CN101553489B - 4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物及其制备方法和其作为抗病毒药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及4-氨基3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3，4-d]嘧啶衍生物及其制备方法以及作为抗病毒药物的应用。本发明的目的在于提供新型化合物作为例如用于治疗细小核糖核酸病毒感染的药物，且可避免已知药物的问题，尤其是抗药性和不耐受之类的问题。采用以通式I表示的化合物可解决这一任务。

Description

4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-D]嘧啶衍生物及其制备方法和其作为抗病毒药物的应用
本发明涉及新型的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3，4-d]嘧啶衍生物及其制备方法，以及作为抗病毒药物、尤其是用于治疗细小核糖核酸病毒感染的应用。
细小核糖核酸病毒、尤其是肠道病毒和鼻病毒是人类众多疾病的罪魁祸首。属于肠道病毒的有60多种不同的人致病性血清型病毒(Melnick J in：Fields B等编辑.Virology.Philadelphia：Lippincott-Raven Publishers；1996，655-712)。肠道病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒A型和B型感染通常均伴随无名发烧，而且可引起通常与鼻病毒感染没有区别的上呼吸道疾病。属于较为严重的流行性病症有出血性结膜炎、疱疹性咽峡炎、手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎以及急性心肌炎。不同类型的病毒可能会引起相同的病症，或者一种类型的病毒引起完全不同的病象。随着现代化灵敏方法运用到病毒诊断领域，已证明持续性肠道病毒RNA以及病毒蛋白与例如II型糖尿病、多发性肌炎以及尤其是慢性心肌炎之类的慢性疾病存在关联。持续性肠道病毒感染也会发生在丙种球蛋白缺乏症患者身上，表现为持续性肠道病毒脑膜脑炎。作为伴发症状出现的通常是皮肌炎或者多发性肌炎。大约有100种血清型病毒属于鼻病毒。人类上呼吸道的所有呼吸系统疾病有一半以上是鼻病毒感染引起的(Couch RB in：Fields BM等编辑：Fields Virology，第3版.Lippincott-Raven，Philadelphia，1996，713-35)。这些感冒病症通常无害，平均发病时间约为10天，每年会引起数百万人就诊、中断工作和学习。作为并发症出现的可能有中耳炎、鼻窦炎、哮喘和囊性纤维变性加重以及下呼吸道感染，主要发生于幼儿、年纪较大的患者以及免疫功能不全的患者。由于类型繁多，目前尚无法进行接种预防。每年因鼻病毒与肠道病毒引起的这些疾病而产生的工作中断、就医与药物费用十分可观。迄今为止均参照症状治疗这些疾病，因为没有病毒特异性治疗药剂可供使用(Rotbart HA：Antiviral Res 2002，53(2)，83-98)。此外，通常开出的处方均为无用的抗生素。因此研发新型抗病毒药迫在眉睫。
Rotbart于2002年在一篇综述文章中总结了肠道病毒与鼻病毒感染治疗方法的研究结果(Rotbart HA：Antiviral Res 2002，53(2)，83-98)。例如，利巴韦林可抑制宿主细胞酶，即肌苷-5′-一磷酸(IMP)脱氢酶。切断合成嘌呤核苷酸所需的这个关键酶，就可以抑制细小核糖核酸病毒在体外和体内的复制。此外，利巴韦林还应当直接植入脊髓灰质炎病毒的基因组之中，并且以此作为RNA病毒的诱变剂(Crotty S等：Nat Med，2000，6(12)，1375-9)。由于副作用很大，这些化合物不适宜用于治疗鼻病毒和肠道病毒感染。用于抑制病毒RNA合成的特异性靶就是基因组自身、病毒RNA依赖性RNA聚合酶、以及其它复制复合体所需的病毒蛋白。早已为人所知的是，胍类、硫代缩氨基脲、苯并咪唑、双嘧达莫以及黄酮均可在细胞培养基中作为各种细小核糖核酸病毒的聚合酶抑制剂，并且已在体内取得了不同程度的成果。恩韦肟衍生物最有希望成为具有广谱抗肠道病毒与抗鼻病毒活性的候选物质。恩伟肟可结合在病毒繁殖过程中形成RNA中间体所需的病毒蛋白3A上，从而阻止合成正链RNA(Heinz BA和VanceLM：J Virol，1995，69(7)，4189-97)。临床研究已发现其具有中度疗效或者没有疗效、药物动力学特性不佳，且有有害的副作用(Miller FD等：Antimicrob AgentsChemother，1985，27(1)，102-6)。迄今为止没有关于具有更好生物利用度与耐受性的新型衍生物的临床数据。
