CN109476669A - Lim激酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了动态肌动蛋白细胞骨架是病毒进入，细胞内迁移和病毒粒子释放所必需的。对于人类免疫缺陷病毒(HIV)，在病毒进入期间，病毒通过劫持趋化因子共受体信号启动早期肌动蛋白活动，该信号激活病毒依赖性宿主因子cofilin及其激酶LIM结构域激酶(LIMK)。虽然用siRNA抑制人LIMK1抑制HIV感染，没有特异的LIMK小分子抑制剂可用。在这里，我们描述了基于不同分子支架的新型人类LIMK小分子抑制剂的设计和开发，用于抑制HIV，埃博拉病毒和其他病毒的感染。本发明化合物还可用于治疗性传播疾病，例如疱疹和衣原体。

Description

LIM激酶抑制剂
政府支持声明
本发明是在国立卫生研究院授予的EY021799的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。
交叉引用
本申请要求2016年5月18日提交的美国临时申请号62/338,040的权益，该申请的内容通过引用整体并入本文。众所周知，对于国际申请，不接受彩色附图和照片。公众被引导到美国专利申请信息检索(PAIR)网站，该网站在查询2016年5月18日提交的美国临时申请号62/338,040时，公众可以访问本申请的附图的彩色版本。
技术领域
背景技术
LIM激酶(Limk)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。两种亚型分别是LIM激酶1(LIMK1,Limk1)和LIM激酶2(LIMK2,Limk2)1-4。Limk1和Limk2高度同源且具有50％的整体同一性。两种亚型都是由两个氨基端LIM结构域，邻接着PDZ结构域和富含脯氨酸/丝氨酸区域，紧跟着一个羧基端蛋白激酶结构域组成。5Limk1被发现在胚胎和成人组织中广泛表达，在脑，肾，肺，胃和睾丸中显著高表达。6除了神经胶质细胞，睾丸和肾小球外，Limk2被发现几乎在所有胚胎和成人组织中都表达。7在通过上游信号激活之后，Limk磷酸化其底物cofilin的丝氨酸-3残基，使其失活，最终导致肌动蛋白细胞骨架的动态调节。8-12累积证据表明Limk的活性与一系列的疾病相关，包括威廉姆斯综合征，13阿尔茨海默病(AD)，14,15银屑病表皮病变，16原发性肺动脉高压(PPH)，17,18颅内动脉瘤(IA)，19高眼压/青光眼，20HIV和其他病毒感染，21-24癌症和癌细胞迁移/侵袭。25-31
LIMK1基因位于人类7号染色体上的一个区域(7q1 1.23)，在威廉综合症(WS)人群中与24个其他基因一起被单倍去除，这是一种罕见的与轻度精神发育迟滞和心血管问题相关的神经发育遗传疾病。在WS人群中，弹性蛋白(ELN)的缺失与许多心血管缺陷明确相关。但是，神经发育的基因型-表型相关性仍然不确定，可能与WBSCR11，CYLN2，GTF2I，NCF1或者是LIMK1的半合子性有关。特别要说的是，小鼠中的LIMK1敲除与海马脊柱形态学和空间学习的改变有关。然而，LIMK1缺失小鼠和患有WS的儿童不具有通常在其他发育遗传疾病中看到的严重多发性障碍，这表明阻断LIMK1不是致命的，并且短期或局部LIMK抑制可能在成人中是耐受的。因此，LIMK被认为是一种治疗各种人类疾病如转移性癌症，阿尔茨海默病和药物依赖性的有价值的靶标。为了抑制HIV感染，在人CD4T细胞中，LIMK1可以被shRNA稳定地敲低(80-90％)，这使得T细胞对HIV感染具有抗性。然而，对于抗病毒药物开发来讲，仅有少数小分子显示非特异性调节LIMK活性的特性，并且没有一种显示出理想的高选择性。
最新的分子生物学研究报道，Limk1在癌症前列腺细胞和组织中过表达；26通过阻滞细胞在G2/M期，减少Limk1的表达延缓了PC3ASL细胞的增殖；26在PC3细胞中，改变Limk1的表达将改变细胞形态和肌动蛋白细胞骨架结构；26在天然表达较低浓度Limk1的细胞中,Limk1表达的增加与染色体异常累积和细胞周期缺陷的发展相关联，27在前列腺癌细胞中，Limk1的表达下降，消除了其侵袭行为；27在前列腺肿瘤中，Limk1的表达变得更高，同时伴随着更高的Gleason评分和转移发生率。27所有这些观察结果表明，上调的Limk1作为细胞癌基因的可能性，抑制癌症前列腺细胞和组织中的Limk1活性可导致磷酸化cofilin的减少和细胞机动性以及肿瘤细胞的侵袭性及其向转移的演化的降低。因此，Limk1小分子抑制剂可以作为一种潜在的前列腺癌的治疗药物。最近的研究也表明Limk抑制剂的使用可能为GBM(多形性胶质母细胞瘤)的侵入性机制提供一种新方法。肌动蛋白聚合物的抑制强烈破坏了HIV-1结合和进入宿主细胞。24,35Wu et al.阐释了HIV介导的Limk激活是通过gp120触发的Rac-PAK-Limk途径的瞬时激活，并且通过siRNA敲低Limk，减少丝状肌动蛋白，增加CXCR4的运输和减少病毒DNA的合成。23Wen et al.表明LIM激酶调节反转录病毒颗粒的释放和细胞-细胞传递事件。24这项研究表明艾滋病毒通过劫持Limk控制皮质肌动蛋白动力学从而促进CD4T细胞的病毒感染的发作。因此，Limk抑制剂被认为具有高潜力作为抗HIV感染应用中的治疗药物。23
据我们所知，几乎没有文献报道小分子Limk抑制剂。28Bristol-Myers Squibb制药公司(BMS)公开了一种基于氨噻唑骨架的有效Limk1抑制剂。36,37特拉维夫大学最近发表了一种基于Limk1/2抑制剂(T56-Limki)的恶唑，这种恶唑来自计算机辅助药物设计，其被发现可用于治疗神经纤维瘤病，有效对抗癌症转移。34来自澳大利亚的一组科学家报道了来自高通量筛选(HTS)的基于Limk1的4-aminobenzothieno[3,2-d]嘧啶，其显示出微摩尔范围内的活性。38,39最近，一个日本小组还报道了来自高通量筛选(HTS)活动的Limk抑制剂(虎刺醛或Dam，天然产品)，该化合物(Dam)具有～800nM的Limk1抑制IC50。31Lexicon药物揭示了一类基于哌啶尿素或胍骨架的Limk抑制剂用于治疗高眼压和相关的青光眼。20最近，同一组Lexicon科学家报道了一种基于磺胺骨架的新型的III型结合Limk2抑制剂。40。
发明内容
在各种实施方案中，本发明涉及一种调节Lim激酶(LIMK)的方法，包括使LIM激酶与有效剂量或浓度的式(I)化合物接触
其中
R1是卤素，氰基(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基或(C2-C6)炔基，其中任何烷基，链烯基或炔基可以不被取代或取代；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2，或者C(＝O)NR'NR’所取代，其中每个独立选择的R'是H或者(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
n1＝0,1,或2；
环A是包含一个或两个氮原子的6元饱和环，其中氮原子位于环A与连接物L成键的位置，或环A与环B成键的位置，其中L作为两个环的纽带，或者是环A与Ar环系统成键的位置；又或者环A是5-或6-元芳基环，一个5-或6-元杂芳基环，或融合的6：5杂芳基环系统；环A被n2R2基团取代，其中R2是卤素，卤代(C1-C6)烷基，氰基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基或(C2-C6)炔基，其中任何烷基，链烯基或炔基可以不被取代或取代；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2，或者C(＝O)NR'NR’所取代，其中每个独立选择的R'是H或者(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
n2＝0,1,或2；
L是环A与环B之间的纽带，或L是N(R3)C(＝O)N(R3)，其中R3独立地是H或者(C1-C6)烷基，其中这R3烷基可以被羟基，(C1-C6)烷氧基，氨基，单-或二-(C1-C6)烷基氨基，或4-至7-元杂环所取代；
环B是5-或6-元芳基环，一个5-或6-元杂芳基环，或融合的6：5杂芳基环系统；环B被n4个R4基团取代，其中R4是卤素，氰基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷氧基羰基，(C3-C7)环烷氧基羰基，R'NHC(＝O)或R'2NC(＝O)，其中任何烷基，烯基或炔基可以不被取代或取代；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2，或者C(＝O)NR'NR’所取代，其中每个独立选择的R'是H或者(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
或者是其药学上可接受的盐。
在各种实施方案中，本发明的一种方法可使用式(IA)的化合物
其中，
Y是CR3或N；
X是NR3，CH2，CHR1,O或S；
其中R1，n1，R2，n2，R3，R4和n4如本文所定义。
在各种实施方案中，本发明的一种方法可使用式(IB)的化合物
X是NR3，CH2，CHR1,O或S；
其中R1，n1，R2，n2，R3，R4和n4如本文所定义。
在各种实施方案中，本发明的一种方法可以使用本文公开和声明的任何有效LIM激酶抑制剂。
在各种实施方案中，本发明还可提供治疗患者病症的方法，其中在医学指示上调节LIM激酶，包括向患者施用有效剂量的式(I)化合物。例如，以上病症可以是病毒感染，转移病症，阿尔茨海默病，青光眼，牛皮癣或药物成瘾。更具体地说，病毒感染可以是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，埃博拉病毒(EBOV)感染，裂谷热病病毒(RVFV)感染，委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)感染或单纯疱疹1型病毒(HSV-1)感染。
在各种实施方案中，本发明可以提供生物活性化合物及其制剂，用于治疗性传播疾病，例如由疱疹病毒引起的疾病，或诸如衣原体的细菌。
在各种实施方案中，本发明提供式(I)，式(IA)，式(IB)的化合物，或本文公开和声明的任何有效的LIM激酶调节化合物。
详细说明
如说明书和所附声明中所使用的，单数形式的“一”，“一个”和“这”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。
当涉及数值或范围时，本文所用的术语“约”允许值或范围的一定程度的可变性，例如，在规定值或规定范围限度的10％或5％以内。
除非另有说明，否则所有百分比成分均以重量百分比给出。
如本文所用，“个体”(如在治疗的受试者中)或“患者”意指哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括例如：人类；非人灵长类动物，例如：猿，猴；和非灵长类动物，例如：狗，猫，牛，马，绵羊和山羊。非哺乳动物包括例如：鱼和鸟。
术语“疾病”或“病症”或“病状”可互换使用，用于指疾病或是病症，其中LIM激酶(LIMK)在涉及疾病或医学病症或症状的生化机制中起作用，比如通过作用于LIMK可以实现治疗上有益的效果，例如：使用有效剂量或浓度的本发明的合成配体。“作用于”LIMK，或“调节”LIMK，可包括在体内与LIMK结合或抑制LIMK的生物活性或变构调节体内LIMK的生物活性。
当用于描述针对患有病症的个体的治疗时，表述“有效量”是指本发明化合物的量或浓度，其有效抑制或以其他方式作用于个体组织中的LIMK，其中LIMK参与该病症，其中这种抑制或其他作用发生到足以产生有益治疗效果的程度。
本文含义内的“救治”或“治疗”是指减轻与病症或疾病相关的症状，或抑制这些症状的进一步发展或恶化，或阻止或预防疾病或病症，或治愈疾病或病症。类似地，如本文所用，本发明化合物的“有效剂量”或“治疗有效剂量”是指全部或部分缓解与病症或病症相关的症状，或停止，或减缓这些症状的进一步发展或恶化，或阻止或预防疾病或病症的化合物的量。特别地，“治疗有效剂量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量的有效性。治疗有效剂量也是治疗有益效果超过本发明化合物的任何毒性或有害作用的量。
在合成方法的上下文中，“在适宜提供的条件下”或”在足以生产的条件下“，如本文所用，是指反应条件，例如时间，温度，溶剂，反应物浓度，等等，在实验者可以改变的普通技能范围内，提供有用的量或产率的反应产物。所需的反应产物不必是唯一的反应产物或被完全消耗的原料，只要提供可以分离或以其他方式进一步使用的所需反应产物。
应进一步了解，在各种实施方案的描述所使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可替代地使用“基本上由......组成”或“由...组成”的语言来描述一种实施方案。“
“化学上可行的”是指键合排列或通常理解的有机结构规则不被违反的化合物，例如，在某些情况下会包含要求定义内的结构，例如，自然界中不存在五价碳原子，这将被理解为不在要求范围内。本文公开的结构，在其所有实施方案中仅旨在包括“化学上可行的”结构和任何列举的化学上不可行的结构，例如在具有可变原子或基团的结构中，本文不打算公开或声明。
当取代基被指定为具有特定身份的一个或多个原子时，“或一个键”，此构型指的是当取代基是“键”时，紧邻指定取代基的基团以化学上可行的键合构型彼此直接连接。
除非特别指出特定的立体化学或异构形式，否则一种结构的所有单一对映异构体，非对映异构形式和外消旋形式都考虑在内。在若干情况下，虽然在明确声明的化合物中描述了单独的立体异构体，但立体化学名称并不意味着交替的异构形式不受喜爱，不被希望或不要求保护。在任何富集程度上，用于本发明的化合物可包含描述中显而易见的在任何或所有不对称原子上富集或拆分的光学异构体。为了大体上不含它们的对映体或非对映体配偶体，外消旋和非对映异构体混合物以及单独的光学异构体可以被分离或合成，这些都在本发明的范围内。
如本文所用，术语“稳定化合物”和“稳定结构”是指化合物足够稳固以经受从反应混合物中分离至有用纯度，并配制成有效治疗剂。本文仅考虑稳定的化合物。
当列举基团时，其中该基团可以在一种结构内以多于一个取向存在，最终导致多于单一的分子结构，例如，羧酰胺基团C(＝O)NR，我们知道该基团可出现在任何可能的取向中，例如，XC(＝O)N(R)-Y或XN(R)C(＝O)-Y，除非上下文明确地限制了该基团在分子结构内的取向。
当提及一个基团，例如“烷基”基团而对基团中的原子数没有任何限制时，它应当理解为该权利要求是明确的并且就烷基的大小而言是有限的，两者都是定义的；即，一个基团比如烷基“基团”所具有的大小(碳原子数)是有限数目，其受普通技术人员对该基团大小的理解的限制，这对于分子实体而言是合理的；并且两者都是功能化的，即，基团的大小，如烷基，受到该基团所赋予的含有该基团的分子的功能特性的限制，例如在水性或有机液体介质中的溶解度。
因此，列举“烷基”或其他化学基团或功能基团的声明是明确的和有界的，因为该基团中的原子数不能是无限的并且受到普通理解的限制。
本领域技术人员已广泛认识到，原子的同位素形式的掺入可赋予有用的性质。例如，可以特别引入氘原子(2H)代替氢原子，否则氢原子将代表氢同位素的自然分布，主要是1H。使用一种或多种这样的同位素取代可以改变其所得成分性质，包括治疗动物的相关性质的改变，例如化合物的较长半衰期或作用持续时间。同位素还可以使得能够检测受影响组织中化合物的量的方法，例如通过检测如3H和14C的同位素的放射性。加入同位素的化学方法(实例包括但不限于2H，3H，13C，14C)是本领域公知的，本发明的声明包括这些同位素形式。
