普通技能的专业人士，将很容易从这里了解到各种青藤碱衍生物的制备方法，在此可能获得各种替代试剂和/或反应条件。

例1 17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱的制备

第一步：苄氧苄氧基青藤碱的制备(Hitotsuyanagi，Y.；Nishimura，K.；Ikuta，H.；Takeya，K.；Itokawa，H.J.Org.Chem.，1995，60(14)，4549-58.)

将青藤碱(1.65g，5mmol)，PPh₃(3.93g，15mmol)，BnOBnOH(3.17g，mmol)和无水THF(50毫升)混合，放入一个25毫升的，装有一个磁搅拌杓子的4颈园底烧瓶里，搅拌。反应混合物用冰冷却，慢慢滴加DEAD(2.61g，15mmol)，耗时30分钟。添加之后，在室温下搅拌12小时。旋去THF，留下残渣，用硅胶柱过柱提纯(乙酸乙酯，然后甲醇)，得一肉色固体。用异丙醚的重结晶物得白色的粉末(2.6g)。mp 72℃；[α]²⁵ _D-69.0°(c＝0.28CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ：7.56(d，2H，J＝8.6Hz.)，7.48-7.34(m，4H)，7.02(d，2H，J＝8.6Hz.)，6.77(dd，2H，J＝8.4Hz)，5.52(d，1H，J＝1.5Hz.)，5.23(d，1H，J＝10.5Hz.)，5.11(s，2H)，5.01(d，1H，J＝10.5Hz)，4.20(d，1H，J＝16.1Hz.)，3.83(s，3H)，3.53(s，3H)，3.18-3.16(m，1H)，3.05-2.97(m，2H)，2.82-2.73(m，1H)，2.49-2.37(m，2H)，2.43(s，3H)，1.97(ddd，1H，J＝11.4，11.4，4.3Hz.)，1.87-1.80(m，2H)。

第二步：17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱

在苄氧苄氧基青藤碱(1.0克)和碳酸氢钠(1.0克)的冰冷的混合物里，逐滴添加无水1，2-二氯乙烷，和氯甲酸1-氯乙酯(0.25毫升)并充分搅拌。在此温度下搅拌约30分钟后，混合物加热至轻微回流一小时。过滤该混合物，滤液减压蒸发，留下残渣，这残渣可以直接醇解，无需进一步的净化。

在氮气的条件下，残渣加入无水甲醇(20毫升)，搅拌回流1小时。蒸发溶剂得一固体，这固体溶在20毫升氯仿用中性饱和碳酸钠溶液(5毫升)中和。有机层分离，用氯仿(10毫升)萃取水层，合并有机层减压蒸发，得到一浅黄色固体。

例2 17-丙磺酰青藤碱的制备

第一步：

在17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱(100mg)，和含有三乙胺的二氯甲烷(10ml)的溶液里，搅拌下慢慢加入含有二氯甲烷(5毫升)的丙磺酰氯(50毫克)溶液。搅拌5分钟，反应混合物经过减压蒸发而得到残留物，残留物用硅胶柱(体积比为1∶2的乙酸乙酯/石油醚)精制，得到17-丙磺酰苄氧苄氧基青藤碱。[α]²⁵ _D+210.5°(c＝0.06CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，DCCl₃)δ：7.56(d，1H，J＝8.7Hz)，7.48-7.34(m，4H)，7.03(d，1H，J＝8.7Hz)，6.81(d，1H，J＝8.7Hz)，6.78(d，1H，J＝8.7Hz)，5.47(s，1H)，5.27(d，1H，J＝10.5Hz)，5.11(s，1H)，5.01(d，1H，J＝10.5Hz)，4.37(s，1H)，4.21(d，1H，J＝15.9Hz)，3.85(s，3H)，3.53(s，3H)，3.52-3.44(m，1H)，3.28-3.20(m，1H)，2.97-2.85(m，4H)，2.74-2.55(m，1H)，2.47(d，1H，J＝15.9Hz)，1.94-1.83(m，3H)，1.80-1.65(m，1H)，1.07(t，3H，J＝7.2Hz)。

第二步：

在室温下，17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱(50mg)被添加到5ml的5％TFA/DCM溶液里。搅拌5分钟后，缓慢加入5ml的10％碳酸氢钠溶液。有机层分离，用无水硫酸钠干燥，然后过滤；滤液蒸发得残留物，用硅胶柱精制，得目标产物，为白色固体。mp 110.0-113.0℃；[α]²⁵ _D+48.2°(c＝0.35CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，DCCl₃)δ_H：6.69(d，1H，J＝8.4Hz.)，6.57(d，1H，J＝8.4Hz.)，6.04(s，1H)，5.44(d，1H，J＝1.8Hz.)，4.40-4.35(m，2H.)，3.84(s，3H)，3.56-3.54(m，1H)，3.51(s，3H)，3.18-3.16(m，1H)，3.02-2.95(m，3H)，2.91-2.85(m，1H)，2.83-2.76(m，1H)，2.48(d，1H，J＝16.0Hz.)，2.07-2.01(m，1H)，1.90-1.82(m，3H)，1.08(t，3H，J＝7.4Hz.)。