基于对病毒蛋白2C的微观结构与机能的认识，已开发出蛋白酶抑制剂AG 7088。在细胞培养基中，AG 7088在纳摩尔浓度范围内对于48种鼻病毒以及柯萨奇病毒A21、B3、70型肠道病毒70与11型埃可病毒11均有疗效(Pattick AK等：Antimicrobila Agents Chemother，1999，43(10)，2444-50)。迄今为止尚未有最终临床研究数据。随着病毒衣壳分子结构的测定，已营造出定靶设计衣壳阻断剂“WIN物质”的前提条件(Diana GD：Curr Med Chem 2003，2，1-12)，这些物质能阻止鼻病毒和肠道病毒吸附或脱壳。其中某些WIN物质仅对单一种类或类型的细小核糖核酸病毒有很强的特异性疗效。其它衍生物可抑制鼻病毒及肠道病毒的繁殖。属于WIN物质的例如有阿立酮、二恶噁沙利及吡罗达韦。这些化合物在细胞培养基中具有非常好的抗病毒作用。由于可溶性差(阿立酮)、生物利用度低(阿立酮和二恶噁沙利)、代谢与排泄速度快(二噁恶沙利和WIN 54954)以及会引起皮疹之类的副作用(WIN 54954)，从而无法实现临床应用。另一种名为普乐康尼的衣壳阻断剂则大有希望，普乐康尼具有非常好的口服生物利用度，能在结合到病毒衣壳的疏水袋之中后阻止鼻病毒、埃可病毒及柯萨奇病毒侵入(Pevear DC等：Antimicrob Agents Chemother1999，43(9)，2109-15；McKinlay MA等：Annu Rev Microbiol 1992，46，635-54)，因此对于常见的感冒直至病毒性脑膜炎或者心肌炎之类的病毒疾病具有潜在的广谱疗效。已观察到鼻病毒、肠道病毒71以及柯萨奇病毒B3有抗药性(LedfordRM等：J Virol 2004，78(7)，3663-74；Groarke JM等：J Infect Dis 1999，179(6)，1538-41)。对肠道病毒性脑膜炎(Abzug MJ等：Pediatr Infect Dis J，2003，22，33541)以及鼻病毒引起的呼吸系统感染(Hayden FG等：Antivir Ther，2002，7，53-65；Hayden FG等：Clin Infect Dis，2003，36，1523-32)进行的儿童与成人临床研究富有积极成果。但是已证实的疗效尚不足以使得普乐康尼(美国的Viropharma公司称作Picovir)在美国取得治疗鼻病毒感染的许可。由于治疗成功率低，同时已证实存在副作用，食品与药物管理局(Food and Drug Administration：FDA)已于2002年3月驳回了相关申请。
也有人将吡唑嘧啶称作CRF拮抗剂(例如EP 674 642和EP 691 128)，其例如可抑制腺苷激酶(EP 496 617或US 4,904,666)、黄嘌呤氧化酶(J.Heterocyc.Chem.19，1565，1982)或其它酶系统(US 2,965,643和US 3,600,389)。
因此研发治疗鼻病毒和肠道病毒疾病的高效病毒抑制剂，就成为一项紧迫的抗病毒研究任务。例如与普乐康尼相比，新型化合物应当具有良好的耐受性，并且要克服抗药性。
本发明的目的在于提供新型的化合物及其制造方法与应用，其可用作肠道病毒和鼻病毒的抗病毒药物，并且能避免现有技术的已知缺点，尤其是药物的抗药性和不耐受性问题。
按照本发明所述，采用以通式I表示的取代的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3，4-d]嘧啶衍生物及其药用盐化合物，即可解决这一问题，
Figure G2007800231625D00031
其中：
-基团A和B相互独立地是苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、吡嗪基、嘧啶基、吡唑基、三嗪基、咪唑基、呋喃基、噻吩基，其中在述任何一个基团中，一至三个氢原子可相互独立地被下列基团R1替换，
-基团R1可以是NO2、CN、CONR2 2、COOR2、CHO、CONH2、卤素、具有1～7个链节的饱和或不饱和的直链或支化脂肪基、具有1～8个链节的饱和或不饱和的直链或支化烷醇基、OR2、SR2、NR2 2、SO2NR3 2、二氟甲基或三氟甲基、苯基，
