CN101570571A

CN101570571A - 截短的人乳头瘤病毒18型l1蛋白

Info

Publication number: CN101570571A
Application number: CNA2008100938172A
Authority: CN
Inventors: 李少伟; 沈文通; 李仲艺; 谢明辉; 潘晖榕; 夏宁邵
Original assignee: Xiamen University; Beijing WanTai Biological Pharmacy Enterprise Co Ltd
Current assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-04-29
Filing date: 2008-04-29
Publication date: 2009-11-04
Anticipated expiration: 2028-04-29
Also published as: US20100272751A1; CN101570571B; EP2147926A4; US9364529B2; DK2147926T3; EP2147926B1; EP2147926A1; WO2008134935A1; BRPI0815818A2; HK1133892A1

Abstract

本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒18型L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒，含该类病毒颗粒的疫苗及其在预防宫颈癌中的用途。

Description

截短的人乳头瘤病毒18型L1蛋白

技术领域

背景技术

人乳头瘤病毒HPV(Human Papillomavirus)属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放框。基因组按功能的不同可以分为三个区域：①早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4～E76个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；②晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；③长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制、表达调控元件。病毒颗粒直径为45～55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。

目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系又可分为3组：①低或无致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌风险组，包括HPV31、33、35、51、52；③高度癌风险组，包括HPV16、18、45、56。

HPV分子流行病学调查证实，高危型HPV感染是宫颈癌发生的重要启动因子。在所有宫颈癌标本中HPV DNA检出率高达80％以上，其中HPV16约占60％，HPV18紧随其后，约占15％(Clifford，G.，S.Franceschi，et al.Vaccine 2006.24 Suppl 3：S26-34.)。

宫颈癌是一种常见见的女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计每年世界范围内约有490,000例左右的新发病例，约有270,000人死于该疾病(Boyle，P.，and J.Ferlay.Ann Oncol 2005，16：481-8.)。在所有宫颈癌病例中，发生于发展中国家的占了约83％，在这些国家中，宫颈癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的15％。而在发达国家，这个数字仅占到1.5％。在撒哈拉以南地区，中南亚，拉丁美洲，东亚均为宫颈癌的高发区。我国也属于宫颈癌高发区。在陕西略阳县，已婚妇女中宫颈癌的发病率高达1026/100000。因此，安全有效的HPV疫苗，特别是针对HPV16，18等高危型别的疫苗，是有效预防宫颈癌，改善广大妇女健康状况的有效途径。

HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55～60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-LikeParticle，VLP)。该种类病毒颗粒为二十面体立体对称结构，由72个L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体。(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992 Proc Natl Acad Sci USA 89(24)：12180-4.)并且，类病毒颗粒并不带有病毒核酸，并无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。

HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。

常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已上市HPV疫苗

采用了酿酒酵母表达系统，其表达量低，生产成本高，因此该产品价位偏高，影响其广泛应用。

原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白已有报道。例如有报道利用大肠杆菌表达HPV16 L1蛋白(Banks，L.，G.Matlashewski，et al.(1987).J Gen Virol 68(Pt 12)：3081-9)。但是由于大肠杆菌所表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者上述蛋白虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV VLP(Kelsall，S.R.and J.K.Kulski(1995).JVirol Methods 53(1)：75-90)，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。HPV L1蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋白的纯化(Li，M.，T.P.Cripe，etal.(1997).J Virol 71(4)：2988-95.)，但融和蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。

因此，本领域仍然需要具有低成本，能够诱导产生针对HPV保护性抗体的HPVL1蛋白及由其组成的类病毒颗粒，从而使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的HPV18L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒及含该类病毒颗粒的疫苗。

本发明人经研究出人意料地发现，在大肠杆菌表达系统能得到可以诱导针对HPV16中和抗体的截短HPV18L1蛋白，该截短的HPV18L1蛋白经纯化后得到高产率，纯度至少50％的HPVL1蛋白。纯化后的HPVL1蛋白经进一步处理得到可诱导针对HPV18保护性抗体的类病毒颗粒，本发明基于以上发明现已完成。

因此，本发明第一方面涉及一种(与野生型HPV18L1蛋白相比)N端截短了50个、55个、60个、65个、或70个氨基酸的HPV18L1蛋白。优选该截短蛋白具有序列1，2，3，4，或5，特别是序列1。

本发明再一方面涉及编码本发明截短蛋白的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。

本发明再一方面涉及包含上述载体的细胞。

本发明还涉及包含上述截短蛋白或多核苷酸或载体或细胞的组合物。

本发明再一方面涉及一种HPV18类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒包含N端截短了50个、55个、60个、65个、或70个氨基酸的HPV18 L1蛋白例如具有序列1，2，3，4，或5的HPV18 L1蛋白，或者由N端截短了50个、55个、60个、65个、或70个氨基酸的HPV18 L1蛋白例如具有序列1，2，3，4，或5的HPV18 L1蛋白组成或形成。

本发明再一方面涉及一种获得HPV18 L1蛋白的方法，其包括在大肠杆菌表达系统中表达截短的HPV18 L1基因片段，然后将含有该截短蛋白的裂解上清进行纯化处理。

在一个优选实施方案中，获得HPV18 L1蛋白的方法包括

a)在大肠杆菌表达系统中表达截短的HPV18 L1基因片段，

b)将表达了截短HPV18 L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液，

c)用水或低盐溶液将b)上清液中盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，

d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的截短HPV18 L1蛋白。

更一般性地，本发明还涉及一种获得HPV L1蛋白例如本发明HPV18 L1蛋白的方法，其包括

a)在大肠杆菌表达系统中表达编码HPV L1蛋白的HPV L1基因，

b)将表达了HPV L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液，

d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的HPV L1蛋白。

本发明还涉及一种预防宫颈癌疫苗，其包括本发明的HPV18 L1蛋白类病毒颗粒，优选地，所述HPV18 L1蛋白类病毒颗粒以预防宫颈癌有效量存在。优选该疫苗还包含至少一种HPV16L1蛋白类病毒颗粒，HPV11L1蛋白类病毒颗粒，HPV6L1蛋白类病毒颗粒，HPV31L1蛋白类病毒颗粒，HPV33L1蛋白类病毒颗粒，HPV45L1蛋白类病毒颗粒，HPV52L1蛋白类病毒颗粒，HPV58L1蛋白类病毒颗粒的类病毒颗粒；优选地，这些类病毒颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效量存在。该疫苗通常还包含疫苗用赋形剂或载体。

优选地，所述疫苗含有：HPV16类病毒颗粒和HPV18类病毒颗粒，特别是，含有具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV16类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV18类病毒颗粒。更优选所述疫苗还含有HPV6类病毒颗粒和HPV11类病毒颗粒，特别是含有具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV6类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV11类病毒颗粒。