通常，“取代”是指本文所定义的有机基团，其中氢原子的一个或多个键包含其中被非氢原子的一个或多个键取代，例如，不限于卤素(例如，F，Cl，Br或I)；例如羟基，烷氧基，芳氧基，芳烷氧基，氧代(羰基)基团，包含羧酸的羧基，羧酸盐和羧酸酯；硫醇基中的硫原子，烷基和芳基硫醚基团，亚砜基团，砜基团，磺酰基和磺酰胺基团等基团中的氧原子；例如胺，羟胺，腈，硝基，亚硝基，N-氧化物，酰肼，叠氮化物和烯胺基团中的氮原子；和其他各种基团中的其他杂原子。取代基的非限制性实例可被键合到取代的碳(或其他)原子包括F，Cl，Br，I，OR，CN，NO，NO2，ONO2，叠氮基，CF3，OCF3，R，O(氧代)，S(硫堇)，亚甲二氧基，亚乙二氧基，N(R)2,，SR，SOR，SO2R，SO2N(R)2，SO3R，C(O)R，C(O)C(O)R，C(O)CH2C(O)R，C(S)R，C(O)OR，OC(O)R，C(O)N(R)2，OC(O)N(R)2，C(S)N(R)2，(CH2)0-2N(R)C(O)R，(CH2)0-2N(R)N(R)2，N(R)N(R)C(O)R，N(R)N(R)C(O)OR，N(R)N(R)CON(R)2，N(R)SO2R，N(R)SO2N(R)2，N(R)C(O)OR，N(R)C(O)R,N(R)C(S)R，N(R)C(O)N(R)2，N(R)C(S)N(R)2，N(COR)COR，N(OR)R，C(＝NH)N(R)2，C(O)N(OR)R或C(＝NOR)R其中R可以是氢或基于碳的功能基团，并且其中碳基部分本身可以进一步被取代；例如，R可以是氢，烷基，酰基，环烷基，芳基，芳烷基，杂环基，杂芳基或杂芳基烷基，其中任何烷基，酰基，环烷基，芳基，芳烷基，杂环基，杂芳基或杂芳基烷基可以进一步被J或与上面列出的一些或所有官能团，或与其他多功能官能团所单取代或多取代；或者其中与氮原子或相邻氮原子键合的两个R基团可以与氮原子一起形成杂环基，其可以进一步被J或与上面列出的一些或所有官能团，或与其他多功能官能团所单取代或独立的多取代；
在各种实施方案中，取代基可以是卤素，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，羟基(C1-C6)烷基，烷氧基(C1-C6)烷基，(Cl-C6)烷酰基，(C1-C6)链烷酰氧基，氰基，硝基，叠氮基，R2N，R2NC(O)，R2NC(O)O，R2NC(O)NR，(C1-C6)链烯基，(C1-C6)炔基，(C6-C10)芳基，(C6-C10)芳氧基，(C6-C10)芳酰基，(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，(C6-C10)芳基(C1-C6)烷氧基，(C6-Cl0)芳氧基(C1-C6)烷基，(C6-C10)芳氧基(C1-C6)烷氧基，(3-至9-元)杂环基，(3-至9-元)杂环基(C1-C6)烷基，(3-至9-(元)杂环基(C1-C6)烷氧基，(5-至10-元)杂芳基，(5-至10-元素)杂芳基(C1-C6)烷基，(5-至10-元)杂芳基(C1-C6)烷氧基或(5-至10-元)杂芳酰基。例如，R独立地在每次出现时可以是H，(C1-C6)烷基或(C6-C10)芳基，其中任何烷基或芳基被0-3J取代。
在各种实施方案中，取代基可以是卤素，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，羟基(C1-C6)烷基，烷氧基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷酰基，(C1-C6)链烷酰氧基，氰基，硝基，叠氮基，R2N，R2NC(O)，R2NC(O)O，R2NC(O)NR，(C1-C6)链烯基，(C1-C6)炔基，(C6-C10)芳基，(C6-C10)芳氧基，(C6-C10)芳酰基，(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，(C6-C10)芳基(C1-C6)烷氧基，(C6-Cl0)芳氧基(C1-C6)烷基，(C6-C10)芳氧基(C1-C6)烷氧基，(3-至9-元)杂环基，(3-至9-元)杂环基(C1-C6)烷基，(3-到9-(元)杂环基(C1-C6)烷氧基，(5-至10-元)杂芳基，(5-至10-元素)杂芳基(C1-C6)烷基，(5-至10-元)杂芳基(C1-C6)烷氧基或(5-至10-元)杂芳酰基。例如，R独立地在每次出现时可以是H，(C1-C6)烷基或(C6-C10)芳基，其中任何烷基或芳基被0-3J取代。
当取代基是单价的时，例如F或Cl，它与通过单键取代的原子键合。当取代基大于1价时，例如O，它是二价的，它可以与被多于一个键取代的原子键合，即二价取代基通过双键键合；例如，用O取代的C形成a羰基，C＝O，其也可写为“CO”，“C(O)”或“C(＝O)”，其中C和O形成双键。当碳原子被双键氧(＝O)基团取代时，氧取代基被称为“氧代”基团。当诸如NR的二价取代基与碳原子形成双键时，所得的C(＝NR)基团被称为“亚氨基”基团。当诸如S的二价取代基与碳原子双键连接时，结果C(＝S)基团被称为“硫代羰基”或“硫代”基团。
或者，二价取代基如O或S通过两个单键连接到两个不同的碳原子上。例如，O，二价取代基，可以与两个相邻碳原子中的每一个键合，从而提供环氧基团，或O可以在相邻或不相邻的碳原子之间形成桥联醚基团，称为“氧杂”或“氧基”基团，例如桥接环己基的1,4-碳原子，形成[2.2.1]-氧杂双环系统。此外，任何取代基可以通过连接物键合到碳或其他原子上，例如(CH2)n或(CR2)n，其中n为1,2,3或更多，并且每个R独立地被选择。
另一个二价取代基是亚烷基碳，表示为C＝和表示如此指示的碳原子(其还带有两个额外的基团)与第三基团形成双键。例如，(CH3)2C＝表示与另一个碳或氮原子键合的异亚丙基。
C(O)和S(O)2基团也可以与一个或两个杂原子(例如氮或氧)键合，而不是与碳原子键合。例如，当C(O)基团与一个碳原子和一个氮原子键合时，所得的基团被称为“酰胺”或“甲酰胺”。当C(O)基团与两个氮原子结合时，官能团被称为“尿素”。当C(O)与一个氧和一个氮原子键合时，所得的基团被称为“氨基甲酸酯”或“氨基甲酸酯”。当S(O)2基团与一个碳原子和一个氮原子结合时，所得基团被称为“磺酰胺”。当S(O)2基团与两个氮原子结合时，得到基团被称为“磺酰胺”。
取代的烷基，链烯基，炔基，环烷基和环烯基以及其它取代基还包括一个或多个键与一个或多个键(包括双键或三键)取代的氢原子或是杂原子，例如，但不限于，羰基(氧代)中的氧原子，羧基，酯，酰胺，酰亚胺，氨基甲酸乙酯和尿素基团；或是亚胺中的氮，羟基亚胺，肟，腙，脒，胍和腈键合。
取代的环基团如取代的环烷基，芳基，杂环基和杂芳基也包括环和稠环系统，其中在环和稠环系统中氢原子的键被碳原子的键或如上所定义的取代基所取代。因此，取代的环烷基，芳基，杂环基和杂芳基也可以被烷基，烯基和炔基取代，或者被上面列出的取代基或本领域普通技术人员已知的其他取代基取代。
本文使用的术语“环系统”是指包含一个，两个，三个或更多个环的功能基团，其可以被非环基团或其他环系统或两者取代，其可以是完全饱和的，部分不饱和的，完全不饱和的或芳香族的，并且当环系统包括多于一个环时，环可以是稠合的，桥接的或螺环的。环系统可以被如上所述的取代基单一地或独立地多取代。“螺环”是指其中两个环在单个四面体碳原子上稠合的结构类型，如本领域所熟知的。
对于本文所述的任何含有一个或多个取代基的基团，它是应理解为，当然，这些基团不含任何在空间上不切实际和/或在合成上不可行的取代或取代模式。此外，该公开主题的化合物包括由这些化合物的取代物而产生的所有立体化学异构体。
对于本文所述的任何含有一个或多个取代基的基团，当然应理解，这些基团不含任何在空间上不实用和/或在合成上不可行的取代或取代模式。此外，该公开主题的化合物包括由这些化合物的取代产生的所有立体化学异构体。
当一个基团中的多个碳原子，例如烷基，链烯基，炔基，环烷基，芳基等被指定为范围时，每个单独的整数代表碳原子的数目。例如，(C1-C4)烷基的详述表明烷基可以是甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，异丁基或叔丁基中的任何一种。据了解，许多碳原子必须是整数。
当指定环中的多个原子时，例如3-至9-元环烷基或杂环基环，环烷基或杂环基环可包括3,4,5,6,7,8或9个原子中的任一个。环烷基环是碳环；除了能够形成两个或更多个键的碳之外，杂环基环还可包括任何元素的原子，例如氮，氧，硫等。环中的原子数应理解为必须是整数。
烷基包括具有1至约20个碳原子，通常1至12个碳原子，或在一些实施方案中，1至8个碳原子的直链和支链碳基基团。直链烷基的实例包括具有1-8个碳的那些原子，如甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基，正庚基和正辛基。支链烷基的实例包括，但不限于，异丙基，异丁基，仲丁基，叔丁基，新戊基，异戊基和2,2-二甲基丙基。如本文所用，术语“烷基”包括正烷基，异烷基和反异烷基以及烷基的其他支链形式。代表性的取代烷基可以用上面列出的任何取代基取代一次或多次，例如氨基，羟基，氰基，羧基，硝基，硫代，烷氧基和卤素基团。示例性的烷基包括，但不限于，1-6,1-4或1-3个碳原子的直链或支链烃，在本文中分别称为C1-6烷基，C1-4烷基和C1-3烷基。示例性的烷基包括但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，2-甲基-1-丁基，3-甲基-2-丁基，2-甲基-1-戊基，3-甲基-1-戊基，4-甲基-1-戊基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，2,2-二甲基-1-丁基，3,3-二甲基-1-1-丁基，2-乙基-1-丁基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，己基等。
环烷基是含有一个或多个碳环的基团，包括，但不限于，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。在一些实施方案中，环烷基可具有3至约8-12个环成员，而在其他实施方案中，环碳原子数为3至4,5,6或7。环烷基还包括多环环烷基，例如，但不限于，降冰片基，金刚烷基，茨醇基，苯基，异辛基和炔基，和稠合环，例如，但不限于十氢萘基等。环烷基还包括被如上定义的直链或支链烷基取代的环。
代表性的取代的环烷基可以是单取代的或取代一次以上，例如，但不限于，2,2-，2,3-，2,4-2,5-或2,6-二取代的环己基或单-，二-或三-取代的降冰片基或环庚基，其可以被例如氨基，羟基，氰基，羧基，硝基，硫代，烷氧基和卤素基团取代。单独或组合的术语“环烯基”表示环状烯基，即包括一个或多个碳—碳双键的环烷基。
术语“碳环形的”，“碳环基”和“碳环”表示环结构，其中环的原子是碳，例如环烷基或芳基。在一些实施方案中，碳环具有3至8个环成员，而在其他实施方案中，环碳原子数为4,5,6或7。除非特别指出相反，否则碳环可被多个N-1取代基取代。其中N是碳环的大小，例如烷基，链烯基，炔基，氨基，芳基，羟基，氰基，羧基，杂芳基，杂环基，硝基，硫代，烷氧基和卤素基团，或其他如上所列的基团。碳环基环可以是环烷基环，环烯基环或芳基环。碳环基可以是单环或多环，并且如果是多环，则每个环可以独立地是环烷基环，环烯基环或芳基环。
(环烷基)烷基，也称为环烷基烷基，是如上定义的烷基，其中烷基的氢或碳键被与如上定义的环烷基的键取代。
烯基包括如上定义的直链和支链和环状烷基，除此之外，在两个碳原子之间存在至少一个双键。因此，链烯基具有2至约20个碳原子，典型地从2至12个碳，或在一些实施方案中，具有2至8个碳原子。实例包括，但不限于，乙烯基，-CH＝CH(CH3)，-CH＝C(CH3)2，-C(CH3)＝CH2，-C(CH3＝CH(CH3)，-C(CH2CH3)＝CH2，环己烯基，环戊烯基，环己二烯基，丁二烯基，戊二烯基和己二烯基等。示例性的烯基包括，但不限于，2-6或3-4个碳原子的直链或支链基团，在此分别称为C2-6链烯基和C3-4链烯基。示例性的烯基包括，但不限于，乙烯基，烯丙基，丁烯基，戊烯基等。
环烯基包括在2个碳之间具有至少一个双键的环烷基。因此，例如，环烯基包括但不限于环己烯基，环戊烯基和环己二烯基。环烯基可具有3至约8-12个环成员，而在其它实施方案中，环碳原子数为3至5,6或7。环烷基还包括多环环烷基，例如，但不限于，降冰片基，金刚烷基，苄基，苯基，异辛基和炔基，和稠合环，例如，但不限于十氢萘基等，条件是它们在环内包含至少一个双键。环烯基还包括被如上定义的直链或支链烷基取代的环。
(环烯基)烷基是如上定义的烷基，其中烷基的氢或碳键被如上定义的环烯基键取代。
炔基包括直链和支链烷基，除了在两个碳原子之间存在至少一个三键。因此，炔基具有2至约20个碳原子，典型地从2至12个碳，或在一些实施方案中，具有2至8个碳原子。实例包括，但不限于，-C≡CH，-C≡C(CH3)，-C≡(CH2H3)，-CH2C≡H，-CH2C≡(CH3)和-CH2C≡C(CH2CH3)等。
芳基是环中不含杂原子的环状芳烃。如本领域所熟知的，芳族化合物是多不饱和环状体系，其含有4n+2π个电子，其中n是整数。因此，芳基包括，但不限于，苯基，茂并芳庚基，庚基，联苯基，茚满基，芴基，菲基，三亚苯基，芘基，萘基，苯基，亚联苯基，蒽基和萘基。在一些实施方案中，芳基在基团的环部分中含有约6至约14个碳。如上所定义，芳基可以是未取代的或取代的。代表性的取代芳基可以是单取代的或取代一次以上，例如，但不限于2-，3-，4-，5-或6-取代的苯基或2-8取代的萘基，它们可以用碳或非碳基团来取代，例如上面列出的那些。
芳烷，也称为芳烷基，基团是如上定义的烷基，其中烷基的氢或碳键被与如上定义的芳基的键取代。代表性的芳烷基包括苄基和苯乙基和稠合的(环烷基芳基)烷基，例如4-乙基-茚满基。芳烯基是如上定义的链烯基，其中烷基的氢或碳键被如上定义的芳基的键取代。
杂环基或术语“杂环基”包括含有3个或更多个环成员的芳族和非芳族环化合物，其中一个或多个环原子是杂原子，例如，但不限于，N，O和S。杂环基可以是环杂烷基，或杂芳基，或者如果是多环的，可以是它们的任何组合。在一些实施方案中，杂环基包括3至约20个环成员，而其他此类基团具有3至约15个环成员。称为C2-杂环基的杂环基可以是具有两个碳原子和三个杂原子的5-环，具有两个碳原子和四个杂原子的6-环等。同样，C4-杂环基可以是具有一个杂原子的5-环，具有两个杂原子的6-环，等等。碳原子数加上杂原子数总和等于环原子总数。环大小也可以由环中的原子总数表示，例如3至10元杂环基，计算碳和非碳环原子。杂环基环还可包括一个或多个双键。杂芳基环是杂环基的具化。术语“杂环基”包括稠环种类，包括包含稠合芳族和非芳族基团的那些。例如，二氧戊环基环和苯并二氧戊环基环系(亚甲二氧基苯基环系)都是本文含义内的杂环基。该术语还包括多环，即，含有一个或多个杂原子的双环和三环系统，例如但不限于，奎宁环。
杂环基可以是未取代的，或者可以如上所述被取代的。杂环基包括，但不限于，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基，吡咯基，吡唑基，三唑基，四唑基，恶唑基，异恶唑基，噻唑基，吡啶基，噻吩基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，二氢苯并呋喃基，吲哚基，二氢吲哚基，氮杂吲哚基，吲唑基，苯并咪唑基，氮杂苯并咪唑基，苯并恶唑基，苯并噻唑基，苯并噻唑基，咪唑并吡啶基，异恶唑并吡啶基，噻吩基萘基，嘌呤基，黄嘌呤基，腺嘌呤基，胍基，喹啉基，异喹啉基，四氢喹啉基，喹喔啉基和喹唑啉基。代表性的取代的杂环基可以是单取代的或取代一次以上的，例如，但不限于，哌啶基或喹啉基，它们是如上所列的2-，3-，4-，5-或6-取代的，或被二取代的基团。
