JP2002509140A - トリアジン抗ウイルス化合物 - Google Patents

トリアジン抗ウイルス化合物

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アナディーズ・ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、１，３，５−トリアジン誘導体を含む薬学的調合物を提供する。本発明の化合物及び調合物は抗ウイルス及び抗生活性を含む広範な活性を示し、抗ウイルス及び／または抗生療法を必要とする患者を治療するための方法として、単独で、または組み合わせて使用することが可能である。本発明のトリアジン誘導体は機能性の核酸に結合してこれを阻害するため、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスによる症状の治療において広い応用が考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、核酸と１，３，５−トリアジン誘導体との相互作用、Ｂ型肝炎ウイ
ルス（ＨＢＶ）の複製の阻害剤としてのそれらの使用、及びＨＢＶによって引き
起こされるウイルス性肝炎の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） 医学分野においてウイルス感染症を治療するための新規な治療薬が待望されて
いる。毎年約３０万人の米国人がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している。
ＨＢＶの治療に現在使用することが可能な薬剤の有効性は限定されたものであり
、持続的な効果を示すものではなかったため、薬剤治療の終了後、ウイルスの力
値は速やかに大きくなる。更に、ウイルスのポリメラーゼを阻害するヌクレオシ
ド類似体などの特定のクラスの薬剤は、耐性を有するウイルス株がすぐに出現す
ることによりしばしば効果を失ってしまう。これらの理由により、異なる作用機
序にて機能する複数の薬剤を使用する複合療法が、ウイルス感染症の治療におい
てはより良好な成績が得られる可能性が高いことが明らかとなった。
【０００３】 小さい分子が高い親和性かつ特異性にてＲＮＡに結合することが可能であり、
結合したＲＮＡの基本的な機能を阻害することが可能である。こうした分子の例
としては、エリスロマイシンやアミノグリコシド類などの抗生物質がある。特定
の抗生翻訳阻害剤がＲＮＡと特異的に相互作用するという最初の示唆は、カナマ
イシン及びゲンタマイシンに対する耐性が１６ＳＲＮＡのメチル化に遺伝子マッ
ピングされたことから得られた（Thompson et al., Mol.Gen.Genet. 201:168, 1
985）。エリスロマイシンは細菌ＲＮＡに結合してペプチジル−ｔＲＮＡ及びｍ ＲＮＡを放出する（Menninger et al., Mol.Gen.Genet. 243:225, 1994）。２−
ＤＯＳを含むアミノグリコシド類は、ＲＲＥとして知られるＨＩＶのＲＮＡの構
造に特異的に結合し、ＨＩＶのＲｅｖタンパク質へのこのＲＮＡの結合を阻害す
ることにより、組織培養細胞内でのＨＩＶの複製を阻害する（Zapp et al., Cel
l 74:969, 1993）。また、アミノグリコシドは翻訳阻害剤として以前から開発が
進められてきたが、タンパク質の非存在下においてｒＲＮＡに結合することが示
されたのはようやく最近になってからである（Purohit and Stern, Nature 370:
659, 1994）。ヒグロマイシンＢはコロナウイルスのＲＮＡ合成を阻害するが、 ウイルスＲＮＡに結合してウイルスＲＮＡの翻訳を特異的に妨害することにより
これを行うものと考えられている（Macintyre et al., Antimicrob. Agents Che
mother. 35:2630, 1991）。したがってウイルス及び微生物の核酸の機能的に重 要な領域に結合する化合物は、複製や他の機能の阻害剤、すなわち、抗ウイルス
剤や抗生物質として有用である可能性がある。
【０００４】 本発明は詳細には、標的ＲＮＡの機能に変化を及ぼすＲＮＡリガンドを含む薬
剤の新規なクラスに関するものである。このクラスの化合物として、包膜化シグ
ナルとして知られるＨＢＶの前ゲノムＲＮＡ（εＲＮＡ）の重要かつ多機能性の
ＲＮＡ構造を特異的に認識する置換１，３，５−トリアジン誘導体がある。この
クラスの化合物はＨＢＶの複製の阻害剤として機能することが予期せずして見出
された。εＲＮＡは図２５５Ａに示されるように、６個のヌクレオチドのバルジ
が介在するステムループ構造に折り畳まれた短い配列からなる。εＲＮＡは、Ｈ
ＢＶの前コアタンパク質をコードする読み取り枠内に含まれているが、ウイルス
粒子内への前ゲノムの包膜化やマイナス鎖のＤＮＡ合成の開始などの、ＨＢＶウ
イルスの複製サイクルの異なる段階においてやはり必要とされる。εＲＮＡはＨ
ＢＶにおいてコードされたポリメラーゼの折り畳み及び活性化においても所定の
役割を果たしている可能性がある。
【０００５】 メラミンの誘導体である、１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン
は各種の用途に適当であることが文献に報告されている。例として、２，４，６
−トリス（ジメチルアミノ）−１，３，５−トリアジンはアルトレタミン（Ａｌ
ｔｒｅｔａｍｉｎ）（登録商標）として知られる抗腫瘍剤であり、卵巣癌の治療
に用いられる（Cancer 71;4 Suppl.:1559,1993）。同様にラーバデックス（Ｌａ
ｒｖａｄｅｘ）（Ｎ−シクロプロピル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−
トリアミン）は鶏舎に発生するハエを駆除するために飼料に添加される添加剤と
して使用されてきた（Poult.Sci.62(12):2371 1983）。
【０００６】 更に、パテル（Patel）等は２−アリールアミノ−４−（４−メトキシアニリ ノ）−６−（４−クロロフェニル／フェニルヒドラジド）−１，３，５−トリア
ジンの多くの誘導体が抗細菌活性を有することについて報告しているが（J.Inst
.Chemists(India),57,1985）、この結論を裏付けるデータは示されておらず、こ
れらの化合物を抗ウイルス剤として使用する可能性については何らの示唆もなさ
れていない。
【０００７】 パラメル（Paramelle）等に付与された米国特許第５，２２５，４０５号には 抗癌及び抗マラリア剤に対して獲得した耐性を失わせる４，６−ビス−アリルア
ミノ−１，３，５−トリアジン−２−イル誘導体について述べられている。パラ
メル等によれば、開示される誘導体は、細胞毒性を有する薬剤と同時に投与され
た場合、多剤耐性を低減するかもしくは完全に抑制する。このトリアジン化合物
は、通常は細胞毒性剤の排出を増加させるよう機能する誘導性膜タンパク質の作
用を阻害することにより、細胞内の薬剤の濃度を低くするものと考えられる。パ
ラメル等は抗ウイルス剤としてのトリアジン誘導体の使用に関しては何も述べて
いない。
【０００８】 オギルビー（Ogilvie）に付与された米国特許第４，５０８，８９８号は、１ ，３，５−トリアジン部分を有するヌクレオシド類似体に関し、この類似体化合
物は抗ウイルス活性を示す。しかしオギルビーの化合物は２，４，６−トリアミ
ノ−１，３，５−トリアジン誘導体を含むものではなく、Ｎにおいて置換された
プリン及びピリミジン化合物である。
【０００９】 キム（Kim）等に付与された欧州特許出願第１７２６０８号は、抗潰瘍、抗炎 症、及び抗抑制活性を示す１，３，５−トリアジン誘導体に関するものであるが
、キム等によれば、開示されたトリアジン誘導体を抗ウイルス剤として使用する
ことが可能であるという示唆はなされていない。
【００１０】 ゴランキエヴィッツ（Golankiewicz）等は抗ウイルス活性を有する複数の１，
３，５−トリアジン誘導体を単離したことについて報告している（J.Med.Chem.3 8 :3558, 1995）。しかし、これらの誘導体はイミダゾ−[１，５−α]−１，３，
５−トリアジン誘導体に限定されており、特にチオ−及びベンジル置換誘導体に
重点がおかれている。
【００１１】 クラウツベルガー（Kreutzberger）等の報告は抗ウイルス活性を有する、脂肪
族置換されたクロロジヘキシルアミノ−１，３，５−トリアジンに関するもので
ある（Arzneim.Forsch./Drug.Res.36(I)(4):626,1986）。しかし、これらの化合
物は本発明の化合物と構造的に異なっている。
【００１２】 国際特許公開公報第ＷＯ９７／２０８２５号には、本発明のものとは構造的に
異なる各種の１，３，５−トリアジン誘導体の単離について開示されている。こ
れらのトリアジン誘導体が抗ウイルス剤として使用可能であることについての示
唆はなく、これらの化合物の、除草剤、殺虫剤、殺ダニ剤、及び、殺菌剤として
の用途について述べられている。
【００１３】 ブラウン（Brown）に付与された米国特許第４，２５４，１２２号は、鎮痛作 用を示す６−アシルアミノテトラヒドロ−１，３，５−トリアジン−２，４−ジ
オン誘導体に関するものである。開示されるこの化合物の用途としては、抗炎症
剤及びプロスタグランジンシンテターゼ阻害剤としての用途がある。
【００１４】 更に、グルツマン（Gluzman）等に付与された欧州特許出願第７９５５４９号 は、抗ウイルス剤としての、ビス−アリールオキシ（アミノ）−トリアジニル−
オキシ（アミノ）アリール誘導体に関するものである。しかし、本発明の化合物
と異なり、グルツマン等の化合物は、２環式または複素環式置換部分によって連
結される２量体であり、グルツマン等は治療用化合物及び／または組成物として
の単量体の使用については示唆していない。
【００１５】 したがって、当該技術分野においては、機能性のウイルスの核酸に結合するこ
とによりウイルスの複製を阻害する化合物の同定、及び、Ｂ型肝炎ウイルスの複
製を阻害する特定の抗ウイルス剤が求められている。こうした抗ウイルス剤はＨ
ＢＶによって引き起こされるウイルス性肝炎の治療において有用であろう。
【００１６】 （発明の概要） 本発明は、ウイルス及び／または微生物の複製を阻害し、ウイルス及び／また
は微生物感染を防止または治療するための方法を提供し、こうした方法において
使用される薬学的調合物を提供するものである。この薬学的調合物は、ＩＡ式、
【００１７】
【化９】
【００１８】 またはＩＢ式、
【００１９】
【化１０】
【００２０】 の化合物であって、 式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、水素、アルキル、アル
ケニル、アルキニル、アリール、複素アリール、非芳香族複素環式、縮合環式ま
たは多環式環構造、及びアリールオキシからなる群からそれぞれ独立に選択され
； ただし、前記アルキル、アルケニル、またはアルキニルは、場合により、ハロ
ゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル、アリール、アリールオ
キシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第
１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シ
クロアルケニル、及びアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基によ
って置換され、 前記アリール、アリールオキシ、複素アリール、非芳香族複素環式または縮合
環式または多環式環構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニ
トロ、トリハロメチル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カル
ボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミ
ン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルか
らなる群から選択される１以上の置換基によって置換されるか； または、Ｒ1とＲ2はともに、Ｒ3とＲ4はともに、または、Ｒ5とＲ6はともに、
シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または
縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアルキル、シクロ
アルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または縮合環式または多環式環
構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチ
ル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシ
ル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロ
アルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択さ
れる１以上の置換基によって置換されるか； または、Ｒ7とＲ8はともに、シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複
素環式または縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアル
キル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、及び縮合環式または多環式環構造
は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル、
アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル、
エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロアル
キル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択される
１以上の置換基によって置換され、ただし、Ｒ7とＲ8がともに縮合環式または多
環式環構造を形成する場合、Ｎに結合する縮合環式または多環式環構造の部分は
非芳香族性である化合物； 及び薬学的に許容されるその塩； 及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【００２１】 更に、本発明の目的は、上記の式にて表される１以上の化合物、及び薬学的に
許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む抗ウイルス
及び抗生調合物、ならびに、こうした調合物を抗ウイルス及び／または抗微生物
治療を必要とする患者に投与するための方法を提供することにある。本発明の更
なる目的は、上記の式の化合物の少なくとも１種類及び薬学的に許容されるその
塩に標的核酸を接触させ、標的核酸と上記の式の化合物の前記少なくとも１種類
との相互作用を監視することにより、標的核酸を検出するための方法を提供する
ことにある。
【００２２】 （発明の詳細な説明） この明細書において引用される全ての特許出願、特許、及び文献はそれらの全
体をここに援用するものである。抵触が発生した場合、定義文を含めたこの説明
文が優先する。用語の定義 本明細書中に用いられる「リガンド」なる語は、標的ＲＮＡに結合する所定の
物質を指すものである。この物質は、標的ＲＮＡが天然または別のコンホメーシ
ョンをとる際、または、標的ＲＮＡが部分的または全体的にほどけた、すなわち
変性した状態にある際に標的ＲＮＡに結合しうる。本発明によれば、リガンドは
標的ＲＮＡの任意の部位に結合する物質でありうる。したがって、本発明のリガ
ンドは、標的ＲＮＡに結合する能力以上の目立った生物学的機能をそれ自体が有
さず、またふくまない物質を含むものである。
【００２３】 本明細書中に用いられる「試験リガンド」なる語は、標的ＲＮＡに結合する能
力について試験が行われる、化合物、分子、または複合物を含む、所定の物質を
指すものである。
【００２４】 本明細書中に用いられる「標的ＲＮＡ」なる語は、これに対するリガンドまた
は結合物質が特定されることが求められるＲＮＡ配列を指すものである。標的Ｒ
ＮＡには、所定の疾病、症状や病理生態学的状態の病因論、または、生理学的機
能の調節に関与することが知られているか関与が考えられる配列が含まれるが、
これらに限定されない。標的ＲＮＡは、詳細には哺乳類、より詳細にはヒトであ
る脊椎動物や、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫やバクテリオファージ
などの任意の生物に由来するものであり得る。標的ＲＮＡは、野生型の配列か、
あるいは、安定性、活性が変化しているかまたは変異体としての他の性質を有す
る突然変異体または変異体配列か、あるいは、ヘテロの配列が加えられたハイブ
リッド配列を含みうる。更に、ここで用いる標的ＲＮＡとは、例として、ビオチ
ン、ペプチド、修飾塩基、蛍光分子などを結合させることにより化学的に修飾し
たＲＮＡをも含むものである。
【００２５】 本発明において用いられる標的ＲＮＡ配列は、一般に約５〜約５００ヌクレオ
チド、好ましくは約３０〜約１００ヌクレオチド、最も好ましくは約５０ヌクレ
オチドの長さを有する。標的ＲＮＡは、天然のものを単離するか、より好ましく
は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するもののような、従来のポリメラーゼに基
づく無細胞系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することが可能である。好ましい
一実施形態においては、標的ＲＮＡはＨＢＶのεＲＮＡである。図２５５Ａには
、包膜化シグナル（εＲＮＡ）に対応するＨＶＢの前ゲノム配列の実際の部分が
示されている。図２５５Ｂには、本発明の方法において標的ＲＮＡとして使用さ
れるεＲＮＡ配列、及び、特異性試験で使用されるＲＲＥ ＲＮＡ標的が示され ている。標的ＲＮＡは、クローニングした標的配列を含む直線化プラスミドをｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ転写して調製した。その際、当業者に知られた方法を用い、αＰ 32 −ＵＴＰの存在下でバクテリオファージＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼを使用し
て放射性同位元素標識した標的ＲＮＡを得た。
【００２６】 ウイルスまたは微生物感染に関して本明細書中に用いられる「治療」なる語に
は、鳥類や哺乳類などの脊椎動物、特にヒトにおいて、疾病、病理学的状態やそ
の１以上の症状を防止、遅滞、及び／または低減させることが含まれる。ＨＢＶ
の場合では、以下のプロセスのいずれかを変化させるかあるいは阻害することが
、ＨＢＶにより媒介される感染症の治療において極めて有用であるものと考えら
れる。
【００２７】 すなわち、 １．食欲不振、倦怠感、むかつき、及び嘔吐や、しばしば発熱を伴う、前徴期
の発現を含む、急性肝炎に伴う症状。前徴期には、じんま疹の発疹、関節痛、及
び黄疸の発現による黄疸期が続く。
【００２８】 ２．黄疸が最も著しくなった際、またはこれに先立つ血清アミノトランスフェ
ラーゼ及び尿中の胆汁レベルの上昇。
【００２９】 ３．正常白血球細胞数の減少、及び、血液スミアにおける異型リンパ球の出現
。
【００３０】 ４．ウイルス血症、セロコンバージョン、肝臓がん、及び肝硬変などの、慢性
肝炎に伴う症状。
【００３１】 本発明によれば、治療は、診療にあたる医師によって観察されるかあるいは定
量的または準定量的技術により決定される、１以上の臨床的または組織学的症状
、または診断マーカにおける任意の改善を構成するものである。適当な技術の非
限定的な例として、血液及び尿の分析がある。
【００３２】 ここで用いられる「複製の阻害」とは、ウイルス、細菌、または真菌の複製ま
たは増殖における検出可能なあらゆる低減を指すものである。例として、約１％
〜約１００％の低減、好ましくは約５％〜約１００％の低減、より好ましくは約
１０％〜約１００％の低減である。熟練した当業者であれば、ウイルスの複製、
細菌や真菌の増殖における任意の低減は、ウイルスの複製及び細菌や真菌の増殖
の既知の阻害剤について観察される低減にほぼ等しいかこれを上回る場合に顕著
である点は認識されよう。
【００３３】 本明細書中に用いられる「抗生物質」、「抗細菌剤」、及び「抗真菌剤」なる
語は、微生物、細菌、または真菌を殺すか、またはその成長を阻害する任意の化
合物を指すものである。
【００３４】 本明細書中に用いられる「アリール」なる語は、約６個〜約１０個の炭素原子
を有するとともに１個のラジカルを有する芳香族炭素環式の環構造系を意味する
ものである。アリール基は縮合環式または多環式環構造の場合もある。例示的ア
リール基としてはフェニルやナフチルがある。
【００３５】 本明細書中に用いられる「アリールオキシ」なる語は、Ｏ−アリール基を意味
するものである。アリールオキシ基は、アリールオキシのアリール部分において
置換される場合もある。適当な置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキ
ル、ニトロ、トリハロメチル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ
、カルボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第１級、第２級、及び第３級
アミン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、及びアルキ
ニルが含まれる。
【００３６】 本明細書中に用いられる「アルキル」なる語は、直鎖型または分枝した飽和炭
化水素基を意味するものである。好ましいアルキル基としては、１〜１２個の炭
素原子を有するものが含まれる。
【００３７】 本明細書中に用いられる「シクロアルキル」なる語は、約３〜約１０個の炭素
の環からなる、非芳香族の単環式または縮合環式または多環式の環構造系を意味
するものである。場合によりシクロアルキル環の炭素原子の１以上を、窒素、酸
素、または硫黄などの異種原子にて置換することが可能である。例示的シクロア
ルキル基としては、シクロヘキシルが含まれる。
【００３８】 本明細書中に用いられる「シクロアルケニル」なる語は、約３〜約１０個の環
炭素からなるとともに炭素−炭素２重結合を含む非芳香族の単環式または縮合環
式または多環式環構造系を意味するものである。場合によりシクロアルケニル環
の炭素原子の１以上を、窒素、酸素、または硫黄などの異種原子にて置換するこ
とが可能である。
【００３９】 本明細書中に用いられる「カルボニル」または「カルボニル部分」なる語は、
例として、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、酸ハロゲン化物、アミド、ペプチ
ド、無水物、及びエステルなどのカルボニル官能基を含む全ての化学的部分を指
すものである。本明細書において、環構造がカルボニル基にて置換されていると
記載される場合、環の炭素原子は、基
【００４０】
【化１１】
【００４１】 にて置換されているものである。
【００４２】 本明細書中に用いられる「異種原子」なる語には、窒素、酸素、硫黄、及び炭
素以外の全ての原子が含まれるものである。
【００４３】 本明細書中に用いられる「環構造」なる語は、芳香族または非芳香族炭素環式
化合物を指すものであり、環の炭素原子の１以上が、窒素、酸素、または硫黄な
どの異種原子によって置換されていてもよい。環構造は場合により、１以上のハ
ロゲン、Ｃ1〜Ｃ12のアルキル、アリール、ビニル、アルキル（アリール）、ビ ニル（アリール）、及びニトロ基によって置換することが可能である。
【００４４】 本明細書中に用いられる「縮合環構造」なる語は、少なくとも２個の隣り合う
炭素中心によって１以上の環構造が接合される環構造を指すものである。本明細
書中において用いる縮合環構造は、芳香族または非芳香族のいずれでもよく、別
個の芳香族及び非芳香族部分から構成されることも可能である。例示的炭素環式
縮合環構造は次式により示される。
【００４５】
【化１２】
【００４６】 環の炭素原子の１以上が異種原子によって置換されている縮合環構造の例とし
て、次式に示されるものがある。
【００４７】
【化１３】
【００４８】 本明細書中に用いられる「多環式環構造」なる語は、２以上の環式化合物が並
んで結合した環構造を指すものである。本明細書において用いる多環式環構造は
芳香族または非芳香族のいずれでもよく、別個の芳香族及び非芳香族部分から構
成されることも可能である。炭素環式多環式環構造の例を次式に示す。
【００４９】
【化１４】
【００５０】 環の炭素原子の１以上が異種原子によって置換されている多環式環構造の例と
して、次式に示されるものがある。
【００５１】
【化１５】
【００５２】 更に、縮合または多環式環構造は場合により、１以上のハロゲン、Ｃ1〜Ｃ12 のアルキル、アリール、ビニル、アルキル（アリール）、ビニル（アリール）、
及びニトロ基によって置換することが可能である。
【００５３】 本明細書中に用いられる「複素アリール」なる語は、１個のラジカルを有する
約５〜１０員の芳香族の単環式または縮合環式または多環式環構造であって、環
構造の炭素原子の１以上が、例として、窒素、酸素、または硫黄などの炭素以外
の原子であるような環構造を意味するものである。複素アリール基の例としてピ
リジンがある。縮合環式または多環式複素アリール基の例としてインドールがあ
る。
【００５４】 本明細書中に用いられる「複素シクリル」または「複素環式」なる語は、約５
〜約１０員の単環式または縮合環式または多環式の、芳香族又は非芳香族の環構
造であって、環構造の炭素原子の１以上が、例として、窒素、酸素、または硫黄
などの炭素以外の原子であるような環構造を意味するものである。複素シクリル
基は縮合環式または多環式環構造のいずれでもあり得る。複素シクリル基の例と
して、ピペリジン、モルホリノ、及びアゼパニルがある。
【００５５】 本明細書中に用いられる「第１級、第２級、または第３級アミン」なる語は、
それぞれ、１個、２個、または３個の官能基を有するアミン化合物を指すもので
ある。適当な官能基としては、ハロゲン、アミン、Ｃ1〜Ｃ12のアルキル基、ア リール、ビニル、アルキル（アリール）、ビニル（アリール）、及びニトロ基が
含まれる。
【００５６】 本明細書中に用いられる「アミド」なる語は、アミド官能基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−
を有する官能基であって、アミド基のＣまたはＮ原子に、アルキル、アルケニル
、またはアルキニル基を結合させることが可能な官能基を指すものである。
【００５７】 本明細書中に用いられる「高親和性」なる語は、標的に固く結合する化合物を
指すものである。本発明の好ましい化合物は、５０μＭまたはそれ未満で、好ま
しくは１０μＭまたはそれ未満で、より好ましくは１μＭまたはそれ未満でＩＣ 50 を示す。
【００５８】 本明細書中に用いられる「特異性」なる語は、標的に対して高い親和性または
弱い親和性を有する化合物を指すものである。高度に特異的な化合物は、競合物
質であるＲＮＡによって影響されず、化合物の親和性とは無関係に、異なる標的