例3 17-对甲苯磺酰青藤碱的制备

第一步：

在含有17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱(100mg)和三乙胺(0.1ml)的二氯甲烷(10ml)混合液里，逐滴加入含有30mg对甲苯磺酰氯的5ml二氯甲烷溶液。室温下混合搅拌10分钟，然后减压蒸发，得17-对甲苯磺酰苄氧苄氧基青藤碱的粗产物，它可以直接用于下一步反应而无需净化。

第二步：

在此例的第一步里所获得的100mg 17-对甲苯磺酰苄氧苄氧基青藤碱，如同例2里的第二步所示，加入10ml 5％TFA/DCM溶液后，可以生成50mg的17-对甲苯磺酰青藤碱。mp 141.0-143.0℃；[α]¹⁰ _D+92.4°(c＝0.49CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，DCCl₃)δ：7.74(d，2H，J＝7.6Hz.)，7.33(d，2H，J＝7.6Hz.)，6.62(d，1H，J＝8.3Hz.)，6.38(d，1H，J＝8.3Hz.)，6.00(s，1H)，5.40(s，1H)，4.49(s，1H)，4.32(d，1H，J＝15.70Hz.)，3.80(s，3H)，3.71-3.67(m，1H)，3.49(s，3H)，3.05-2.99(m，1H)，2.84(s，1H)，2.74-2.59(m，2H)，2.46(s，3H)，2.37(d，1H，J＝15.7Hz.)，1.97-1.93(m，1H)，1.75-1.70(m，1H).¹³CNMR(75MHz，DCCl₃)δ：193.51，153.11，145.57，145.06，143.77，138.03，130.20，129.03，128.87，127.39，121.36，119.07，115.31，113.30，109.81，56.43，55.25，51.14，48.95，45.13，40.82，39.96，35.57，30.99，21.94。

例4 17-环丙甲基青藤碱的制备

第一步：

向溶于甲醇(30mg)的17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱(100mg)里，加入环丙基甲醛(10ml)和NaBH₃CN(50mg)。室温搅拌反应的混合物6小时。去除溶剂得残留物，用20ml氯仿溶解此残留物，加入10ml 5％的氯化铵溶液。分离有机层，无水硫酸钠干燥，然后减压蒸发，得到17-环丙甲基苄氧苄氧基青藤碱粗品。

第二步：

如同例2所示的，此粗品加入10ml 5％TFA/DCM溶液，生成白色固体17-环丙甲基苄氧苄氧基青藤碱。mp：127.0-127.5℃；[α]²⁵ _D-5.3°(c＝0.52，CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.62(d，1H，J＝8.4Hz)，6.51(d，1H，J＝8.4Hz)，6.09(s，1H)，5.49(d，1H，J＝2.0Hz)，4.35(d，1H，J＝15.6Hz)，3.79(s，1H)，3.50(s，1H)，3.49-3.42(m，1H)，3.04-3.02(m，1H)，2.90(d，1H，J＝18.3Hz)，2.80-2.76(m，1H)，2.73-2.63(m，1H)，5.53-2.48(m，1H)，2.46(d，1H，J＝15.6Hz)，2.35-2.30(m，1H)，2.03-1.91(m，1H)，1.89-1.80(m，1H)，0.90-0.83(m，1H)，0.52-0.49(m，2H)，0.15-0.11(m，2H).¹³CNMR(75MHz，CDCl₃)δ：194.47，152.71，145.27，145.06，130.98，123.21，118.53，115.87，109.29，60.36，56.42，55.15，55.03，49.71，46.20，46.01，41.51，36.36，25.52，9.77，4.47，4.06。

例5 17-环丙甲基青藤碱盐酸盐的制备

例4中所获得的17-环丙甲基青藤碱(50mg)，用DCM(2ml)溶解，然后，用玻璃管加入无水盐酸，得到标题所示的白色固体化合物。

例6 17-环戊基青藤碱的制备

如例4所阐述的，用环戊酮和17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱制备得到白色固体的标题所叙述的化合物。mp：180.0-182.0℃；[α]²⁵ _D-69.5°(c＝0.48，CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.65(d，1H，J＝8.3Hz)，6.55(d，1H，J＝8.3Hz)，5.98(s，1H)，5.48(s，1H)，4.36(d，1H，J＝15.6Hz)，3.82(s，3H)，3.51(s，3H)，3.45-3.41(m，1H)，3.07-3.01(m，2H)，2.90-2.69(m，3H)，2.46(d，1H，J＝15.6Hz)，2.05-1.85(m，6H)，1.85-1.70(m，2H)，1.61(m，1H)，1.50-1.40(m，2H).¹³CNMR(75MHz，CDCl₃)δ：194.50，152.65，145.29，145.05，130.91，123.15，118.49，115.85，109.30，63.84，56.43，55.15，53.95，49.60，46.15，45.18，41.18，36.45，32.03，31.42，25.03，24.17，23.98。