杂芳基是含有5个或更多个环成员的芳环化合物，其中一个或多个是杂原子，例如，但不限于，N，O和S；例如，杂芳基环可具有5至约8-12个环成员。杂芳基是具有芳香族电子结构的多种杂环基，其是包含4n+2π电子的多不饱和环状体系，其中n是整数。指定为C2-杂芳基的杂芳基可以是具有两个碳原子和三个杂原子的5-环(即，5-元环)，具有两个碳原子和四个杂原子的6-环(即，6-元环)等等。同样，C4-杂芳基可以是具有一个杂原子的5-环，具有两个杂原子的6-环，等等。碳原子数加上杂原子数总和等于环原子总数。
术语“烷氧”或“烷氧基”是指与烷基连接的氧原子，包括如上定义的环烷基。线性烷氧基的实例包括，但不限于，甲氧基，乙氧基，正丙氧基，正丁氧基，正戊氧基，正己氧基等。支链烷氧基的实例包括，但不限于，异丙氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，异戊氧基，异己氧基等。示例性的烷氧基包括，但不限于，1-6或2-6个碳原子的烷氧基，本文分别称为C1-6烷氧基和C2-6烷氧基。示例性的烷氧基包括，但不限于，甲氧基，乙氧基，异丙氧基等。
烷氧基可包括与氧原子键合的1至约12-20个碳原子，并且还可包括双键或三键，并且也包括杂原子。例如，烯丙氧基是本文含义内的烷氧基。甲氧基乙氧基也是本文含义中的烷氧基，在一个结构的两个相邻原子被其取代的情况下，亚甲二氧基也是如此。
本文所用的术语“环烷氧基”是指与氧连接的环烷基(环烷基-O-)。环状烷氧基的实例包括，但不限于，环丙氧基，环丁氧基，环戊氧基，环己氧基等。示例性的环烷氧基包括，但不限于，3-6个碳原子的环烷氧基，在本文中称为C3-6环烷氧基。示例性的环烷氧基包括，但不限于，环丙氧基，环丁氧基，环己氧基等。
除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”或“卤化物”本身或作为另一取代基的一部分是指氟，氯，溴或碘原子，更可取地，氟，氯或溴。
“卤代烷基”包括单卤代烷基，其中所有卤原子可以相同或不同的多卤代烷基，和全卤代烷基，其中所有氢原子被相同或不同的卤素原子取代，例如，作为氟和/或氯原子。卤代烷基的实例包括三氟甲基，1,1-二氯乙基，1,2-二氯乙基，1,3-二溴-3,3-二氟丙基，全氟丁基等。
“卤代烷氧基”包括单卤代烷氧基，其中所有卤原子可以相同或不同的多卤代烷氧基，和全卤代烷氧基，其中所有氢原子被卤素原子取代，例如氟。卤代烷氧基的实例包括三氟甲氧基，1,1-二氯乙氧基，1,2-二氯乙氧基，1,3-二溴-3,3-二氟丙氧基，全氟丁氧基等。使用例如本领域公知的化学基团的标准缩写；例如，Me＝甲基，Et＝乙基，i-Pr＝异丙基，Bu＝丁基，t-Bu＝叔丁基，Ph＝苯基，Bn＝苄基，Ac＝乙酰基，Bz＝苯甲酰基等。
本领域熟知的“盐”包括离子形式的有机化合物如羧酸，磺酸或胺，在离子形式下，与抗衡离子结合。例如，阴离子形式的酸可与阳离子形成盐，如金属阳离子，例如钠，钾等；用铵盐如NH4+或各种胺的阳离子，包括四烷基铵盐如四甲基铵盐，或其它阳离子如三甲基锍等。“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”盐是由已经批准供人食用并且通常无毒的离子形成的盐，例如氯盐或钠盐。“两性离子”是内部盐，例如可以在具有至少两个可电离基团的分子中形成，一个形成阴离子，另一个形成阳离子，其用于彼此平衡。例如，氨基酸如甘氨酸可以以两性离子形式存在。“两性离子”是本文含义内的盐。本发明的化合物可以采取盐的形式。术语“盐”包括游离酸或游离碱的加成盐，它们是本发明的化合物。盐可以是“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指具有在药学应用中提供效用的，在一定范围内具有毒性特征的盐。尽管如此，药学上不可接受的盐可具有如高结晶度的性质，其在本发明的实践中具有实用性，例如在本发明化合物的合成，纯化或配制过程中的实用性。“药学上或药理学上可接受的”包括适当地施用于动物或人时不产生不利，过敏或其他不良反应的分子实体和成分。对于人类给药，制剂应符合FDA生物制品标准办公室要求的无菌，致热原性和一般安全性和纯度标准。
另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式描述。例如，如果X被描述为选自由溴，氯和碘组成的群组，则X的权利要求是溴，或X的要求是溴和氯。此外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什群组的个体成员或成员子群的任何组合来描述。因此，例如，如果X被描述为选自由溴，氯和碘组成的群组，那么Y被描述为选自由甲基，乙基和丙基组成的群组，则X是溴，Y是甲基。
如果变量的值必须是整数，例如，烷基中的碳原子数或环上的取代基的数目，被描述为一个范围，例如，0-4，则意味着值可以是0和4之间的任何整数，即0,1,2,3或4。在各种实施方案中，例如在本发明方法中使用的化合物或化合物组可以是上面列出的实施方案的任何一种组合或亚组合。
在各种实施方案中，提供了任何实施例中所示的化合物，或者示例性化合物中的化合物。附文可以应用于任何公开的类别或实施方案，其中任何一个或多个上述其他公开的实施方案或种类可以从这些类别或实施方案中排除。
本文所述的化合物可以基于本文包含的教导和本领域已知的合成方法以多种方式制备。在以下描述的合成方法中，应理解为，所有提出的反应条件，包括溶剂的选择，反应气氛，反应温度，实验持续时间和后处理程序，可以选择作为反应的标准的条件，除非另有说明。有机合成领域的技术人员应了解，分子各部分上存在的官能团应与所提出的试剂和反应相容。与反应条件不相容的取代基对于本领域技术人员而言是显而易见的，因此指出了替代方法。实施例的原料可以商购获得，或者可以通过标准方法由已知材料容易地制备。所有可商购的化学品均得自Aldrich，Alfa Aesar，Wako，Acros，Fisher，Fluka，Maybridge等，除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。例如，通过使它们通过活性氧化铝柱获得干燥溶剂。
本发明还包括本发明的分离的化合物。表述“分离的化合物”是指本发明化合物或本发明化合物的混合物的制剂，其中分离的化合物已在化合物的合成中与所用的试剂和/或形成的副产物分离。“分离的”并不意味着该制剂在技术上是纯的(均相的)，但它足够纯，可以与治疗上使用的形式进行化合。优选地，“分离的化合物”是指本发明化合物或本发明化合物的混合物的制剂，其含有所述化合物或本发明化合物的混合物，其量至少占总重量的10％。优选地，该制剂含有所述化合物或化合物的混合物，其量至少占总重量的50％；更优选，至少占总重量的80％；最优选，至少占制剂总重量90％，95％或98％。
本发明化合物和中间体可从其反应混合物中分离，并通过标准技术纯化，例如过滤，液—液萃取，固相萃取，蒸馏，重结晶或色谱法，包括快速柱色谱法或HPLC。
在本发明中，应了解，式(I)化合物或其盐可表现出互变异构现象，由此两种化学化合物能够通过在两个原子之间交换氢原子而易于相互转化，其中之一形成共价键。由于互变异构化合物彼此以流动平衡存在，因此它们可被视为相同化合物的不同异构形式。我们应该知道，本说明书中的结构式图仅可代表一种可能的互变异构形式。然而，还应理解到，本发明包括任何互变异构形式，并且不仅限于在结构式图中使用的任何一种互变异构形式。本说明书中的结构式附图可以仅代表一种可能的互变异构形式，并且应该理解到，本说明书包括所描绘的化合物的所有可能的互变异构形式，而不仅仅是那些在本文中以图形方式显示的形式。
应当了解，当本发明的化合物含有一个或多个手性中心时，该化合物可以以单一和基本上纯的对映体或非对映体形式或作为外消旋混合物存在，并且可以分离。因此，本发明包括本发明化合物的任何可能的对映异构体，非对映异构体，外消旋体或其混合物。
典型的组合物包括本发明的化合物和药学上可接受的赋形剂，其可以是载体或稀释剂。例如，活性化合物通常与载体混合，或用载体稀释，或包封在载体内，载体可以是安瓿，胶囊，小药囊，纸或其它容器的形式。当活性化合物与载体混合时，或当载体用作稀释剂时，它可以是固体，半固体或液体材料，其充当活性化合物的载体，赋形剂或介质。活性化合物可以吸附在粒状固体载体上，例如包含在小袋中。一些合适的载体的实例是水，盐溶液，醇，聚乙二醇，聚羟乙氧基化蓖麻油，花生油，橄榄油，明胶，乳糖，白土，蔗糖，糊精，碳酸镁，糖，环糊精，直链淀粉，硬脂酸镁，滑石，明胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸或纤维素的低级烷基醚，硅酸，脂肪酸，脂肪酸胺，脂肪酸单甘油酯和甘油二酯，季戊醇脂肪酸酯，聚氧乙烯，羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。类似地，载体或稀释剂可包括本领域已知的任何持续释放材料，例如单独或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
制剂可以与助剂混合，助剂不会与活性化合物发生有害反应。这些添加剂可包括润湿剂，乳化剂和悬浮剂，影响渗透压的盐，缓冲剂和/或着色物质防腐剂，甜味剂或调味剂。如果需要，组合物也可以灭菌。
给药途径可以是将本发明的活性化合物有效转运至适当或所需作用部位的任何途径，例如口服，鼻腔，肺部，口腔，皮下，皮内，透皮或肠胃外，例如直肠，贮库，皮下，静脉内，尿道内，肌肉内，鼻内，眼用溶液或软膏，口服途径是首选的。
如果使用固相载体进行口服给药，可以将制剂压片，以粉末或丸剂形式置于硬明胶胶囊中，或者可以是锭剂或锭剂的形式。如果使用液体载体，则制剂可以是糖浆，乳液，软明胶胶囊或无菌可注射液体的形式，例如水性或非水性液体悬浮液或溶液。
可注射剂型通常包括含水悬浮液或油悬浮液，其可使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂制备。可注射形式可以是溶液相或悬浮液形式，其用溶剂或稀释剂制备。可接受的溶剂或载体包括无菌水，林格氏溶液或等渗盐水溶液。或者，无菌油可用作溶剂或悬浮剂。优选地，油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油，脂肪酸，甘油单酯，甘油二酯或甘油三酯。
对于注射，制剂也可以是适用于如上所述的适当溶液重构的粉末。这些的实例包括，但不限于，冷冻干燥，旋转干燥或喷雾干燥的粉末，无定形粉末，颗粒，沉淀物或颗粒。对于注射，制剂可选择性地包含稳定剂，pH调节剂，表面活性剂，生物利用度调节剂和这些的组合。这些化合物可以通过注射或连续输注等方式进行肠外给药。用于注射的单位剂型可以是安瓿或多剂量容器。
本发明的制剂可以设计成通过采用本领域熟知的方法在给予患者后保证活性成分的快速，持续或延迟释放。因此，制剂也可以配制用于控释或缓释。
本发明考虑的组合物可包括，例如，胶束或脂质体，或一些其他包囊形式，或可以延长释放形式给药，以提供延长的储存和/或递送效果。因此，可以将制剂压缩成小丸或圆柱体，并作为长效注射剂肌肉内或皮下植入。这种植入物可以使用已知的惰性材料，例如硅氧烷和可生物降解的聚合物，例如聚丙交酯-聚乙交酯。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。
对于鼻腔给药，制剂可以含有溶解或悬浮在液体载体中的本发明化合物，优选含水载体，用于气溶胶应用。载体可含有添加剂，例如增溶剂，例如丙二醇，表面活性剂，吸收增强剂，例如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精，或防腐剂，例如对羟基苯甲酸酯。对于肠胃外应用，特别合适的是可注射溶液或悬浮液，优选含有溶解在多羟基化蓖麻油中的活性化合物的水溶液。
含有滑石或碳水化合物载体或粘合剂等的片剂，糖衣丸或胶囊特别适合口服。用于片剂，糖衣丸或胶囊的优选载体包括乳糖，玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。在可以使用加糖车辆的情况下，可以使用糖浆或酏剂。
本发明化合物可以给予哺乳动物，特别是需要这种治疗，预防，消除，缓解或改善疾病的人。这些哺乳动物包括动物，家畜，例如家畜。家养宠物，农场动物和野生动物等非家畜。
本发明化合物在宽剂量范围内有效。例如，在成年人的治疗中，可以使用每天约0.05至约5000mg，优选约1至约2000mg，更优选约2至约2000mg的剂量。典型的剂量为每天约10mg至约1000mg。在为患者选择治疗方案时，经常需要以较高剂量开始并且当病情得到控制时需减少剂量。确切的剂量将取决于化合物的活性，给药方式，所需治疗，给药形式，待治疗对象和待治疗对象的体重，以及医师的偏好和经验。或兽医负责。
通常，本发明化合物以单位剂量形式分配，包括每单位剂量约0.05mg至约1000mg活性成分和药学上可接受的载体。
通常，适于口服，鼻腔，肺部或透皮给药的剂型包括约125μg至约1250mg，优选约250μg至约500mg，更优选约2.5mg至约250mg的与a混合的化合物。药学上可接受的载体或稀释剂。
剂型可以每天给药，或者每天给药超过一次，例如每天两次或三次。或者，如果发现处方医师建议，剂型可以比每天更频繁地施用，例如每隔一天或每周施用。
附图说明
图1.基于激酶抑制剂的苯基脲素骨架由ROCK抑制向LIMK抑制的转变。
图2.筛选抗HIV活性的LIMK抑制剂。a，将HIV Rev-依赖型示踪T细胞，Rev-CEM-GFP-Luc，用LIMK抑制剂或DMSO预处理1小时，然后用HIV-1(NL4-3)感染3小时。洗涤细胞以除去病毒和抑制剂，并孵育48小时。通过流式细胞术检测HIV依赖性GFP表达。在流式细胞术检测期间添加碘化丙啶(PI)以同时测量细胞活力。仅有活细胞用于GFP定量。使用GFP+细胞的相对百分比绘制药物处理的细胞相对于DMSO处理的细胞(100％)的相对感染率。b，在药物处理和Rev-CEM-GFP-Luc感染(红色三角形)后，通过荧光素酶测定法测量R10015的IC50。为了形成对比，还用100μM的R10015处理细胞，并用VSV-G假型HIV(黑点)感染。c，通过碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术同时测量R10015的细胞毒性。d，流式细胞术结果表明Rl0015抑制HIV-1(NL4-3)，但不抑制HIV-1(VSVG)，实验使用的是Rev-CEM-GFP-Luc。
图3.筛选抗HIV活性的LIMK抑制剂。将HIV Rev-依赖型示踪T细胞，Rev-CEM-GFP-Luc，用LIMK抑制剂或DMSO预处理1小时，然后用HIV-1(NL4-3)感染3小时。洗涤细胞以除去病毒和抑制剂，并孵育48小时。通过流式细胞术检测HIV依赖性GFP表达。在流式细胞术检测期间添加碘化丙啶(PI)以同时测量细胞活力。仅活细胞(门R1)用于GFP定量。GFP+细胞的百分比如图所示。
图4.对附着在中心苯基基团上的尿素NH的取代是不能容许的。
图5.将18b对接到Limk1的晶体结构(PDB ID 3S95)。A)显示关键交互的示意图。B)显示结合口袋的表面视图。
图6.A：用18b处理的HGF刺激的PC-3前列腺癌细胞系中p-cofilin的Western印迹分析。在PC-3细胞中也观察到化合物18f的类似细胞效力。B：对于18p，18r和18x，CEM-SS T细胞系中p-cofilin的Western印迹分析。
图7.Limk抑制剂对PC-3细胞侵袭的影响。用18b(1μM)或18f(1μM)处理PC-3细胞48小时，后比较细胞侵袭(左图)和相差图像(右图)。结果显示为一个代表性实验(来自三个独立实验)的平均值SD，此实验分三次进行。显示出了统计学上的显著差异(*)p<0.05。
图8.Limk1抑制剂对PC-3细胞迁移的影响。用指定浓度的18b(A)或18f(B)处理PC-3细胞24小时来比较伤口闭合(左图)和相差图像(右图)的平均值(％)。结果显示为一个代表性实验(来自三个独立实验)的平均值SD，此实验分三次进行。统计学上的显著性差异显示(NS)无显著性，(*)p<0.01。比例尺：20μm。
图9. 18w对大鼠眼睛的IOP降低作用。局部给药50μg。数据取自6次测定的平均值(基于6只大鼠)。