物質を用いた非相同的アッセイに影響を与えることはない。好ましい一実施形態
においては、本発明の化合物は、非相同的アッセイにおいて、特異的アッセイに
おける場合と比較して、全く活性を示さないか、あるいは少なくとも５倍高いＩ
Ｃ50値を示す。
【００５９】 本発明は、ウイルス及び微生物の複製を阻害し、ウイルスまたは微生物感染症
を予防するかまたはこれを治療するための方法であって、１，３，５−トリアジ
ン化合物及び薬学的に許容可能なそれらの塩を投与することを含む方法を提供す
るものである。この化合物は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のεＲＮＡに高い親
和性及び特異性にて結合することにより、その機能を変化させるものである。本
発明の調合物はＩＡ式、
【００６０】
【化１６】
【００６１】 もしくはＩＢ式
【００６２】
【化１７】
【００６３】 にて表されるトリアジン誘導体であって、式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6 ，Ｒ7及びＲ8は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素ア
リール、非芳香族複素環式、縮合環式または多環式環構造、及びアリールオキシ
からなる群からそれぞれ独立に選択され、 ただし、前記アルキル、アルケニル、アルキニルは、場合により、ハロゲン、
ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル、アリール、アリールオキシ、
アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第１級、
第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シクロア
ルケニル、またはアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基によって
置換され、 前記アリール、アリールオキシ、複素アリール、非芳香族複素環式または縮合
環式または多環式環構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニ
トロ、トリハロメチル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カル
ボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミ
ン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニルまたはアルキニル
からなる群から選択される１以上の置換基によって置換されるか、 または、Ｒ1とＲ2はともに、Ｒ3とＲ4はともに、または、Ｒ5とＲ6はともに、
シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または
縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアルキル、シクロ
アルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または縮合環式または多環式環
構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチ
ル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシ
ル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロ
アルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択さ
れる１以上の置換基によって置換されているか、 または、Ｒ7とＲ8はともに、シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複
素環式または縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアル
キル、シクロアルケニル及び非芳香族の複素環式または縮合環式または多環式環
構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチ
ル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシ
ル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロ
アルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択さ
れる１以上の置換基によって置換され、ただし、Ｒ7とＲ8がともに縮合環式また
は多環式環構造を形成する場合、Ｎに結合する縮合環式または多環式環構造の部
分は非芳香族性である トリアジン誘導体、 及び薬学的に許容されるその塩、 及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【００６４】 一実施形態においては、本発明は、Ｒ1及びＲ2の一方が場合に応じて置換され
たアリールであるＩＢ式の化合物に関する。別の一実施形態においては、本発明
は、Ｒ7またはＲ8の一方が場合に応じて置換されたアリールであるＩＢ式の化合
物に関する。本発明の化合物の非限定的な例として以下のものが含まれる。
【００６５】
【化１８】
【００６６】
【化１９】
【００６７】
【化２０】
【００６８】
【化２１】
【００６９】
【化２２】
【００７０】
【化２３】
【００７１】 以下は、ＩＡ式、
【００７２】
【化２４】
【００７３】 またはＩＢ式、
【００７４】
【化２５】
【００７５】 のトリアジンの効率的製造のための化学的プロセスである。
【００７６】 最初に、商業的に入手可能な塩化シアヌル（ＩＸ）を、第１級及び第２級アミ
ンからなる群から選択した２当量の試薬と反応させ、１箇所が置換された（Ｘ）
式のトリアジンを得た。
【００７７】
【化２６】
【００７８】 次に（Ｘ）式の２−アミノ−４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジンを第
１級アミン及び第２級アミンからなる群から選択した２当量の試薬と反応させ、
２箇所が置換された（ＸＩ）式のトリアジンを得た。
【００７９】
【化２７】
【００８０】 次いで（ＸＩ）式の２，４−ジアミノ−６−クロロ−１，３，５−トリアジン
を、第１級アミン、第２級アミン、及びヒドラジンからなる群から選択した２当
量の試薬と反応させることが可能である。第１級アミン及び第２級アミンの場合
では、この反応により３箇所が置換された（ＸＩＩ）式のトリアジンが得られる
。
【００８１】
【化２８】
【００８２】 ヒドラジンの場合では、縮合反応により化合物（ＸＩＩＩ）が得られる。
【００８３】
【化２９】
【００８４】 次いで化合物（ＸＩＩ）を、アルデヒド及びケトンからなる群から選択した試薬
と更に反応させて、（ＸＩＶ）式の２，４，６−置換−１，３，５−トリアジン
を得ることが可能である。
【００８５】
【化３０】
【００８６】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 以下にトリアジン誘導体の効率的製造のための化学的プロセスを示す。
【００８７】 例１． ２−フルオロベンズアルデヒドＮ−[４−（ベンジルアミノ）−６− （ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル]ヒドラゾン （化合物９３）。
【００８８】
【化３１】
【００８９】 工程１ 塩化シアヌルをＤＭＥに加えた−３０℃の攪拌溶液に２当量のベンジルアミン
水溶液を滴下した。次いでこの混合物を上記低温下で３時間攪拌し、その後室温
にまで暖め、飽和炭酸水素ナトリウム及び水にて順次洗い、硫酸マグネシウム上
で乾燥し、真空に引いた。この生成物を精製せずに次の工程で使用した。
【００９０】
【化３２】
【００９１】 工程２ 工程１の生成物をジクロロメタンに溶かした室温の攪拌溶液に、２当量のｔｅ
ｒｔ−ブチルアミンを滴下した。この溶液を１２時間攪拌し、その後混合物を、
０．１Ｍ塩酸、水、及び飽和食塩水にて順次洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、
真空に引いて、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）の溶液から再結晶化して工程２
の出発物質を得た。
【００９２】
【化３３】
【００９３】 工程３ 工程２の生成物をジクロロメタンに溶かした溶液に、２当量のヒドラジン水溶
液を滴下した。この溶液を１２時間６０℃に加熱し、その後混合物を室温にまで
冷却し、食塩水及び水にて順次洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥して真空に引き、
残渣をヘキサン：酢酸エチル（４：１）の溶液から再結晶化して工程４の出発物
質を得た。
【００９４】
【化３４】
【００９５】 工程４ 丸底フラスコ中で工程３の生成物をトルエンに溶かした攪拌溶液に１当量の２
−フルオロベンズアルデヒドを加えた。このフラスコにディーンスターク（Ｄｅ
ａｎ Ｓｔａｒｋ）トラップを取り付け、還流して共沸的に水を除去した。水の
除去が完了した後、溶液を室温にまで冷却して溶媒を真空下で除去した。残渣を
ヘキサン：酢酸エチル（５：１）の溶液から再結晶化して化合物９３を得た。
【００９６】
【化３５】
【００９７】 例２． ２−ヒドロキシベンズアルデヒドＮ−[４−（ベンジルアミノ）−６ −（ジエチルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル]ヒドラゾン（化合 物１５５） 工程１ 塩化シアヌルをＤＭＥに加えた−３０℃の攪拌溶液に２当量のベンジルアミン
水溶液を滴下した。次いでこの混合物を上記低温下で３時間攪拌し、その後室温
にまで暖め、飽和炭酸水素ナトリウム及び水にて順次洗い、硫酸マグネシウム上
で乾燥し、真空に引いた。この生成物を精製せずに次の工程で使用した。
【００９８】
【化３６】
【００９９】 工程２ 工程１の生成物をジクロロメタンに溶かした攪拌溶液に２当量のジエチルアミ
ンを滴下した。この溶液を１２時間攪拌し、その後混合物を、０．１Ｍ塩酸、水
、及び飽和食塩水にて順次洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空に引いて、ヘ
キサン：酢酸エチル（４：１）の溶液から再結晶化して工程３の出発物質を得た
。
【０１００】
【化３７】
【０１０１】 工程３ 工程２の生成物をジクロロメタンに溶かした溶液に、２当量のヒドラジン水溶
液を滴下した。この溶液を１２時間６０℃に加熱し、その後混合物を室温にまで
冷却して、食塩水及び水にて順次洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥して真空に引き
、残渣をヘキサン：酢酸エチル（４：１）から再結晶化して工程４の開始物質を
得た。
【０１０２】
【化３８】
【０１０３】 工程４ 丸底フラスコ中で工程３の生成物をトルエンに溶かした攪拌溶液に１当量のサ
リチルアルデヒドを加えた。このフラスコにディーンスターク（Ｄｅａｎ Ｓｔ
ａｒｋ）トラップを取り付け、還流して共沸的に水を除去した。水の除去が完了
した後、溶液を室温にまで冷却して溶媒を真空下で除去した。
【０１０４】
【化３９】
【０１０５】 残渣をヘキサン：酢酸エチル（５：１）の溶液から再結晶化して化合物１５５を
得た。
【０１０６】
【化４０】
【０１０７】抗ウイルスまたは抗微生物活性の決定 Ｉｎ Ｖｉｔｒｏアッセイ 本発明の化合物の活性を決定するうえで用いられるアッセイの１つが、１９９
６年９月６日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／７０９，３４２号に開示
されており、ここにその開示の全体を援用するものである。このアッセイは、標
的ＲＮＡと、特異的な相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに
対する試験リガンドの阻害能を測定することにより標的ＲＮＡ分子と試験リガン
ドとの相互作用を検出するものである。一実施形態では、標的ＲＮＡを放射性同
位元素標識し、オリゴヌクレオチドをビオチンにて標識する。この場合、ハイブ
リダイゼーションの程度は、ストレプトアビジン／ビオチン捕捉系において検出
される放射性同位元素標識されたＲＮＡの量を測定することにより決定される。
【０１０８】 ｉｎ ｖｉｔｒｏの一次アッセイにおいて阻害活性を示したリガンドは、二次
アッセイにおいて滴定、試験を行い、偽陽性の結果を除外する。約０．１μＭ〜
約２００μＭの濃度の試験化合物の阻害能について、大過剰量の標識していない
非特異的ＲＮＡ競合物質（リボゾームＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）の存在下または非
存在下において放射線同位元素標識したεＲＮＡを使用して検定する。εＲＮＡ
に非特異的に結合する化合物はｒＲＮＡによって競合的に置換され、放射性同位
元素標識したεＲＮＡとビオチン化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
ョンの阻害は低減するかあるいは全く見られなくなる。逆に、εＲＮＡに特異的
に結合する化合物の阻害活性は競合物質としてのｒＲＮＡの存在下においても影
響されない。
【０１０９】 放射性同位元素標識したＲＮＡがＨＩＶ由来のＲＲＥ ＲＮＡであり、ビオチ ン化オリゴヌクレオチドがＲＲＥに相補的であるような第３のアッセイにおいて
特異性について更なる試験を行う。εＲＮＡに対して高い特異性にて活性を有す