在一个特别优选的实施方案中，所述疫苗包含：含有具有SEQ IDNO：7所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV16类病毒颗粒，含有具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV18类病毒颗粒，含有具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV6类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV11类病毒颗粒；优选地，这些类病毒颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效量存在。

本发明进一步涉及本发明HPV18 L1蛋白或其类病毒颗粒在制备用于预防宫颈癌疫苗中的用途。

本发明还涉及一种预防宫颈癌的方法，其包括将含预防有效量的本发明HPV18 L1蛋白疫苗给予需预防宫颈癌的人。

本发明还涉及一种获得HPV18 L1蛋白类病毒颗粒的方法，其包括：

e)将纯度至少50％的截短HPV18 L1蛋白进一步通过色谱层析纯化，

f)将e)步骤中得到的HPV18 L1蛋白去除还原剂。

本发明还涉及一种制备用于预防宫颈癌疫苗的方法，其包括将上述类病毒颗粒与任选的一种或多种选自HPV6，11，16，31，33，45，52，和58的HPV型别的类病毒颗粒及疫苗用载体或者赋形剂混和。

本发明中相关术语的说明及解释

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“截短HPV18L1蛋白基因片段”是指在野生型HPV18 L1蛋白基因(cDNA)的5’端或3’端去掉编码一个或者多个氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV18 L1蛋白基因全长序列来源于举例但不限于NCBI数据库中如下序列：AY262282.1，X05015.1，AY863156.1，U89349.1等。

“截短HPV18 L1蛋白”是指在野生型HPV18 L1蛋白的N端和/或C端去掉一个或者多个氨基酸后的蛋白质，其中野生型HPV18 L1蛋白的例子有但不限于NCBI数据库中AY262282.1，X05015.1，AY863156.1，U89349.1等所编码的全长L1蛋白。

根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体“是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于：Tween-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“色谱层析“包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。

根据本发明，本发明的截短HPV18L1蛋白优选如下获得：将表达有截短HPV18L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100-600mM，优选200-500mM的缓冲液中进行破碎，分离破碎溶液，得到上清液，用水或低浓度(通常低于破碎用的盐浓度)盐降低所得上清液中盐浓度至盐浓度100Mm-0M，分离盐浓度低至100Mm-0的上清液中的沉淀；将沉淀在含还原剂及盐浓度150-2000mM优选200mM以上的溶液中重新溶解，分离，得到纯度至少为50％，优选至少70％，更优选至少80％的截短HPV18L1蛋白溶液。

根据本发明，在本发明获得的截短HPV18L1蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。

根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现；

根据本发明，在本发明获得的截短HPV18L1蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH₄Cl、(NH4)₂SO₄中的一种或几种。优选NaCl。所用的还原剂包括但不限于DTT，2-巯基乙醇。所用量包括但不限于10mM-100mM。

根据本发明，本发明的截短HPV18L1蛋白类病毒颗粒如下获得：将上述纯度至少50％的截短HPVL1蛋白溶液通过例如色谱层析进一步分离，得到纯化的截短HPV18L1蛋白溶液。去除纯化的截短HPV18L1蛋白溶液中的还原剂，得到截短HPV18L1的类病毒颗粒。去除还原剂的方式包括但不限于本领域已知技术，例如，透析，超滤或者层析等。

根据本发明，本发明的截短HPVL1蛋白优选具有序列1。

根据本发明，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。

根据本发明，本发明疫苗优选单位剂型使用，其中单位剂型中截短HPV18L1蛋白类病毒颗粒的量为5μg-80μg，优选20μg-40μg。

有益效果

目前HPV类病毒颗粒的制备所采用的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。

在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统所采用的杆状病毒表达系统及酵母表达系统均有表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难。

在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量大的优点。但在大肠杆菌表达系统中表达的HPV L1蛋白往往失去正确天然构象，以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中蛋白进行复性依然是一个世界性难题。复性困难，效率低下，使得从包含体中获得有正确构象的VLP在大规模生产中难以实施，只能局限于小规模的实验室研究中。虽然HPV L1也可以正确构象可溶性形式表达于大肠杆菌裂解上清中，但是表达量低下，而且要从大肠杆菌裂解上清中种类繁多的可溶性蛋白纯化出HPV L1蛋白也相当困难，往往需要借助融合表达及亲和层析等手段进行纯化，以上手段往往需要昂贵的酶，难以进行工业化生产。

本发明在大肠杆菌表达系统中表达N端截短HPV18 L1蛋白，并且采用温和的手段选择性沉淀表达在大肠杆菌裂解上清中的HPV18 L1蛋白，进一步采用含盐缓冲液重溶HPV18 L1蛋白，使得在保持HPV18 L1蛋白正确构象前提下使其纯度有了显著提高。且重溶后的目的蛋白可以直接进行离子交换层析及疏水交换层析纯化获得纯蛋白。通过以上步骤获得纯化后的截短HPV18 L1截短蛋白可以组装为类病毒颗粒，具有良好的免疫原性，可以诱导高滴度的针对HPV18的中和抗体，预防HPV18对人体的感染，是一种良好的疫苗形式。此外，本发明中采用的截短HPV18 L1蛋白易于在大肠杆菌表达系统中表达，所采用的纯化方法无需使用昂贵的酶，成本低廉。而且目的蛋白在纯化过程中构象没有经过剧烈的变性复性过程，损失小，可应用于大规模工业化生产。

在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。

附图说明

图1显示了在本发明方法步骤a)-d)过程中不同阶段HPV18N65C-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M：分子量Marker；1，10倍稀释后的菌体裂解上清2，经过切向流沉淀的HPV18N65C-L1 3，经重悬液重悬的HPV18N65C-L1电泳结果显示，HPV18N65C-L1蛋白在通过沉淀，复溶的步骤之后，纯度达到了约70％左右。

图2显示了步骤d)中所得的HPV18N65C-L1进一步经本发明步骤e)纯化后的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1：分子量Marker；1，经本发明步骤e)纯化所得HPV18N65C-L1上样5μl 2，经本发明步骤e)纯化所得HPV18N65C-L1上样25μl结果显示，经过本发明步骤e)纯化所得的HPV18N65C-L1纯度达到98％左右。

图3显示了步骤f)中所得的HPV18N65C-L1类病毒颗粒透射电镜观察(放大100,000倍，Bar＝100nm)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。

图4显示了步骤f)中所得的HPV18N65C-L1类病毒颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV18N65C-L1类病毒颗粒的水化分子动力学半径为29.38nm，颗粒组装百分比为100％。