图10.R10015的化学和生物化学表征。a，R10015的化学结构及其与LIMK1(PDB ID3S95，链A)的晶体结构的对接。R10015的结合模体显示它是典型的I型ATP竞争性激酶抑制剂。b，R10015抑制重组LIMK1酶的10倍剂量抑制曲线(IC50＝38±5nM)。c，R10015阻断人T细胞中的cofilin丝氨酸3磷酸化。用R10015(100μM)处理CEM-SS T细胞一段时间，并通过蛋白质印迹测量cofilin，LIMK和PAK1/2的磷酸化。测量每种蛋白质或GAPDH的水平作为上样内参。d，R10015抑制Jurkat T细胞对SDF-1应答的趋化性。e，R10015。f，R10015抑制趋化肌动蛋白活性。用R10015处理静息的CD4T细胞，然后暴露于SDF-1一段时间。通过FITC-鬼笔环肽染色测量肌动蛋白聚合。g，绘制的F-肌动蛋白染色的相对强度。
图11.R10015抑制HIV-1的DNA合成，核迁移和病毒粒子释放。a，R10015对表面CD4和CXCR4表达的影响。用R10015(100μM)处理CEM-SS T细胞，然后对表面CD4或CXCR4进行染色。b，R10015不抑制病毒进入。用R10015处理CEM-SS T细胞，然后用BlaM-Vpr标记的HIV-1(NL4-3)或HIV-1(VSV-G)感染细胞以检测病毒进入。C，R10015抑制病毒DNA合成。用R10015处理CEM-SS T细胞1小时，然后在R10015存在下用单周期HIV-1(Env)感染2小时。感染后，洗涤细胞以除去HIV-1和R10015。通过实时PCR测量病毒DNA合成。d，R10015抑制2-LTR环状DNA形成。用R10015做相同地细胞处理并感染。通过实时PCR定量2-TLR环。e，R10015抑制病毒粒子释放。用HIV-1(Env)感染细胞2小时，洗涤，温育12小时，然后用R10015处理。通过测量上清液中的p24来定量病毒粒子的释放。
图12.R10015抑制HIV-1，EBOV，VEEV，RVFV和HSV-1的感染。a，R10015抑制静息CD4+T细胞的HIV潜伏感染。将细胞用R10015(100μM)或DMSO处理1小时，用HIV-1(NL4-3)感染2小时，洗涤，在没有R10015的情况下培养5天，然后用CD3/CD28磁珠活化。测量病毒p24释放。b，CD25和CD69表面染色表明R10015不抑制T细胞活化。c，R10015抑制CD45RO+记忆CD4T细胞的R5HIV-1潜伏感染。细胞同样用R10015处理，用HIV-1(AD8)感染，洗涤，孵育，然后活化。d，进行CD69表面染色作为对照用于R10015对T细胞活化的影响。e-g，R10015抑制EBOV感染。将HFF-1细胞用R10015处理2小时，在R10015存在下用EBOV(Zaire)(MOI，2.5)感染细胞48小时。固定细胞并用Alexa 488标记的抗体(g，绿色)或用Hoechst染色细胞核(g，蓝色)染色EBOV GP蛋白。使用感染的药物未处理的细胞作为对照，将相对GP蛋白染色转化为抑制百分比(a).以未感染作为对照，基于每孔的细胞核数计算细胞活力。(b).g是感染和药物治疗处理的染色细胞的共聚焦成像。h，R10015抑制HSV-1感染。将Vero细胞用R10015(100μM)或DMSO预处理2小时，然后用连续稀释的HSV-1感染2小时。感染后，洗涤细胞，并在没有R10015的情况下培养。用吉姆萨染色法对病毒噬斑进行染色定量。i，Rl0015抑制VEEV感染，用R10015或DMSO处理Vero细胞，用荧光素酶报告病毒VEEV-Luc(TC-83)，VEEV(TC-83)或VEEV(TrD)(MOI，0.1)感染，将R10015加入感染后的培养基中。在感染期间未观察到药物诱导的细胞毒性(数据未展示)。感染后24小时收集病毒上清液，并用荧光素酶或噬斑测定法分析。j，R10015抑制RVFV感染。同样地，用R10015处理Vero细胞，后用RVFVLuc(MP12)(MOI，0.1)感染，并用荧光素酶测定法分析。
具体实施方式
说明
我们小组报道了一种新型吡唑—苯基尿素骨架1(图1)作为有效和选择性Rho激酶(ROCK)抑制剂，其对大鼠眼睛的严重眼内压(IOP)具有降低作用。41,42化合物1在计数-屏幕研究中具有低Limk抑制作用(IC50>10μM)。然而，SAR研究显示用4-基-吡咯并嘧啶(化合物2)取代1中的铰链结合部分吡唑显著降低其ROCK-II亲和力(ROCK-IIIC50＝188nM的2vs.2nM的1))。另一方面，化合物2获得适度的Limk1抑制(Limk1IC50＝642nM vs.10μM的1)，揭示了该苯基脲基支架的有趣的铰链-结合剂依赖性激酶选择性。化合物2在其脲末端侧的进一步修饰导致化合物3(图1)，其具有甚至更弱的ROCK-II亲和力(IC 50＝1365nM)但改善了Limk1生化能力(IC 50＝201nM)。有趣的是，2和3中的4-基-吡咯并嘧啶部分也存在于Lexicon哌啶尿素/胍基Limk抑制剂中，并被认为参与铰链结合的相互作用.20
受化合物3对Limk1和ROCK-II的选择性偏差的刺激，我们对这种双芳基脲支架进行了进一步的优化(从3开始)，希望能发现用于各种应用的高效，选择性和专有的Limk抑制剂。在这里，我们报告了这一系列基于双芳基脲的Limk抑制剂的合成和结构-活性关系(SAR)研究。
此外，在我们的初步药物化学研究期间，我们设计并开发了一系列来自几个骨架的LIMK抑制剂。我们使用HIV Re-依赖性示踪细胞Rev-CEM-GFP-Luc筛选了大约25种这些新设计的LIMK抑制剂，其在HIV感染时表达GFP和荧光素酶。我们鉴定了7种先导化合物(R10015，R8584，R8482，R8212，R7826，R10543和R10659)，其在剂量下阻断了X4HIV感染，没有可检测的细胞毒性(图2和3)。
如图1所示，通过短途径获得抑制剂3和7。在HATU作为偶联剂和DIEA作为碱的情况下，使3-氨基苯甲酸与丙-2-胺偶合得到羰基酰胺4。将中间体4与1-溴-4-异氰酸基苯衍生物在二氯甲烷(DCM)中混合，产生溴化物5。最后，通过Suzuki偶联合适的芳基硼酸萘乙酸酯或者通过两步钯催化硼酸化/Suzuki偶联序列与芳基卤化物合成目标抑制剂3和7。最终靶向Limk抑制剂通过高压反相液相色谱(HPLC)方法纯化，得到基于UV吸收(254nm)的2'95％的纯度。
图1：抑制剂3和7的合成
试剂和条件：(a)丙-2-胺，HATU，N,N-二异丙基乙胺，N,N-二甲基甲酰胺，室温；(b)异氰酸苯酯衍生物,二氯甲烷；(c)硼酸频哪醇酯,四(三苯基膦)钯,二氧六环/水,95℃；(d)双联频哪纯基二硼,1,1'-双(二苯基膦)二茂铁氯化钯,二氧六环,回流；(e)Ar-Cl,四(三苯基膦)钯,二氧六环/水,95℃。
吡咯并嘧啶10通过室温下苯胺8与异氰酸基苯衍生物在二氯甲烷中取代反应合成，然后与4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶进行钯催化的硼酸化/Suzuki偶联反应。(图2)。
图2：抑制剂10的合成
试剂和条件：(a)异氰酸根合苯衍生物，二氯甲烷，室温；(b)(i)双联频哪纯基二硼，1,1'-双(二苯基膦)二茂铁氯化钯,二氧六环,回流；(ii)4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，四(三苯基膦)钯，二氧六环/水95℃。
在图3中描述了N-取代的(在连接到中心苯环上的脲NH上)化合物14的合成。为了制备12b和12c(12a可商购获得，甲基连接到丙氨酸上)，首先通过在K2CO3存在下在CH3CN中使4-溴-苯胺与2-氯乙基氯甲酸酯反应制备N-(4-溴苯基)恶唑烷-2-酮11。然后将中间体11和仲胺吡咯烷或哌啶溶解在DMSO中并在110℃下在微波炉中加热1小时，得到N-取代的4-溴-苯胺12b(来自吡咯烷)和12c(来自哌啶)。在搅拌下将12和1-异氰酸基-4-甲氧基苯在DCM中混合，得到尿素13。最后，溴化物13经历钯-催化的硼酸化/Suzuki偶联反应以产生14。
图3：抑制剂14的合成
试剂和条件：(a)2-氯乙基氯甲酸酯,K2CO3,CH3CN,回流；(b)吡咯烷或哌啶,DMSO,微波,110℃,1h；(c)1-异氰酸基-4-甲氧基苯,DCM；(d)(i)双(频哪醇合)二硼，PdCl2dppf，二恶烷，回流；(ii)4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶,Pd(PPh3)4,二恶烷/水,95℃。
图4中显示了N-取代的(在与末端苯环连接的脲NH上)化合物18的制备。在DCM中向苯胺和吡啶的混合物中加入2-氯乙基氯代甲酸酯，得到N-苯基-恶唑烷-2-酮。然后，在乙醇中对15和氢氧化钾进行回流，产生N-羟基乙基苯胺16。在二氧六环中加热碘苯，N'，N'-二取代乙胺，Pd(dba)2，BINAP和碳酸铯的混合物，得到二级苯胺17。最后，按照图3中所述的合成方法，由16或17合成抑制剂18。
图4：抑制剂18的合成
试剂和条件：(a)2-氯乙基氯代甲酸酯,吡啶,DCM,室温；(b)氢氧化钾,乙醇,回流；
(c)双(二亚苄基丙酮)钯,BINAP,碳酸铯,二氧六环；(d)(i)1-溴-4-异氰酸,DCM,室温；(ii)双戊酰二硼,1,1'-双(二苯基膦)二茂铁氯化钯,二氧六环,回流；(iii)4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，Pd(PPh3)4，二氧六环/水，95℃。
首先在针对Limk1(Reaction Biology Corporation，http//www.reactionbiology.com)和ROCK-II的生物化学测定中筛选制备的化合物。选择的有效Limk抑制剂也针对ROCK-I，PKA和JNK3以及四种选择的P450亚型(1A1,2C9,2D6和3A4)进行了反选筛选。然后在基于细胞的测定中评估有效和有选择性的Limk抑制剂对A7r5细胞中cofilin磷酸化的抑制作用。由于Limk抑制剂在治疗癌症和HIV感染方面的潜在应用，在肝细胞生长因子(HGF)刺激的前列腺癌(PC-3)细胞系和HIV相关CEM-SS T细胞中使用Western印迹分析细胞也评估了选定的前导抑制剂。为了评估这些基于双芳基脲的Limk抑制剂的药用性，在体外和体内药物代谢和药代动力学(DMPK)研究中进一步评估了一些有效的，可选择的和膜可渗透的化合物。
由于铰链结合部分的变异可以诱导激酶的抑制效力和选择性的显著差异，如图2所示，我们通过改变3的杂芳基环进行SAR研究，以发现Limk抑制剂的尿素骨架双芳基的最佳铰链结合部分。如表1所示，具有简单的5-或6-元杂芳环作为铰链结合部分的化合物，例如吡唑，吡啶和氨基嘧啶，基本上都是ROCK抑制剂(7a-7c，IC50<200nM)，具有低的Limk1抑制效果(IC50>10μM)。该观察结果与我们之前的报道一致，即吡唑，吡啶和氨基吡啶是用于开发ROCK抑制剂合适的铰链结合部分。[5,6]-稠合芳环如吡咯并吡啶(7d)和嘌呤酮(7e)的应用仍然产生具有良好ROCK-II抑制的化合物(IC50＝132和247nM，分别为7d和7e)但具有低Limk1抑制作用(IC50>10μM)。然而，使用4-基-嘌呤部分逆转了ROCK和Limk之间的激酶选择性。化合物7f对Limk1抑制(IC50＝1.5μM)的效力略高于ROCK-II抑制(IC50＝5.6μM)。有趣的是，将7f中嘌呤的铰链结合基团改变为3中的吡咯并嘧啶环显著增强了Limk1抑制效力和对ROCK的选择性。此外，在吡咯并嘧啶环(7g)的5-位上取代甲基进一步提高了对Limk1的抑制效力(IC50＝62nM vs.3的201nM)和对ROCK-II的选择性(IC50＝1608nM))。有趣的是，用6-甲基吡咯并嘧啶和5,6-二甲基吡咯并嘧啶环(7h和7i)产生略低的Limk1抑制(IC50＝80nM)，但比ROCK-II具有更好的选择性。因此，对3的其他部分的进一步优化将使用5-甲基吡咯并嘧啶作为铰链结合部分。然而，5,6-二甲基吡咯并嘧啶部分也将用于制备候选药物Limk抑制剂，因为它可以导致更高的选择性和更好的DMPK性质(表5,6和7)。
表1.铰链结合部分的SAR研究
a IC50是≥2次实验的平均值，误差在平均值的40％以内。
为了方便化合物合成，中心苯环的SAR研究主要基于其邻位(对于脲部分)的取代。如表2所示，评估了三种取代。与未取代的抑制剂7g相比，三氟甲基取代产生具有类似Limk1抑制效力的化合物(7j)(IC50＝60nM vs.7g的62nM)但选择性较低(ROCK-II IC50＝976nMvs.7g的1608nM)。然而，用一个小的F基团(大小接近质子的化合物，化合物7k)取代导致Limk1抑制增强(IC50＝18nM)和对ROCK-II的选择性提高(基于IC50值，选择性超过ROCK-II分别是7g和7k的26倍和43倍，表2)。另一方面，用大的二甲基氨基乙氧基侧链(7l)取代显著降低了Limk1抑制效果(IC50＝710nM vs.7g的62nM)和对ROCK-II的选择性(表2)。因此，中心苯环上的邻位F取代是制备高效和选择性Limk抑制剂的最佳选择。
表2.取代反应对中心苯环的影响
aIC50是≥2次实验的平均值，误差在平均值的40％以内。
继续在化合物7g的末端苯环上研究SAR，为了便于有机合成5-甲基吡咯并嘧啶用作铰链结合部分，并且中心苯基是非取代的。如表3所示，从7g的末端苯环上除去3-羰基酰胺，得到具有较低Limk1抑制活性的化合物(10a)(对于10a，IC50＝142nM，对于7g，IC50＝62nM)。有趣的是，用F基团(10b)取代3-羧基酰胺显著降低了Limk1抑制作用(IC50＝315nM)，这可能是由于在L-环下，该F基团与其周围蛋白质残基之间的特殊F-键相互作用。(参见对接研究的图5)。这种特殊的F-键相互作用可能会干扰这些基于尿素的Limk抑制剂的最佳结合构象。在几种其他Limk抑制剂中也观察到相同的效果(参见表4)。重要的是，对于中心苯环上的F-取代没有观察到F-键相互作用的这种特殊效应(7k，表2)，表明该效应取决于F-取代的位置。实际上，我们已经观察到F-键相互作用在开发我们的ROCK-II抑制剂和JNK3抑制剂时的类似负面影响(降低激酶抑制效力)，其中F-取代的芳族部分都与p-环内的、蛋白激酶的ATP结合口袋以外的区域结合。
与F-取代不同，使用甲氧基取代3-羧酰胺导致Limk抑制剂(10d)具有相似的Limk1抑制效力(IC50＝75nM vs.7g的62nM)，并且对ROCK-II的选择性稍好一些(表3)。然而，2-甲氧基取代(10c)显着降低了Limk1抑制活性(IC50＝283nM)。另一方面，4-甲氧基取代(10e)增强Limk1抑制(IC50＝35nM)和对ROCK-II的选择性(IC50>10μM，选择性>285倍)。对于该末端苯基上的F-，Cl-和甲基取代也获得了类似的SAR模式(参见表4)，表明在Limk抑制中4-取代最适合该骨架。除苯环外的杂芳基环也被评价为末端芳族功能基团。例如，使用2-基-噻唑(10f)导致较低的Limk1抑制(与10a相比)；并且使用2-基-吡啶功能团(10g)几乎使化合物对Limk1和ROCK-II失活。
表3.终端芳环的SAR研究
aIC50是≥2次实验的平均值，误差在平均值的40％以内。
研究两个尿素NH基团的替代效应是我们SAR研究的下一个重点。对于与中心苯环连接的尿素NH，可以包容包括吡咯烷基乙基和哌啶子基乙基在内的小的或大的取代。如图4所示，简单的甲基取代(14a)将显着降低Limk1抑制效力(IC50＝1090nM vs.10e的35nM)。该NH基团的较大取代甚至产生更低的Limk1抑制，如化合物14b和14c的Limk1IC50值所证明的那样(图4)。这些结果表明，对该尿素NH的烷基化干扰了最佳结合构象，或NH参与与蛋白质的H-键相互作用，因此导致低Limk亲和力(也参见图5中的对接模式)。