-基团R2、R3、R4、R5可以相互独立地是H、具有1～7个链节的饱和或不饱和，卤化或非卤化的直链或支化脂肪基、苄基、苯基或萘基、具有杂原子N、S、O的饱和或不饱和单杂环或多杂环，其中上述基团可以独立地被氟、氯、溴、三氟甲基、烷基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、氨烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、苄基、苯基或萘基取代。
从属权利要求中所述的是具体的被取代的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3，4-d]嘧啶衍生物及其制备方法与应用的有利实施方案，但本发明并不局限于此。
在本发明的优选实施方案中，所涉及的是通式(I)表示的化合物，其选自以下组中的6-苯基氨基吡唑[3，4-d]嘧啶系列的化合物：
4-氨基-6-苯基-3-(三-R1)苯基氨基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-6-(三-R1)苯基-3-苯基氨基吡唑[3，4-d]嘧啶、
1-烷基-4-氨基-6-苯基-3-(三-R1)苯基氨基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-1，6-二(三-R1)苯基-3-苯基氨基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-6-苯基-3-(三-R1)苯基烷氨基吡唑[3，4-d]嘧啶、
1-烷基-4-氨基-6-苯基-3-(三-R1)苯基烷氨基吡唑[3，4-d]嘧啶。
本发明尤其也包括以通式(I)表示的6-苯基氨基吡唑[3，4-d]嘧啶，包括：
4-氨基-3-(3-氟苯基)氨基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(3-氟苯基)氨基-6-(4-氯苯基)吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(3-氯)氨基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(3-甲氧基)氨基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(4-氟苯基)氨基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(4-氟苯基)氨基-6-(4-氯苯基)吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(4-氯苯基)氨基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(3-氟苯基)氨基-1-甲基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶、
4-氨基-1-苄基-3-(3-氟苯基)氨基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶。
对于细小核糖核酸病毒、尤其对于肠道病毒和鼻病毒，本发明所述的化合物在纳摩尔或微摩尔浓度的范围有很强的抗病毒活性。
因此，本发明所述含有以式(I)表示的化合物的药物制剂，特别适合用于治疗细小核糖核酸病毒、尤其是肠道病毒和鼻病毒引起的人和动物的呼吸系统感染、无菌性脑膜炎、脑炎、疱疹性咽峡炎等。
以下将根据合成方法、以通式(I)表示的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3，4-d]嘧啶衍生物及其对细小核糖核酸病毒感染的疗效与应用，对本发明进行详细解释。
以下合成路线1所示为合成本发明所述吡唑[3，4-d]嘧啶1的示意图，其包括在第一步骤将[二(甲硫基)亚甲基]丙二腈2与芳基胺3在醇中缩合成芳基衍生物4。可将后者离析、提纯，以备下一步反应之用，或者不进行提纯直接用于下一步反应(“一锅法”反应)。随后的步骤是让芳基衍生物4与肼或者肼衍生物相互作用。该反应在沸腾状态下进行1～4小时，使得吡唑5的收率较高。关键的吡唑[3，4-d]嘧啶1合成步骤包括：在有醋酸、三氟醋酸或者醋酸钠存在的条件下，使吡唑5与芳基脒6进行缩合。
Figure G2007800231625D00061
另一种合成方法包括：在有氢化钠存在使丙二腈与芳基异硫氰酸酯进行“一锅法”反应，然后使用碘甲烷或者硫酸二甲酯处理反应混合物。这时将形成大量的烯胺。这里也是在有酸存在的条件下，例如醋酸、三氟醋酸或其盐类(醋酸盐)，将吡唑5与芳基脒6进行缩合，实施制备吡唑[3，4-d]嘧啶1的关键合成步骤。