例7 17-(2’-氧代-丙基)青藤碱的制备

将17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱(100mg)和碳酸钾(30mg)溶于丙酮(10ml)，混合搅拌后，加入1-氯丙酮(20mg)，加热反应混合物，回流30分钟。冷却后，过滤，然后蒸发溶剂得到残渣，用硅胶柱(1∶1乙酸乙酯/石油醚)提纯，得到17-(2’-氧代-丙基)苄氧苄氧基青藤碱，呈胶质固体。[α]²⁵ _D+27.5°(0.11CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，DCCl₃)δ：7.55(d，1H，J＝8.7Hz)，7.48-7.34(m，5H)，7.02(d，2H，J＝8.7Hz)，6.78(s，2H)，5.47(s，1H)，5.27(d，1H，J＝10.8Hz)，5.11(s，2H)，5.01(d，1H，J＝10.8Hz)，4.20(d，1H，J＝15.9Hz)，3.84(s，3H)，3.57-3.3.53(m，2H)，3.52(s，3H)，3.52-3.35(m，1H)，3.27(m，1H)，2.94(s，2H)，2.76-2.70(m，1H)，2.50(d，1H，J＝15.9Hz)，2.24(s，3H)，1.94-1.83(m，1H)，1.87-1.82(m，2H)。

如例4所示的，17-(2’-氧代-丙基)苄氧苄氧基青藤碱(60mg)加入5％TFA/DCM(5ml)，得到白色固体17-(2’-氧代-丙基)青藤碱。mp147.2-148.0℃；[α]²⁵ _D+53°(c＝0.21CHCl₃)；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.65(d，1H，J＝8.3Hz)，6.54(d，1H，J＝8.3Hz)，5.99(s，1H)，5.44(d，1H，J＝1.5Hz)，4.36(d，1H，J＝15.6Hz)，3.82(s，1H)，3.49(s，1H)，3.44(d，1H，J＝17.1Hz)，3.29(d，1H，J＝17.1Hz)，3.25(m，1H)，3.12(s，1H)，2.98-2.70(m，2H)，2.57-2.53(m，1H)，2.47(d，1H，J＝15.6Hz)，2.21(s，3H)，2.18-2.10(m，1H)，1.96-1.91(m，2H)。

例8 17-环丙基甲酰青藤碱的制备

将17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱(100mg)和环丙基甲酸(18mg)溶于DCM(10ml)，得混合液，再加入DCC(45mg)，室温搅拌6小时后，过滤反应液，用饱和的碳酸氢钠溶液(2×10ml)洗脱。用Na₂SO₄干燥有机层，蒸发，得到固体粗品。如例2所示的，这个粗品直接和5％TFA/DCM(20ml)反应，得到一白色固体。mp＞187.0℃；+144.2°(c 0.22CHCl₃)；¹HNMRδ：6.69(d，1H，J＝8.1Hz.)，6.54(d，1H，J＝8.1Hz.)，6.05(s，1H)，5.50(s，1H)，5.17(s，0.7H)，4.78(br s，0.3H)，4.41(d，1H，J＝15.6Hz.)，4.04-4.00(m，0.7H)，3.84(s，3H)，3.54，3.52(each s，0.9，2.1H)，3.43(s，0.3H)，3.25-3.10(m，1H)，3.02-2.93(m，1H)，2.83(s，1H)，2.69(d，1H，J＝17.7)，2.46(d，1H，J＝15.6Hz.)，2.10-2.06(m，1H)，1.90-1.80(m，1H)，1.75-1.65(m，1H)，1.05-1.00(m，2H)，0.85-0.70(m，2H)。

例9 17-(3′，5′-二甲基-苯甲酰)青藤碱的制备

将17-去甲基苄氧苄氧基青藤碱(100mg)和三乙胺(0.05ml)溶于DCM(10ml)，得混合液，再加入3，5-二甲基-苯甲酰氯(50mg)。反应物在室温下搅拌约5分钟，然后除去部分溶剂(约7ml)，得残渣。如例2所示的，这个残渣里加入5％TFA/DCM(10ml)又得到一残余物。这个残余物用硅胶柱(1∶1乙酸乙酯/石油醚)进行层析分离，获取到标题所示的化合物。

例10 化学结构式I的化合物的具体说明

下面的图表提供了化学结构式I包含的化合物的特举实例。每个化合物具体的特征是由，取代先导体青藤碱甲基的R集团的，不同数量和不同结构的替代基而决定的。虽然表上陈列了69种化合物，但实际的数量可能会远远多于此发明里所包含的数量。

修饰的青藤碱化合物

                        表A

              表B

                    表C

Compound 55 R¹＝R²＝H，R³＝OCH³，R⁴＝OH，R＝CO-CONEt₂

Compound 56 R¹＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 59 R¹＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 60：R′＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 61：R′＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 62：R′＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 63：R′＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 64：R′＝Br，R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 65：R′＝Br R＝Br，R³＝OCH₂Ph，R⁴＝OH，