图5显示了HPV18N65C-L1类病毒颗粒接种羊后不同阶段血清中和抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一周后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到10⁷的较高水平。

图6显示了HPV18N65C-L1类病毒颗粒接种兔后不同阶段血清中和抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一周后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到10⁶的较高水平。

图7显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV18总IgG抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，总IgG抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。

图8显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV18中和抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。

图9显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV16总IgG抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，总IgG抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。

图10显示了实施例5中HPV16/18二价疫苗接种恒河猴后不同时间的血清中的HPV16中和抗体滴度。免疫程序为0,4W(周)。第一次免疫后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到20,000倍。

图11显示了实施例5中HPV6/11/16/18四价疫苗接种小鼠后不同时间的血清中HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗体滴度变化情况。免疫程序为0,2W(周)。第一次免疫后，HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到1×10⁵-1×10⁶。

序列列表

序列1(SEQ ID NO：1)：

1 MRPSDNTVYL PPPSVARVVN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP AGGGNKQDIP

61 KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL GVGLSGHPFY

121 NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT ACKSRPLSQG

181 DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD YLQMSADPYG

241 DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP SPSGSIVTSD

301 SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP GQYDATKFKQ

361 YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT SLVDTYRFVQ

421 SVAIACQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA GLRRKPTIGP

481 RKRSAPSATT ASKPAKRVRV RARK

序列2(SEQ ID NO：2)：

1 MRNVNVFPIF LQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARVVNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP

61 YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG

121 RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH

181 WAKGTACKSR PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI

241 CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS

301 CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTVVDTTR STNLTICAST

361 QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP

421 PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK

481 FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARK

序列3(SEQ ID NO：3)：

1 MFPIFLQMAL WRPSDNTVYL PPPSVARVVN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP

61 AGGGNKQDIP KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL

121 GVGLSGHPFY NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT

181 ACKSRPLSQG DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD

241 YLQMSADPYG DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP

301 SPSGSIVTSD SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP

361 GQYDATKFKQ YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT

421 SLVDTYRFVQ SVAITCQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA

481 GLRRKPTIGP RKRSAPSATT SSKPAKRVRV RARK

序列4(SEQ ID NO：4)：

1 MQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARVVNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN

61 KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS

121 GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR

181 PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS

241 ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS

301 IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTVVDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA

361 TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT

421 YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK

481 PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARK

序列5(SEQ ID NO：5)：

1 MTVYLPPPSV ARVVNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY

61 QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD

121 TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR PLSQGDCPPL

181 ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF

241 CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN

301 KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTVVDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV

361 EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT

421 CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA

481 PSATTSSKPA KRVRVRARK

序列6(SEQ ID NO：6)：

1 ATGCGGCCT AGTGACAAT ACCGTATAT CTTCCACCT CCTTCTGTG GCAAGAGTT

55 GTAAATACC GATGATTAC GTGACTCGC ACAAGCATA TTTTATCAT GCTGGCAGC

109 TCTAGATTA TTAACTGTT GGTAATCCA TATTTTAGG GTTCCTGCA GGTGGTGGC

163 AATAAGCAG GATATTCCT AAGGTTTCT GCATACCAA TATAGAGTA TTTAGGGTG

217 CAGTTACCT GACCCAAAT AAATTTGGT TTACCTGAT ACTAGTATT TATAATCCT

271 GAAACACAA CGTTTAGTG TGGGCCTGT GCTGGAGTG GAAATTGGC CGTGGTCAG

325 CCTTTAGGT GTTGGCCTT AGTGGGCAT CCATTTTAT AATAAATTA GATGACACT

379 GAAAGTTCC CATGCCGCC ACGTCTAAT GTTTCTGAG GACGTTAGG GACAATGTG

433 TCTGTAGAT TATAAGCAG ACACAGTTA TGTATTTTG GGCTGTGCC CCTGCTATT

487 GGGGAACAC TGGGCTAAA GGCACTGCT TGTAAATCG CGTCCTTTA TCACAGGGC

541 GATTGCCCC CCTTTAGAA CTTAAAAAC ACAGTTTTG GAAGATGGT GATATGGTA

595 GATACTGGA TATGGTGCC ATGGACTTT AGTACATTG CAAGATACT AAATGTGAG

649 GTACCATTG GATATTTGT CAGTCTATT TGTAAATAT CCTGATTAT TTACAAATG

703 TCTGCAGAT CCTTATGGG GATTCCATG TTTTTTTGC TTACGGCGT GAGCAGCTT

757 TTTGCTAGG CATTTTTGG AATAGAGCA GGTACTATG GGTGACACT GTGCCTCAA

811 TCCTTATAT ATTAAAGGC ACAGGTATG CGTGCTTCA CCTGGCAGC TGTGTGTAT

865 TCTCCCTCT CCAAGTGGC TCTATTGTT ACCTCTGAC TCCCAGTTG TTTAATAAA

919 CCATATTGG TTACATAAG GCACAGGGT CATAACAAT GGTGTTTGC TGGCATAAT

973 CAATTATTT GTTACTGTG GTAGATACC ACTCGCAGT ACCAATTTA ACAATATGT

1027 GCTTCTACA CAGTCTCCT GTACCTGGG CAATATGAT GCTACCAAA TTTAAGCAG

1081 TATAGCAGA CATGTTGAG GAATATGAT TTGCAGTTT ATTTTTCAG TTGTGTACT

1135 ATTACTTTA ACTGCAGAT GTTATGTCC TATATTCAT AGTATGAAT AGCAGTATT

1189 TTAGAGGAT TGGAACTTT GGTGTTCCC CCCCCGCCA ACTACTAGT TTGGTGGAT

1243 ACATATCGT TTTGTACAA TCTGTTGCT ATTGCCTGT CAAAAGGAT GCTGCACCG

1297 GCTGAAAAT AAGGATCCC TATGATAAG TTAAAGTTT TGGAATGTG GATTTAAAG

1351 GAAAAGTTT TCTTTAGAC TTAGATCAA TATCCCCTT GGACGTAAA TTTTTGGTT

1405 CAGGCTGGA TTGCGTCGC AAGCCCACC ATAGGCCCT CGCAAACGT TCTGCTCCA

1459 TCTGCCACT ACGGCTTCT AAACCTGCC AAGCGTGTG CGTGTACGT GCCAGGAAG

1513 TAA

下面结合实施例对本发明进一步举例描述。这些实施例是非限制性的。

实施例1：具有序列1的截短HPV18 L1蛋白的表达

用做模板之HPV18 L1基因片段的制备

以从福建省厦门市子宫颈癌病人阴道分泌物中提取的DNA为模板，18H 5430F：5’-CCT CTT GGG ATG TGC CTG TAT AC-3’(SEQ IDNO：10)为正向引物，18H7190R：5’-TAC AAA CAC AAC AAT AGA TGT ATATA-3’(SEQ ID NO：11)为反向引物，在PCR仪(Biometra，T3)按照如下条件进行PCR反应：