在下列实施例中列出了一些以通式(I)表示的具体化合物，这些化合物尤其适用于治疗细小核糖核酸病毒感染(本发明并不仅限于此)。本发明所述的化合物可在药物学可接受的含水介质、有机介质或者水-有机介质中配制成溶液或混悬液，用于通过静脉、皮下或者肌肉注射方式进行局部或胃肠外给药，或者用于鼻腔给药；或者这些化合物可用口服给药的常规载体制成片剂、胶囊或水悬液，或者制成栓剂形式。
可以按照每公斤体重0.1～1000mg的剂量使用以通式(I)表示的上述化合物。
1、4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3，4-d]嘧啶衍生物的制备与分析
通过合成方式、元素分析、核磁共振光谱分析与质谱分析，测定本发明所述化合物的结构。
原料：按照合成路线1所示的方法以及Tominaga Y等的描述(J.Heterocycl.Chem.，1990，27，775-779)，合成5-氨基-4-氰基-3-芳基氨基吡唑。按照已知的现有技术，使用适当的氰基起始化合物合成芳基脒(Boere，RT等：J.Organomet.Chem.，1987，331，161-167；Garigipati RS：Tetrahedron Lett，1990，31，1969-1978；Dann O等：Justus Liebigs Ann.Chem.，1982，1836-1839)。
实施例1：4-氨基-3-苯氨基-6-苯基吡唑[3，4-d]嘧啶
在搅拌下将3.0g(17.24mmol)苯甲脒盐酸水合物以及2.2g(23.0mmol)醋酸钠加入2.3g(11.5mmol)5-氨基-4-氰基-3-苯氨基吡唑之中。在220℃温度下将反应混合物加热30分钟。所得到的物质用50ml水处理、过滤，然后用20ml冷甲醇以及20ml冷酯进行洗涤。反应产物通过在DMF/水中的结晶进行提纯。
浅黄色固体结晶物质。收率57％。mp 253-5℃.
Rf(氯仿-甲醇；10/1)-0.8(硅胶60)。
MS m/z302(M+).
Figure G2007800231625D00071
1H NMR(DMSO-d6)δ12.38(1H，s，NH(9))，8.32-8.36(2H，q，CH(18)，CH(19))，8.23(1H，br.s，NH(7))，7.67(2H，d，CH(2)，CH(6))，7.48(2H，br.s，NH2)，7.42(3H，m，CH(20)，CH(21)，CH(22))，7.12(2H，d，CH(3)，CH(5))和6.98(1H，m，CH(4))ppm.
13C NMR(DMSO-d6)δ161.0(C(11))，156.2(C(12))，153.0(C(10))，144.2(C(8))，138.3(C(17))，136.0(C(1))，130.3(C(4))，129.8(C(22))，128.8(C(3)，C(5))，128.0和127.7(C(18)，C(19))，120.4(C(4))，120.2(C(2)，C(6))，88.7(C(13))ppm.
针对C17H14N6的计算值：C，67,54；H，4,67；N，27,80
实测值：C，67,61；H，4,82；N，27,79
实施例2：4-氨基-3-(3-氟苯基)氨基-6-苯基吡唑[3.4-d]嘧啶
与实施例1所述的方式一样进行制备。
浅黄色固体结晶物质。收率46％。mp 267-9℃.
Rf(氯仿-甲醇；10/1)-0.85(硅胶60)。
MS m/z320(M+).
1H NMR(DMSO-d6)δ12.61(1H，s，NH(9))，8.35-8.38(2H，q，CH(18)，CH(19))，8.64(1H，br.s，NH(7))，7.46(2H，br.s，NH2)，7.3-7.52(6H，m，CH(2)，CH(4)，CH(6)，CH(20)，CH(21)，CH(22))，6.60(1H，t，CH(5))ppm.
13C NMR(DMSO-d6)δ166.2和161.2(C(3))，162.2(C(11))，161.8(C(10))，156.1(C(12))，144.3(C(1))，143.4(C(8))，130.0(C(17))，129.8(C(5))，128.5(C(22))，127.0(C(18)，C(19))，112.5(C(6))，105.5和105.8(C(2))，102.6和103.9(C(4))，89.39(C(13))ppm.
针对C17H14FN6的计算值：C，63.74；H，4.09；N，26.24
实测值：C，63.60；H，4.02；N，27.99
实施例3：4-氨基-3-(3-甲基苯基)氨基-6-苯基吡唑[3.4-d]嘧啶
与实施例1所述的方式一样进行制备。
几乎呈白色的固体结晶物质。收率73％。mp 246-8℃.
Rf(氯仿-甲醇；10/1)-0.90(硅胶60)。
MS m/z 316(M+).