Compound 66：R′＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 67：R′＝R²＝H，R³＝OCH₂Ph，R⁴＝OH，

Compound 68：R′＝R²＝H，R³＝OCH₃，R⁴＝OH，

Compound 69：R′＝R²＝H，R³＝OCF₃，R⁴＝OH，

例11青藤碱衍生物组合库的建立

本发明的组合库里的成员化合物有以下结构：

或更多特异的

和/或

传统的化学合成方法是由，单一的步骤和单一的反应所组成。其概念，是一种化合物的产生是源于一个化学反应。例如，如下图所示，在适当的反应条件下，R₁COOH和R₂NH₂反应会产生一个新的单一化合物。但是，这一传统方法成本高，效率低下。

组合化学的概念是R₁COOH和R₂NH₂之间进行多种的反应。这些反应可以产生多个可用于测试的化合物。如图1所示的反应，50种R₁COOH和50种R₂NH₂反应后能产生含有2500种酰胺的组库。这种方法的效率大大高于传统的化学合成。

图1普通化学和组合化学

Figure 1.Conventional Chemistry and Combinatorial Chemistry

Conventional Chemistry：

1acid×1amine＝1amide

Combinatorial Chemistry：

50acids×50amines＝2500amides

组合化学有两个基本方法：固相合成和液相合成。

固相合成：

简单来说，小的分子可通过化学键来键合高分子材料，如聚苯乙烯。因为高分子材料的可扩展在有机溶剂中，化学试剂能弥漫到高分子材料里与其中的化学分子进行反应。化学反应完成后，杂质和其他不需要的化合物可被滤去或洗脱。针对新的分子或化合物，可以使用适当的化学方法提取。固相合成的优势是可以避免使用传统方法如使用柱层析或蒸馏精制产品的不利之处。在这种类型的合成里，最著名的方法是所谓“混合和裂解”的方法。使用这种方法，许多化学反应的步骤可以削减。举例来说，建立一个化合物库，其中有三个修饰处(50×50×50库)，建立含125000个化合物的化合物库需要150个反应。可是，如果使用传统的化学合成或平行合成，建立含125000个化合物的化合物库却需要125000化学反应。

液相合成

在液相合成里，平行合成是主要的方法。液相合成的概念是基于传统的化学反应发生多个化学反应。举例来说，为了获得一个2500个化合物的库，用50种酸和50种胺，需要2500个化学反应。这种做法的优势是，无须花太多时间优化实验条件，化合物生产量大大提高，且容易操作。缺点是效率较低。

组合化学的方法已被广泛用于寻找新的化合物。然而，组合化学尚未被用来修修饰传统中药的重要结构。下面图表中，我们设计了具体的组合化学合成的方法，建立青藤碱衍生物库：(图表1)：

·青藤碱与高分子物质，如聚乙烯苯，在适当的化学条件下，进行反应。

青藤碱与聚乙烯苯通过共价键结合产生一个中间体(1)。

·N-甲基被选择性除去，获得中间体(2)。

·中间体(2)被放入50个不同的反应容器里，与50种醛(R₁CHO，在这里R₁是不同的基团)，通过还原氨化反应获得的中间体(3)。

·在适当的条件下，青藤碱衍生物可以从聚合物中裂解出来，从而得到50种青藤碱衍生物库。若用500种醛就能建立500种青藤碱衍生物库。

这些化合物可用于生物活性的进一步筛选。

中间体(3)可用于为了建立新化合物库所需进行的其他化学反应，如下图2所示。可以选择性地还原中间体(3)的羰基，而得到中间体(5)。接着使用“混合和裂解”方法，让中间体(5)与50种R₂X起反应，就能生产出青藤碱衍生物(6)。最后，化合物从聚合物中裂解出来，从而建立2500种青藤碱衍生物库。

例12生物活性

青藤碱衍生物活性，是通过测量其对在培养的人全血中细胞因子释放的抑制来评估的。人的血液在受到LPS的刺激白细胞后会释放细胞因子。细胞因子也可由单核细胞(用酵母聚糖A刺激)(Hartman DA et al：InflammRes 1995；44：269-274)，或淋巴细胞(用SEB)(Hermann et al：Journal ofImmunological Methods 2003；275：69-79)所释放。

在类风湿关节炎中起着重要作用的4种细胞因子TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8，在这里被用来测试青藤碱衍生物的生物活性。因为在类风湿关节炎的病理里，TNF-α是最重要的反应媒介因子，我们首先通过测试各种化合物对TNF-α的抑制能力，来确定活性最强的重要化合物，然后，测量这些化合物对其它细胞因子(IL-1，IL-6和IL-8)的抑制能力和IC₅₀。