94℃变性5min

72℃延伸10min

扩增得到特异的1.6kb左右大小的产物，即为制备编码本发明中截短HPV-18L蛋白DNA片段的模板。

截短HPV18 L1基因的非融合表达载体的构建

以前一步骤所获得1.6kb大小的DNA片段用做再次PCR反应的模板。以18N65F：5’-CAT ATg CGG CCT AGT GAC AAT AC-3’为正向引物，其5’端引入限制性内切酶Nde I位点，Nde I位点序列为CAT ATG，ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子；18CR：5′-CTC gAg TTA CTT CCTGGC ACG TAC ACG CAC A-3′为反向引物，其5’端引入限制型内切酶XhoI位点。在PCR热循环仪(Biometra T3)按照如下条件进行PCR反应：

94℃变性5min

72℃延伸10min

扩增得到1.5kb左右大小特异的DNA片段。将该PCR产物与商售的pMD18-T载体(TAKARA公司生产)连接，经NdeI/XhoI酶切鉴定，得到插入截短HPV18L1基因的阳性克隆pMD 18-T-HPV18N65C-L1。

在上海博亚生物工程公司，利用M13(+)/(-)引物，测得pMD18-T-HPV18N65C-L1质粒中插入的目的核苷酸序列为序列6，其编码的氨基酸序列即为序列1：该序列对应的蛋白质为为N端被截短65个氨基酸、C端未被截短的HPV18 L1蛋白，命名为HPV18N65C-L1。

将上述的pMD 18-T-HPV18N65C-L1质粒，经NdeI/XhoI酶切，获得截短的HPV18N65C-L1基因片段。再将该片段与经Nde I/Xho I酶切的pTrxFus原核表达载体(购自Invitrogen公司)相连接，由于融合蛋白已被切除，在起始氨基酸Met之后紧接着目的蛋白，不带其他融合多肽。NdeI/XhoI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆Ptrx-HPV18N65C-L1。取1μL的pTRX-HPV18N65C-L1质粒(0.15mg/ml)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌GI698((购自Invitrogen公司)，涂布于氨苄(终浓度100mg/ml，下同)抗性的固体CAA培养基(6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，0.5g NaCl，1g NH₄Cl，20g酪蛋白水解物，0.095g MgCl₂，1.5g琼脂粉溶解于900ml去离子水中，加入50％甘油20ml)，30℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL氨苄抗性的液体IMC培养基之试管，25℃ 220转/分振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃冻干保存。

HPV18N65C-L1的大量表达

从-70℃中取出带有重组质粒pTRX-HPV-18N65C-L1的大肠杆菌冻干菌种，接入氨苄抗性的50ml IMC液体培养基，200rpm，30℃，培养大约8小时，然后转接入10瓶500ml培养基中，每瓶接入5ml菌液，200rpm，30℃，摇瓶培养过夜。

主要仪器，上海保兴生物公司50升发酵罐

校正发酵罐pH电极，配制30升培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。

补料准备，酪蛋白水解物配制浓度为30％(30g溶至100ml)，葡萄糖50％(50g溶至100ml)，121℃灭菌20分钟。

第二天将10瓶种子液5升接入发酵罐中，温度30℃，PH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。

流加补料，将50％葡萄糖和30％酪蛋白水解物按溶质质量比2∶1的比例混合。

流加速度如下：

100％为25ml/min

第一小时：5％；

第二小时：10％；

第三小时：20％；

第四小时：40％；

第五小时以后60％

培养至菌浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃加入4g色氨酸诱导培养4小时。终浓度大约为40左右(OD600)下罐，离心收集菌体大约2.5kg

IMC培养基配方如下(1升)：

Na2HPO4	6g
Na2HPO4	6g	KH2PO4	3g
NaCl	0.5g	KH2PO4	3g
NaCl	0.5g	NH4Cl	1g
酪蛋白水解物	20g	NH4Cl	1g
酪蛋白水解物	20g	MgCl2	0.095g

实施例2：纯度约70％的HPV18N65C-L1的获得

按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬菌体，采用APV均质机(An Invensys Group产品)以600bar压力破碎菌体5次。JA-14转头13500rpm(30000g)，离心15min，留取上清，通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，此时上清中HPV18N65C-L1的纯度约为10％。采用CENTRASETTE 5切向流装置(PALL产品)对上清进行透析，所用膜包截留分子量为30kDa，透析液为10mM磷酸缓冲液pH 6.0缓冲液，透析体积为三倍上清体积，运行时压力为0.5psi，流速为500mL/min，切向流速为200mL/min。透析充分后，JA-10转头(Beckman J25高速离心机)9500rpm(12000g)，20min离心收获沉淀，用1/10上清体积的10mM磷酸缓冲液pH7.0，10mM DTT，300mM NaCl重悬沉淀，搅拌30min。JA-14转头(Beckman J25高速离心机)，13500rpm(30000g)，离心20min，离心得上清，使用0.22μm孔径滤膜过滤样品，以该样品进行下一步的阳离子交换色谱纯化。取150μL过滤后样品，加入6X Loading Buffer 30μL。混匀，于80℃水浴10min后取10μL于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图1。通过SDS-PAGE分析可知HPV18N65C-L1蛋白在通过沉淀、复溶的步骤之后，目的蛋白得到了纯化和富集，纯度从之前的约10％左右提高到了约70％左右。

实施例3：HPV18N65C-L1的色谱纯化

HPV18N65C-L1的阳离子交换色谱纯化

仪器系统：GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。

层析介质：SP Sepharose 4 Fast Flow。

柱体积：5.5cm×20cm。

缓冲液：20mM磷酸缓冲液pH7.0，10mM DTT

20mM磷酸缓冲液pH7.0 10mM DTT 2M NaCl。

流速：25mL/min

检测器波长：280nm

样品为3L纯度约为70％HPV18N65C-L1溶液

洗脱程序为：300mM NaCl洗脱杂蛋白，500mM NaCl洗脱目的蛋白，收集500mM NaCl洗脱产物，共获得HPV18N65C-L1纯化样品1000mL。

HPV18N65C-L1的CHT-II(羟基磷灰石色谱)纯化

仪器系统：GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。

层析介质：CHT-II(购自Bio-RAD)