る化合物は、このＲＲＥ ＲＮＡアッセイでは阻害能を示さないものと考えられ る。εＲＮＡに対するリガンドの特異性は、いずれも競合物質としてのＲＮＡの
存在下における、特定の標的ＲＮＡについて得られるＩＣ50値と、ヘテロである
標的（ＲＲＥ ＲＮＡ）について得られるＩＣ50値と間の比として表される。
【０１１０】 好ましくは本発明の置換２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘
導体は、非特異的競合物質としてのｒＲＮＡの過剰量の存在下において、３００
μＭまたはそれ未満、より好ましくは５０μＭまたはそれ未満、最も好ましくは
５μＭまたはそれ未満の濃度で、εＲＮＡに対する相互作用のＩＣ50を示す。
【０１１１】 バイオアッセイ 上記において決定されたようにεＲＮＡに対する高い親和性及び特異性を示す
リガンドに対してＨＢＶ複製の阻害能についての試験を行う。慢性ＨＢＶ感染に
対する有効な治療薬としての可能性のあるものを同定するため、複数の細胞系及
び細胞培養アッセイが開発されている。これらの細胞系の１つである２．２．１
５は、慢性的な細胞内でのＨＢＶ複製の正確なモデル、及びｉｎ ｖｉｖｏでの
慢性ヘパドナウイルス感染に対する抗ウイルス応答の予測モデルとなることが繰
り返し示されている標準アッセイにおいて使用されてきた。２．２．１５細胞は
、細胞のゲノムに組み込まれる完全なＨＢＶゲノムのコピーを含み、ＨＢＶの感
染による影響を受けない（Sells, M.A. et al,.J.Virol.62(8):2836-2844(1988)
）。これらの細胞は、チンパンジーに感染可能な完全なＨＢＶ粒子を作るＨＢＶ
遺伝子を発現する（Acs,G.et al.,Prc.Natl.Acad.Sci.USA 84(13):4641-4644(19
87)）。簡単に述べると、２．２．１５細胞を培養し、試験化合物にて９日間予 備処理する。その時点で培地を回収し、ドット−ブロットハイブリダイゼーショ
ンを行ってＨＢＶビリオンのＤＮＡを検出する。
【０１１２】 更に、任意の化合物の抗ウイルス作用はその毒性について測定されなければな
らない。抗ウイルス活性について用いられるものと同じ細胞を使用してニュート
ラルレッド吸収法によって細胞毒性を測定する。
【０１１３】 当業者であれば、不要な実験を行うことなく本発明を実施するための化合物の
阻害能を評価するうえで適当な任意のアッセイを用いることが可能である点は理
解されよう（参照例、J.Sambrook and T.Maniatis,"Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbo
r, NY(1989), "Current Protocols in Molecular Biology" Ed. F.M Ausubel,
et al.,J.Wiley & Sons,Inc. 1997, D.Leland, "Clinical Virology", W.B.Saun
ders Co., 1996, and "Cells: A Laboratory Manual", Ed. D.L. Spector, et a
l. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 19
97）。
【０１１４】 本発明の化合物は、機能的に重要なウイルスまたは微生物の核酸に結合するこ
とによりウイルスまたは微生物の複製を阻害するものと考えられる。こうした核
酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、あるいは、ウイルスまたは微生物の
ゲノムの一部またはそれらの中間体をなすものであってもよく、あるいは、ウイ
ルスまたは微生物の複製や機能に固有の、発現されたｍＲＮＡ種や他の任意の機
能性核酸を示す場合もある。
【０１１５】 本発明の化合物は、１９９６年９月６日出願の、同時係属中の米国特許出願第
０８／７０９，３４２号に記載のアッセイにおいて、オリゴヌクレオチドプロー
ブのハイブリダイゼーションを阻害するものである。このことは、これらの化合
物は、ＲＮＡの構造を安定化することによりＲＮＡ標的と相互作用し、これによ
り、ＲＮＡ標的とアッセイ中に存在する相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブ
リッド形成を阻害することを示すものである。
【０１１６】 トリアジン化合物がＲＮＡ標的と相互作用するという主張を支持する更なる根
拠が、化合物５によって、ＲＮＡの特定の部位がＲＮアーゼによる分解から保護
されるという観察から得られる。ＲＮアーゼに対する保護は、末端標識したＲＮ
Ａを、ＲＮＡ構造の可能な切断部位のそれぞれにおける１つの切断を示す梯子模
様が形成される（ゲル電気泳動法に基づく）だけの必要な所定量のＲＮアーゼと
ともにインキュベートすることにより評価した。ＲＮＡに結合したリガンドの存
在により、この結合部位はＲＮアーゼによるアクセスが不能となり、したがって
、この結合部位は分解パターン（図２５８Ａ及び２５８Ｂ）において特定のバン
ドが消失または弱く現れることによって示される。
【０１１７】 更に、トリアジン化合物のＲＮＡ結合能を、εＲＮＡのバルジ領域のみを含む
ＲＮＡ標的を調製することによって示した。このＲＮＡの融解温度を、温度を上
昇させつつ２６０ｎｍにおける吸光度の変化を監視することにより求めた。１０
μＭのトリアジン化合物を加えることにより、融解温度はシフトしたが、これは
リガンドによってＲＮＡ構造が安定化したことを示すものである（図２５９Ａ及
び２５９Ｂ）。
【０１１８】 すなわち、これらの実験はトリアジン化合物が核酸結合によりεＲＮＡのバル
ジ領域と相互作用することを示すものである。
【０１１９】 本発明の方法及び調合物を使用して、以下に列記するウイルスの複製の阻害及
び／またはこれらによる感染症を予防または治療することが可能である：Ｂ型肝
炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス１型及び２型、水痘−帯状疱
疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ポリオーマ
ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、伝染性
軟属腫ウイルス、マルブルク及びエボラウイルス、インフルエンザＡ型及びＢ型
、麻疹、流行性耳下腺炎、ＲＳウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイル
スＡ型及びＢ型、ライノウイルス、ロタウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス１型
及び２型、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、ウマ脳症ウイルス。本発明に包含さ
れるＤＮＡ及びＲＮＡウイルスとしては、アデノウイルス科、ヘパドナウイルウ
ス科、ヘルペスウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ポックスウ
イルス科、アレナウイルス科、ブンヤウイルス科、フラビウイルス科、オルトミ
クソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科
、レトロウイルス科、及びラブドウイルス科のウイルスの科に属するウイルスが
含まれるがこれらに限定されない。
【０１２０】 したがって、本発明の化合物及び調合物を、ＨＢＶによるウイルス性肝炎の予
防及び治療、ならびに他のＤＮＡ及びＲＮＡウイルスに関連する疾患症状の予防
及び治療において使用することが可能である。こうした症状に含まれるものとし
ては以下のものがあるがこれらに限定されない。すなわち、アデノウイルスによ
る、上下気道感染症、眼の感染症、胃腸炎、膀胱炎、及び臓器移植患者における
合併症；日和見免疫系がサイトメガロウイルスに関するものである、免疫的に日
和見感染状態の患者の治療；エプスタイン−バーウイルスによる伝染性単核球症
；水痘−帯状疱疹ウイルスによる、水痘及び帯状疱疹；ヘルペスウイルス、パピ
ローマウイルス、及びポリオーマウイルスによる、口辺、性器、皮膚の病変、及
び各種の皮膚科学的異常；天然痘、並びに痘瘡、軟属腫、及び感染性病原体に関
連したアレルギー性発疹、進行性痘疹、及びワクチン後脳炎を含む天然痘ワクチ
ン接種による合併症；ラッサ熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、及び他
のアレナウイルスによる、出血熱及び無菌性髄膜炎；インフルエンザＡ型、Ｂ型
、及びＣ型による、上下気道感染、重篤な急性気道疾患、ならびに肺炎；パラミ
クソウイルスによる、麻疹、流行性耳下腺炎、及びパラインフルエンザ；ピコル
ナウイルスによる、腸、神経筋及び中枢神経系感染；ＨＩＶ感染による、後天性
ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び関連する感染症及び臨床学的症候群；なら
びに、トガウイルスによる、脳炎及び麻疹。
【０１２１】 更に、本発明の化合物と、例えば、ネオマイシン、エリスロマイシン、及びア
ミノグリコシドなどの他のＲＮＡ結合分子との機能的な類似性があれば、本発明
の化合物及び組成物は抗生物質として使用することが可能である。抗生物質は、
植物、動物及びヒトの感染性疾患の治療に使用され、微生物を殺すかその成長を
阻害する。したがって本発明の化合物及び組成物は、殺菌性、静菌性かつ広域ス
ペクトルの抗生物質として使用することが可能である。
【０１２２】 薬学的調合物 本発明の組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、生物種、及び状態などの
因子ならびに投与経路を考慮した、医学、獣医学、及び農学における当業者には
よく知られる投与量及び投与法により投与することが可能である。本発明の組成
物は、単独で投与するか、あるいは、アシクロビル、α−インターフェロン、リ
バビリン等非トリアジン系抗ウイルス薬、及びリトナビル、インジナビル、サキ
ナビルなどの各種プロテアーゼ阻害剤、及び／またはエリスロマイシン、ゲンタ
マイシン、カナマイシン、及びストレプトマイシンなどの非トリアジン系抗生物
質などの、更なる薬剤と同時投与または順次投与することが可能である。
【０１２３】 トリアジン化合物５と抗ウイルス活性を有するよく知られたヌクレオシド類似
体である、２’−デオキシ−３’−チアシチジンとの同時投与において２つの治
療薬の相互作用の評価を行った。結果は、これら２つの薬剤を１：１５のモル比
（３ＴＣ：トリアジン；図２５７Ａ）にて一緒に投与した場合の強力な相乗的相
互作用を示した。この複合薬剤治療において見られた抗ウイルス活性は、各化合
物単独の活性に基づいて予想される相加的活性よりも大きなものである。相乗的
な応答により、複合療法においては各薬剤の使用量を減らすことが可能であり、
毒性や２次的なリスクが低減される。更に、異なる標的に作用する複数の薬剤を
用いた複合療法では、薬剤耐性を有するウイルス株が出現する確率が低減される
。
【０１２４】 更に本発明の調合物は、例えば、経口、経鼻、経肛門、経膣、経口、消化管内
投与などの、経粘膜投与のための、溶液、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤と
いった液体製剤を含む投与法に適した調剤にて投与することが可能であるが、こ
れに限定されるものではない。更に、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与
及びこれに類する投与を行うための、例えば注射によって投与するための滅菌溶
液、懸濁液、または乳濁液といった本発明の組成物の投与のための液体製剤は、
不要な実験を行うことなく調剤することが可能である。現在のところ経口投与が
好ましい。
【０１２５】 ある組成物を動物やヒトに投与するためには、また、任意の特定の投与法を行
うためには、マウスなどの適当な動物モデルにおいて致死量（ＬＤ）及びＬＤ50 を決定することなどにより毒性を決定し、組成物の投与量及び組成物中の諸成分
の濃度を決定し、抗ウイルス及び／または抗微生物応答を最大化するための投与
のタイミングを決定することが好ましい。こうした因子は、例えばＥＬＩＳＡ及
び／またはＥＦＦＩＴ分析による、抗体や抗原についての血清の力価測定及び分
析といった方法によって、不要な実験を行うことなく決定することが可能である
。当業者の知識、本発明の開示、及びここに引用される文献に基づけばこうした
決定において不要な実験を行う必要はない。
【０１２６】 この調合物は、例えば抗ウイルス活性及び／または抗微生物活性などの、標的
指標のための相対活性及び毒性、投与経路、及び、年齢、性別、体重、生物種、
ならびに特定の患者の状態といった因子を考慮して、薬学的な有効量、抗ウイル
ス的有効量、及び／または抗微生物的有効量にて投与することが可能である。
【０１２７】 本発明の組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ剤、エリキシル剤、カプ
セル剤、錠剤などでありうる。本発明の組成物は、滅菌水、生理食塩水、ブドウ
糖などの適当な担体、希釈剤や腑形剤を含むことが可能である。更に、これらの
組成物は凍結乾燥することも可能であり、所望の投与経路及び剤型に応じて、保
湿すなわち乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化すなわち増粘剤、保存料
、香料、着色料などの補助的物質を含みうる。不要な実験を行うことなく適当な
製剤を調製するためには、ここに援用する“Remington's Pharmaceutical Scien
ce”（17th Ed.,1985）などの標準的なテキストを参照することができる。
