JP5171815B2

JP5171815B2 - ４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体、その製造方法及び抗ウイルス性作用物質としての使用

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Publication number: JP5171815B2
Application number: JP2009515702A
Authority: JP
Inventors: マカロフ，ヴァディム; ヴュツラー，ペーター; シュミット，ミカエラ; ダーシェ，ハンス−マルティン
Original assignee: ドリットパテントポートフォリオベタイリガングスゲセルシャフトエムベーハーウントコー．カーゲー
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-20
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2027-06-20
Also published as: NO20090332L; AU2007262524A1; IL195837A0; KR101107839B1; BRPI0713488A2; BRPI0713488B1; EP2049540B1; JP2009541230A; ATE492548T1; RU2456288C2; ZA200900165B; US20100010018A1; EP2049540A1; CA2655754A1; RU2009101920A; WO2007147401A1; CN101553489A; CN101553489B; AU2007262524B2; ES2359677T3

Description

本発明は、新規４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体、その製造方法及び本誘導体の特にピコルナウイルス感染症の治療のための抗ウイルス性作用物質としての使用に関する。

ピコルナウイルス、特にエンテロウイルス及びライノウイルスは、広いスペクトルのヒトの疾患の原因となる。エンテロウイルスには６０種類以上のヒト病原性血清型がある（ＭｅｌｎｉｃｋＪ．；ＦｉｅｌｄｓＢ．ら編、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ出版社、フィラデルフィア、１９９６、６５５〜７１２）。エンテロウイルス感染症、エコーウイルス感染症、コクサッキーウイルスＡ群感染症及びコクサッキーウイルスＢ群感染症は頻回に非特異的な熱を伴い、上気道の疾患を誘発するが、これらの疾患はしばしばライノウイルス感染症と区別できない。流行的に発生することもある重度の病像としては、出血性結膜炎、ヘルパンギーナ、手足口病、無菌性髄膜炎、脳炎及び急性心筋炎がある。この場合、異なる型のウイルスが同じ症候を引き起こし、若しくは同一の型のウイルスが全く異なる病像をもたらし得る。ウイルス診断に最新且つ高感度の方法を導入することにより、持続性のエンテロウイルスＲＮＡの検出、並びに慢性疾患、例えばＩＩ型糖尿病、灰白筋炎、及び特に慢性心筋炎との関連でウイルスタンパク質の検出に成功した。持続性のエンテロウイルス感染症は無ガンマグロブリン血症患者でも発症し、この場合は持続性エンテロウイルス髄膜脳炎として発現する。随伴症状として皮膚筋炎又は多発性筋炎が頻回に発症した。ライノウイルスには約１００種類の血清型がある。ライノウイルス感染症は、ヒトにおいて上気道に関連する全呼吸性疾患の半数以上の原因となっている（ＣｏｕｃｈＲ．Ｂ．；ＦｉｅｌｄｓＢ．Ｍ．ら編、ＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、フィラデルフィア、１９９６、７１３〜３５）。ほとんどの場合無害に進行するこれらの風邪は、平均発病期間が約１０日間で、毎年何百万件という診療、休業及び休校の原因となっている。合併症として中耳炎、洞炎、喘息及び嚢胞性線維の増悪、並びに下部気道の感染症が特に幼児、高齢患者及び免疫抑制患者に発症し得る。型が多様であるため、目下のところ予防接種は不可能である。これらの疾患に伴う休業、診療及び投薬により、ライノウイルス及びエンテロウイルスは毎年巨額のコストを発生させている。これらのウイルス感染症の治療は、ウイルス特異的な治療薬がないため従来対症療法的に行われている（ＲｏｔｂａｒｔＨ.Ａ.、ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ２００２、５３（２）、８３〜９８）。更に、抗生物質が不必要に処方されることも多い。よって新しいウイルス抑制剤の開発が不可欠である。