一般认为，在人全血中对于细胞因子释放起抑制作用的化合物，在体内也很可能发挥同样的抑制作用。(Hartman et al.，Inflamm Res 1995；44：269-274；Hermann et al.，Journal of Immunological Methods 2003；275：69-79；Zhang Y et al：International Immunopharmacology 2004；4：1845-1857；Zhang Yet al.，J.of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2004；309：348-355；Lagrelius M et al.，Cytokine 2006；33：156-165.)。因此，对在人全血中细胞因子抑制化合物的确定，会为发现有效的临床治疗药物提供捷径。

多年以来，人全血的细胞因子释放模型已被用来描述各种疾病的特性，例如：多发性硬化症(Beck et al.，1988 Acta Neurol.Scand.78，318-323.；Chofflon et al.，1991，Schweiz.Arch.Neurol.Psychiatr.142，107-112；1992，Eur.Cytokine Netw.3，523-531.)，利什曼病(Frankenburg and Klaus，1991)，类风湿关节炎(Zangerle et al.，1992，Cytokine 4，568-575)，，败血症(Volk et al.，1991，Behring Inst.，208-2 15.；Ertel et al.，1993，Surgery 114，243-250(discussion 250-1)；Ertel et al.，1994，Arch.Surg.129，90-97(discussion97-8)1994)；癌(Elsasser-Beile et al.，1993a，b)，艾滋病毒感染(Hartung et al.，1998，J.Infect.Dis.178，686-692.)和疏螺旋体病(Diterich et al.，2001)。该方法在炎症监测和免疫调节治疗方面也被证明是有价值的，如用G-CSF或白介素-10治疗健康志愿者(Hartung et al.，1995，1999；von Aulock et al.，2000；Chernoff et al.，1995，J.Immunol.154，5492-5499)，或用G-CSF治疗病人(Hartung et al.，2000)。

1.In vivo的方法

简述

青藤碱衍生物经过测试，确认是一类稳定的有生物活性的化合物，它们可以和许多无活性的物质一起被送入体内，比如和淀粉，凝胶等混合制作成药片和/或胶囊以供口服，在我们的实验里，为了在体内测试青藤碱衍生物的生物活性，青藤碱衍生物的最终浓度被设在30mg/ml，它是用2％Tween 80和0.5％Methylcellulose vehicle调制，以供大鼠的经口投药。除此之外，青藤碱衍生物也可以溶于水或者缓冲液溶剂，以供多种形式临床使用。比如：5％的葡萄糖注射液，生理盐水，葡萄糖，磷酸缓冲液等。使用这些溶剂，青藤碱衍生物可制成注射液，以供静脉注射或输液，皮下注射，肌肉注射。

动物实验的方法

青藤碱衍生物的抗炎效果，使用动物关节炎模型进行评定。比如，adjuvant-诱导的大鼠关节炎模型和胶原蛋白诱导的小鼠关节炎模型。

辅剂(adjuvant)-诱导的大鼠关节炎模型

此关节炎模型是用雄性的Lewis大鼠诱导。参照已经发表的文章(Zhang，et al：International Immunopharmacology 2004；4：1845-1857)，具体方法是，从大鼠尾部皮内注射0.1ml Freund’s Adjuvant-Complete(Signa-Aldrich，Saint Louis，MO)。八天之后，大鼠发生关节炎并且出现相应的损伤，。其后，动物被随机分成二组，每组至少包含6只大鼠.第1组为治疗：用2％Tween80和0.5％Methylcellulose vehicle制备的最终浓度为30mg/ml的青藤碱衍生物经口给药，每天2次，剂量为1mg/kg。第2组为对照组：只使用2％Tween80和0.5％Methylcellulose vehicle经口给药。在21天的治疗期间里，每天观察大鼠后肢的肿胀和红斑情况以观测治疗的效果(Zhang et al：International Immunopharmacology 2004；4：1845-1857)。血液样品在第5天，第10天，第21天从末梢血管采取，以供测量血浆中的TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8的水平。在治疗开始后的第21天，使用CO₂处死动物。其后进行尸检，采取跗骨接合部和跗骨接合部滑膜组织，以供组织学的检查。

胶原蛋白诱导的小鼠关节炎模型

2型胶原蛋白乳液是用牛II型胶原蛋白溶液，是和0.01M醋酸和Freund’s complete adjuvant(Signa-Aldrich，Saint Louis，MO)混合制备而成(POLYTRON，KINEMATICA，Switzerland)。比例是，牛的II型胶原蛋白溶液∶0.01M醋酸∶Freund’s complete adjuvant＝2∶1∶3。最后得到1mg/ml的II型胶原蛋白乳液。

DBA1/J小鼠尾部末端注射0.1ml的乳液二十天后，使用100μg的II型胶原蛋白和Incomplete Freund’s Adjunvant促进小鼠的疾病变化。关节炎模型是否建立成功的判断标准，是依据最近文献发表的4个病理判断等级(Wada et al：European Journal of Pharmacology 2005；506：285-295)。当任何一个后掌出现的病理变化超过3度病理变化时，这一天设置为day 0。从此时开始，小鼠每天接受持续21天的100mg/kg的青藤碱衍生物的经口给药。青藤碱衍生物是用2％Tween 80和0.5％Methylcellulose vehicle制备而成。二组小鼠(每组12只)用作研究：治疗组和对照组(只使用2％Tween 80和0.5％ Methylcellulose vehicle)。在21天的治疗过程中，将根据同样的病理判断标准，每天观测关节炎的严重程度。使用CO₂处死所有的动物后，每只小鼠的四掌将会被采取用作组织学研究。