【０１２８】 本発明の化合物の好適な投与量は、以下に示される実施例及び本明細書中に引
用される文献に基づけば不要な実験を行うことなく求めることが可能である。例
として、組成物における抗ウイルス及び／または抗生剤の好適な投与量は、０．
１〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ／日未満、最も好まし
くは５０ｍｇ／ｋｇ／日未満である。
【０１２９】 更なる実施形態においては、本発明の化合物を、化合物の抗ウイルス及び／ま
たは抗生活性を向上させるための導入化合物として使用することが可能である。
これは、化合物の特定の官能基とその生物学的な活性との間の構造／活性の関係
の認識に基づき、本発明の化合物の特定の官能基を修飾することによって行われ
る。こうした修飾としては、官能基の大きさ、親水性、疎水性、酸性度、及び塩
基性度の合成的操作が含まれ、これにより化合物の活性を阻害または促進するこ
とが可能である。
【０１３０】 更に、本発明の化合物と核酸との間に見られる結合相互作用に基づき、本発明
の化合物を、核酸を検出及び／または精製するための方法、例えば結合アッセイ
及びアフィニティークロマトグラフィにおいて使用することが可能である。例え
ば、本発明の化合物をクロマトグラフィ用の支持体に共有結合により付着させ、
この固体支持体上で核酸を含む溶液を溶離させることが可能であり、標的核酸は
支持体に結合し、溶液の他の成分はカラムから流過液中に溶出する。結合アッセ
イ及びアフィニティークロマトグラフィに関しては、その開示をここに援用する
、A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 2d Ed., W.H. Freeman & Co.,
New York, 1985及び R.K. Scopes, Protein Purification, Principles and Pr actice, 2d Ed. , Springer-Verlag, New York, 1987が参照される。
【０１３１】 更に、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロセスを調べるため、本
発明の化合物をウイルスの複製サイクルの特定の段階の阻害剤として用いること
が可能である。診断用途においては、本発明の化合物を、蛍光、免疫化学的、ま
たは放射性の部分にて標識したトリアジン誘導体を用いることにより、試料中の
特定のＲＮＡ種の検出に使用することが可能である。更に、こうした標識トリア
ジン化合物を使用して、組織培養プレパラートを用いた電子顕微鏡法または光学
顕微鏡法によりＲＮＡ標的の細胞内局在化を調べることが可能である。
【０１３２】 以下の実施例は、本発明を更に説明することを目的としたものであるが、発明
を不要に限定するものではない。
【０１３３】 実施例１ εＲＮＡリガンドのハイスループット同定 本発明の化合物を商業的な販売元より入手した。化合物３２はマイクロソース
ディスカバリーシステムズ社（MicroSource Discovery Systems, Inc.）（ゲイ ローズビル、コネティカット州）（Gaylordsville, Connecticut）より入手可能
である。化合物６４，１３６及び１４８はコムジェネックス社（ComGenex, Inc.
）（ブダペスト、ハンガリー）（Budapest, Hungary）より入手可能である。化 合物１０３及び１２３はケムブリッジ社（ChemBridge Corp.）（サンディエゴ、
カリフォルニア州(San Diego, California）より入手可能である。残りの化合物
はスペックスアンドバイオスペックス社（Specs and Biospecs B.V.）(Rijswilk
, The Netherlands)より入手可能である。
【０１３４】 ８×１２の９６ウェルアレイの第２列〜第６列及び第８列〜第１２列において
、８０種類の薬剤（５μｌの６０μｇ／ｍｌＤＭＳＯ溶液）を１ウェルに１種づ
つ入れた９６ウェルプレートにおいてハイスループットアッセイを行った。第１
列と第７列の残りの１６個のウェルには５μｌのＤＭＳＯを入れてコントロール
反応とした。４５μｌの緩衝液、塩類、及び、放射性同位元素標識した標的ＲＮ
Ａを含む反応混合物を化合物が入れられたプレートの各ウェルに入れて、５０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、５ｍＭのＤＴＴ、６μｇ／ｍｌの試験化合物、及び、２５ｎＭの[32Ｐ]−標識
εＲＮＡを含む５０μｌの混合物とした。この反応をビオチン化オリゴヌクレオ
チドとして２６２．１０４Ａ（５μｌ）を１００ｎＭの最終濃度となるように加
えて開始させた。この反応を２５℃にて６０分間インキュベートした後、５μｌ
の０．３ｍｇ／ｍｌ ＳＡＡＰ（ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ共 役化合物）（ピアース社、ロックフォード、イリノイ州）（Pierce，Rockford，
Ill）を加えた。この反応を更に３０分、２５℃にてインキュベートし、マルチ スクリーン真空マニホルド（ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州
）（Millipore, Bedford, MA）を用いて９６−ウェル用ＨＡＴＦニトロセルロー
スフィルター（ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）にて濾過し
た。この後、３００μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
２００ｍＭのＫＣｌ）をフィルターに通して洗浄した。このフィルターを乾燥し
、２０μｌのシンチレーション液（スーパーミックス、ワラックオイ社、ターク
、フィンランド）（Super Mix, Wallac Oy, Turku, Finland）を補充した。形成
されたハイブリッドの量をフィルター上に残った放射性同位元素標識したεＲＮ
Ａのシンチレーション計数によって求めた。
【０１３５】 試験化合物の阻害効果（阻害の百分率、％Ｉｎｈ．として表される）を次式を
用いて計算した： ％Ｉｎｈ．＝（１−ＲX／ＲO））×１００ ただし、ＲOは第１列及び第７列の１６個の同じコントロール反応におけるハ イブリッドの平均残留量であり、ＲXは試験薬剤ｘの存在下で残留したハイブリ ッドである。
【０１３６】 ビオチン化オリゴヌクレオチドである２６２．１０４Ａ（５’−ビオチン−Ｔ
ＴＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＴＴ ＧＡＡ ＣＡＧ Ｔ
Ｇ−３’）及び２０８．９２Ａ（５’−ビオチン− ＣＧＴ ＣＡＴ ＴＧＡ ＣＧＣ ＴＧＣ ＧＣＣ ＣＡ−３’）は合成により調製した（オリゴス イー
ティーシー、ウィルソンビル、オレゴン州）（Oligos Etc., Willsonville, OR ）。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれεＲＮＡ及びＲＲＥ ＲＮＡ標的 の特定の領域に対して相補的である。
【０１３７】 バクテリオファージＳＰ６のプロモーターに続いて標的配列を含むプラスミド
を、例としてアンビオン社（オースチン、テキサス州）（Ambion, Austin TX） などの供給元による説明、及び当業者には周知の方法に基づき、 [α32Ｐ]−Ｕ ＴＰ及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、放射性同位元素標識したεＲＮ Ａの合成のための鋳型として用いた。
【０１３８】 上記の１次スクリーニングアッセイを阻害した化合物を、０．１μＭ〜２００
μＭの濃度にて、非特異的競合物質としてのｒＲＮＡの６０倍過剰量の存在下及
び非存在下において個々に同じアッセイで力価測定した。標的としての放射性同
位元素標識したＲＲＥ ＲＮＡ及び相補的なビオチン化オリゴヌクレオチド２０ ８．９２Ａを用いた非相同的アッセイにおいて第３の力価測定を行った。これら
３つのアッセイからそれぞれの化合物のＩＣ50値及び特異性を計算した。
【０１３９】 結果 （実施例１からの）ｒＲＮＡ競合物質及び放射性同位元素標識したＲＲＥ Ｒ ＮＡを用いたＩＣ50値を以下のリガンドについて表１に示した。一連の力価測定
によりＩＣ50値が推定されるだけの充分な阻害が見られない場合、化合物は不活
性であるものとみなす。特異性は、ＲＲＥ＋ｒＲＮＡのＩＣ50／εＲＮＡ＋ｒＲ
ＮＡのＩＣ50の比として計算される。εＲＮＡリガンドがＲＲＥアッセイにおい
て不活性であった場合、値を計算することはできないためこのリガンドの特異性
は最大（ｍａｘ）であるものと定義する。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
【表４】
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
【表６】
【０１４６】
【表７】
【０１４７】
【表８】
【０１４８】
【表９】
【０１４９】
【表１０】
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】 実施例２ 抗ウイルス活性の決定 ｉ． 材料及び方法 本発明の化合物の抗ウイルス活性をKorba and Gering, Antiviral Res. 19: 5
5-70(1992)に述べられる方法により測定する。
【０１５２】 可能な場合常に、材料の全ては滅菌し、溶液は０．２２ミクロンのフィルター
に通過させた。
【０１５３】 材料 １． ＨＢＶハイブリダイゼーションプローブ プラスミドクローン（例 ｐ
ＡＭ６）を制限酵素により切断した分解産物を、１％アガロースゲル電気泳動に
かけ、得られた３．２ｋｂの完全なゲノム長のＨＢＶフラグメントを単離し、−
２０℃で保存した。
【０１５４】 ２． ＨＢＶゲルスタンダード １．０μｌのＨＢＶスタンダード（１００ｎ
ｇ／ｍｌ）に５μｌのトラッキング色素及び１４μｌのＴＥを加えた（１レーン
当たり）。ＨＢＶスタンダードは、クローン化したＨＢＶのＤＮＡをＢａｍ Ｈ
Ｉ及びＥｃｏ ＲＩにて別個に分解処理することにより作製した。これらの分解
産物の等モル量を混合して−２０℃にて保存した。これによりいくつかのＨＢＶ
断片（正のハイブリダイゼーションコントロール）及び非ＨＢＶプラスミドＤＮ
Ａ断片（負のハイブリダイゼーションコントロール）を生じた。例として、ｐＡ
Ｍ６からは、３．２、１．８５、及び１．３５ｋｂのＨＢＶのＤＮＡ断片ならび
に４．３ｋｂのプラスミド断片を生じた。この混合物を正及び負のハイブリダイ
ゼーションコントロール、サイズの基準、及びゲルの１レーンにのみ入れられる
定量化の基準とした。
【０１５５】 ３． ＨＢＶ培地スタンダード 融合性Ｇ４１８非処理２．２．１５細胞から
培地（ＲＰ２）を回収し、−７０℃にて凍結保存した。必要なだけのアリコート
（通常１〜２Ｌ）をプールし、７０００×ｇにて１０分遠心分離して細胞の破砕
片を除去した。この上清をＹＭ１００膜（cat.No.13642）を取り付けたアミコン
社(Amicon Inc.)製「スタードセル」（"stirred cell"）（８４００シリーズ） に４００ｍｌ加え、４℃にて約１３７．９ｋＰａ（２０ｐｓｉ）の窒素雰囲気下
で膜が乾燥しないように常に攪拌しつつ限外濾過した（約３〜５時間）。これに
より体積比にして濃度は約４０倍となった。この濃縮された試料中のＨＢＶ Ｄ ＮＡ含量を既知のＨＢＶ ＤＮＡの標準量に対しするブロットハイブリダイゼー ションにて定量化した。このプロセスの間において、ＨＢＶ ＤＮＡは約２分の １の濃度にしばしば失われた（理論上の開始濃度と比較して）。最終生成物をＲ
ＰＭＩ１６４０にて（ＦＢＳは使用せずに）１０ｎｇＨＢＶ ＤＮＡ／ｍｌの標 準濃度に希釈した。次いでこの濃度をブロットハイブリダイゼーションにより再
確認した。調整されたスタンダードプールを再びブロットハイブリダイゼーショ
ンにより再確認した。この調整されたスタンダードプールをスクリューキャップ
を有する試験管に５ｍｌのアリコートとして分取し、−７０℃にて保存したが、
これは少なくとも５年は安定であった。 ｉｉ． ２．２．１５細胞の培養のガイドライン セルカルチャーは抗生物質を用いることなく空気遮断された設備（ＢＳレベル
ＩＩ）にて無菌的に扱った。２．２．１５細胞の基礎培地としてＲＰＭＩ１６４
０を用いた。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を２％ないし４％の最終濃度にて加え、熱
による不活化またはロット試験は行わなかった。Ｌ−グルタミンを４ｍＭの最終
濃度となるように加えた。完全培地を４℃にて最大で４週間保存した。細胞を３
７℃にて５％ＣＯ2加湿雰囲気下におき、培養した。
【０１５６】 フラスコ及びプレートに細胞を３〜５×１０4細胞／ｃｍ2の密度にて通常の方
法にて播種した。この播種密度では３〜５日目でカルチャーの細胞は密集状態に
達した。約１×１０4細胞／ｃｍ2の播種密度は許容可能であり、密集状態となる
までに長時間を要した。密集状態では、細胞は３〜５×１０5細胞／ｃｍ2の密度
であり、最大かつ比較的安定したＨＢＶレベルを示した。４％ＦＢＳを加えた培
地中で生育した密集状態の「健康な」Ｔ−７５のフラスコを、９６ウェルまたは
２４ウェル平底プレートに６まで継代培養した。 ｉｉｉ． 「一次」すなわち「スクリーニング」アッセイ（９６ウェルプレート フォーマット） このアッセイフォーマットは、潜在的な抗ウイルス活性について試験化合物を
スクリーニングするのによく適合する。このアッセイでは、（ｉ）細胞からのＨ
ＢＶビリオンの放出のレベル、及び、（ｉｉ）細胞毒性を測定することにより、