ロートバルトはエンテロウイルス感染症及びライノウイルス感染症の治療可能性を精力的に研究した結果をまとめて２０００年に発表した（ＲｏｔｂａｒｔＨ．Ａ．、ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ２００２、５３（２）、８３〜９８）。例えばリバビリンは宿主細胞酵素であるイノシン５’−モノリン酸（ＩＭＰ）デヒドロゲナーゼを抑制する。プリンヌクレオチドの合成の鍵になるこの酵素を排除することによって、ピコルナウイルスの複製をｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏにおいて抑制できる。更にリバビリンは直接ポリオウイルスのゲノムに組み込まれ、それによって追加的にＲＮＡウイルスに対する突然変異原として作用する（ＣｒｏｔｔｙＳ．ら、ＮａｔＭｅｄ.、２０００、６（１２）、１３７５〜９）。これらの化合物は副作用が強いため、エンテロウイルス感染症及びライノウイルス感染症の治療には使用されない。ウイルスＲＮＡ合成を抑制するための特異的ターゲットはゲノム自体、ウイルスＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、及び複製複合体に必要なウイルスタンパク質である。グアニジン、チオセミカルバゾン、ベンズイミダゾール、ジピリダモール及びフラボンは、以前から種々のピコルナウイルスのポリメラーゼの抑制物質であることが細胞培養において知られていた。それにより非常に様々な成果がｉｎｖｉｖｏで達成された。広範な抗エンテロウイルス活性及び抗ライノウイルス活性を有する最も有望な候補はエンビロキシム誘導体と見られている。エンビルロキシムはウイルスタンパク質３Ａに結合することにより、ウイルス増殖の際にＲＮＡ中間体を形成するために必要なプラス鎖ＲＮＡの合成を阻害する（ＨｅｉｎｚＢ. Ａ．及びＶａｎｃｅＬ．Ｍ．、ＪＶｉｒｏｌ．１９９５、６９（７）、４１８９〜９７）。臨床研究において、治療効果は中等度又は皆無であり、薬物動態は不良であり、望ましくない副作用が確認された（ＭｉｌｌｅｒＦ．Ｄ．ら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９８５、２７（１）、１０２〜６）。バイオアベイラビリティー及び耐容性を有する比較的新しい誘導体について、これまで臨床データは出ていない。

ウイルスタンパク質分解酵素２Ｃの微小構造と機能に関する知見に基づき、プロテアーゼインヒビターＡＧ７０８８が開発された。ＡＧ７０８８は細胞培養において、ナノモル濃度範囲で４８のライノウイルス型、並びにコクサッキーウイルスＡ２１、Ｂ３、エンテロウイルス７０及びエコーウイルス１１に対して効果がある（ＰａｔｔｉｃｋＡ．Ｋ．ら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｌａＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９９９、４３（１０）、２４４４〜５０）。これまで臨床研究の最終的なデータは知られていない。

ウイルスカプシドの分子構造を解明することにより、カプシド遮断薬「ＷＩＮ物質」を的確に設計するための前提が提供された（ＤｉａｎａＧ．Ｄ．、ＣｕｒｒＭｅｄＣｈｅｍ、２００３、２、１〜１２）。これらの物質はライノウイルス及びエンテロウイルスの吸着及び／又は脱殻を阻止する。あるＷＩＮ物質は、高特異的にピコルナウイルスの幾つかの属又はウイルス型に対してのみ作用する。その他の誘導体はライノウイルスだけでなくエンテロウイルスの増殖も抑制する。ＷＩＮ物質には、例えばアリルドン、ジソキサリル及びピロダビルがある。これらの物質は細胞培養において非常に良好な抗ウイルス性を示す。しかし不良な可溶性（アリルドン）、低いバイオアベイラビリティー（アリルドン及びジソキサリル）、急速な代謝と排出（ジソキサリル及びＷＩＮ５４９５４）、並びに副作用、例えば皮疹（ＷＩＮ５４９５４）のために臨床応用は不可能である。別のカプシド遮断薬であるプレコナリルに大きな期待が寄せられた。プレコナリルは非常に良好な経口バイオアベイラビリティーを有し、ウイルスカプシド内の疎水性ポケット内に結合した後、ライノウイルス、エコーウイルス及びコクサッキーウイルスの浸透を抑制する（ＰｅｖｅａｒＤ．Ｃ．ら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ１９９９、４３（９）、２１０９〜１５；ＭｃＫｉｎｌａｙＭ．Ａ．ら、ＡｎｎｕＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２、４６、６３５〜５４）。それによって通常の感冒からウイルス性の髄膜炎又は心筋炎に至る広いスペクトルのウイルス疾患に対して潜在的に有効である。ライノウイルス、エンテロウイルス７１及びコクサッキーウイルスＢ３で耐性が観察された（ＬｅｄｆｏｒｄＲ．Ｍ．ら、ＪＶｉｒｏｌ２００４、７８（７）、３６６３〜７４；ＧｒｏａｒｋｅＪ．Ｍ．ら、ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９９９、１７９（６）、１５３８〜４１）。エンテロウイルス髄膜炎（ＡｂｚｕｇＭ．Ｊ．ら、ＰｅｄｉａｔｒＩｎｆｅｃｔＤｉｓＪ．２００３、２２、３３５〜４１）、及びライノウイルスに起因する呼吸器感染症（ＨａｙｄｅｎＦ．Ｇ．ら、ＡｎｔｉｖｉｒＴｈｅｒ．、２００２、７、５３〜６５；ＨａｙｄｅｎＦ．Ｇ．ら、：ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２００３、３６、１５２３〜３２）に罹患した子供と大人を対象とした臨床研究の結果は肯定的であった。しかし証明された治療効果は、アメリカ合衆国においてプレコナリル（Ｐｉｃｏｖｉｒ、Ｖｉｒｏｐｈａｒｍａ、米国）をライノウイルス感染症の治療に許可するには十分ではなかった。２００２年３月にはそのための申請は、治療成果が乏しい上に副作用が確認されたため食品医薬品局（ＦＤＡ）によって却下された。