柱体积：5.5cm×20cm

缓冲液：10mM磷酸缓冲液pH7.0，10mM DTT，0.5M NaCl。

流速：20mL/min。

检测器波长：280nm。

样品为：SP Sepharose 4 Fast Flow 500mM NaCl洗脱产物，

洗脱程序为：直接收取含目的蛋白的穿透

收集穿透产物，获得纯化的HPV18N65C-L1样品1100mL。取经本实施例方法纯化的HPV18N65C-L1样品150μL，加入6X LoadingBuffer 30μL混匀，于80℃水浴10min后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图2。由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为0.8mg/ml，SDS-PAGE考染纯度大于98％。

实施例4：HPV18N65C-L1类病毒颗粒的组装

仪器系统为PALL生产的CENTRASETTE 5切向流系统；膜包截留分子量为30kDa；样品为实施例3所得HPV18N65C-L1 1100ml。

样品的浓缩：调节系统切向流速为50mL/min，浓缩样品至总体积为800mL。

样品的复性：以10L复性缓冲液(20mM PB pH 6.0，2mM CaCl2，2mMMgCl₂，0.5M NaCl)充分交换样品缓冲液。切向流装置运行时压力为0.5psi，切向流速度为10mL/min，待复性缓冲液交换完后，改为储存缓冲液(20L PBS：20mM PB pH 6.5，0.5M NaCl)进行交换，交换体积为20L。运行时压力为0.5psi，切向流速为25mL/min。待所有液体交换完毕后，使用PALL 0.20μm滤器无菌过滤样品，将过滤后的样品置于37℃恒温箱孵育过夜。经过孵育的HPV18N65C-L1类病毒颗粒于4℃保存备用。

实施例5：HPV18N65C-L1 VLP的形态学检测及其免疫原性测定

HPV18N65C-L1类病毒颗粒透射电镜观察

仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。HPV18N65C-L1类病毒颗粒经2％磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图3，可见实施例4所得样品大量半径为25nm左右的类病毒颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。

HPV18N65C-L1类病毒颗粒动态光散射观察

仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪(含温度控制器)，使用算法为Regulation算法。样品为实施例4所得样品。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图4。结果显示HPV18N65C-L1VLP的水化分子动力学半径为29.38nm。

HPV18假病毒中和细胞模型的建立

由于HPV难以在体外进行培养，而且HPV宿主特异性强，难以在人以外的宿主上繁殖，缺乏合适的动物模型。因此，为了能对HPV疫苗的免疫保护性进行快速评估，需要建立有效体外中和实验模型。

假病毒(pseudovirions)体外感染模型：利用了HPV VLP可非特异包装核酸的特性，通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒组成HPV假病毒。(Yeager，M.D，Aste-Amezaga，M.et al(2000)Virology(278)570-7)具体方法有重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。

本发明采用的多质粒共转染方法，并且针对HPV系统采取了如下的改进：建立了对293FT细胞的优化的磷酸钙转染方法，可获得高达90％以上的转染效率，有利于进行较大规模的生产。获得了密码子优化的HPV结构蛋白的表达质粒，其可在哺乳动物细胞中高效表达HPV L1和L2基因，有利于高效组装假病毒。

1.HPV假病毒的构建

用CsCl密度梯度离心方法分别纯化带有HPV18L1基因的质粒p18L1h、带有HPV18L2基因的质粒p18L2h、及带有绿色荧光蛋白基因的质粒pN31-EGFP(以上质粒由NIH的John T.Schiller教授馈赠)。CsCl密度梯度离心纯化质粒的方法参照《分子克隆：第三版》。简言之：将质粒转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落接种到500mL LB培养基中，37℃摇瓶培养16小时。9000g离心5min，收集菌体。每1000mL菌液收获的菌体，依次加40mL溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH＝8.0))和2mL RNase A(1μg/μL)，40mL溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，48mL溶液III(5M乙酸钾60.0mL，冰乙酸11.5mL，去离子水28.5mL)。在冰上放置10min后，15000g，4℃离心20min，取上清与0.6倍体积的异丙醇混合，15000g离心30min，弃去上清，用70％乙醇洗沉淀1次，用TE溶解沉淀，测定DNA含量。在DNA溶液中溶入CsCl(每克DNA对应1.01g CsCl)，再溶入100uL 10mg/mL的溴化乙锭溶液，用Beckman NVT65转子，62000rpm，20℃离心10hr。用注射器针头收集闭环DNA区带，用等体积的异戊醇重复抽提4次。加入3倍体积的水和8倍体积的无水乙醇，20000g，4℃离心30min，收集DNA沉淀。75％酒精洗涤1次，用1mL TE溶解DNA沉淀。测定DNA溶液的浓度，分装成小份储存于-20℃。

纯化后的p18L1h、p18L2h、pN31-EGFP用磷酸钙方法共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT细胞(Invitrogen)。磷酸钙转染方法：将p18L1h、p18L2h、pN31-EGFP各40ug加入1mL的HEPES溶液(每50mL去离子水含有pH＝7.3的1M Hepes 125uL，4℃储存)和1mL的0.5mol/L CaCl₂溶液的混合溶液，混合后逐滴加入2mL 2×HeBS溶液(0.28M NaCl(16.36g)，0.05M HEPES(11.9g)，1.5mMNa₂HPO₄(0.213g)，溶解于1000mL去离子水，pH＝6.96，-70℃储存)中，室温下静置1min后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞培养皿中，6hr后弃去原培养液，加入10mL完全培养液(invitrogen公司产品)。转染48hr后，弃去培养基，用PBS洗2次，将细胞刮下收集细胞，细胞计数，每10⁸个细胞用1mL裂解液(0.25％ Brij58，9.5mM MgCl₂)重悬。裂解完成后，5000g离心10min，收集上清，加入5M NaCl(终浓度为850mM)，即为假病毒液，分装为小份后置于-20℃保存。

将293FT细胞(Invitrogen)铺于96孔细胞培养板中(1.5×10⁴/孔)。5hr后进行中和实验，将待测的血清样品分别用10％DMEM进行连续倍比稀释，然后取50μL分别与50μL稀释于10％DMEM的上文制备的假病毒液(moi＝0.1)混合。4℃孵育1h后分别加入预铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养72h后先用荧光观察确定各样品大概的中和滴度，再用流式细胞仪(EPICS XL，美国Beckman Coulter公司)检测各孔细胞的感染率，计算单抗或多抗血清的准确中和滴度。感染率为细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区的数量百分率。