2.为测试细胞因子的释放而准备人的全血培养液

人血样(～20ml)是从健康的志愿者(男性，20-50岁，非吸烟者)末梢静脉采取(10ml)，立即装入灭菌的无内毒素的ethylenediaminetetra-acetic(EDTA)试管。血样分成3个不同的实验组：对照组，LPS单独刺激组，和LPS加待测化合物组。每组包含5个血样，分别来自不同的个体。在对照组，100μl的全血血样用900μL的RPMI 1640稀释于24孔板。在LPS单独刺激组和LPS加待测化合物组，100μl的全血血样里加入1μl的待测化合物或是DMS0后，稀释于889ul的RPMI 1640(RPMI 1640由25mMHepes，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，4mM 1-glutamine和10％胎牛血清组成)。从以上3组得到的所有的样品在37℃，5％CO₂的条件下培养15分钟。其后每个样品加入10μl LPS(1μg/ml)(对照组除外)，37℃，5％CO₂的条件下培养6小时。样品放于冰上3分钟，4℃ 1500g离心10分钟。回收离心后的上清液，储存于-80℃，以供TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8的分析。每组中的添加物列表如下：

3.使用人全血培养对TNF-α的抑制分析法，鉴定待测青藤碱衍生物中的关键化合物

本实验用以上所叙述的各青藤碱衍生物，测定对于全血培养物里TNF-α释放量的抑制作用。我们用人TNF-αEnzyme Immunometric Assay Kit(Lot.235123)(R&D Systems公司(MN，USA))，来测定TNF-α的释放量。具体的方法是依照试剂盒所提供的使用说明书。LPS-诱导的全血培养物中TNF-α的释放量是884.2±329.8pg/ml。根据待测青藤碱衍生物对这一TNF-α释放量的抑制能力之强弱，22个待测青藤碱衍生物被分为3组：

第一个实验组：如被测化合物对于LPS-诱导释放的TNF-α量的抑制率超过40％，这些即被定义为“关键化合物”以用作进一步研究。有7个化合物可将LPS-诱导的TNF-α的释放量从884.2±329.8pg/ml抑制到530pg/ml以下。这些化合物对TNF-α释放量的抑制率从40.2％到64.1％不等，它们分别是第#20，#33，#37，#39，#44，#48和#54化合物。

图1A和1B显示了这些化合物对于LPS-诱导的TNF-α量的绝对数值的抑制效果，和百分比抑制效果(条状图是根据化合物生物活性的顺序排列)。

第二实验组：有5个化合物对于LPS-诱导释放的TNF-α量的抑制率小于40％，但大于30％。这一组化合物将TNF-α的浓度从884.2±329.8pg/ml被抑制到530pg/ml-650pg/ml。这些化合物对TNF-α释放量的抑制率从31％到38.3％不等，它们分别是第#18，#42，#43，#46和#49号化合物。图2A和2B显示了这些成分对于LPS-诱导的TNF-α量的绝对数值的抑制效果，和百分比抑制效果(条状图是根据活性的顺序排列)。

第三实验组：这组里有10个化合物，这些化合物对于LPS-诱导释放的TNF-α量的抑制率小于30％，分别从29.5％到-5.2％不等，它们是第#1，#2，#5，#9，#10，#14，#15，#28，#36和#47号化合物。图3A和3B显示了这些成分对于LPS-诱导的TNF-α量的绝对数值的抑制效果，和百分比抑制效果(棒状图是根据活性的顺序排列)。

因为TNF-α在风湿性关节炎和其他炎症相关疾病起着重要的作用，所以，对于LPS-诱导释放的TNF-α的抑制率超过40％的化合物，将被用作进一步的研究，以确定对于LPS-诱导释放的TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8的IC₅₀。由于第#54和#44号化合物是混合的化学异构体，这两个混合物没有用来做进一步的测试。以下的化合物浓度被选择用来测量IC₅₀：10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5和10^-4Mol/L.青藤碱作为对照，从而能够揭示青藤碱新化合物比青藤碱对细胞因子抑制有效性增加了多少。IC₅₀是使用calcdemo软件程序计算而得的。

4.5个关键化合物抑制LPS-诱导的TNF-α释放量的IC₅₀

图4显示了5个关键化合物对于LPS-诱导释放的人全血培养物中的TNF-α的抑制效果的量效曲线((浓度：10^-9-10^-5mol/L)。血样和LPS(浓度：10ng/ml)一起培养6小时。青藤碱被用作对照。由于所有化合物在10^-9mol/L浓度上，包括青藤碱在内，对于LPS-诱导的TNF-α没有抑制效果，因此在图中，10^-9mol/L浓度的化合物加入后的TNF-α的释放水平，按照LPS组的TNF-α释放水平表示。a图中(a₁-a₆)显示了TNF-α的释放量，b图中(b₁-b₆)显示了对于LPS-诱导的TNF-α释放量的抑制百分比。所有结果以平均值±标准差表示。5个关键化合物对LPS-诱导的TNF-α释放量抑制的IC₅₀总结于下表格：