与图4中的观察结果相反，SAR研究表明，在末端苯环上连接的尿素NH基团上的取代被很好地耐受，并且通过这种修饰可以获得优异的Limk抑制剂。如表4中所示，吡咯烷基乙基取代产生具有略低的Limk1抑制的化合物(18a)(IC50＝368nM vs.10a的142nM)。然而，用羟基取代吡咯烷环(18b)导致高Limk1抑制活性(IC50＝43nM vs.10a的142nM)和对ROCK-II的良好选择性(IC50＝6565nM vs.10a的2358nM)。灵受18b鼓舞，一个4x3＝12个类似物(18b)的小型文库，基于四个官能团(F-，Cl-，甲基和甲氧基)和末端苯环上的三个取代模式(2-，3-，4位)被制备并评价，(化合物18c至18n，表4)。通常，4-取代显示最高，2-取代显示最低的Limk1抑制活性。对ROCK-II的选择性遵循相同的模式，其中4-取代最高，2-取代最低，无论取代基是什么。在4取代的Limk抑制剂中，4-Cl类似物具有最佳的Limk1抑制效力(18h，IC50＝25nM)，其4-F对应物(18e，IC50＝86nM)具有最低的Limk1亲和力，可能是由于特殊的F键相互作用，而Limk1抑制活性和对ROCK-II的选择性对甲基和甲氧基类似物(18k和18n)介于两者之间。
为了证实对该尿素NH基团的烷基化可以被很好地耐受，我们探索了另外两个取代。如表4所示，将氨基乙基和N'，N'-二甲基氨基乙基取代物应用于4-Cl-和4-甲氧基苯基脲，得到的4种化合物18o-18r均显示出高Limk1抑制作用。在反筛选研究中评估化合物18p至18r，发现18q和18r对ROCK-II具有高选择性(IC50>10μM，选择性分别为>210倍和>500倍，18q和18r)而18p只有约21倍。与18q和18r相比，18a观察到的较低Limk1抑制效力，可能是由于其庞大的吡咯烷环可能扰乱了最佳结合构象。
表4.与末端苯基部分连接的脲NH基团的SAR
aIC50是≥2次实验的平均值，误差在平均值的40％以内。b不确定。
前导化合物的计算机模拟研究表明，这些基于双芳基脲的Limk抑制剂都是I型ATP竞争性激酶抑制剂。化合物18b在Limk1蛋白(PDB ID 3S95)晶体结构中的对接模式如图5所示。该基序中的关键相互作用包括：吡咯并嘧啶N/NH(N1和N7)与铰链残基I416之间的两个H键；吡咯并嘧啶环的N3与残基T413的侧链OH基团之间的一个似乎合理的H键(图5中未标记，因为该H键需要T413侧链的旋转运动)；脲羰基功能团与K368的侧链氨基之间的一个H键；OH基团与残基D478之间的一个H键；K368的末端苯环与侧链氨基之间的阳离子-n相互作用；P-环下末端苯环与其周围残基之间的疏水相互作用。需要特别指出的是吡咯并嘧啶/中心苯基功能团的芳环与其蛋白质残基的周围侧链之间的疏水相互作用也有助于这些Limk抑制剂的高亲和力。
化合物18b的结合模体支持我们观察到的SAR。例如，由于该区域周围的开放空间，单-和双-甲基取代(至5-和/或6-位)，或甚至更大的基团取代的吡咯并嘧啶环都具有良好的耐受性，并且这些取代可以增强抑制剂的由于替代引入的额外相互作用导致的限制抑制。取代与中心苯环连接的尿素NH导致无活性化合物，因为这种取代可能干扰尿素羰基的取向，从而削弱其与K368的H-键合。另一方面，与末端苯环相邻的尿素NH的取代被很好地耐受并且可以导致增强的Limk抑制，因为在该区域周围有足够的空间并且取代指向溶剂。末端苯基上的4-取代产生最活跃的Limk抑制剂(与2-和3-取代相比)，因为在那里存在深的疏水口袋。吡咯并嘧啶N3与T413的侧链OH之间的H-键相互作用解释了为什么化合物3(表1)是良好的Limk抑制剂，而化合物7d具有低Limk1抑制作用。与3(表1)相比，7f中Limk1抑制的显著降低，可能是由于N5(7f)与周围蛋白质残基之间的额外H键相互作用，这可能干扰配体的最佳结合构象，从而减少其对Limk1的亲和力。
我们对这种基于双芳基脲的Limk抑制剂骨架的SAR分析和对接研究表明，5-和6-甲基-4-基-嘧啶，以及5,6-二甲基-4-基-吡咯并嘧啶均可作为用于Limk抑制的铰链结合部分。其中，5,6-二甲基吡咯并嘧啶是最好的，因为它可以提供更好的选择性(对ROCK)和更高的微粒体稳定性(见表6)。中心苯环(对于脲部分)的邻-F-取代可以改善Limk抑制效力，同时仍保持高微粒体稳定性(表6)。另一方面，末端苯环上的F-取代降低了对Limk1的抑制效力，这可能是由于特殊的F-键相互作用(在P-环下)。SAR分析还表明末端苯基上的4-Cl或4-甲基取代给出总体最佳Limk抑制剂。值得注意的是，对末端苯基侧连接的尿素NH的取代可以改善生物化学和细胞效力，增强选择性，更重要的是，增加抑制剂的DMPK性质和生物利用度(参见下表7)。
表5.优化的Limk抑制剂的生化和细胞效力
aIC50是≥2次实验的平均值，误差在平均值的40％以内。b不确定。
为了利用上述重要的SAR信息，制备并评估结合了SAR分析中最佳结构元素的Limk抑制剂。表5列出了四种代表性化合物的结构和生物化学效力数据。在化合物18s至18w中，使用4-基-5,6-二甲基吡咯并嘧啶作为铰链结合部分，以获得最佳的微粒体稳定性和更好的选择性；使用中心苯环上的邻-F-取代和末端苯基上的4-Cl取代，以获得更高的Limk1效力；使用末端尿素NH上的代表性取代以进一步研究DMPK性质(参见表6和7的讨论)。实际上，这些化合物都具有优异的Limk1效力(IC50＝21nM)和对ROCK-II的良好选择性(对于18w和18x，IC50>20μM)。
为了检查这些基于双芳基脲的Limk1抑制剂的选择性特征，对选择的先导化合物进行针对ROCK-1，JNK3和四种代表性细胞色素P450同种型的反筛选。如表6中所总结，这些Limk抑制剂均显示出比测试的激酶和P450酶低的抑制活性，除了7i在10μM下对酶1A2(77％)显示出适度的抑制。除了针对ROCK和JNK3的反向筛选之外，还针对一组61种激酶(Reaction Biology Corporation，http//www.reactionbiology.com/webapps/site/)描述了前导抑制剂18b。结果显示，1.0μM的18b仅抑制Limk1和STK16，抑制率为2'80％(命中率约为3％)，并且还击中Aurora-a，Flt3，LRRK2和RET，抑制率>50％(命中率约为10％)。
这些Limk抑制剂在人和大鼠肝微粒体中也具有良好至优异的稳定性(表6)，具有良好至极好的半衰期。需要特别指出的是，与基于单甲基取代的吡咯并嘧啶的类似物7g相比，基于5,6-二甲基吡咯并嘧啶的Limk抑制剂7i，18s和18t在人和大鼠微粒体中表现出更高的稳定性，并且对ROCK更高的选择性(也见表2和5)。然而，当18s和18t上的羟基或氨基被甲基化时，如18w和18x所示，微粒体稳定性显著下降(表6)。显然，18w和18x的较低稳定性主要是由于其侧链二甲氨基或甲氧基上的去甲基化。表6中选择性分析和稳定性数据的其他重要SAR信息包括1)所有羟乙基取代(对尿素NH)化合物(18系列)在人肝微粒体中具有优异的稳定性，但18g除外(t1/2＝22)，2)中心苯环上的F-取代没有降低微粒体稳定性，同时仍保持优异的选择性(7k vs.7g)，3)末端苯环上的F-取代不仅降低了Limk1抑制效力(与其Cl-，甲基和甲氧基取代的对应物相比)但也降低了微粒体稳定性(18e vs.18b，18h，18k和18n)，4)与其4-取代的对应物(18g vs.18h和18m vs.18n)相比，对于未取代的类似物(18b)，甚至对于其2-取代的类似物(18f)，末端苯环上的3-取代导致微粒体稳定性显著减少。
表6.所选化合物的选择性，微粒体稳定性和细胞效力数据。
a IC50是≥2次实验的平均值，误差在平均值的40％以内。b未确定。
为了研究这些Limk1抑制剂的基于细胞的活性，我们监测了几种细胞系中cofilin的磷酸化状态。A7r5细胞中的数据(表6)显示，在其尿素NH基团(7g，7i，7k)上没有任何取代的抑制剂具有仅在微摩尔范围内的IC50值的细胞活性。另一方面，Limk抑制剂及其尿素NH基团(连接在末端芳基环上)被羟乙基，氨基乙基，甲氧基乙基或二甲氨基甲基(18b至18x)取代，其IC50值均为亚微摩尔范围，最佳接近100nM(18h)。此外，基于细胞的效力中显示的SAR模式与在生物化学效力和选择性测定中观察到的类似。例如，4-Cl(18h)和4-甲基(18k)取代产生的化合物具有比4-甲氧基(18n)取代更好的细胞活性，并且4-取代在2-，3-和2中显示出最高的细胞活性。末端苯环上的4-取代(18f，18g和18h)。
由于Limk抑制剂可以广泛应用，如青光眼，癌症，感染和阿尔茨海默病(AD)等，还对肝细胞刺激的前列腺癌(PC3)细胞系中少数几种铅化合物进行了cofilin磷酸化检测。生长因子(HGF)和HIV相关的CEM-SS T细胞系。如图6所示，在PC-3细胞中的cofilin磷酸化的蛋白质印迹分析中，抑制剂18b甚至在仅50nM的浓度下也显示出显着的抑制作用(图6A)。在PC-3细胞中也观察到18f和18h的类似的基于细胞的效力。图6B中显示了抑制剂18p，18r和18x的CEM-SS T细胞中p-cofilin的磷酸化状态。对于所有这些化合物，在1μM时再次观察到>50％的抑制，这种抑制效力类似于在A7r5细胞中获得的抑制效力。这三种测试细胞系的结果表明，优化的Limk抑制剂具有良好的细胞渗透性。化合物18p和18r具有几乎相同的生物化学Limk1效力(IC50值均为～20nM，表4)。显然，18r观察到的细胞效力比18p更好(图6B)是由于18p中存在的游离NH2基团，这是一种通常与细胞渗透性恶化相关的结构元素。
在各个阶段的整个优化期间对所选化合物进行体内药代动力学(PK)研究，以鉴定有利于体内应用的结构元件，和/或评估优化的Limk抑制剂用于动物研究的可行性。表7中列出了静脉内给药(1mg/kg)的PK特性和选定的铅Limk抑制剂的口服生物利用度(％F)。通常，与未取代的相比，2-羟乙基侧链降低了清除率(Cl)。(NH)脲衍生物(10a，18b，18h，18k，18n vs.7g和7k)。相反，含有末端氨基的侧链显着增加了清除率(18o，18p，18r vs.18h，18k和18n)。值得注意的是，通过在中心苯环上引入F-取代，或通过使用5,6-二甲基吡咯并嘧啶(代替5-甲基吡咯并嘧啶)作为铰链结合，可以显着降低具有氨基侧链的化合物的高清除率。部分或两者的组合(18w vs.18r)。表7中列出的所有Limk1抑制剂具有合理的分布体积(Vd)值，除了少数具有氨基侧链并且其中5-甲基吡咯并嘧啶用作铰链结合部分(18o，18p和18r)。与18r(以及18o和18p)相比，18w的更低的Cl和Vd值以及更高的AUC值进一步证明了中心苯环上的F-取代和5,6-二甲基吡咯并嘧啶的应用。铰链结合部分可以改善抑制剂的PK特性。
表7.大鼠的血浆药代动力学研究数据。a
a报告的数据是三次测定的平均值，标准误差在平均值的40％以内。biv剂量：1mg/kg。cpo剂量：2mg/kg。d尚未确定。
表7中的PK数据显示，对尿素NH基团的取代通常可以增加这些基于尿素的Limk抑制剂的半衰期(10和18系列vs.7系列)。这些化合物的AUC和Cmax性质也很优异，只有三种抑制剂(18o，18p和18r)在其中心苯环上含有氨基侧链且没有F-取代，其中使用5-甲基吡咯并嘧啶作为铰链结合部分。重要的是要指出，即使具有氨基侧链，抑制剂18w仍然表现出良好的AUC和Cmax值，可能是由于中心苯环上的F-取代和5,6-二甲基吡咯并嘧啶部分的存在。它的结构。表7中的数据还表明，虽然未取代的脲化合物(7g和7k)根本没有口服生物利用度(％F)，但所有含有羟乙基侧链的抑制剂都可以表现出合理的口服生物利用度。然而，含有氨基侧链(18o，18p和18r)的那些抑制剂也没有口服生物利用度，可能是因为这些化合物表现出高清除率(Cl)。
由于Limk1表达在癌性前列腺细胞中高度表达并且主要在转移性前列腺肿瘤组织中发现，并且是癌细胞迁移和侵袭所必需的，因此Limk1被认为是前列腺癌进展的生物标志物。Limk1通过灭活cofilin的磷酸化参与Rac诱导的肌动蛋白细胞骨架重组，并且还通过粘着斑复合物介导。细胞骨架的重组是癌细胞的运动，分离和侵袭的基本特征。此外，Limk1表达与癌细胞的侵袭性相关，并且转移性PC-3细胞中的Limk1表达高于侵袭性较低的LNCaP和M21细胞。为了证实Limk抑制剂对前列腺癌的侵袭和迁移的作用，我们使用体外侵袭测定或体外迁移测定检查了优化的Limk抑制剂在PC-3细胞中的作用。因此，如实验部分所述，将Transwell室用GFR Matrigel包被，并将PC-3细胞接种在室的插入物中。孵育48小时后，对侵入性PC-3细胞进行计数，并在显微镜下通过苏木精染色进行分析。如图7中针对两种代表性抑制剂18b或18f所示，通过1μM Limk抑制剂的处理显着抑制PC-3细胞的侵袭(18b为76％，与对照相比，18f为83％)。
为了验证Limk抑制剂对PC-3细胞迁移的作用，如实验部分所述，通过在细胞单层中刮擦产生伤口。在用抑制剂18b或18f处理温育24小时后，通过ImageJ软件(Ver1.48)分析指示迁移细胞的闭合伤口区域。如图8所示，即使浓度低至0.1μM，迁移的PC-3细胞也显着减少，1μM抑制剂18b的迁移被抑制74％(16.5％(NS)减少0.1μM，74.0％(p<0.01)为1μM，与对照相比为77.5％(p<0.01)×10μM。对于抑制剂18f也获得了类似的抑制效力(与对照相比，13μM(NS)0.1μM，76.1％(p<0.01)×1μM，和81.0％(p<0.01)×10μM)。这些结果表明18b或18f对转移性PC-3细胞的侵袭和迁移具有抑制作用。考虑到两种抑制剂对ROCK-I和ROCK-II的抑制作用较低(表4和表6)，其抑制也可导致细胞迁移/侵袭的抑制，结果图7和8也证明了18b和18f必须在体外Limk抑制中发挥了作用。
为了证明这些Limk抑制剂在治疗青光眼中的潜在应用，化合物18w的局部压力(IOP)-在局部施用于大鼠眼睛后监测(Brown Norway大鼠，n＝6/组，在恒定低照度条件下饲养)遵循我们小组先前描述的方案。因此，使用50μg剂量(20μL滴0.25％溶液)将化合物18w施用于升高的IOP大鼠模型的右眼(初始IOP为～28mmHg)。如图9所示，在4小时时检测到IOP的显着降低，在7小时略微减弱，并且与载体相比，IOP在24小时时返回基线。必须指出的是，IOP下降不能归因于ROCK抑制，因为18w对ROCK具有高选择性(表5)。
通过应用4-基-吡咯并嘧啶作为铰链结合部分来取代ROCK抑制剂1中的吡唑基团，我们鉴定了具有高Limk1抑制效力的化合物。围绕这种双芳基脲骨架(3)的系统性SAR研究已经产生了一系列有效的和选择性的Limk抑制剂。对接研究表明，这些双芳基脲Limk抑制剂表现出典型的I型激酶结合基序。优化的Limk抑制剂比ROCK-1，ROCK-II和JNK3具有高生物化学效力和高选择性。发现抑制剂18b(也编码为SR-7826)仅针对一组61种激酶在1μM下以2'80％抑制仅击中Limk1和STK16。前导抑制剂在cofilin磷酸化测定和基于细胞的迁移/侵袭测定中也具有良好的基于细胞的效力。此外，它们具有良好的体外和体内DMPK特性，例如针对选择的CYP-450同种型的清洁抑制特性，人和大鼠肝微粒体中的高稳定性，以及静脉内给药中的有利PK特性(高AUC/Cmax，低Cl和长半衰期)和大鼠良好的口服生物利用度(18b，18k，18n和18s)。例如，化合物18s至18x(也编码为SR-11157)均具有优异的针对Limk1的效力(IC50s≤21nM)，对A7r5细胞中的cofilin磷酸化具有良好的基于细胞的活性(IC50≤320nM)，并且具有高选择性。ROCK和JNK。优化的抑制剂，例如18b和18f，在基于迁移/侵袭细胞的测定中显示出优异的活性。此外，在局部给药(剂量为50μg)后，抑制剂18w(也编码为SR-11124)在大鼠眼上获得显着的IOP下降(>20％)。