ピラゾロピリミジンもＣＲＦ拮抗薬として記載されており（例えばＥＰ６７４６４２号及びＥＰ６９１１２８号）、例えばアデノシンキナーゼ（ＥＰ４９６６１７号又はＵＳ４９０４６６６号）やキサンチンオキシゲナーゼ（Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃ．Ｃｈｅｍ．１９、１５６５、１９８２）、その他の酵素系（ＵＳ２９６５６４３号及びＵＳ３６００３８９号）を抑制する。

従って依然としてライノウイルス疾患及びエンテロウイルス疾患の治療のための効果の高いウイルス抑制剤の開発が、抗ウイルス性に関する研究の緊急の課題である。新しい化合物は耐容性に優れており、例えばプレコナリルに対して存在する耐性を克服するものでなければならない。

ＥＰ６７４６４２号ＥＰ６９１１２８号ＥＰ４９６６１７号ＵＳ４９０４６６６号ＵＳ２９６５６４３号ＵＳ３６００３８９号

ＭｅｌｎｉｃｋＪ．；ＦｉｅｌｄｓＢ．ら編、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ出版社、フィラデルフィア、１９９６、６５５〜７１２ＣｏｕｃｈＲ．Ｂ．；ＦｉｅｌｄｓＢ．Ｍ．ら編、ＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、フィラデルフィア、１９９６、７１３〜３５ＲｏｔｂａｒｔＨ.Ａ.、ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ２００２、５３（２）、８３〜９８ＣｒｏｔｔｙＳ．ら、ＮａｔＭｅｄ.、２０００、６（１２）、１３７５〜９ＨｅｉｎｚＢ. Ａ．及びＶａｎｃｅＬ．Ｍ．、ＪＶｉｒｏｌ．１９９５、６９（７）、４１８９〜９７ＭｉｌｌｅｒＦ．Ｄ．ら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９８５、２７（１）、１０２〜６ＰａｔｔｉｃｋＡ．Ｋ．ら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｌａＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９９９、４３（１０）、２４４４〜５０ＤｉａｎａＧ．Ｄ．、ＣｕｒｒＭｅｄＣｈｅｍ、２００３、２、１〜１２ＰｅｖｅａｒＤ．Ｃ．ら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ１９９９、４３（９）、２１０９〜１５ＭｃＫｉｎｌａｙＭ．Ａ．ら、ＡｎｎｕＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２、４６、６３５〜５４ＬｅｄｆｏｒｄＲ．Ｍ．ら、ＪＶｉｒｏｌ２００４、７８（７）、３６６３〜７４ＧｒｏａｒｋｅＪ．Ｍ．ら、ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９９９、１７９（６）、１５３８〜４１ＡｂｚｕｇＭ．Ｊ．ら、ＰｅｄｉａｔｒＩｎｆｅｃｔＤｉｓＪ．２００３、２２、３３５〜４１ＨａｙｄｅｎＦ．Ｇ．ら、ＡｎｔｉｖｉｒＴｈｅｒ．、２００２、７、５３〜６５ＨａｙｄｅｎＦ．Ｇ．ら、：ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２００３、３６、１５２３〜３２Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃ．Ｃｈｅｍ．１９、１５６５、１９８２