1HNMR(DMSO-d6)δ12.38(1H，s，NH(9))，8.32-8.36(2H，q，CH(18)，CH(19))，8.23(1H，br.s，NH(7))，7.42-7.67(6H，m，NH2，CH(6)，CH(20)，CH(21)，CH(22))，7.21-7.29(2H，m，CH(2)，CH(5))和6.42(1H，d，CH(4))，2.17(3H，s，CH3)ppm.
针对C18H16N6的计算值：C，68.34；H，5.10；N，26.56
实测值：C，68.43；H，5.16；N，26.71
实施例4：4-氨基-3-(4-甲基苯基)氨基-6-苯基吡唑[3.4-d]嘧啶
与实施例1所述的方式一样进行制备。
物理化学参数为：
几乎呈白色的固体结晶物质。收率43％。mp 266-8℃.
Rf(氯仿-甲醇；10/1)-0.85(硅胶60)。
MS m/z316(M+).
1HNMR(DMSO-d6)δ12.38(1H，s，NH(9))，8.33-8.38(2H，q，CH(18)，CH(19))，8.15(1H，br.s，NH(7))，7.60(2H，d，CH(2)，CH(6))，7.48(2H，br.s，NH2)，7.42(3H，m，CH(20)，CH(21)，CH(22))，6.84(2H，d，CH(3)，CH(5))和2.34(3H，s，CH3)ppm.
13C NMR(DMSO-d6)δ161.0(C(11))，156.2(C(12))，153.0(C(10))，144.2(C(8))，138.3(C(17))，136.0(C(1))，130.3(C(4))，129.8(C(22))，128.0和127.7(C(18)，C(19))，123.8(C(3)，C(5))，118.2(C(2)，C(6))，88.9(C(13))，20.8(CH3)ppm.
针对C18H16N6的计算值：C，68.34；H，5.10；N，26.56
实测值：C，68.38；H，5.07；N，26.47
实施例5：4-氨基-3-(4-溴苯基)氨基-6-苯基吡唑[3.4-d]嘧啶
在搅拌下向1.0g(3.6mmol)5-氨基-4-氰基-3-(4-溴苯基)氨基吡唑在20ml醋酸中的溶液内加入1.87g(10.7mmol)苯甲脒盐酸水合物以及0.89g(10.7mmol)醋酸钠。将反应混合物煮4小时，用50ml水进行处理、过滤，然后用20ml冷甲醇以及20ml冷酯进行洗涤。粗产物通过在乙醇中的结晶进行提纯。物理化学参数为：
黄色固体结晶物质，收率38％。mp 272-4℃.
Rf(氯仿-甲醇；10/1)-0.9(硅胶60)。
MS m/z 381(M+).
1HNMR(DMSO-d6)δ12.44(1H，s，NH(9))，8.33-8.38(2H，q，CH(18)，CH(19))，8.12(1H，br.s，NH(7))，7.40-7.53(7H，m，NH2，CH(3)，CH(5)，CH(20)，CH(21)，CH(22))，7.10(2H，d，CH(2)，CH(6))ppm.
针对C17H13BrN6的计算值：C，53.65；H，3.44；N，22.04
实测值：C，53.80；H，3.48；N，21.95
实施例6：4-氨基-3-(4-氟苯基)氨基-6-苯基吡唑[3.4-d]嘧啶
与实施例5所述的方法一样进行合成，使用三氟醋酸作为溶剂。最终产物从乙醇/DMF中结晶析出。
物理化学参数为：
淡黄色固体结晶物质，收率58％。mp 259-263℃.
Rf(氯仿-甲醇；10/1)-0.8(硅胶60)。
MS m/z 320(M+).
1H NδMR(DMSO-d6)δ12.69(1H，s，NH(9))，8.33-8.41(4H，m，CH(2)，CH(6)，CH(18)，CH(19))，8.18(1H，br.s，NH(7))，7.58-65(5H，m，NH2，CH(20)，CH(21)，CH(22))，7.27-7.31(2H，m，CH(3)，CH(5))ppm.