抗ウイルス活性の閾値評価を行うことが可能である。それぞれの化合物に対して
２行の細胞を用い、アッセイコントロールに対して４行の細胞を用いた（非処理
に対し２行、例えば３ＴＣなどの陽性の抗ウイルスコントロールに対し２行）。
試験化合物の存在下で９日間インキュベートした後、培地を収集し、９６ウェル
Ｕ字底プレートに移して遠心分離した。上清を試験管に移してＨＢＶビリオンＤ
ＮＡのドットブロットハイブリダイゼーション分析を行った。培地をこの毒性プ
レートから吸引して廃棄した。この後、毒性プレートをニュートラルレッド色素
（好ましい場合はＭＴＴを使用することも可能である）とともにインキュベート
し、ＤＰＢＳにて洗浄し、酢酸−エタノール溶液にて現像し、プレート読み取り
機中でアッセイした。
【０１５７】 これらのアッセイにおいてどのような濃度範囲を使用するかについては多くの
選択肢がある。本発明の化合物は、化合物の溶解度と同程度に高い濃度において
毒性について試験し、可能な希釈剤（しばしばＤＭＳＯ）の毒性について試験し
た。２．２．１５細胞は最大で１０日間、生存率の低下をほとんど見ることなく
２〜３％ＤＭＳＯ中で生存する。
【０１５８】 １． ２．２．１５細胞を、上述したように９６ウェル平底組織培養プレート
に播種する。それぞれの試験化合物についての抗ウイルス処理について、複数の
プレートを使用した（プレートの各ペア当り最大８種の化合物）。３〜４日後に
細胞は密集状態に達し、培地の色は黄色となった。薬剤処理開始の２４時間前に
培地を除去し、１００μｌのＲＰ２にて置換した。
【０１５９】 ２ａ． 抗ウイルス処理のための化合物を以下のようにして調製した。
【０１６０】 ｉ）各化合物について４つの濃度を調べた。これには、４本の滅菌した１．
１ｍｌ小型試験管を９セット要した（３６本／化合物）。各セットの第１の試験
管に充分量の化合物を分取して、７００μｌ（１０倍の連続希釈用）及び９８０
μｌ（３．３倍の連続希釈用）の最も高い試験濃度を調製した。残りの試験管に
は何も入れなかった。
【０１６１】 ｉｉ）処理の最終日のための試料アリコートを、他のアリコートに対し３倍
高い濃度にて得た。これはＤＮＡ分析のために充分な材料を与えるためのもので
ある（下記を参照）。
【０１６２】 ｉｉｉ）試験管にラック蓋をして、適当にラベルを付し、−２０℃もしくは
試験化合物にとっての適温にて保存した。これにより、試験化合物のストック溶
液が多数回にわたって凍結と氷解を繰返すことが防止され、９日分の試験アリコ
ートの全てを温度変化について同じ条件にて扱うことが可能である。化合物を４
℃にて保存する場合、試験管の上部をパラフィルムで覆って蒸発を防止した。
【０１６３】 ２ｂ． 毒性処理のための化合物を次のようにして調製した。各化合物につい
て４つの濃度を調べた。これには、４本の滅菌した１．１ｍｌ小型試験管を９セ
ット要した（３６本／化合物）。各セットの第１の試験管には充分量の化合物を
分取して、４６５μｌの最も高い試験濃度を調製した。残りの試験管には何も入
れなかった。試験管にラック蓋をし、−２０℃もしくは所定の適温にて保存した
。毒性試験の処理の最終日のための試験管は、前日まで使用された化合物の量と
同量の化合物を含む（抗ウイルスアッセイの場合のような３倍の量ではない）。
【０１６４】 ３ａ． 抗ウイルス処理のための化合物の連続希釈物は次のようにして調製し
た。
【０１６５】 ｉ）１０倍の連続希釈では、第１の（化合物が入れられた）試験管に７００
μｌ（１７５μｌ×４）を加えた。残りの３本の試験管には６３０μｌ（２１０
μｌ×３）のＲＰ２培地を加えた。第１の試験管をピペットマン（多チャンネル
ピペットマンでは複数の化合物を同時に処理することが可能である）にて吸込ん
では出すことで混合した。７０μｌの試験化合物を含む培地を第１の試験管から
残りの３本の試験管に順次移した。その際、培地を移す前に各試験管が充分に混
合されるように気をつけた。
【０１６６】 ｉｉ）３．３倍の連続希釈では、９６０μｌ（１６０μｌ×６）のＲＰ２を
第１の試験管（化合物のアリコートが入れられた）に加え、６４０μｌ（１６０
μｌ×４）のＲＰ２を空の試験管のそれぞれに加えた。２８０μｌの試験化合物
を含む培地を第１の試験管から残りの３本の試験管に順次移した。
【０１６７】 ３ｂ． 試験化合物の毒性を、３．３倍の連続希釈において次のようにして分
析した。４８５μｌ（１５５μｌ×３）のＲＰ２を第１の試験管（化合物のアリ
コートが入れられた）に加え、３１０μｌ（１５５μｌ×２）のＲＰ２を残りの
３本の試験管のそれぞれに加えた。１５０μｌの試験化合物を含む培地を第１の
試験管から残りの３本の試験管に順次移した。
【０１６８】 ４． 処理は以下の手順で開始した。
【０１６９】 ａ）単層の細胞が培地のない状態におかれる時間を最小とするように気をつ
けながら培地を除去した。
【０１７０】 ｂ）１００μｌの各化合物の希釈液のそれぞれを、下記に例として列記した
配列を用いて６個のウェル（３ウェル／プレート）のそれぞれに加えた。最低濃
度のものを最初に加え、同じチップを用いてより高い濃度のものを加えていく。
非処理細胞には１ウェル当り１００μｌのＲＰ２を加えた（非処理細胞は抗ウイ
ルスアッセイプレートの内の１対にのみ入れられている）。 第1〜3列 第4〜6列 第7〜9列 第10〜12列 行A ・・・・・・・非処理細胞・・・・・・・・・・ 行B 薬1(1X) 薬1(10x) 薬1(1/100x) 薬1(1/1000x) 行C ・ ・ ・ ・ 行D ・ ・ ・ ・ 行E ・ ・ ・ ・ 行F ・ ・ ・ ・ 行G ・ ・ ・ ・ 行H ・ ・ ・ 薬7(1/1000x) ｃ）処理を９日間毎日繰り返した。処理の最終日には、ウェルを試験化合物
にて処理した後に抗ウイルスアッセイプレートの各ウェルに２００μｌのＲＰ２
を更に加えた（各ウェル当り全体で３００μｌの培地）。
【０１７１】 ５． 各試験化合物について１個のプレートを毒性処理に使用した（各毒性プ
レートにおいて一番上の行は非処理細胞に使用されるため、プレート１枚につき
最大７種の化合物）。処理を開始するため、培地を除去し、１００μｌの各化合
物の各希釈液を、抗ウイルス処理について上記に示したものと同様の配列にて３
個のウェルのそれぞれに加えた。非処理細胞にはウェル１個当り１００μｌのＲ
Ｐ２を加えた。処理を９日間毎日繰り返した。
【０１７２】 ６． アッセイを終了し、第９日の処理から２４時間後に培地を除去し、この
培地を９６ウェルＵ字底培養プレートに保存することにより、ＨＢＶビリオンＤ
ＮＡの定量分析のための試料を収集した。これらの試料はブロッティングが行わ
れるまで４℃にて保存した。長期保存のためにはこの後、試料を−２０℃に移し
た。 ｉｖ． 細胞内のＨＢＶ複製に対する効果についてのアッセイ（２４ウェルプレ ートフォーマット） このアッセイフォーマットでは、細胞内のＨＢＶのＤＮＡ複製可能型のレベル
を評価することが可能であるので、抗ウイルス剤となりうるものの作用を更に調
べるために使用される。この種のアッセイは、一般に、９６ウェルプレートフォ
ーマットにおいて活性を有することが示された化合物に対して行われるが、これ
は、これらの実験において示される有効な抗ウイルス濃度をこの種のアッセイ（
より大きな労力とコストを必要とする）において指標として用いることが可能で
あるためである。一般に、細胞内のＨＢＶ ＤＮＡ複製に対して同様の効果を得 るためには、抗ウイルスアッセイにおいて示されたものよりも３〜５倍高い化合
物の濃度が必要とされる。このアッセイを行うため、２．２．１５細胞を２４ウ
ェルプレートに播種し、試験化合物にて９日間処理する。処理期間の最後におい
て培地を収集し、ＨＢＶビリオンＤＮＡの分析を行う。細胞内ＨＢＶ ＤＮＡの 分析を行うためには、細胞の単層をグアニジンチオシアネート／サルコシル／β
ＭＥにて溶解し、透析し、ＳＤＳ／プロテイナーゼＫにて消化し、フェノール及
びクロロホルムにて抽出し、酢酸ナトリウム／イソプロパノールにて沈殿させる
。次いでこの細胞内ＤＮＡを再懸濁し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩにて消化し、ゲル電気
泳動にかけ、ニトロセルロースに移してハイブリダイゼーション分析を行う。
【０１７３】 １． 上述したように２４ウェルプレートに細胞を播種する。化合物を加える
前日に培地をＲＰ２（０．５ｍｌ／ウェル）に変える。９６ウェルプレートアッ
セイの場合と同様、複数のプレートを使用する。各プレートにつき２個のウェル
を化合物の各希釈液にて処理する（４ウェル／希釈液）。
【０１７４】 ２． 抗ウイルス処理のための化合物を以下のようにして調製した。各化合物
について４つの濃度を調べた。これには、４本の滅菌した１．１ｍｌ小型試験管
を９セット要した（３６本／化合物）。各セットの第１の試験管に充分量の化合
物を分取して、２．２ｍｌの薬剤を含んだ培地を調製した（適当な総体積とする
ための更なる培地は細胞処理を行う段階で加えた（下記工程４参照））。毒性試
験の処理の最終日のための試験管は、前日まで使用された化合物の量と同量の化
合物を含む（抗ウイルスアッセイの場合のような３倍の量ではない）。試験管に
ラック蓋をし、−２０℃もしくは所定の適温にて保存した。
【０１７５】 ３． このアッセイでは化合物を３．３倍連続希釈にて試験した。この連続希
釈を行うため、７２０μｌ（２４０μｌ×３）を第１の試験管に加えた。４６０
μｌ（２３０μｌ×２）の培地を残りの３本の試験管に加えた。２００μｌを第
１の試験管から残りの３本の試験管に順次移した。
【０１７６】 ４． 薬剤の最低濃度から最高濃度まで、４個のウェルのそれぞれに１００μ
ｌを加えてウェルを処理した。更に４００μｌのＲＰ２（薬剤を含まない）を各
ウェルに加えた。培地を連続的に変え、試験化合物を９日間にわたって毎日加え
た。
【０１７７】 ５． 化合物を最後に加えてから２４時間後に、培地を収集して新たな２４ウ
ェルプレートに保存した。保存した培地試料のそれぞれの２５０μｌアリコート
を９６ウェルＵ字底培養プレートに移し（１個のプレートに最大で４個の２４ウ
ェルプレートからの試料を入れることが可能）、ドットブロッティングを行うま
で４℃にて保存した。
【０１７８】 ６． この後、細胞の単層を溶解し、上述したように細胞内ＨＢＶ ＤＮＡの 分析を行った。 ｖｉ）． 薬剤毒性のニュートラルレッド染色による決定 全ての化合物の抗ウイルス効果を毒性と比較して評価した。上述のガイドライ
ンにしたがって細胞を播種、処理した後、ニュートラルレッド色素取り込みアッ
セイを行って以下に述べられる毒性の評価を行った。細胞毒性の他のアッセイ（
例 ＭＴＴ）を以下に述べる方法に置き換えることが可能である。この方法は、
抗ウイルス分析において用いられたものと同じ培養及び処理条件下における毒性
を評価するものであり、これにより、ウイルスの複製の低減が特定の抗ウイルス
効果によるものか、あるいはホスト細胞に対する毒性効果によるものかを決定す
ることが可能である。必要条件としてカルチャーは密集状態にあるため、試験化
合物の毒性作用は、活発に分裂している細胞に対して予想される細胞毒性作用と
比較して恐らく低減しているものと考えられる。
【０１７９】 １． カルチャーを指定の毒性プレート上で試験化合物にて上述のように処理
した。
【０１８０】 ２． 処理９日目から２４時間後に培地を慎重に除去した。最上段の左から３
個のウェル（行Ａ、第１〜３列）の細胞単層を完全に除去した。これらのウェル
をプレート読み取り機において「ブランク」として使用した。
【０１８１】 ３． 空のウェルを含む各ウェルに１００μｌのＤＰＢＳ（０．０１％ニュー
トラルレッド色素を含む）を加え、組織培養インキュベータ内で３０分インキュ
ベートした。
【０１８２】 ４． ニュートラルレッドとのインキュベーションにより単層は壊れやすくな
るため、多チャンネルピペットマンを使用して注意深くかつ穏やかに色素を取り
除いた。単層を揺動させないように注意しながら全てのウェルに２００μｌのＤ
ＰＢＳを加えた。このＤＰＢＳを除去し、１００μｌの５０％エタノール／１％
氷酢酸（水溶液）を各ウェルに加えた。オービタルプラットフォーム震盪機（１
２０〜１５０ＲＰＭ）にて１５分プレートを混合し、細胞から色素を完全に抽出
した。
【０１８３】 ５． ＥＬＩＳＡ型プレート読み取り機において３個の空のウェルを使用して
バックグラウンドを設定し、５１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。平均吸光
度の値を１個のプレート上の９個の非処理カルチャーについて計算し、この値に
対するパーセンテージとして同じプレート上の処理カルチャーの色素の吸光度を
表した。この手順を各個別のプレートについて繰り返した。
【０１８４】 表２は一群のεＲＮＡリガンドの抗ウイルス活性を示したものである。細胞外
のウイルス生成の５０％の低減をみた（ＥＣ50）、及び９０％の低減をみた（Ｅ
Ｃ90）マイクロモル濃度が報告されている。ＨＢＶは細胞死を引き起こさないた
め、化合物の細胞毒性は、上述したようなニュートラルレッド取り込み法によっ
て細胞死を測定することによって同じカルチャーにおいて推定することも可能で
ある。この値を５０％細胞死（ＣＧ50μＭ）にて示した。
【０１８５】
【表１２】
【０１８６】
【表１３】
【０１８７】
【表１４】
【０１８８】
【表１５】
【０１８９】
【表１６】
【０１９０】
【表１７】
【０１９１】
【表１８】
【０１９２】 化合物は著明な抗ウイルス活性を示した。特に化合物５及び６は、同じアッセ
イにおいて、よく知られた抗ウイルス薬である３ＴＣ（２’デオキシ−３−チア
シチジン）について見られた値の３〜５倍のＥＣ90値を示す抗ウイルス活性を示
した。記号「＞」は試験された最も高い濃度において何らの効果も見られなかっ
たことを示す。
【０１９３】 上記において試験された化合物は広い範囲の抗ウイルス活性を示し、いくつか