本発明の課題は、エンテロウイルス及びライノウイルスに対して抗ウイルス性作用物質として使用可能であり、上述の先行技術の問題点、特に上述の薬剤の耐性及び不耐容に関する問題を回避する新規化合物、その製造及びその使用を提供することである。

本発明に従い、前記の課題は特異的に置換された一般式Ｉ：

（式中、Ａ基及びＢ基は互いに独立にフェニル基、ナフチル基、ピリジル基、キノリル基、ピラジニル基、ピリミジル基、ピラゾリル基、トリアジニル基、イミダゾリル基、フラニル基、チエニル基を表し、前記の各々の基において互いに独立に１〜３個の水素原子は次に挙げる基Ｒ^１で置換することができ、
基Ｒ^１は、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＮＲ^２ _２、ＣＯＯＲ^２、ＣＨＯ、ＣＯＮＨ_２、ハロゲン、構成元素数１〜７の飽和又は不飽和、直線状又は分枝状の脂肪族基、構成元素数１〜８の飽和又は不飽和、直線状又は分枝状のアルカノール基、ＯＲ^２、ＳＲ^２、ＮＲ^２ _２、ＳＯ_２ＮＲ^３ _２、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチル、フェニルであることができ、
基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５は互いに独立にＨ、構成元素数１〜７の飽和又は不飽和、置換又は非置換、ハロゲン化又は非ハロゲン化、直線状又は分枝状の脂肪族基、ベンジル、フェニル又はナフチル、ヘテロ原子Ｎ、Ｓ、Ｏを有する飽和又は不飽和の単環式複素環若しくは多環式複素環であり、これら各基はフッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アミノアルキル、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、ベンジル、フェニル又はナフチルで置換されてよい）で表わされる４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体及びその薬学的に許容される塩化合物によって解決される。

従属請求項には特異的に置換された４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の有利な実施形態、並びにこれを製造するための方法及びその応用の可能性が記載されているが、本発明はこれらのいずれにも制限されない。

一般式（Ｉ）で表わされる本発明化合物の好ましい形態としては６−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類から選択され、これらは次のものを含む：
４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−６−（トリ−Ｒ^１）フェニル−３−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
１−アルキル−４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−１、６−ジ（トリ−Ｒ^１）フェニル−３−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアルキルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、及び
１−アルキル−４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアルキルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン。

本発明において有利な一般式（Ｉ）で表わされる６−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンは次のものを含む：
４−アミノ−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−６−（４−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−クロロ）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−メトキシ）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（４−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（４−フルオロフェニル）アミノ−６−（４−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−１−メチル−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、及び
４−アミノ−１−ベンジル−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン。

驚くべきことに本発明の化合物は、ナノモル若しくはマイクロモルの濃度範囲でピコルナウイルス、特にエンテロウイルス及びライノウイルスに対して強い抗ウイルス活性を示す。

従って、式（Ｉ）の化合物を包含する本発明の製剤は、ヒト及び動物においてピコルナウイルス、特にエンテロウイルス及びライノウイルスに起因し得る呼吸器感染症、無菌性髄膜炎、脳炎、ヘルパンギーナ等に特に適している。

以下、本発明の一般式（Ｉ）の４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の具体例、並びにピコルナウイルス感染症に対するその効果及び応用について詳細に説明する。

図１は、本発明に係るピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン１を合成するための概略スキームを示す。第１段階では[ビス（メチルチオ）メチレン]マロノニトリル２をアルコール中がアリールアミン３と縮合させてアリール誘導体４を生成することを含む。アリール誘導体４はその都度単離されて後続の反応のために精製されるか、或いは精製せずに直接後続の反応に使用することができる（「ワンポット」反応）。これに続く段階は、アリール誘導体４とヒドラジン又はヒドラジン誘導体との相互作用からなる。この反応を１〜４時間加熱して行うと、ピラゾール５が高収率で得られる。ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン１の合成の重要な段階は、ピラゾール５を酢酸、トリフルオロ酢酸又は酢酸ナトリウムの存在下でアリールアミジン６と縮合させることである。