5.5个关键化合物对于抑制LPS-诱导的IL-1释放量的IC₅₀

所测化合物对于LPS-诱导释放的IL-1的抑制活性，是用CaymanChemical公司(MI，USA)提供的IL-1β Enzyme Immunometric Assay Kit试剂盒(Lot number 145020)检测。试剂盒中的说明书详细解释了使用方法。试剂盒也提供了所有的试剂和溶液：

1)按照说明书的指导，正确准备实验中所需的试剂和溶液，测定生化活性。

2)试剂盒提供了标准品。使用上述添加了待测化合物的血液样品和添加了LPS的血液样品进行测试。从每个样品中采集50ul，加入到孔中。其后，10μL DTT，5μL小鼠血清和100μL Fab’被分别加入每个孔中。用胶粘带覆盖后，在4℃培养过夜。根据标准品和样品分析和记录的需要，设计板面。

3)使用自动洗板机，和试剂盒所提供的600μL洗液，清洗每个孔。清洗后完全去除每孔中的残存液体，以保证实验的精确执行。总共清洗5次。

4)清洗结束后，将200μL的Ellman’s reagent加入到每个孔中，用一页黑纸覆盖在上面，温和摇动，室温培养4小时。

5)最后，每孔的吸光度用酶标仪读取，吸收光设定在412nm。

图5显示了5个关键化合物对于LPS-诱导释放的人全血培养物中的IL-1的抑制效果的量效曲线((浓度：10^-9-10^-5mol/L)。血样和10ng/ml的LPS共同培养6小时。青藤碱对于IL-1的抑制效果也被测定。由于所有待测化合物在10^-9mol/L浓度上，包括青藤碱在内，对于LPS-诱导的IL-1没有抑制效果，因此在图中，加入了10^-9mol/L的所有化合物后的IL-1的释放水平，按照LPS组的IL-1释放水平表示。a图中(a₁-a₆)显示了IL-1的释放量，b图中(b₁-b₆)显示了所测化合物对于LPS-诱导的IL-1释放量的抑制百分比。所有结果的表现形式为平均值±标准差。

5个关键化合物对于抑制LPS-诱导的IL-1释放量的IC₅₀总结于下表格：

6.5个关键化合物对于抑制LPS-诱导IL-6释放量的IC₅₀

所测化合物对于脂多糖-诱导释放的IL-1的抑制活性，是用Biosource公司(Carlsbad，CA，USA)提供的人IL-6 Elisa Kit试剂盒(Lot number054204D)检测。试剂盒中的说明书详细解释了使用方法，如下所示。试剂盒提供了所有的试剂和溶液：

1)按照说明书的指导，正确准备实验中所需的试剂和溶液，测定生化活性。

2)试剂盒提供了50ul标准品溶液。使用上述添加了所测化合物的血液样品和只添加了LPS的血液样品进行测试，加入到每个孔中。其后，50μL的Biotin Conjugate被追加到每个孔中。用胶粘带覆盖后，在室温培养2小时。3)使用自动洗板机，和试剂盒所提供的600μL洗液，清洗每个孔。每一步都完全去除每孔中的残存液体，以保证实验的精确执行。总共清洗4次。

4)每个孔中加入100μL Streptavidin-HRP working solution，用新的胶粘带覆盖空后，在室温培养30分钟。

5)如同第3步所描述，重复洗板过程。

6)每个孔中加入100μL Stabilized Chromogen，室温培养30分钟。注意遮光。

7)每个孔中加入100μL Stop Solution。

8)Stop Solution加入后30分钟内，吸光度用酶标仪读取，吸收光设定在450nm。

图6显示了5个关键化合物对于LPS-诱导释放的人全血培养中的IL-6的抑制效果的量效曲线((浓度：10^-9-10^-5mol/L)。血样和10ng/ml的LPS共同培养6小时。青藤碱对于IL-6的抑制效果也被测定。由于所有化合物在10^-9mol/L浓度上，包括青藤碱在内，对于LPS-诱导的IL-6没有抑制效果，因此在图中，加入了10^-9mol/L所测化合物后的IL-6的释放水平，按照LPS组的IL-6产生水平表示。a图中(a₁-a₆)显示了IL-6的释放量，b图中(b₁-b₆)显示了化合物对于LPS-诱导的IL-6释放量的抑制百分比。所有结果以平均值±标准差表示。