针对C17H14FN6的计算值：C，63.74；H，4.09；N，26.24
实测值：C，63.57；H，4.07；N，26.33
2、根据本发明的4-氨基-3-芳氨基-6-芳基吡唑[3.4-d]嘧啶衍生物作为抗病毒药物 的应用
2.1以上实施例1～6所述的化合物在细胞培养基中的相容性：
将1×104个HeLa细胞(DSMZ，ACC 57)种入每个微量测试板孔的0.2ml培养基RPMI 1640之中。在没有测试物的标准情况下(温度37℃，5％CO2以及大约95％相对空气湿度)，将微量滴定板在生理条件下培养48小时，以便产生分会合单层。然后在该单层上加入具有适当稀释水平的测试物，并且在生理条件下培养72小时。在培养时间终了时，经过戊二醛固定以及亚甲基蓝染色之后，使用微孔板阅读仪(Sunrise，TECAN)测定660nm微量滴定板所有孔的消光系数，并且借助分析程序“Magellan”测定CC50。由于预培养HeLa细胞已使得分会合细胞层形成，因此在随后使用测试物进行培养的过程中，细胞溶解是进行分析的关键因素。
将GMK细胞种入微量滴定板之中，然后在5％CO2、温度为37℃且空气湿度为95％的条件下，在培养箱中预培养48小时形成细胞层(Schmidtke M等：J Tirol Meth，2001，95(1-2)，133-143)。然后移去培养基，并且将不同浓度的物质(100μl/孔/浓度，稀释系数2)施用在培养基中。分别使用100μl培养基来测定对照值(六个未经处理的细胞对照组)在施用物质并培养72小时之后，使用结晶紫/甲醇对细胞进行染色。在染料溶解之后，在Dynatech公司的微孔板阅读仪中(550/630nm)测定各个孔的光密度(OD)。对照组的平均值假设为100％。根据平均剂量反应曲线，利用线性插补法算出50％细胞毒性浓度(CC50)。
Figure G2007800231625D00111
2.2以上实施例1～6所述的化合物在培养基中的抗病毒效果：
使用国际参考株柯萨奇病毒B3 Nancy(CVB3 Nancy)、人鼻病毒2和8 (HRV2和HRV14)在HeLa细胞中进行细胞病变效应(zpE)抑制试验
在该测试中所用病毒的复制导致宿主细胞完全破坏，即明显的细胞病变效应(zpE)。加入抗病毒有效物质(100μl/孔/浓度，稀释系数2)能抑制病毒引起的zpE(Schmidtke M.等：J Virol Meth，2001，95(1-2)，133-143)。在试验过程中，使用能在感染之后24小时(CVB3 Nancy)或者72小时(HRV2和HRV8)在未经处理的病毒对照组中引起完全zpE的病毒剂量，来感染未经处理的以及经过测试物处理的封闭细胞层。这时使用结晶紫/福尔马林将尚且贴壁的细胞固定，并且进行染色。洗脱染料之后，在Dynatech微孔板阅读仪中以光度法对病毒引起的zpE的抑制效果进行定量检测。将经过测试物处理和未经处理的感染病毒细胞的光密度与设定为100％的细胞对照组的光密度进行比较，计算抗毒效果。根据平均剂量反应曲线，算出50％的抑制浓度。使用普乐康尼作为对照物质。使用实施例物质获得的试验结果均汇总在下表之中。
Figure G2007800231625D00121
使用实施例1所述的物质与可萨奇病毒B1、B2、B4、B5、B6(CVB1、CVB2、CVB4、CVB5、CVB6)进行空斑减少试验(PRT)
进行试验时，使用50～80个空斑形成单位(PFU)感染12孔组织培养板中已经封闭两到三天的HeLa细胞层(Schmidtke M等：J VirolMeth，2001，95(1-2)，133-143)。将两个未感染的板孔作为细胞对照组(ZK)。在37℃温度下吸附病毒一小时后，抽去含有病毒的上清液。使用不含(病毒对照组)或者含有非细胞毒性浓度物质(稀释系数为2，每种浓度测定两次)且含有0.4％琼脂的试验培养基涂在感染的细胞上，然后在37℃温度下培养48小时。使用结晶紫-福尔马林将微孔板固定、染色之后，移去琼脂，然后用流动的清水冲洗。在灯箱上清点病毒引起的空斑数量，然后计算测试物引起的空斑百分比减少率。执行三次相同的试验步骤，根据算出的平均剂量反应曲线，计算致使空斑减少50％的浓度(IC50)。使用实施例1所述的物质获得的试验结果均汇总在下表之中：
Figure G2007800231625D00122
2.3实施例2和4所述的化合物在小鼠体内的急性与亚急性毒性
确定实施例2和4所述的物质在4～5周大的小鼠(没有品系名称)体内的急性毒性。在1％羧甲基纤维素溶液中加入1～2滴TWIN-80制成悬浮液。每5只小鼠为一组，按照1500、2000、2500、3000、4000或5000mg/kg剂量，让其一次口服实施例2和4所述的物质。在随后的3天确定这些小鼠的一般情况、体重变化、直肠温度和存活率。
一次性喂给浓度在3000mg/kg以下的实施例2和4所述的物质，所有小鼠均能存活(参见下表)。无论是一般情况，还是直肠温度或体重，均没有受到影响。