の化合物は他の化合物に比べてより高い活性を示したことに留意されたい。１〜
２５４の全ての構造はＨＢＶに対する活性を有する可能性があるものと考えられ
る。しかしながら、当業者によれば理解されるように、不活性を示すアッセイの
結果は、細胞の透過性や代謝安定性といった多くの因子によるものである可能性
がある。
【０１９４】 実施例３ 抗ウイルス複合療法 化合物５及び３ＴＣを、上記の実施例２において概略を述べた抗ウイルスアッ
セイにおいて、単独及び組み合わせで、異なる濃度にて試験した。これらの薬剤
を独立に試験した場合のウイルス生成の減少率を図２５６に示した。３ＴＣ単独
では２１６ｎＭで９０％のウイルスの減少率をみた（ＥＣ90）のに対し、化合物
５単独ではＥＣ90は１３００μＭであった。
【０１９５】 化合物と３ＴＣを、１：１５、１：５、及び１：１．５のモル比で組み合わせ
て試験した場合の結果を、図２５７Ａ、２５７Ｂ及び２５７Ｃに示した。各グラ
フの前列の柱は各薬剤の効果が相加的である場合に予想されるウイルス減少の％
を示したものである。各グラフの後列は観察された抗ウイルス活性を示したもの
である。これらの結果は薬剤が１：１５（３ＴＣ：化合物５）のモル比にて混合
された場合に強力な相乗効果が見られることを示している。例として、２０ｎＭ
の３ＴＣと３００ｎＭの化合物５との予想される相加的効果は約７％のウイルス
減少率であるが、観察されたウイルス減少率は９２％に達し、相乗的な相互作用
を示している。
【０１９６】 これらの結果は、１：１５の比で組み合わされた場合、これら２種類の薬剤を
各薬剤が単独で投与される場合と比較して約４〜１０倍低い濃度にて使用するこ
とが可能であることを示している。
【０１９７】 実施例４ トリアジン化合物の核酸結合 ５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍｇ／
ｍｌのｒＲＮＡ（担体として）、０．５ｐｍｏｌの３’末端32Ｐ標識εＲＮＡ、
０．０５単位のＢ．Ｃｅｒｅｕｓ由来ＲＮアーゼ、及び、０〜２００μＭの濃度
の化合物５を含む反応混合物（１０μｌ）を２５℃にて３０分インキュベートし
た。反応生成物をポリアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動にかけた。Ｂ．
Ｃｅｒｅｕｓ ＲＮアーゼは一本鎖特異的ＲＮアーゼである。結果を図２５８Ａ に示した。図中、εＲＮＡ構造のバルジ及びループ部分における切断に対応した
分解産物による梯子模様の部分が示されている。反応中の化合物５の濃度（上に
示される）を大きくすることにより、星印にて示されるバルジの特定の位置にお
ける切断は減少していることが明らかである。逆に、ループ及び構造の他の部分
は影響を受けていない。化合物６，１５，２８，３３及び６１を使用した場合に
も同様な結果が得られた。
【０１９８】 これらの結果は、トリアジン化合物はＲＮＡに結合し、しかもバルジ領域に重
なる所定の部位においてＲＮＡに結合することを示すものである。更に、εＲＮ
Ａのバルジに類似した構造的要素を有するＲＮＡは、ＲＮＡ構造の安定性を大き
くするトリアジン化合物によって結合されやすい。
【０１９９】 更に、εＲＮＡのバルジ領域のみを含む小さなＲＮＡ標的を調製し、このＲＮ
Ａ構造の融解温度（ｔｍ）を温度を上昇させつつ２６０ｎｍにおける吸光度（Ｏ
Ｄ）の変化を監視することにより求めた。反応混合物の１ｍｌアリコートは、５
０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１０％ＤＭ
ＳＯ、及び２μＭのバルジＲＮＡを含むものであった。
【０２００】 結果を図２５９Ａに示す。ｙ軸はＯＤ単位／℃で表された２６０ｎｍにおける
ＯＤの変化の一次導関数である。２μＭのＲＮＡを含むが薬剤は含まない反応で
はＲＮＡのｔｍは６５℃であり、１０μＭの化合物６を加えるとｔｍは８３℃に
シフトした。これらの結果はＲＮＡ構造がリガンドによって安定化することを示
唆するものである。
【０２０１】 この説明文において触れた、全ての特許、特許出願、試験方法、及び刊行物を
ここに援用するものである。
【０２０２】 本発明の多くの変形例は上記に詳述された開示に鑑みれば当業者には自明とな
るものである。そうした改変の全ては特許請求の範囲の最も拡大された範囲に含
まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１〜２５４】 図１〜２５４は、本発明の好ましい１，３，５−トリアジン化合物を示す図で
ある。
【図２５５】 図２５５Ａは、包膜化シグナル（εＲＮＡ）に対応するＨＢＶの前ゲノム配列
を示す概略図である。図２５５Ｂ及び図２５５Ｃは、本発明の方法において使用
される標的ＲＮＡを示す概略図である。
【図２５６】 図２５６は、ＨＢＶを生ずる２．２．１５細胞を使用した抗ウイルスアッセイ
において、化合物５と抗ウイルス薬である２’−デオキシ−３’−チアシチジン
を、単独または組み合わせにて、異なる濃度にて試験した場合のウイルス生成の
減少率を示すグラフである。
【図２５７】 図２５７Ａ、２５７Ｂ及び２５７Ｃは、化合物５と抗ウイルス薬である２’−
デオキシ−３’−チアシチジンを、それぞれ１：１５、１：５及び１：１．５の
モル比にて組み合わせて試験を行った場合のウイルスの減少率を示すグラフであ
る。
【図２５８】 図２５８Ａ及び図２５８Ｂはそれぞれ、ｒＲＮＡ、εＲＮＡ、ＲＮアーゼ、及
び化合物５を０〜２００μＭの濃度にて反応させた結果を示す写真図及び概略図
である。
【図２５９】 図２５９Ａ及び図２５９は、化合物６の存在下及び非存在下におけるεＲＮＡ
の融解温度（ｔｍ）の変化を示すグラフ及び概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 31/12 31/12 Ｃ０７Ｄ 251/70 Ｃ０７Ｄ 251/70 Ａ 401/12 401/12 403/12 403/12 405/12 405/12 409/12 409/12 487/04 １４７ 487/04 １４７ (72)発明者 クロード，シャロン，ティー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138， ケンブリッジ，チルトン・ストリート・ 162 (72)発明者 フレミング，エリザベス，エス アメリカ合衆国マサチューセッツ州02178， ベルモント，シーン・ロード・30 (72)発明者 シアン，イー，ビン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01720， アクトン，メイン・ストリート・821 Ｆターム(参考） 4C050 AA01 AA07 BB07 CC08 DD10 EE04 FF02 GG04 HH01 4C063 AA01 BB09 CC43 CC75 CC81 CC92 DD06 DD17 DD26 DD43 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 BC64 BC73 CB09 GA02 GA03 GA07 GA12 MA01 MA04 MA52 NA14 ZA75 ZB33 ZB35

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＩＡ式 【化１】 またはＩＢ式、 【化２】 の化合物（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、水素、アルキ
    ル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素アリール、非芳香族複素環式、縮
    合環式または多環式環構造、及びアリールオキシからなる群からそれぞれ独立に
    選択され； ただし、前記アルキル、アルケニル、またはアルキニルは、場合により、ハロ
    ゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル、アリール、アリールオ
    キシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第
    １級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シ
    クロアルケニル、またはアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基に
    よって置換され、 前記アリール、アリールオキシ、複素アリール、非芳香族複素環式または縮合
    環式または多環式環構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニ
    トロ、トリハロメチル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カル
    ボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミ
    ン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルか
    らなる群から選択される１以上の置換基によって置換され； または、Ｒ1とＲ2はともに、Ｒ3とＲ4はともに、または、Ｒ5とＲ6はともに、
    シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または
    縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアルキル、シクロ
    アルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または縮合環式または多環式環
    構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチ
    ル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシ
    ル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロ
    アルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択さ
    れる１以上の置換基によって置換され； または、Ｒ7とＲ8はともに、シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複
    素環式または縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアル
    キル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、または縮合環式または多環式環構
    造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル
    、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル
    、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロア
    ルキル、アルケニル及びアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基に
    よって置換され、ただし、Ｒ7とＲ8がともに縮合環式または多環式環構造を形成
    する場合、Ｎに結合する縮合環式または多環式環構造の部分は非芳香族性である
    ）； 及び薬学的に許容されるその塩； 及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的調合物。
  2. 【請求項２】 Ｒ1またはＲ2の一方が場合に応じて置換されたアリールであ
    るＩＢ式の化合物を含む請求項１に記載の調合物。
  3. 【請求項３】 Ｒ7またはＲ8の一方が場合に応じて置換されたアリールであ
    るＩＢ式の化合物を含む請求項１に記載の調合物。
  4. 【請求項４】 希釈剤、賦形剤、アジュバント、１以上の非トリアジン系抗
    ウイルスまたは抗生剤、及びこれらの混合物からなる群から選択される少なくと
    も１つの成分を更に含む請求項１に記載の調合物。
  5. 【請求項５】 前記化合物が１以上の核酸に結合する請求項１に記載の調合
    物。
  6. 【請求項６】 前記１以上の核酸がＲＮＡである請求項５に記載の調合物。
  7. 【請求項７】 Ｂ型肝炎ウイルス感染の予防または治療を、そのような処置
    を必要とする患者においてする方法であって、 ＩＡ式、 【化３】 またはＩＢ式、 【化４】 の化合物（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、水素、アルキ
    ル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素アリール、非芳香族複素環式、縮
    合環式または多環式環構造、及びアリールオキシからなる群からそれぞれ独立に
    選択され； ただし、前記アルキル、アルケニル、またはアルキニルは、場合により、ハロ
    ゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル、アリール、アリールオ
    キシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第
    １級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シ
    クロアルケニル、またはアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基に