代替的な合成法においては、水素化ナトリウムの存在下でマロノニトリルをアリールイソチオシアン酸塩と「ワンポット」反応させ、次いでこの反応混合物をヨードメチル又は硫酸ジメチルで処理する。この場合、多量のエナミンが生成される。この場合もやはりピラゾール５を酢酸又はトリフルオロ酢酸等の酸、若しくはその塩（酢酸塩）の存在下でアリールアミジン６と縮合させることが、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン１の合成を製造するための重要な段階である。

以下の実施例において、ピコルナウイルス感染症に対して適用するのに特に適した一般式（Ｉ）の化合物の具体例を挙げる（本発明はこれらの化合物によって限定されない）。この場合、本発明に係る化合物は、薬学的に許容される水性媒体、有機媒体又は水性有機媒体を用いた溶液又は懸濁液として、静脈注射、皮下注射又は筋肉注射による局所的使用又は非経口使用の目的に、或いは鼻腔内用製剤に調製可能である。更に本発明に係る化合物は、従来の製剤担体を用いた錠剤、カプセル若しくは水性懸濁液として経口投与剤に、又は座剤として形成されている。

本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、用量０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重で使用することができる。

１．４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の製造及び分析
本発明化合物の構造は、合成して元素分析し、更にＮＭＲ及び／又は質量分析を行って確立した。
出発物質
５−アミノ−４−シアノ−３−アリールアミノピラゾールを図１に示した方法及びＴｏｍｉｎａｇａＹｅｔａｌ．（Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、２７、７７５〜７７９）の記載に従って合成した。アミールアミジンを公知の先行技術に従い出発シアン化合物から合成する（ＢｏｅｒｅＲ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、３３１、１６１〜１６７；ＧａｒｉｇｉｐａｔｉＲ．Ｓ．、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９９０、３１、１９６９〜１９７８；ＤａｎｎＯら、ＪｕｓｔｕｓＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．Ｃｈｅｍ．、１９８２、１８３６〜１８３９）。

４−アミノ−３−フェニルアミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２．３ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）の５−アミノ−４−シアノ−３−フェニルアミノピラゾールに、３．０ｇ（１７．２４ｍｍｏｌ）の塩酸ベンザミジン水和物と２．２ｇ（２３．０ｍｍｏｌ）の酢酸ナトリウムを攪拌しながら添加する。反応混合物を３０分間２２０℃で加熱する。その結果生じる材料を５０ｍＬの水で処理し、濾過して、２０ｍＬの低温メタノール及び２０ｍＬの低温エステルで洗浄する。生成物をＤＭＦ／水から結晶化することにより精製する。

淡黄色の固体結晶材料。収率５７％。融点２５３〜５℃。
Ｒｆ値（クロロホルム−メタノール；１０／１）：０．８（シリカゲル６０）。
質量分析ｍ／ｚ値：３０２（Ｍ^＋）。

４−アミノ−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
実施例１に記載した方法と同様に製造した。
淡黄色の固体結晶材料。収率４６％。融点２６７〜９℃。
Ｒｆ値（クロロホルム−メタノール；１０／１）：０．８５（シリカゲル６０）
質量分析ｍ／ｚ値：３２０（Ｍ^＋）

４−アミノ−３−（３−メチルフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
実施例１に記載した方法と同様に製造した。
ほぼ白色の固体結晶材料。収率７３％。融点２４６〜８℃。
Ｒｆ値（クロロホルム−メタノール；１０／１）：０．９０（シリカゲル６０）
質量分析ｍ／ｚ値：３１６（Ｍ^＋）

４−アミノ−３−（４−メチルフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
実施例１に記載した方法と同様に製造した。
物理化学的パラメータは次の通りである。
ほぼ白色の固体結晶材料。収率４３％。融点２６６〜８℃。
Ｒｆ値（クロロホルム−メタノール；１０／１）：０．８５（シリカゲル６０）
質量分析ｍ／ｚ値：３１６（Ｍ^＋）