此外，已经从三种化学型鉴定了铅LIMK抑制剂。骨架A基于4-基-哌啶-或哌嗪-苯并咪唑衍生物；骨架B衍生自苯基苯并咪唑类似物，骨架C基于双-芳基脲部分。所有三种骨架共享取代或未取代的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶部分(表10)。在LIMK1(PDB ID 3S95)的晶体结构中的分子对接研究证明，该吡咯并嘧啶部分起到与铰链残基Ile416的主链结合的ATP位点铰链结合基团的作用，其具有来自吡咯并嘧啶的NH/N的H-键合相互作用。来自这三种支架的所有化合物都是I型ATP竞争性激酶抑制剂(图9)。除铰链相互作用外，这些LIMK抑制剂的末端芳香族部分与P-环下的口袋结合，具有强疏水相互作用(图10)。可能有助于这些LIMK抑制剂的高亲和力的另外的H-键相互作用也可能存在于该结合基序中，这取决于功能性取代。例如，对于R10015，在酯羰基和残基G351的主链酰胺之间也存在H键相互作用(图10)。
表8:代表性化合物的结构和LIMK1 IC50值(nM)
我们选择R10015进行进一步详细的机械研究。R10015的合成，纯化和生物化学表征描述于实施例部分和图10中。R10015对纯化的人LIMK1激酶活性的生化IC50值确定为约38nM(图10b)。针对一组62种激酶(表9)的分析表明，R10015具有高选择性，仅对LRRK2和p70S6K具有显着的脱靶抑制(在1μM的R10015下抑制2'90％)，并且对PKA的中度抑制(～76％))，ROCK2(～70％)和FLT3(～68％)。
为了进一步证实R10015在细胞中的特异性，我们处理人CEM-SS T细胞一段时间，并检测到cofilin丝氨酸3磷酸化的显着抑制(图2c)。这种抑制作用特异于LIMK的激酶活性，因为R10015不改变细胞中cofilin或LIMK的总量。R10015也不抑制其他激酶如PAK1/2对LIMK本身的磷酸化，其活性受上游Rho家族GTP酶如Rac，cdc42和Rho4,22的调节。R10015也未抑制PAK1/2本身的磷酸化(图10c)，证明上游激酶和GTP酶不受R10015的影响。
我们进一步测试了R10015抑制SDF-1介导的趋化性和肌动蛋白动力学，已知其受LIMK调节。我们观察到Jurkat T细胞趋化性的剂量依赖性抑制，并且IC 50为约10μM(图10d)。一致地，用R10015预处理静息CD4T细胞显着抑制SDF-1介导的肌动蛋白聚合(图10e和10f)，证实R10015阻断LIMK调节的肌动蛋白动力学。为了抑制CD4T细胞的HIV感染，R10015显示出14.9μM的半数最大抑制浓度(IC50)，并且该药物在所有测试浓度(高达200μM)下都没有可检测的细胞毒性(图9b和9c)。此外，即使在100μM时，R10015也不抑制VSVG假型HIV(图9b和9d)，这表明HIV的抑制不是由非特异性细胞毒性引起的，并且确实特异于与HIVgp120介导的融合相关的病毒过程。进入，已知需要皮质肌动蛋白动力学2；VSV-G介导的内吞作用绕过皮质肌动蛋白，因此不易受R10015的影响。这些结果支持R10015通过直接阻断LIMK调节的肌动蛋白动力学来抑制HIV。
该药物还可用于预防性传播疾病(STD)。发现R10015还抑制单纯疱疹病毒。该药物可配制用于局部使用，以防止引起STD的病毒的性传播。此外，它还可以通过阻断细胞内细菌迁移来抑制细菌感染，细菌迁移依赖于肌动蛋白聚合和LIMK活性。例如，衣原体是一种性传播的细菌感染，可以用本发明的化合物治疗。
Table9:R10015在1μM对60种激酶的分析数据研究
Kinase ％Activity Kinase ％Activity
ABL1 89.2 LIMK1 6.4
AKT2 73.1 LRRK2(G2019S) 6.7
ALK 95.5 MEK1 75.6
AMPK(A1/B1/G1) 76.6 MLCK/MYLK 83.3
Aurora A 60.3 MRCKa/CDC42BPA 96.5
BRAF 91.9 mTOR/FRAP1 100.0
BTK 90.2 NEK1 67.2
CAMK2b 90.8 P38a/MAPK14 98.6
CDK2/cyclin A 82.7 p70S6K/RPS6KB1 10.0
CDK5/p35 85.5 PAK2 98.2
CK1d 85. PDGFRb 78.6
CK2a 94.2 PIM2 97.6
c-Kit 81.3 PKA 24.0
c-MET 82.1 PKCa 47.5
c-Src 92.4 PKN1/PRK1 58.6
DAPK1 87.8 PLK2 103.2
EGFR 93.2 RET 46.5
EPHA3 91.1 ROCK1 42.3
ERK2/MAPK1 87.2 ROCK2 29.5
FAK/PTK2 81.5 RSK1 47.2
FGFR1 86.5 SGK1 61.0
FLT3 32.2 SLK/STK2 108.0
GSK3b 67.8 STK16 48.6
IGF1R 90.0 STK33 56.5
IKKa/CHUK 90.5 TAK1 82.4
IKKb/IKBKB 85.1 TAOK1 54.0
IKKe/IKBKE 84.1 TBK1 82.0
JAK3 61.1 TESK1 90.2
JNK1 95.2 TLK1 98.5
JNK3 85.7 WEE1 97.2
KDR/VEGFR2 87.2 ZIPK/DAPK3 98.5
按照其网站上描述的方案，在Reaction Biology Corporation进行分析：http：//www.reactionbiology.com/webapps/site/。其中％数据是两次测定的平均值。使用的ATP浓度：10μM；Staurosporine用作阳性对照。
为了进一步阐明抗HIV机制，我们用R10015预处理人CEM-SS T细胞1小时。这种简短的治疗并没有改变CD4和CXCR4的表面表达；然而，延长治疗时间(4小时)会略微降低CD4的表面密度(图11a和11b)4。通过HIV-1 Vpr-β-内酰胺酶感染测量，R10015没有显着抑制病毒进入(图1c))或Nef-荧光素酶标记的病毒颗粒。然而，当使用单循环HIV-1(Env)(用HIV-1gp160假型化)测量进入后步骤时，R10015在所有时间点抑制病毒DNA合成(图11c)。此外，通过病毒2-LTR圈测量，R10015抑制病毒核迁移(图11d)。此外，当在HIV感染的后期应用时，R10015也抑制病毒释放(图11e)。这些结果证明R10015抑制病毒DNA合成，核迁移和病毒粒子释放，这种表型与shRNA LIMK1敲低细胞中观察到的抑制一致。
在HIV传播过程中，早期病毒利用CCR5(R5)，主要感染记忆CD4T细胞和巨噬细胞，而晚期病毒也利用CXCR4(X4)。我们测试了R10015抑制血液静息CD4T细胞和记忆CD4T细胞的X4和R5病毒感染，并观察到无毒剂量下X4和R5病毒的抑制(图12a至12d)。这些结果证实LIMK抑制剂可有效阻断主要靶标的HIV感染。鉴于肌动蛋白动力学的需求在多种病毒之间共享，我们测试了R10015抑制其他几种病毒的能力，并发现R10015还抑制EBOV(扎伊尔埃博拉病毒)，RVFV(裂谷热病毒)，VEEV(委内瑞拉马脑炎)病毒)和HSV-1(单纯疱疹病毒)(图12e至12j)，证明其广泛的抗病毒活性。
我们的研究证明了开发高度特异性LIMK抑制剂以抑制HIV和其他病毒感染的可能性。鉴于缺乏有效的HIV疫苗，这些新型抑制剂是预防HIV性传播的有价值的替代品。这些LIMK抑制剂抑制病毒逆转录，核迁移和释放，并且预期是HIV染色的广谱，因为病毒依赖于肌动蛋白动力学感染的高度保守性质。此外，这些LIMK抑制剂具有抗炎特性，并且可以抑制感染的免疫细胞的迁移和趋化性以用于HIV细胞-细胞传递(图10d)。这些病毒学和免疫学特性使其成为预先暴露预防的理想候选者，补充了目前的抗逆转录病毒药物。
示例
除非另有说明，否则使用市售试剂和无水溶剂而无需进一步纯化。用预涂硅胶60F254进行薄层色谱(TLC)分析。使用的Finnigan LCQ Advantage MAX光谱仪通过LC/MS记录质谱。通过用EtOAc/己烷或MeOH/DCM作为洗脱液，在预填充的硅胶柱(230-400目，40-63μm)上进行快速色谱。制备型HPLC在SunFire C18OBD10μm(30×250mm)上用CH3CN+50％MeOH/H2O+0.1％TFA作为洗脱剂进行以纯化目标化合物。使用CH3CN(溶剂B)/H2O+0.9％CH3CN+0.1％TFA(溶剂A)作为洗脱液，在Agilent技术1200系列上进行分析型HPLC，并且在215-310nm的检测范围内通过UV检测目标产物。通过该方法测定所有化合物纯度>95％。在室温下用Bruker400MHz光谱仪记录NMR光谱，残留溶剂峰为内标。多重峰的线位置以ppm(o)给出，偶合常数(J)以赫兹给出。用Thermo Finnigan orbitrap质量分析仪进行高分辨率质谱(HRMS，电喷雾电离)实验。以m/z 400在100000的分辨率下以正离子模式获得数据。在分析之前立即用外部校准混合物进行校准。
一般合成程序:
将3-氨基苯甲酸(10mmol)，丙-2-胺(10mmol)，HATU(10mmol)和DIEA(30mmol)在DMF(10mL)中的混合物在室温下搅拌直至完全转化为开始的材料。然后，加入饱和NaHCO 3以淬灭反应并用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，得到粗苯胺甲酰胺4。然后将苯胺4(0.2mmol)加入到异氰酸基苯衍生物(0.2mmol)的DCM(1mL)溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时。然后，真空除去溶剂，得到粗溴化物5，用于下一步，无需进一步纯化。将取代的苯胺8(0.2mmol)和异氰酸基苯衍生物(0.2mmol)在DCM(1mL)中的混合物在室温下搅拌2小时，然后真空除去溶剂，得到粗溴化物9，用于下一步骤而无需进一步操作。纯化。
将2-氯乙基氯甲酸酯(10mmol)加入到4-溴-苯胺(10mmol)和K2CO3(30mmol)在CH3CN(100mL)中的混合物中，并将反应搅拌24小时。然后，真空除去溶剂，将剩余的残余物再溶于水和乙酸乙酯中。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，并通过硅胶纯化，得到粗N-(4-溴苯基)恶唑烷-2-酮11。
然后将包含吡咯烷和哌啶的11(0.2mmol)和仲胺(0.6mmol)溶解在DMSO(1mL)中并在110℃下在微波中加热。在11完全转化后，将混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到中间体12a-12c。将12a-12c(0.2mmol)和1-异氰酸根合-4-甲氧基苯(0.2mmol)在DCM(1mL)中的混合物在室温下搅拌2小时，然后真空除去溶剂，得到粗溴化物13a-13c用于下一步而无需进一步纯化。
最后，将硼酸频哪醇酯(0.3mmol)和粗溴化物5(0.2mmol)溶解在脱气的5：1二恶烷/H2O中。在氩气下依次加入Pd(PPh3)4(0.02mmol)和2M K2CO3溶液(0.6mmol)，并将混合物在95℃加热2小时。冷却至室温后，将混合物用水稀释并用乙酸乙酯(3×5mL)萃取。合并有机层，用无水Na2SO4干燥并真空浓缩。然后通过制备型HPLC纯化残余物，得到目标产物7a和7b，为白色固体。
在另一种途径中，将双-(频哪醇合)二硼(0.24mmol)，粗5,9和13(0.2mmol)和PdCl2(dppf)(0.02mmol)溶解在脱气的二恶烷(5mL)中。回流2小时后，将混合物用水稀释并用乙酸乙酯(3×5mL)萃取。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，得到粗硼酸频哪醇酯。按照7a，7c-7k，10a-10f，14a-14c的合成方法，由粗硼酸频哪醇酯(0.2mmol)和Ar-Cl(0.2mmol)合成。
将2-氯乙基氯代甲酸酯(1mmol)加入到取代的苯胺(1mmol)和吡啶(3mmol)在DCM(10mL)中的混合物中，并将反应搅拌24小时。然后，真空除去溶剂，将剩余的残余物再溶于水和乙酸乙酯中。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，得到粗品15。将KOH(10mmol)加入到粗品15(1mmol)的EtOH(10mL)混合物中。然后将混合物回流直至完全转化为15。真空除去溶剂，将剩余的残余物再溶于水和乙酸乙酯中。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，并通过硅胶纯化，得到中间体16。碘苯(0.2mmol)，2-(吡咯烷-1-基)乙胺(0.6mmol)，Pd(dba)2(0.01mmol)，BINAP(0.01mmol)和Cs2CO3(0.6mmol)的二恶烷(1mL)溶液回流24小时。冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯。然后合并有机层，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，并通过硅胶纯化，得到中间体17。然后分别从17和16合成18a和18b-18n，然后从8开始合成10a-10f的合成步骤。
3-(3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲基)-N-异丙基苯甲酰胺(3)：45％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.28(s,br,1H),9.06(s,1H),8.96(s,1H),8.81(s,1H),8.18-8.16(m,3H),7.87(s,1H),7.71-7.64(m,4H),7.46-7.44(m,1H),7.38-7.36(m,1H),6.95(s,1H),4.14-4.07(m,1H),1.18(d,J＝5.2Hz,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 165.50,152.70,152.38,152.19,147.81,143.00,139.47,135.77,130.01,129.56,128.51,127.01,120.81,120.71,118.10,117.70,113.78,101.66,40.95,22.27；LC/MS(M+H+):415.11；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd for C23H23N6O2:415.1882[M+H+],Found415.1872.3-(3-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)脲基)-N-异丙基苯甲酰胺(7a)：68％yield in3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.86(s,br,1H),8.82(s,1H),8.69(s,1H),8.18-8.16(m,1H),7.96-7.93(m,1H),7.84-7.79(m,1H),7.78-7.74(m,1H),7.72-7.68(m,1H),7.65-7.60(m,1H),7.53-7.51(m,2H),7.45-7.41(m,3H),7.36-7.32(m,1H),4.08(q,J＝6.4Hz,1H),1.17(d,J＝6.4Hz,6H)；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd for C20H22N5O2:364.1773[M+H+],Found 364.1792.