两种物质的50％致死剂量约为3500mg/kg(根据
Figure G2007800231625D00131
在Mayer等的病毒学工作方法(Virologische Arbeitsmethoden)中公布的计算结果，Gustav-Fischer出版社，Jena，1973)。服用5000mg/kg剂量之后，动物在3～5小时内死亡。
Figure G2007800231625D00132
根据这些试验结果，在一次性口服情况下，实施例2和4所述的物质可评为耐受性非常好。
确定这些物质(实施例2和4)在四周龄的小鼠体内(没有品系名称)的亚急性毒性。在1％羧甲基纤维素溶液中加入1～2滴TWIN-80制成悬浮液。每7只小鼠为一组，按照100mg/kg剂量，连续5天每天一次让其口服实施例2和4所述的物质。观察时间为10天。每天评估一般情况、体重差、直肠温度变化和存活率，以及在试验结束时分组评估脾脏、肺和肝脏的形态变化。
服用测试物对于一般情况以及体温没有任何影响。与未经处理的对照组动物一样，体重增加。没有任何动物死亡。按照100mg/kg剂量五次口服实施例2和4所述的物质，结果证明耐受性非常好。
所使用的附图标记清单
1    -    吡唑[3，4-d]嘧啶
2    -    [二(甲硫基)亚甲基]丙二腈
3    -    芳基胺
4    -    芳基衍生物
5    -    吡唑
6    -    芳基脒

Claims (9)

1.4-氨基-3-芳氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于是以通式I表示的一种化合物，
Figure FDA00002899388700011
其中：
-基团A是苯基或萘基，且该基团中一至三个氢原子任选相互独立地被以下基团R1替代，
-基团B是苯基或萘基，
-基团R1是卤素或具有1～7个链节的饱和的直链或支化脂肪基，以及
-基团R2、R3、R4、R5各为H。
2.根据权利要求1所述的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于是通式I表示的4-氨基-6-苯基-3-(三-R1)苯基氨基吡唑[3,4-d]嘧啶。
3.根据权利要求1或2所述的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物，其中基团R1相互独立地选自卤素。
4.根据权利要求1所述的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物，其特征在于选自包括以下化合物的6-苯基氨基吡唑[3,4-d]嘧啶化合物：
4-氨基-3-苯氨基-6-苯基吡唑[3,4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(3-氟苯基)氨基-6-苯基吡唑[3,4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(3-甲基苯基)氨基-6-苯基吡唑[3,4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(4-甲基苯基)氨基-6-苯基吡唑[3,4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(4-氟苯基)氨基-6-苯基吡唑[3,4-d]嘧啶、
4-氨基-3-(4-溴苯基)氨基-6-苯基吡唑[3,4-d]嘧啶。
5.权利要求1所述4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物的制备方法，其特征在于，在醋酸、三氟醋酸或者其盐类存在下，使吡唑化合物与芳基脒化合物进行缩合反应。
6.权利要求1～4中任一项所述的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基苯基[3,4-d]嘧啶衍生物或者其药用盐类在制备抗病毒药物中的应用。
7.权利要求6所述的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物的应用，其特征在于所述药物是用于预防、治疗由细小核糖核酸病毒导致的感染。
8.权利要求6或7所述的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物的应用，其特征在于该衍生物是作为单一物质用于所述药物中。
9.权利要求6或7所述的4-氨基-3-芳基氨基-6-芳基吡唑[3,4-d]嘧啶衍生物的应用，其特征在于该衍生物是与其它有效物质共同用在所述药物中。
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