４−アミノ−３−（４−ブロモフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
１．０ｇ（３．６ｍｍｏｌ）の５−アミノ−４−シアノ−３−（４−ブロモフェニル）アミノピラゾールを酢酸（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、１．８７ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）の塩酸ベンザミジン水和物と０．８９ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）の酢酸ナトリウムを攪拌しながら添加する。反応混合物を４時間加熱し、５０ｍＬの水で処理し、濾過して、２０ｍＬの低温メタノール及び２０ｍＬの低温エステルで洗浄する。粗生成物をエタノールから結晶化させて精製した。
物理化学的パラメータは次の通りである。
黄色の固体結晶材料。収率３８％。融点２７２〜４℃。
Ｒｆ値（クロロホルム−メタノール；１０／１）：０．９（シリカゲル６０）
質量分析ｍ／ｚ値：３８１（Ｍ^＋）

４−アミノ−３−（４−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
実施例５の記載と同じ方法で合成したが、溶剤としてトリフルオロ酢酸を使用した。最終生成物はエタノール／ＤＭＦから結晶化させた。
物理化学的パラメータは次の通りである。
白黄色の固体結晶材料。収率５８％。融点２５９〜２６３℃。
Ｒｆ値（クロロホルム−メタノール；１０／１）：０．８（シリカゲル６０）
質量分析ｍ／ｚ値：３２０（Ｍ^＋）

２．本発明の４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の抗ウイルス性作用物質としての使用
２．１実施例１〜６の化合物の細胞培養における耐容性
マイクロテストプレートの１ウェル当り０．２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に１×１０^４個のＨｅＬａ細胞（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５７）を播種した。被験物質なしで標準条件（３７℃、５％ＣＯ_２、相対空気湿度約９５％）においてマイクロタイタープレートを生理的条件下で４８時間培養して、サブコンフルエントな単層を生じさせた。その後単層に種々の希釈段階の被験物質を添加して、生理的条件下で７２時間培養した。培養終了時に、グルタルアルデヒド固定及びメチレンブルー染色を行った後、マイクロタイタープレートのすべてのウェルにおける細胞の死滅をマイクロプレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ、ＴＥＣＡＮ）を用いて６６０ｎｍで測定し、解析プログラム「Ｍａｇｅｌｌａｎ」を用いてＣＣ_５０を決定する。ＨｅＬａ細胞の事前の培養において既にサブコンフルエントな細胞集団が形成されるので、被験物質を使用した後続培養における細胞溶解が評価の基準となる。

ＧＭＫ細胞をマイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃及び空気湿度９５％に設定した恒温装置で４８時間事前培養して細胞集団を生じさせた（ＳｃｈｍｉｄｔｋｅＭ．ら、ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈ、２００１、９５（１−２）、１３３〜１４３）。その後培地を取り出して種々の濃度の物質（１００μＬ／ウェル／濃度、希釈度２倍）を培養培地に塗布した。対照値（６個の未処理の対照細胞群）を求めるために、それぞれ１００μＬの培地を使用した。物質適用及び培養から７２時間後に、クリスタルバイオレット／メタノールで細胞を染色した。色素を溶出した後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社のプレートフォトメーター（５５０／６３０ｎｍ）で個々のウェルの光学密度（ＯＤ）を測定し、対照細胞群の平均値と比較した。対照群の平均値を１００％と仮定した。平均用量作用曲線に基づき、線形的内挿法によって５０％細胞毒性濃度（ＣＣ_５０）を計算した。