5个关键化合物对抑制LPS-诱导的IL-6释放量的IC₅₀总结于下表格：

7.5个关键化合物对于抑制LPS-诱导的IL-8释放量的IC₅₀

所测化合物对于LPS-诱导产生的IL-1的抑制活性，是用Biosource公司(Carlsbad，CA，USA)提供的人IL-8Elisa Kit试剂盒(Lot number 061302B)检测。试剂盒中的说明书详细解释了使用方法，如下所示。试剂盒提供了所有的试剂和溶液：

1)按照说明书的指导，正确准备实验中所需的试剂和溶液，以测定生化活性。

2)试剂盒提供了标准品溶液。每个孔中加入50μL添加了所测化合物的血液样品，和添加了LPS的血液样品进行测试。其后，50μL的Biotin Conjugate被追加到每个孔中。用胶粘带覆盖后，让它们在室温培养1.5小时。

3)使用自动洗板机，和试剂盒所提供的600μL洗液，清洗每个孔。每一步都完全去除每孔中的残存液体，以保证实验的精确执行。总共清洗4次。

4)每个孔中加入100μL Streptavidin-HRP working solution，用新的胶粘带覆盖后，在室温培养30分钟。

5)如同第3步所描述，重复洗板过程。

6)每个孔中加入100μL Stabilized Chromogen，室温培养30分钟。注意遮光。

7)每个孔中加入100μL Stop Solution。

8)Stop Solution加入后30分钟内，每孔的吸光度用酶标仪读取，吸收光设定在450nm。

图7显示了5个关键化合物对于LPS-诱导释放的人全血培养物中的IL-8的抑制效果的量效曲线((浓度：10^-9-10^-5mol/L)。血样和10ng/ml的LPS共同培养6小时。青藤碱对于IL-8的抑制效果也被测定。由于在所有化合物10^-9mol/L浓度上，包括青藤碱在内，对于LPS-诱导的IL-8没有抑制效果，因此在图中，加入了10^-9mol/L所测化合物后的IL-8的释放水平，按照LPS组的IL-8释放水平表示。a图中(a₁-a₆)显示了IL-8的释放量，b图中(b₁-b₆)显示了所测化合物对于LPS-诱导的IL-8释放量的抑制百分比。所有结果以平均值±标准差表示。

5个关键化合物对抑制LPS-诱导的IL-8释放量的IC₅₀总结于下图：

Claims (14)

1.一种式(I)的化合物：

式I，

其中

苯环上的R¹、R²、R³、R⁴为独立地选自由以下各基团组成的群组的取代基：H、-OH和1到20个碳原子的烷氧基；

R为磺酰基R⁵S(O₂)-，其中R⁵为具有1到20个碳原子的未分枝、分枝或环状饱和或不饱和烷基，或视情况经取代的苯或萘；

或其医药学上适当的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中R具有式R⁵S(O₂)-，其中R⁵为具有1到20个碳原子的未分枝、分枝或环状饱和或不饱和烷基，或视情况经取代的苯或萘，其中烷基、苯或萘视情况经一个或多个独立地选自由以下各基团组成的群组的基团取代：卤素、-CN、-N₃、硝基、酰基、氨基和羟基；并且其中所述其医药学上可接受的盐为酸加成盐。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中R为

其中R⁷为氢原子，或经取代或未经取代、分枝或未分枝或环状且具有1到20个碳原子的饱和或不饱和烷基，或具有1到20个碳原子的经取代或未经取代的醚、酯、酰胺、胺或硫醚；并且R⁸为氢原子、具有1到20个碳原子的经取代或未经取代的烷基，或具有1到20个碳原子的经取代或未经取代的醚、酯、酰胺、胺或硫醚，或其医药学上可接受的酸加成盐。

4.根据权利要求2所述的化合物，其中R为

其中所述医药学上可接受的盐为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、富马酸、酒石酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、丙酮酸、丙二酸或戊二酸的酸加成盐。

5.一种化合物，选自：17-甲烷磺酰基青藤碱、17-乙烷磺酰基-青藤碱、17-丙烷磺酰基青藤碱。

6.一种化合物，选自：17-对甲苯磺酰基青藤碱、17-(4’-乙酰基氨基)苯磺酰基青藤碱、17-(2’-甲基-6’-甲氧基羰基)-苯磺酰基青藤碱。

7.一种医药组合物，其包含一定量用于抑制炎症的根据权利要求1至3中任一权利要求所述的化合物，并且另外包含医药学上可接受的赋形剂和/或载剂。

8.根据权利要求7所述的医药组合物，其中所述化合物为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、富马酸、酒石酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、丙酮酸、丙二酸或戊二酸的酸加成盐。

9.根据权利要求7至8中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述式I化合物中的R为

10.一种根据权利要求1至6中任一权利要求所述的化合物的用途，其用于制备适用于治疗炎症的医药组合物。

11.根据权利要求10所述的化合物的用途，其中所述炎症为关节炎。

12.根据权利要求11所述的化合物的用途，其中所述关节炎为类风湿性关节炎或骨关节炎。

13.根据权利要求12所述的化合物的用途，其中所述关节炎为类风湿性关节炎。

14.根据权利要求12所述的化合物的用途，其中所述关节炎为骨关节炎。

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