感染抑制率＝(1-阻断孔的感染率/未阻断孔的感染率)×100％。

抗体中和滴度的定义为：达到高于50％感染抑制率的最大稀释倍数。经50倍稀释后能达到50％以上感染抑制率的单抗或多抗被视为具有中和能力。

HPV18 VLP疫苗免疫动物的免疫保护性评价

小鼠ED50检测：将实施例4所制备的HPV18N65C-L1类病毒颗粒吸附于氢氧化铝佐剂上.而后使用疫苗稀释液将其稀释至0.100μg/mL，0.033μg/mL，0.011μg/mL，0.004μg/mL，以1∶3比例进行稀释成4个浓度，每组分别以1mL上述浓度腹腔注射BALB/c小鼠各10只，于注射后第四和五周分别采集血清进行HPV抗体的EIA检测和假病毒细胞中和实验法检测，最后一次采血时处死小鼠。另外设立空白组，含10只BALB/c小鼠。

EIA检测结果按照其阴性均值(若阴性均值小于0.05，以0.05来计算)+0.16作为CUTOFF值。所有BALB/c小鼠在注射前均为HPV抗体阴性。检测结果见表1。

表1EIA检测HPV18N65C-L1类病毒颗粒在BALB/c小鼠中的ED₅₀结果

根据Reed-Muench法进行ED50的计算，疫苗注射后观察4、5周，HPV18N65C-L1类病毒颗粒4W、5W的ED50分别为0.008μg、0.008μg。因此在该剂量免疫可以产生较高的免疫抗体，其有效性显著小于0.1μg的免疫剂量。

假病毒细胞中和实验法检测结果为阴性对照的细胞发光数不小于20％，且阳性对照不发光，实验方为有效。按照细胞发光数小于阴性对照细胞发光数的50％为阳性判断阴阳性。检测结果见表2。

表2，假病毒细胞中和实验法检测HPV18N65C-L1类病毒颗粒在BALB/c小鼠中的ED₅₀结果

根据Reed-Muench法进行ED50的计算，疫苗注射后观察4、5周，采血检测ED50。HPV18N65C-L1类病毒颗粒4W、5W的ED50分别为0.018μg、0.016μg。因此在该剂量免疫可以产生较高的免疫抗体，其有效性显著小于0.1μg的免疫剂量。

兔：普通级，雌性，6～8周龄，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV18N65C-L1类病毒颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为100ug/只，此后分别于4，10周各加强一次，加强免疫剂量为50ug/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。

羊：普通级，雌性，6～8周龄，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV18N65C-L1类病毒颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为1mg/只，此后分别于4，10，18周各加强一次，加强免疫剂量为0.5mg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。

以上述假病毒中和细胞模型实验评估上述抗血清的中和效价，如图5和6所示。结果表明，本发明实施例4获得的HPV18N65C-L1类病毒颗粒(除了实验中用到的福氏佐剂外，也可以是商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂)混合配制成为疫苗，具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，可作为预防HPV感染的疫苗。

HPV16/18二价疫苗免疫恒河猴的免疫保护性评价

恒河猴：普通级，雌性，2岁，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV18N65C-L1类病毒颗粒吸附于氢氧化铝佐剂上，类似方法制备的HPV16N 30C-L1类病毒颗粒也吸附于氢氧化铝佐剂上，再将两者2∶1(重量比)混合，制成HPV16/18二价疫苗，其中每剂量(0.5ml)含有40μg的HPV16N30C-L1类病毒颗粒和20μg的HPV18N65C-L1类病毒颗粒，含有氢氧化铝0.6mg。免疫方式为上肢三角肌注射，分5ug、10ug、20ug三个HPV18剂量，每个剂量3只恒河猴，候选动物在免疫前均被确定为HPV18总IgG抗体和中和抗体呈阴性，免疫程序为0,4周。饲养9周，每周采血一次，血样于37℃放置1.5小时后，10,000rpm离心5分钟，收集血清进行HPV18和HPV16总IgG抗体和中和抗体滴度的检测，两个型别的抗体检测方法相类似。

结果如图7和图8所示，本发明的HPV18N65C-L1类病毒颗粒可诱导恒河猴在免疫后的第9周产生高达20,000的总IgG抗体和中和抗体滴度，显示了良好的免疫原性，可作为预防HPV18感染的疫苗。同样地，如图9和图10所示，二价疫苗中的HPV16N30C-L1类病毒颗粒可诱导恒河猴在免疫后的第9周产生高达20,000的抗HPV16总IgG抗体和中和抗体滴度，显示了良好的免疫原性，亦可作为预防HPV16感染的疫苗。

上述的HPV16N30C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为(SEQ IDNO：7)：

Met Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser

1 5 10 15

Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr

20 25 30

His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro

35 40 45

Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly

50 55 60

Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe

65 70 75 80

Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val

85 90 95

Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val

100 105 110

Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn

115 120 125

Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile

130 135 140

Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro

145 150 155 160

Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala

165 170 175

Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile

180 185 190

Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr

195 200 205

Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser

210 215 220

Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His

245 250 255

Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu

260 265 270

Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr

275 280 285

Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe

290 295 300

Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile

305 310 315 320

Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser

325 330 335

Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr

340 345 350

Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp

355 360 365

Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile

370 375 380

Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn

385 390 395 400

Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg

405 410 415

Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala

420 425 430

Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu

435 440 445

Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys

450 455 460

Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly

465 470 475 480

Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys

485 490 495

Arg Lys Lys Arg Lys Leu

500

HPV6/11/16/18四价疫苗免疫小鼠的免疫保护性评价

免疫动物：4-5周龄SPF级BALB/c小鼠4只，将按本发明实施例4所述类似方法制备的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，类病毒颗粒与HPV18N65C-L1类病毒颗粒按1∶2∶2∶1(重量比)的比例混合，使得混合后的上述四种类病毒颗粒的浓度为40，80，80，40μg/ml。而后再加入等体积的福氏完全佐剂与之混合均匀。加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1类病毒颗粒各10μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1类病毒颗粒各20μg/只。此后分别于2周加强一次，加强免疫剂量为HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1类病毒颗粒各20μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1类病毒颗粒各40μg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，按实施例5所述方法分别检测免疫小鼠中针对HPV6，HPV11，HPV16，HPV18假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图11所示，结果表明，由本发明实施例1-4所述方法获得的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四种类病毒颗粒混合而制备的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18四价疫苗具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的针对HPV6，HPV11，HPV16，HPV18的中和抗体，可作为预防HPV6/HPV11/HPV16/HPV18感染的有效疫苗(除了实施例中所采用的福氏佐剂外，该疫苗也可由本发明所制备的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四种类病毒颗粒与商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂混合而成)。