２．２実施例１〜６の化合物の細胞培養における抗ウイルス作用
ＨｅＬａ細胞における国際基準株コクサッキーウイルスＢ３ナンシー（ＣＶＢ３ナンシー）、ヒトライノウイルス２及び８（ＨＲＶ２及びＨＲＶ１４）による細胞変性効果（ｚｐＥ）抑制試験
試験で使用したウイルスの複製は宿主細胞を完全に破壊して、極めて高い細胞変性効果（ｚｐＥ）を発現した。抗ウイルス性物質（１００μＬ／ウェル／濃度、希釈度２倍）を添加することにより、ウイルス誘発ｚｐＥを的確に抑制できる（ＳｃｈｍｉｄｔｋｅＭ．ら、ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈ、２００１、９５（１−２）、１３３〜１４３）。試験においては、未処理の細胞集団と物質処理した細胞集団を所定量のウイルスで感染させた。未処理のウイルス対照群では感染後２４時間（ＣＶＢ３ナンシー）又は７２時間（ＨＲＶ２及びＨＲＶ８）で完全なｚｐＥが発現した。この時点でまだ接着性の細胞をクリスタルバイオレット／ホルマリン溶液で固定及び染色した。色素を溶出した後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社プレートフォトメーターでウイルス誘発ｚｐＥの抑制を分光学的に定量した。抗ウイルス作用の計算は、ウイルスに感染させた物質処理細胞及び未処理細胞の光学密度と、対照細胞群の平均光学密度（１００％と仮定）を比較することによって行った。平均用量作用曲線に基づき、５０％抑制濃度を求めた。対照物質としてプレコナリルを使用した。各実施例の物質によって達成された結果を、次の表にまとめた。

実施例１の物質とコクサッキーウイルスＢ１、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６（ＣＶＢ１、ＣＶＢ２、ＣＶＢ４、ＣＶＢ５、ＣＶＢ６）を用いたプラーク減少試験（ＰＲＴ）
試験を実施するために、２〜３日齢のコンパクトなＨｅＬａ細胞を１２ウェル組織培養プレートに入れ５０〜８０プラーク形成単位（ＰＦＵ）で感染させた（ＳｃｈｍｉｄｔｋｅＭ．ら、ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈ、２００１、９５（１−２）、１３３〜１４３）。プレートの非感染２穴は対照細胞（ＺＫ）として用いた。ウイルスを３７℃で１時間吸着させた後、ウイルスを含有する上清を吸引した。感染した細胞を、物質で処理しない（対照ウイルス）、若しくは非細胞毒性濃度（希釈度２倍、１濃度当り２回測定）の物質で処理した、０．４％寒天を含む試験培地で覆い、３７℃で４８時間培養した。プレートをクリスタルバイオレット／ホルマリンで固定及び染色した後、寒天を取り出し、流水で洗浄した。ウイルス感染したプラークをライトボックス上で計数し、次に物質に起因するプラーク減少率を計算した。同じ試験を３回実施し、算出された平均用量作用曲線に基づき、５０％のプラーク減少をもたらした濃度（ＩＣ_５０）を計算した。実施例１による物質で達成された結果を、以下の表にまとめた。

２．３マウスにおける実施例２及び４の化合物の急性及び亜急性毒性
実施例２及び４による物質の急性毒性を、４〜５週齢のマウス（系統名なし）で調べた。ＴＷＩＮ８０を１〜２滴添加した１％カルボキシメチルセルロース水溶液を使用して、物質懸濁液を調製した。実施例２及び４の物質１５００、２０００、２５００、３０００、４０００又は５０００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ５匹のマウスに１回経口投与した。その後３日間に亘り、マウスの全身状態、体重変化、直腸温及び生存率を確認した。

実施例２及び４の物質を１回投与した場合、物質濃度３０００ｍｇ／ｋｇ未満ではすべての動物が生存した（次表参照）。全身状態も、直腸温及び体重も影響はなかった。

両物質の５０％致死量は、約３５００ｍｇ／ｋｇであった（Ｋａｅｒｂｅｒ；Ｍａｙｅｒら、「ウイルス学研究法」、Ｇｕｓｔａｖ−Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、イエーナ、１９７３による計算）。用量５０００ｍｇ／ｋｇを投与すると、動物は３〜５時間以内に死亡した。

これらの結果に基づき、実施例２及び４による物質は、１回経口投与した場合に耐容性が非常に良好であると評価される。

同じ物質（実施例２及び４）の亜急性毒性を、４週齢のマウス（系統名なし）で調べた。ＴＷＩＮ８０を１〜２滴添加した１％カルボキシメチルセルロース水溶液を使用して、物質懸濁液を調製した。実施例２及び４による物質１００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ７匹のマウスに１日１回５日間に亘り経口投与した。観察期間は１０日間に及んだ。毎日、マウスの全身状態、体重変化、直腸温の変化及び生存率、並びに実験終了後に解剖して脾臓、肺、肝臓の形態学的変化を評価した。