N-异丙基-3-(3-(4-(吡啶-4-基)苯基)脲基)苯甲酰胺(7b)：65％yield in3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 9.12(s,1H),9.04(s,1H),8.78(d,J＝5.6Hz,2H),8.19-8.17(m,1H),8.12(d,J＝5.6Hz,2H),7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.89-7.88(m,1H),7.70(d,J＝8.8Hz,2H),7.64-7.61(m,1H),7.46-7.44(m,1H),7.38-7.34(m,1H),4.08(q,J＝6.4Hz,1H),1.17(d,J＝6.4Hz,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 165.46,152.57,152.35,144.23,142.99,139.46,135.77,128.52,128.49,127.52,121.84,120.82,120.68,118.42,117.74,40.94,22.28；LC/MS(M+H+):375.14.
3-(3-(4-(2-氨基嘧啶-4-基)苯基)脲基)-N-异丙基苯甲酰胺(7c)：52％yield in4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 9.43(s,br,2H),8.92-8.80(m,1H),8.32-8.17(m,1H),8.24-8.17(m,1H),8.12-8.10(m,2H),7.90(s,1H),7.66-7.61(m,3H),7.45-7.34(m,3H),7.28(s,1H),4.09(q,J＝6.8Hz,1H),1.16(d,J＝6.8Hz,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o166.79,165.51,159.06,152.36,152.00,143.87,139.51,135.78,128.67,128.46,128.19,120.74,120.66,117.72,117.64,105.05,40.93,22.27；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcdfor C21H23N5O2:391.1882[M+H+],Found 391.1889.
N-异丙基-4-[3-[4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-苯基]-脲基]-苯甲酰胺(7d)：40％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.26(s,br,1H),9.08(s,1H),8.97(s,1H),8.80(s,1H),8.25-8.14(m,3H),8.12(d,J＝8.8Hz,2H),7.87(s,1H),7.76(d,J＝8.8Hz,2H),7.46-6.36(m,2H),6.96-6.95(m,2H),4.08(m,1H),1.17(d,J＝6.4Hz,6H)；LC/MS(M+H+):414.15.
4-[3-[4-(7-乙基-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)-苯基]-脲基]-N-异丙基-苯甲酰胺(7e)：45％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.08(s,br,1H),9.42(s,1H),8.84-8.82(m,1H),8.76(s,1H),8.35-8.14(m,3H),8.12(d,J＝8.8Hz,2H),7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.69-7.59(m,1H),4.08(m,1H),3.35(q,J＝3.2Hz,2H),1.17(d,J＝6.4Hz,6H),1.07(t,J＝3.2Hz,3H)；LC/MS(M+H+):460.17.
N-异丙基-4-[3-[4-(9H-嘌呤-6-基)-苯基]-脲基]-苯甲酰胺(7f)：29％yield in4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 11.98.(s,br,1H),9.48(s,1H),8.81-8.79(m,1H),8.76(s,1H),8.35-8.14(m,3H),8.12(d,J＝8.8Hz,2H),7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.69-7.59(m,2H),6.95(s,1H),4.08(m,1H),1.17(d,J＝6.4Hz,6H)；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd forC22H22N7O2:416.1835[M+H+],Found 416.1849.
N-异丙基-3-(3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲基)苯甲酰胺(7g)：40％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.63(s,1H),9.21(s,1H),9.10(s,1H),8.92(s,1H),8.19-8.18(m,1H),7.89(s,1H),7.74-7.68(m,4H),7.65-7.61(m,2H),7.46-7.44(m,1H),7.39-7.35(m,1H),4.10(q,J＝6.4Hz,1H),2.10(s,3H),1.17(d,J＝6.4Hz,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o165.52,159.07,158.74,153.86,152.50,152.09,145.81,142.76,139.59,135.78,130.90,128.46,125.16,120.78,117.71,117.44,114.54,111.64,40.94,22.27,12.51；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd for C24H25N6O2:429.2039[M+H+],Found 429.2029.
N-异丙基-3-(3-(4-(6-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲基)苯甲酰胺(7h)：35％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.22(s,br,1H),9.07(s,1H),8.96(s,1H),8.74(s,1H),8.20-8.18(m,1H),8.14-8.12(m,2H),7.88(s,1H),7.70-7.68(m,2H),7.66-7.61(m,1H),7.46-7.44(m,1H),7.38-7.34(m,1H),6.69(s,1H),4.10(q,J＝6.8Hz,1H),1.17(d,J＝6.8Hz,6H)；LC/MS(M+H+):429.17.
3-(3-(4-(5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲基)-N-异丙基苯甲酰胺(7i)：32％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 9.04(s,1H),8.99(s,1H),8.74-8.73(m,1H),8.19-8.17(m,1H),7.87(s,1H),7.68-7.61(m,5H),7.46-7.44(m,1H),7.38-7.34(m,1H),4.11(q,J＝6.8Hz,1H),1.97(s,3H),1.17(d,J＝6.8Hz,6H)；LC/MS(M+H+):443.16.
3-(3-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲基)-N-异丙基苯甲酰胺(7l))：46％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o12.3(s,br,1H),9.73(s,1H),9.60(s,1H),8.84(s,1H),8.45(s,1H),8.34-8.32(m,1H),8.20-8.18(m,1H),7.90(s,1H),7.71-7.70(m,1H),7.51(s,1H),7.48-7.47(m,1H),7.40-7.33(m,2H),4.51(t,J＝4.6Hz,2H),4.10(q,J＝6.4Hz,1H),3.63(t,J＝4.6Hz,2H),2.94(s,6H),2.12(s,3H),1.17(d,J＝6.4Hz,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 165.44,158.91,158.58,154.45,152.33,152.23,146.68,145.76,139.52,135.78,131.26,128.52,127.95,123.80,120.68,118.34,117.72,114.64,113.18,111.10,62.96,55.44,42.65,40.94,22.26,12.78；LC/MS(M+H+):516.13.
N-异丙基-3-(3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯基)脲基)-苯甲酰胺(7j)：47％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.19(s,br,1H),9.71(s,1H),8.83(s,1H),8.33-8.26(m,2H),8.21-8.19(m,1H),8.01-8.00(m,2H),7.85(s,1H),7.70-7.68(m,1H),7.48-7.46(m,2H),7.41-7.37(m,1H),4.10(q,J＝6.8Hz,1H),2.09(s,3H),1.16(d,J＝6.8Hz,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 165.37,155.31,152.57,152.17,149.46,139.24,137.50,135.83,134.08,131.87,128.70,127.18,126.48,125.15,124.24,122.44,120.96,120.58,117.53,114.95,108.93,40.93,22.27,12.81；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C25H24F3N6O2:497.1913[M+H+],Found 497.1902.
3-(3-(2-氟-4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲基)-N-异丙基苯甲酰胺(7k)：42％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.20(s,br,1H),9.46(s,1H),8.89(s,1H),8.81(s,1H),8.52-8.49(m,1H),8.25-8.19(m,1H),7.88-7.84(m,1H),7.68-7.64(m,2H),7.52-7.48(m,3H),7.42-7.39(m,1H),4.10(q,J＝6.8Hz,1H),2.10(s,3H),1.17(d,J＝6.8Hz,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 165.44,154.88,152.40,152.10,149.96,148.37,139.27,135.83,129.21,128.61,126.88,126.43,120.84,120.56,119.50,117.45,116.19,115.99,114.82,109.82,40.95,22.26,12.75；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcdfor C24H24FN6O2:447.1945[M+H+],Found 447.1934.
1-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-苯基脲(10a)：62％yieldin 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.56(s,br,1H),9.18(s,1H),8.94-8.90(m,2H),7.78-7.67(m,4H),7.62-7.58(m,1H),7.50-7.48(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.01-6.98(m,1H),2.10(s,3H)；HRMS,Calcd for C20H18N5O:344.1511[M+H+],Found 344.1526.
1-(3-氟苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(10b)：51％yield in 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.55(s,br,1H),9.17-9.12(m,2H),8.88(s,1H),7.69-7.68(m,4H),7.60-7.50(m,2H),7.36-7.31(m,1H),7.18-7.16(m,1H),6.84-6.79(m,1H),2.10(s,3H)；LC/MS(M+H+):362.11.
1-(2-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(10c)：60％yield in 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.49(s,1H),9.66(s,1H),8.88(s,1H),8.35(s,1H),8.16-8.14(m,1H),7.69-7.68(m,4H),7.56(s,1H),7.06-7.03(m,1H),7.00-6.98(m,1H),6.96-6.89(m,1H),3.90(s,3H),2.10(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o154.87,152.24,152.18,147.80,146.90,142.24,130.81,128.35,127.60,126.70,122.12,120.52,118.45,117.12,114.61,110.93,110.77,55.75,12.66；LC/MS(M+H+):374.09.
1-(3-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(10d)：57％yield in 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.61(s,br,1H),9.14(s,1H),8.93-8.91(m,2H),7.72-7.67(m,4H),7.60(s,1H),7.23-7.18(m,2H),6.98-6.96(m,1H),6.59-6.57(m,1H),3.74(s,3H),2.10(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 159.64,153.71,152.42,152.07,145.64,142.89,140.85,130.91,129.49,128.52,124.83,117.37,114.51,111.75,110.63,107.32,104.13,54.88,12.50；LC/MS(M+H+):374.09.
1-(4-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(10e)：45％yield in 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 11.89(s,br,1H),8.86(s,1H),8.71(s,1H),8.60(s,1H),7.61-7.60(m,4H),7.38(d,J＝8.8Hz,2H),7.35(s,1H),6.88(d,J＝8.8Hz,2H),3.73(s,3H),2.10(s,3H)；LC/MS(M+H+):374.14；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcdfor C21H20N5O2:374.1617[M+H+],Found 374.1608.
1-[4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-苯基]-3-噻唑-2-基-脲(10f)：40％yield in 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 11.95(s,br,1H),8.76(s,1H),8.71(s,1H),8.60(s,1H),7.71-7.68(m,4H),7.53-7.48(m,1H),6.99-6.97(m,1H),6.58-6.56(m,1H),2.10(s,3H)；LC/MS(M+H+):351.14.
1-[4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-苯基]-3-吡啶-2-基-脲(10g):48％yield in 3steps.LC/MS(M+H+):345.12.
3-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-1-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(14a)：55％yield in 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.40(s,br,1H),8.87(s,1H),8.40(s,1H),7.73(d,J＝8.8Hz,2H),7.55-7.54(m,1H),7.52(d,J＝8.8Hz,2H),7.36(d,J＝6.8Hz,2H),6.85(d,J＝6.8Hz,2H),3.38(s,3H),3.17(s,3H),2.11(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 159.21,154.89,152.28,147.29,146.42,134.02,132.78,130.47,127.57,127.29,124.54,122.05,114.80,113.53,110.66,55.12,37.10,12.67；LC/MS(M+H+):388.18；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd for C22H22N5O2:388.1773[M+H+],Found 388.1764.
3-(4-甲氧基苯基)-1-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)尿素(14b)：18％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 9.59(s,br,1H),8.79(s,1H),8.12(s,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.43(s,1H),7.32(d,J＝6.8Hz,2H),6.82(d,J＝6.8Hz,2H),4.08-4.04(m,2H),3.70(s,3H),3.65-3.64(m,2H),3.37-3.32(m,2H),3.12-3.06(m,2H),2.14(s,3H),2.04-2.02(m,2H),1.90-1.86(m,2H)；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C27H31N6O2:471.2508[M+H+],Found471.2516.3-(4-甲氧基苯基)-1-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-1-(2-(哌啶-1-基)乙基)尿素(14c)：19％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.02(s,br,1H),8.77(s,1H),8.15(s,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(s,1H),7.31(d,J＝8.8Hz,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,2H),4.09-4.06(m,2H),3.70(s,3H),3.56-3.54(m,2H),3.28-3.24(m,2H),2.97-2.91(m,2H),2.14(s,3H),1.85-1.81(m,2H),1.68-1.62(m,4H)；LC/MS(M+H+):485.15.
3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-1-苯基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)脲(18a))：46％yield in 4steps.1H NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.04(s,br,1H),9.57(s,1H),8.74(s,1H),8.20(s,1H),7.63-7.55(m,4H),7.53-7.51(m,2H),7.48-7.46(m,1H),7.42-7.39(m,2H),4.04-4.00(m,2H),3.68-3.65(m,2H),3.31-3.29(m,2H),3.08-3.07(m,2H),2.04-2.02(m,5H),1.90-1.87(m,2H)；LC/MS(M+H+):441.00.
1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-1-苯基脲(18b)：From commecially available 2-phenylamino-ethanol,18b was synthesized in62％yield through 3steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 8.83-8.81(m,1H),8.40(s,1H),7.64-7.58(m,4H),7.47-7.43(m,3H),7.39-7.37(m,2H),7.32-7.29(m,1H),3.76(t,J＝6.4Hz,2H),3.56(t,J＝6.4Hz,2H),2.06(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 154.43,152.14,146.62,142.62,130.30,129.37,129.09,127.78,127.66,127.59,126.52,119.18,118.67,114.56,111.08,58.79,52.24,12.61；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C22H22N5O2:388.1773[M+H+],Found388.1764.