    よって置換され、 前記アリール、アリールオキシ、複素アリール、非芳香族複素環式または縮合
    環式または多環式環構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニ
    トロ、トリハロメチル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カル
    ボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミ
    ン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルか
    らなる群から選択される１以上の置換基によって置換され； または、Ｒ1とＲ2はともに、Ｒ3とＲ4はともに、または、Ｒ5とＲ6はともに、
    シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または
    縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアルキル、シクロ
    アルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または縮合環式または多環式環
    構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチ
    ル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシ
    ル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロ
    アルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択さ
    れる１以上の置換基によって置換され； または、Ｒ7とＲ8はともに、シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複
    素環式または縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアル
    キル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、または縮合環式または多環式環構
    造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル
    、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル
    、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロア
    ルキル、アルケニル及びアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基に
    よって置換され、ただし、Ｒ7とＲ8がともに縮合環式または多環式環構造を形成
    する場合、Ｎに結合する縮合環式または多環式環構造の部分は非芳香族性である
    ）； 及び薬学的に許容されるその塩； 及び薬学的に許容される担体または希釈剤を投与することを含み、前記化合物
    はウイルスの複製を阻害するうえで充分な量及び時間にて投与される方法。
  8. 【請求項８】 Ｒ1またはＲ2の一方が場合に応じて置換されたアリールであ
    るＩＢ式の化合物を投与することを含む請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 Ｒ7またはＲ8の一方が場合に応じて置換されたアリールであ
    るＩＢ式の化合物を投与することを含む請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】１以上の更なる非トリアジン系抗ウイルス剤、及びこれらの
    混合物からなる群から選択される少なくとも１つの成分を投与することを更に含
    む請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記抗ウイルス調合物が経口投与される請求項７に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】前記化合物が、０．１〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量にて
    投与される請求項７に記載の方法。
  13. 【請求項１３】微生物感染の予防または治療を、そのような処置を必要とす
    る患者において行うための方法であって、 ＩＡ式、 【化５】 またはＩＢ式、 【化６】 の化合物（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、水素、アルキ
    ル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素アリール、非芳香族複素環式、縮
    合環式または多環式環構造、及びアリールオキシからなる群からそれぞれ独立に
    選択され； ただし、前記アルキル、アルケニル、またはアルキニルは、場合により、ハロ
    ゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル、アリール、アリールオ
    キシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第
    １級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シ
    クロアルケニル、またはアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基に
    よって置換され、 前記アリール、複素アリール、非芳香族複素環式または縮合環式または多環式
    環構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメ
    チル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキ
    シル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シク
    ロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択
    される１以上の置換基によって置換され； または、Ｒ1とＲ2はともに、Ｒ3とＲ4はともに、または、Ｒ5とＲ6はともに、
    シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または
    縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアルキル、シクロ
    アルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または縮合環式または多環式環
    構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチ
    ル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシ
    ル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロ
    アルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択さ
    れる１以上の置換基によって置換され； または、Ｒ7とＲ8はともに、シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複
    素環式または縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアル
    キル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、または縮合環式または多環式環構
    造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル
    、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル
    、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロア
    ルキル、アルケニル及びアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基に
    よって置換され、ただし、Ｒ7とＲ8がともに縮合環式または多環式環構造を形成
    する場合、Ｎに結合する縮合環式または多環式環構造の部分は非芳香族性である
    ）； 及び薬学的に許容されるその塩； 及び薬学的に許容される担体または希釈剤を投与することを含み、前記化合物
    はウイルスの複製を阻害するうえで充分な量及び時間にて投与される方法。
  14. 【請求項１４】Ｒ1またはＲ2の一方が場合に応じて置換されたアリールであ
    るＩＢ式の化合物を投与することを含む請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】Ｒ7またはＲ8の一方が場合に応じて置換されたアリールであ
    るＩＢ式の化合物を投与することを含む請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記化合物が、１以上の更なる非トリアジン系抗生剤、及び
    これらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの成分と共投与される
    請求項１３に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記化合物は経口投与される請求項１３に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記化合物は、０．１〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量にて
    投与される請求項１３に記載の方法。
  19. 【請求項１９】標的核酸を検出するための方法であって、標的核酸を （ａ）ＩＡ式、 【化７】 またはＩＢ式、 【化８】 の化合物（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、水素、アルキ
    ル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素アリール、非芳香族複素環式、縮
    合環式または多環式環構造、及びアリールオキシからなる群からそれぞれ独立に
    選択され； ただし、前記アルキル、アルケニル、またはアルキニルは、場合により、ハロ
    ゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチル、アリール、アリールオ
    キシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第
    １級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シ
    クロアルケニル、またはアルキニルからなる群から選択される１以上の置換基に
    よって置換され、 前記アリール、アリールオキシ、複素アリール、非芳香族複素環式または縮合
    環式または多環式環構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニ
    トロ、トリハロメチル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カル
    ボニル、カルボキシル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミ
    ン、シアノ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルか
    らなる群から選択される１以上の置換基によって置換され； または、Ｒ1とＲ2はともに、Ｒ3とＲ4はともに、または、Ｒ5とＲ6はともに、
    シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または
    縮合環式または多環式環構造を場合により形成し、前記シクロアルキル、シクロ
    アルケニル、非芳香族複素環式、複素アリール、または縮合環式または多環式環
    構造は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ニトロ、トリハロメチ
    ル、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボニル、カルボキシ
    ル、エステル、アミド、第１級、第２級、または第３級アミン、シアノ、シクロ
    アルキル、アルケニル、シクロアルケニル及びアルキニルからなる群から選択さ
    れる１以上の置換基によって置換される）； 及び薬学的に許容されるその塩； 及び薬学的に許容される担体または希釈剤に接触させることと、 （ｂ）標的核酸と少なくとも１種の化合物との相互作用を監視することとを含
    む方法。
  20. 【請求項２０】前記化合物は、蛍光化合物、標的核酸に対する抗体、及び放
    射性標識からなる群から選択される部分にて標識される請求項１９に記載の方法
    。
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