物質処理は、全身状態及び体温に影響を与えなかった。観察期間中、体重は未処理対照群と同様に増加した。死亡した動物は皆無であった。従って実施例２及び４の物質は、濃度１００ｍｇ／ｋｇを５回経口投与した場合の耐容性が非常に良好であると評価された。

１ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
２［ビス（メチルチオ）メチレン］マロノニトリル
３アリールアミン
４アリール誘導体
５ピラゾール
６アリールアミジン

Claims

一般式Ｉ：

（式中、Ａ基及びＢ基は互いに独立にフェニル基、ナフチル基、ピリジル基、キノリル基、ピラジニル基、ピリミジル基、ピラゾリル基、トリアジニル基、イミダゾリル基、フラニル基、チエニル基を表し、前記の各々の基において互いに独立に１〜３個の水素原子は次に挙げる基Ｒ^１で置換することができ、
基Ｒ^１は、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＮＲ^２ _２、ＣＯＯＲ^２、ＣＨＯ、ＣＯＮＨ_２、ハロゲン、構成元素数１〜７の飽和又は不飽和、直線状又は分枝状の脂肪族基、構成元素数１〜８の飽和又は不飽和、直線状又は分枝状のアルカノール基、ＯＲ^２、ＳＲ^２、ＮＲ^２ _２、ＳＯ_２ＮＲ^３ _２、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチル、フェニルであることができ、
基Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５は互いに独立にＨ、構成元素数１〜７の飽和又は不飽和、置換又は非置換、ハロゲン化又は非ハロゲン化、直線状又は分枝状の脂肪族基、ベンジル、フェニル又はナフチル、ヘテロ原子Ｎ、Ｓ、Ｏを有する飽和又は不飽和の単環式複素環若しくは多環式複素環であり、これら各基はフッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アミノアルキル、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、ベンジル、フェニル又はナフチルで置換されてよい）で表わされる化合物であることを特徴とする４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体。
一般化合物Ｉの４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンにおいて、Ａ基及びＢ基における基Ｒ^１は互いに独立してＣＯＮＨ_２、ＣＮ、ハロゲン、ＮＯ_２又はＣＦ_３であることを特徴とする、請求項１に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体。
一般化合物Ｉの１−Ｒ^３−４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンにおいて、Ａ基及びＢ基における基Ｒ^１は互いに独立してＣＯＮＨ_２、ＣＮ、ハロゲン、ＮＯ_２又はＣＦ_３であることを特徴とする、請求項１に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体。
４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−６−（トリ−Ｒ^１）フェニル−３−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
１−アルキル−４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−１、６−ジ（トリ−Ｒ^１）フェニル−３−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアルキルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、及び
１−アルキル−４−アミノ−６−フェニル−３−（トリ−Ｒ^１）フェニルアルキルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンを含む６−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類から選択されることを特徴とする、請求項１に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体。
６−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類から選択され、Ａ基及びＢ基における基Ｒ^１は互いに独立してハロゲンであることを特徴とする、請求項１に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体。
４−アミノ−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−６−（４−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−クロロ）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−メトキシ）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（４−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（４−フルオロフェニル）アミノ−６−（４−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
４−アミノ−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−１−メチル−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、及び
４−アミノ−１−ベンジル−３−（３−フルオロフェニル）アミノ−６−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンを含む６−フェニルアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類から選択されることを特徴とする、請求項１に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体。
酸又はその塩の存在下においてピラゾールとアリールアミジンを縮合させることを特徴とする、請求項１に記載の４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の製造方法。
前記酸又はその塩が、酢酸、トリフルオロ酢酸又はその塩であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
医薬品を製造するための請求項１〜６の１項に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用であって、それらが生物学的作用物質であることを特徴とする使用。
請求項９に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の使用において、生物学的作用物質は抗ウイルス作用を示すことを特徴とする使用。
請求項１０に記載４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の使用において、それらがウイルス感染症に対する予防的及び治療的適用のためのものであることを特徴とする使用。
前記ウイルス感染症が、ピコルナウイルス感染症であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
請求項９〜１２の１項に記載の４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の使用において、単一物質として使用されることを特徴とする使用。
請求項９〜１２の１項に記載の４−アミノ−３−アリールアミノ−６−アリールピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の使用において、公知の薬剤と共に使用されることを特徴とする使用。