上述的HPV6N5C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为(SEQ IDNO：8)：

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys

35 40 45

Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn

195 200 205

Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe

225 230 235 240

Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser

260 265 270

Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu

325 330 335

Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys

340 345 350

Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln

355 360 365

Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr

370 375 380

Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro

385 390 395 400

Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala

405 410 415

Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr

420 425 430

Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly

450 455 460

Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg

485 490 495

上述的HPV11N4C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为(SEQ IDNO：9)：

Met Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His

20 25 30

Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile

35 40 45

Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr

50 55 60

Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro

65 70 75 80

Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys

85 90 95

Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser

100 105 110

Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly

115 120 125

Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp

130 135 140

Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly

145 150 155 160

Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn

165 170 175

Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly

180 185 190

Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln

195 200 205

Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr Val Cys Lys

210 215 220

Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu

225 230 235 240

Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn

245 250 255

Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys

260 265 270

Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val His Thr

275 280 285

Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro

290 295 300

Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly

305 310 315 320

Asn His Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met

325 330 335

Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp

340 345 350

Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile

355 360 365

Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala Tyr Ile

370 375 380

His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser

385 390 395 400

Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser

405 410 415

Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys Gln Asp

420 425 430

Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe

435 440 445

Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln

450 455 460

Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile Lys Arg Pro

465 470 475 480

Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr

485 490 495

Lys Lys

上述的HPV16N30C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为SEQ IDNO：7，如上所述。

上述一系列实验结果表明，本发明实施例4获得的HPV18N65C-L1类病毒颗粒(除了实验中用到的福氏佐剂外，也可以是商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂)混合配制成为疫苗，具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，可作为预防HPV感染的疫苗。

实施例6：

依据本发明实施例1-5所采用的技术，制备具有序列2，3，4，5的截短HPV18L1蛋白，以上截短蛋白均可组装为类病毒颗粒。

序列表

<110>厦门大学

<120>截短的人乳头瘤病毒18型L1蛋白

<130>IDC080055

<160>11

<170>PatentIn yersion 3.2

<210>1

<211>504

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr

20 25 30

His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg

35 40 45

Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala

50 55 60

Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe

65 70 75 80

Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val

85 90 95

Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val

100 105 110

Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser

115 120 125

Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val

130 135 140

Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro

145 150 155 160

Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro

165 170 175

Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu

180 185 190

Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser

195 200 205

Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser

210 215 220

Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His

245 250 255

Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu

260 265 270

Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr

275 280 285

Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe

290 295 300

Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val

305 310 315 320

Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser

325 330 335

Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln

340 345 350

Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr

355 360 365

Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp

370 375 380

Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp

385 390 395 400

Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr

405 410 415

Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Ala Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro

420 425 430

Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp

435 440 445

Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg

450 455 460

Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro

465 470 475 480

Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Ser Lys Pro Ala Lys

485 490 495

Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys

500

<210>2

<211>519

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Arg Asn Val Asn Val Phe Pro Ile Phe Leu Gln Met Ala Leu Trp

1 5 10 15

Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg

20 25 30

Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr His

35 40 45

Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg Val

50 55 60

Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly

85 90 95

Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp

100 105 110

Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly

115 120 125

Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser

130 135 140

His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val Ser

145 150 155 160

Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala

165 170 175

Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro Leu

180 185 190

Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu Glu

195 200 205

Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr

210 215 220

Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile

225 230 235 240

Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly Asp

245 250 255

Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His Phe

260 265 270

Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu Tyr

275 280 285

Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser

290 295 300

Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn

305 310 315 320

Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val Cys

325 330 335

Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr

340 345 350

Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln Tyr

355 360 365

Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr Asp

370 375 380

Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val

385 390 395 400

Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp Asn

405 410 415

Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr Arg

420 425 430

Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro Ala

435 440 445

Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp Leu

450 455 460

Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys

465 470 475 480

Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro Arg

485 490 495

Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys Arg

500 505 510

Val Arg Val Arg Ala Arg Lys

515

<210>3

<211>514

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Phe Pro Ile Phe Leu Gln Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Asn

1 5 10 15

Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp

20 25 30

Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg

35 40 45

Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg Val Pro Ala Gly Gly Gly

50 55 60

Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe

65 70 75 80

Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Thr Ser

85 90 95

Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Ala Gly Val

100 105 110

Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro

115 120 125

Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser

130 135 140

Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln

145 150 155 160

Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His Trp

165 170 175

Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys

180 185 190

Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val

195 200 205

Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys

210 215 220

Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys

245 250 255

Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly

260 265 270

Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Gly

275 280 285

Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly

290 295 300

Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu

305 310 315 320

His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu

325 330 335

Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Cys

340 345 350

Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln Tyr Asp Ala Thr Lys Phe

355 360 365

Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe

370 375 380

Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His

385 390 395 400

Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro

405 410 415

Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val

420 425 430

Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro Ala Glu Asn Lys Asp Pro

435 440 445

Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser

450 455 460

Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln Ala

465 470 475 480

Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro Arg Lys Arg Ser Ala Pro

485 490 495

Ser Ala Thr Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys Arg Val Arg Val Arg Ala

500 505 510

Arg Lys

<210>4

<211>509

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Gln Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg

20 25 30

Thr Ser Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly

35 40 45

Asn Pro Tyr Phe Arg Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile

50 55 60

Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro

65 70 75 80

Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu

85 90 95

Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly

100 105 110

Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu

115 120 125

Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp

130 135 140

Val Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile

145 150 155 160

Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala

165 170 175

Cys Lys Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu

180 185 190

Lys Asn Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly

195 200 205

Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu

2l0 215 220

Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser

225 230 235 240

Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln

245 250 255

Leu Phe Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr

260 265 270

Val Pro Gln Ser Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro

275 280 285

Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser

290 295 300

Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly

305 310 315 320

His Asn Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val

325 330 335

Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser

340 345 350

Pro Val Pro Gly Gln Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg

355 360 365

His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile

370 375 380

Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser

385 390 395 400

Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser

405 410 415

Leu Val Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Thr Cys Gln

420 425 430

Lys Asp Ala Ala Pro Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys

435 440 445

Phe Trp Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln

450 455 460

Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys

465 470 475 480

Pro Thr Ile Gly Pro Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ser

485 490 495

Ser Lys Pro Ala Lys Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys

500 505

<210>5

<211>499

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Met Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr

1 5 10 15

Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser

20 25 30

Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg Val Pro Ala Gly Gly

35 40 45

Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val

50 55 60

Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Thr

65 70 75 80

Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Ala Gly

85 90 95

Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His

100 105 110

Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr

115 120 125

Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr

195 200 205

Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe

225 230 235 240

Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu Tyr Ile Lys Gly Thr

260 265 270

Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile

325 330 335

Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln Tyr Asp Ala Thr Lys

340 345 350

Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile

355 360 365

Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile

370 375 380

His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Val Pro

385 390 395 400

Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser

405 410 415

Val Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro Ala Glu Asn Lys Asp

420 425 430

Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe

435 440 445

Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln

450 455 460

Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro Arg Lys Arg Ser Ala

465 470 475 480

Pro Ser Ala Thr Thr Ser Ser Lys Pro Ala Lys Arg Val Arg Val Arg

485 490 495

Ala Arg Lys

<210>6

<211>1515

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60

accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120

actgttggta atccatattt tagggttcct gcaggtggtg gcaataagca ggatattcct 180

aaggtttctg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240

ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300

ggagtggaaa ttggccgtgg tcagccttta ggtgttggcc ttagtgggca tccattttat 360

aataaattag atgacactga aagttcccat gccgccacgt ctaatgtttc tgaggacgtt 420

agggacaatg tgtctgtaga ttataagcag acacagttat gtattttggg ctgtgcccct 480

gctattgggg aacactgggc taaaggcact gcttgtaaat cgcgtccttt atcacagggc 540

gattgccccc ctttagaact taaaaacaca gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600

ggatatggtg ccatggactt tagtacattg caagatacta aatgtgaggt accattggat 660

atttgtcagt ctatttgtaa atatcctgat tatttacaaa tgtctgcaga tccttatggg 720

gattccatgt ttttttgctt acggcgtgag cagctttttg ctaggcattt ttggaataga 780

gcaggtacta tgggtgacac tgtgcctcaa tccttatata ttaaaggcac aggtatgcgt 840

gcttcacctg gcagctgtgt gtattctccc tctccaagtg gctctattgt tacctctgac 900

tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac agggtcataa caatggtgtt 960

tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca ctcgcagtac caatttaaca 1020

atatgtgctt ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa atttaagcag 1080

tatagcagac atgttgagga atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact 1140

ttaactgcag atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200

aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260

tctgttgcta ttgcctgtca aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 1320

aagttaaagt tttggaatgt ggatttaaag gaaaagtttt ctttagactt agatcaatat 1380

ccccttggac gtaaattttt ggttcaggct ggattgcgtc gcaagcccac cataggccct 1440

cgcaaacgtt ctgctccatc tgccactacg gcttctaaac ctgccaagcg tgtgcgtgta 1500

cgtgccagga agtaa 1515

<210>7

<211>502

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Met Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser

1 5 10 15

Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr

20 25 30

His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro

35 40 45

Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly

50 55 60

Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe

65 70 75 80

Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val

85 90 95

Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val

100 105 110

Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn

115 120 125

Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile

130 135 140

Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro

145 150 155 160

Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala

165 170 175

Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile

180 185 190

Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr

195 200 205

Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser

210 215 220

Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His

245 250 255

Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu

260 265 270

Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr

275 280 285

Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe

290 295 300

Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile

305 310 315 320

Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser

325 330 335

Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr

340 345 350

Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp

355 360 365

Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile

370 375 380

Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn

385 390 395 400

Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg

405 410 415

Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala

420 425 430

Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu

435 440 445

Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys

450 455 460

Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly

465 470 475 480

Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys

485 490 495

Arg Lys Lys Arg Lys Leu

500

<210>8

<211>496

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys

35 40 45

Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn

195 200 205

Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe

225 230 235 240

Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser

260 265 270

Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu

325 330 335

Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys

340 345 350

Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln

355 360 365

Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr

370 375 380

Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro

385 390 395 400

Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala

405 410 415

Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr

420 425 430

Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly

450 455 460

Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg

485 490 495

<210>9

<211>498

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

Met Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His

20 25 30

Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile

35 40 45

Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr

50 55 60

Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro

65 70 75 80

Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys

85 90 95

Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser

100 105 110

Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly

115 120 125

Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp

130 135 140

Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly

145 150 155 160

Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn

165 170 175

Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly

180 185 190

Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln

195 200 205

Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr Val Cys Lys

210 215 220

Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu

225 230 235 240

Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn

245 250 255

Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys

260 265 270

Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val His Thr

275 280 285

Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro

290 295 300

Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly

305 310 315 320

Asn His Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met

325 330 335

Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp

340 345 350

Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile

355 360 365

Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala Tyr Ile

370 375 380

His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser

385 390 395 400

Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser

405 410 415

Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys Gln Asp

420 425 430

Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe

435 440 445

Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln

450 455 460

Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile Lys Arg Pro

465 470 475 480

Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr

485 490 495

Lys Lys

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cctcttggga tgtgcctgta tac 23

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tacaaacaca acaatagatg tatata 26

Claims

1.N端截短了50个、55个、60个、65个、或70个氨基酸的HPV18L1蛋白。

2.权利要求1的蛋白，其具有序列1、2、3、4、或5，优选序列1。

3.编码权利要求1-2任一项的蛋白的多核苷酸。

4.包含权利要求3的多核苷酸的载体。

5.包含权利要求4的载体的细胞。

6.包含权利要求1或2的蛋白的组合物。

7.一种HPV18类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有权利要求1或2的蛋白或者由权利要求1或2的蛋白形成。

8.一种制备HPV L1蛋白例如权利要求1或2的蛋白的方法，其包括

a)在大肠杆菌表达系统中表达编码HPV L1的HPV L1基因，

9.一种用于预防宫颈癌的疫苗，其包括：(1)权利要求7的HPV18类病毒颗粒，(2)可有可无的至少一种(例如2、3、4种)选自HPV6，11，16，31，33，45，52，和58型别的HPV类病毒颗粒(例如HPV L1类病毒颗粒)，及(3)疫苗用赋形剂或载体，

优选地，所述疫苗含有：HPV16类病毒颗粒和HPV18类病毒颗粒，特别是，含有具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的蛋白质的HPV16类病毒颗粒和含有具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的HPV18类病毒颗粒，更优选还含有HPV6类病毒颗粒和HPV11类病毒颗粒，特别是含有具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的蛋白质的HPV6类病毒颗粒和含有具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的蛋白质的HPV11类病毒颗粒。

10.权利要求1-2任一项的蛋白或权利要求7的类病毒颗粒在制备用于预防宫颈癌的疫苗中的用途。

11.一种预防宫颈癌的方法，其包括将含预防有效量的权利要求1-2任一项的HPV18L1蛋白或权利要求7的类病毒颗粒的疫苗或预防有效量的权利要求9的疫苗给予需要预防宫颈癌的人。

12.获得HPV18L1蛋白类病毒颗粒的方法，其包括：

e)将纯度至少50％的权利要求1或2的HPV18L1蛋白进一步通过色谱层析纯化，

f)将e)步骤中得到的HPV18L1蛋白去除还原剂。

13.制备用于预防宫颈癌疫苗的方法，其包括将权利要求7的类病毒颗粒与任选的一种或多种选自HPV6，11，16，31，33，45，52，和58的HPV型别的类病毒颗粒及疫苗用载体或者赋形剂混和。