1-(2-氟苯基)-1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18c)：49％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.59(s,br,1H),8.89(s,1H),8.75(s,1H),7.66-7.54(m,4H),7.52-7.50(m,1H),7.42-7.40(m,1H),7.39-7.37(m,1H),7.34-7.26(m,2H),3.72(t,J＝6.4Hz,2H),3.57(t,J＝6.4Hz,2H),2.07(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 159.17,158.37,156.71,154.39,153.62,152.07,145.55,143.00,130.74,130.49,129.81,128.64,125.11,119.20,116.55,114.51,111.76,58.92,51.98,12.47；LC/MS(M+H+):406.07.
1-(3-氟苯基)-1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18d)：45％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.54(s,br,1H),8.88(s,1H),8.66(s,1H),7.68-7.62(m,4H),7.57(s,1H),7.48-7.43(m,1H),7.32-7.29(m,1H),7.23-7.21(m,1H),7.15-7.10(m,1H),3.79(t,J＝6.0Hz,2H),3.58(t,J＝6.0Hz,2H),2.07(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 163.53,161.11,154.21,152.14,146.34,144.40,142.65,130.67,130.58,130.36,128.04,123.44,118.83,114.75,114.52,112.97,111.26,58.81,52.25,12.58；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd for C22H21FN5O2:406.1679[M+H+]Found406.1686.
1-(4-氟苯基)-1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18e)：41％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.51(s,br,1H),8.86(s,1H),8.37(s,1H),7.66-7.62(m,4H),7.60(s,1H),7.44-7.41(m,2H),7.29-7.25(m,2H),3.73(t,J＝6.0Hz,2H),3.55(t,J＝6.0Hz,2H),2.06(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o161.76,159.34,154.39,152.13,146.35,142.72,138.65,130.30,130.14,128.01,118.83,116.20,115.98,114.55,111.24,58.70,52.33,12.57；LC/MS(M+H+):406.06；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C22H21FN5O2:406.1679[M+H+],Found 406.1670.
1-(2-氯苯基)-1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18f)：40％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.70(s,br,1H),8.92(s,1H),8.72(s,1H),7.69-7.63(m,5H),7.53-7.52(m,1H),7.47-7.43(m,1H),7.36-7.33(m,1H),3.78(t,J＝6.0Hz,2H),3.57(t,J＝6.0Hz,2H),2.07(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o158.42,158.07,154.22,152.08,145.63,144.25,142.95,133.22,130.69,130.46,128.58,127.53,126.23,126.19,118.86,114.51,111.70,58.82,52.31,12.49；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C22H21ClN5O2:422.1384[M+H+],Found 422.1369.
1-(3-氯苯基)-1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18g)：45％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 8.85(s,1H),7.64-7.58(m,5H),7.57-7.56(m,1H),7.52(s,1H),7.47-7.45(m,1H),7.44-7.39(m,2H),3.58(t,J＝6.0Hz,2H),3.42(t,J＝6.0Hz,2H),2.06(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 158.28,157.95,154.22,152.12,146.21,142.75,139.25,132.59,131.76,130.35,130.24,129.21,128.36,128.15,118.99,114.53,111.33,58.79,51.67,12.58；LC/MS(M+H+):422.06.
1-(4-氯苯基)-1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18h)：48％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.49(s,br,1H),8.87(s,1H),8.56(s,1H),7.66-7.60(m,4H),7.55(s,1H),7.50-7.47(m,2H),7.43-7.40(m,2H),3.75(t,J＝6.0Hz,2H),3.56(t,J＝6.0Hz,2H),2.06(s,3H)；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcdfor C22H21ClN5O2:422.1384[M+H+],Found 422.1375.
1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-1-邻甲苯基脲(18i)：45％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.56(s,br,1H),8.88(s,1H),8.18(s,1H),7.65-7.58(m,5H),7.36-7.29(m,4H),3.74(t,J＝6.0Hz,2H),3.58(t,J＝6.0Hz,2H),2.22(s,3H),2.06(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 158.40,158.06,154.37,153.84,152.08,145.75,143.02,136.21,131.13,130.43,129.30,128.47,127.64,127.09,118.82,114.50,111.62,58.82,51.71,17.31,12.51；LC/MS(M+H+):402.09.
1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-1-间-甲苯基脲(18j)：43％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.70(s,br,1H),8.92(s,1H),8.40(s,1H),7.68-7.61(m,5H),7.35-7.31(m,1H),7.21(s,1H),7.16-7.12(m,2H),3.74(t,J＝6.4Hz,2H),3.53(t,J＝6.4Hz,2H),2.35(s,3H),2.07(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o158.11,154.38,153.97,152.09,145.87,142.96,142.34,138.77,130.42,129.16,128.37,128.20,127.32,124.73,118.69,114.50,111.55,58.75,52.20,20.95,12.53；LC/MS(M+H+):402.06.
1-(2-羟乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-1-对甲苯基脲(18k)：39％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.60(s,br,1H),8.89(s,1H),8.28(s,1H),7.66-7.62(m,4H),7.60-7.58(m,1H),7.26-7.25(m,4H),3.72(t,J＝6.0Hz,2H),3.54(t,J＝6.0Hz,2H),2.34(s,3H),2.07(s,3H)；LC/MS(M+H+):402.09；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd for C23H24N5O2:402.1930[M+H+],Found 402.1920.
1-(2-羟乙基)-1-(2-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18l)：47％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 8.83(s,1H),7.59-7.58(m,5H),7.49-7.48(m,1H),7.38-7.32(m,2H),7.16-7.14(m,1H),7.04-7.00(m,1H),3.80(s,3H),3.62-3.51(m,4H),2.06(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 158.30,155.25,154.72,154.23,152.10,146.10,143.02,130.49,130.32,130.01,128.97,128.16,120.86,118.67,114.51,112.74,111.39,58.74,55.67,51.22,12.54；LC/MS(M+H+):418.07.
1-(2-羟乙基)-1-(3-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18m)：46％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.50(s,br,1H),8.86(s,1H),8.39(s,1H),7.66-7.60(m,4H),7.55(s,1H),7.36-7.32(m,1H),6.98-6.97(m,1H),6.93-6.88(m,2H),3.78(s,3H),3.75(t,J＝6.0Hz,2H),3.56(t,J＝6.0Hz,2H),2.07(s,3H)；13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)o 159.95,158.32,158.10,154.26,152.11,146.22,143.55,142.78,130.36,130.05,128.11,119.77,118.71,114.53,113.57,112.22,111.33,58.75,55.18,52.19,12.57；LC/MS(M+H+):418.05.
1-(2-羟乙基)-1-(4-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18n)：48％yield in 5steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.56(s,br,1H),8.88(s,1H),8.13(s,1H),7.66-7.59(m,5H),7.30(d,J＝6.8Hz,2H),7.01(d,J＝6.8Hz,2H),3.80(s,3H),3.69(t,J＝6.4Hz,2H),3.53(t,J＝6.4Hz,2H),2.06(s,3H)；HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C23H24N5O3:418.1879[M+H+],Found 418.1686.
1-(2-氨基乙基)-1-(4-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18o)：52％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.64(s,1H),8.86(s,1H),8.35(s,1H),7.82(s,2H),7.59(dt,J＝13.0,6.5Hz,5H),7.53–7.43(m,4H),3.85(t,J＝6.2Hz,2H),2.93–2.82(m,2H),2.00(dd,J＝8.4,2.5Hz,3H).LC/MS(M+H+):415.11.
1-(2-氨基乙基)-1-(4-氯苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18p)。45％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.60(s,1H),8.89(s,1H),8.06(s,1H),7.87(s,2H),7.69(d,J＝8.8Hz,2H),7.62(d,J＝8.8Hz,2H),7.58(s,1H),7.45–7.39(m,2H),7.10–7.04(m,2H),3.87(t,J＝6.2Hz,2H),3.81(d,J＝9.0Hz,3H),2.99–2.88(m,2H),2.06(d,J＝0.9Hz,3H).HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C22H22ClN5O:421.1544[M+H+],Found 421.1563.
1-(2-(二甲基氨基)乙基)-1-(4-甲氧基苯基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18q))。50％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.55(s,1H),9.42(s,1H),8.88(s,1H),8.10(s,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,2H),7.62(d,J＝8.8Hz,2H),7.57(s,1H),7.45–7.38(m,2H),7.11–7.03(m,2H),3.98(t,J＝6.2Hz,2H),3.82(s,3H),3.20(d,J＝5.2Hz,2H),2.88(t,J＝8.5Hz,6H),2.05(d,J＝0.9Hz,3H).LC/MS(ESI-Orbitrap),Found 445.21.
1-(4-氯苯基)-1-(2-(二甲基氨基)乙基)-3-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)脲(18r))。65％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.70(s,1H),9.52(s,1H),8.93(s,1H),8.48(s,0H),7.67(dd,J＝23.4,8.8Hz,4H),7.62–7.49(m,5H),4.04(t,J＝6.2Hz,2H),3.21(d,J＝4.7Hz,2H),2.89(d,J＝3.5Hz,6H),2.06(d,J＝0.7Hz,3H).LC/MS(ESI-Orbitrap),Found 449.21.
1-(4-氯苯基)-3-(4-(5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-氟苯基)-1-(2-羟乙基)脲(18S)。52％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.67(s,1H),8.84(s,1H),8.54(s,1H),7.93(t,J＝8.3Hz,1H),7.58(dd,J＝11.4,1.9Hz,2H),7.54–7.40(m,4H),3.80–3.76(m,4H),2.40(d,J＝10.5Hz,3H),1.93(s,3H).HRMS(ESI-Orbitrap)Calcdfor C23H21ClFN5O2:454.1446[M+H+],Found 454.1434.
1-(2-氨基-乙基)-1-(4-氯-苯基)-3-[4-(5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-氟-苯基]-脲(18t)：52％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.30(s,1H),8.76(s,1H),7.85(d,J＝9.0Hz,3H),7.80(d,J＝8.6Hz,2H),7.63–7.56(m,4H),7.51(dd,J＝11.4,1.8Hz,1H),7.45(dd,J＝8.3,1.7Hz,1H),3.91(t,J＝6.3Hz,2H),3.10(qd,J＝7.3,4.8Hz,3H),2.95(dd,J＝11.9,6.0Hz,2H),2.37(s,3H),1.92(d,J＝4.5Hz,3H),1.18(t,J＝7.3Hz,4H).LC/MS(M+H+):453.14.
1-(4-氯苯基)-3-(4-(5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-氟苯基)-1-(2-(二甲氨基))乙基)尿素(18w)。54％yield in 4steps.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.38(s,1H),9.33(s,1H),8.76(s,1H),7.86(s,1H),7.78(t,J＝8.2Hz,1H),7.66–7.57(m,2H),7.57–7.42(m,3H),4.02(t,J＝6.3Hz,2H),3.21(s,2H),2.86(s,6H),2.36(s,3H),1.91(s,3H).HRMS(ESI-Orbitrap),Calcd for C25H26ClFN6O:481.1919[M+H+],Found 481.1909.
1-(4-氯苯基)-3-(4-(5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)脲(18X)。50％yield in 4steps.1H-NMR(400MHz,DMSO)o 12.63(s,1H),8.83(s,1H),8.54(s,1H),7.86(t,J＝8.2Hz,1H),7.68–7.29(m,6H),3.94–3.84(m,4H),3.66(s,3H),2.39(s,3H),1.93(s,3H).LC/MS(ESI-Orbitrap),Found 468.14.
R10015的合成-除非另有说明，否则使用市售试剂和无水溶剂而无需进一步纯化。用预涂硅胶60F254进行薄层色谱(TLC)分析。使用的Finnigan LCQAdvantage MAX光谱仪通过LC/MS记录质谱。通过用EtOAc/己烷或MeOH/DCM作为洗脱液，在预填充的硅胶柱(230-400目，40-63μm)上进行快速色谱。制备型HPLC在SunFire C18OBD10μm(30×250mm)上进行，用CH 3CN+50％MeOH/H 2O+0.1％TFA作为洗脱剂，以纯化目标化合物。使用CH3CN(溶剂B)/H2O+0.9％CH3CN+0.1％TFA(溶剂A)作为洗脱液，在Agilent技术1200系列上进行分析型HPLC，并且在215-310nm的检测范围内通过UV检测目标产物。在室温下用Bruker 400MHz光谱仪记录NMR光谱，残留溶剂峰为内标。多重峰的线位置以ppm(o)给出，偶合常数(J)以赫兹给出。用Thermo Finnigan orbitrap质量分析仪进行高分辨率质谱(HRMS，电喷雾电离)实验。以m/z 400在100000的分辨率下以正离子模式获得数据。在分析之前立即用外部校准混合物进行校准。
一般合成程序-下面描述的方案和合成程序用于抑制剂R10015。表9中列出的其他LIMK抑制剂的合成遵循类似的方案。
方案5：R10015的合成
将EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)(1.2当量)加入到搅拌的1(1当量)，2(1.05当量)，HOBt(1-羟基苯并三唑)(1当量)的混合物中，并且DIEA(二异丙基乙胺)(3当量)在DMF(二甲基甲酰胺)中的溶液。在室温下继续搅拌过夜，其中LC-MS显示完全反应。真空除去溶剂，得到残余物，将其悬浮在EtOAc(乙酸乙酯)中。将悬浮液用盐水和饱和NaHCO 3洗涤，用无水Na 2SO 4干燥，并在减压下蒸发，得到粗酰胺产物3和4的混合物。无需进一步纯化，将该混合物悬浮在乙酸中，并在70℃下加热。环闭合4小时，得到Boc保护的4-基-哌啶子基苯并咪唑，通过快速色谱法纯化。然后通过30％TFA的DCM溶液除去Boc保护，得到5作为油状物。最后，将5和4,5-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶在少量异丙醇中的混合物在130℃下在微波条件下加热3小时，得到Limk抑制剂R10015，通过反相HPLC纯化，基于分析型HPLC分析(254nm的UV检测)，得到>95％的纯度。
2-(1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-1H-偶氮[d]咪唑-5-羧酸甲酯(R10015)：25％yield in 4steps after HPLC purification.1H NMR(DMSO-d6,400MHz)o 12.39(br,1H),8.34(s,1H),8.28(s,1H),8.27(dd,J＝1.2,8.4Hz,1H),7.87(d,J＝8.8Hz,1H),7.59(d,J＝2.4Hz,1H),4.31-4.47(m,2H),3.91(s,3H),3.51–3.58(m,1H),3.29(t,J＝12.0Hz,2H),2.25–2.34(m,2H),2.11–2.18(m,2H)；Analytical HPLC purity:single peak observed at UV＝254nm；HRMS(ESI-Orbitrap)Calcd for C20H20ClN6O2:411.1336[M+H+],Found 411.1328.
R10015对接研究：
使用LigPrep(Schrodinger，LLC，NY)制备抑制剂R10015用于滑动对接。使用Maestro V 9.8(Schrodinger，LLC，NY)中的蛋白质制备向导，通过除去水分子和结合的配体，并加入氢原子，制备PDB ID 3S95的链A.在原始配体周围产生对接网格，盒子尺寸为18×18×18 3。对接没有任何限制地进行。使用Prime(Schrodinger，LLC，NY)将最高得分的对接姿势合并至蛋白质以进行能量最小化。
LIMK1生化检测:
所有抑制剂的生物化学LIMK1测定在Reaction Biology Corporation(http://www.reactionbiology.com)中进行，并遵循其网站上描述的方案。化合物以10剂量IC50模式进行测试，其中3倍系列稀释从10μM开始。对照化合物Staurosporine以10剂量IC50模式进行测试，其中3倍连续稀释从10μM开始。反应在10μMATP，1μM底物辅因子和50nM Limk1(终浓度)下进行。LIMK1激酶特定信息：Genbank登录号NP_002305；通过ROCK1的共表达激活重组催化结构域(氨基酸285-638，His标记，从昆虫细胞中纯化)。试剂：碱反应缓冲液；20mMHepes(pH 7.5)，10mM MgCl 2,1mM EGTA，0.02％Brij35,0.02mg/ml BSA，0.1mM Na 3VO 4,2mM DTT，1％DMSO。没有向反应混合物中加入额外的辅助因子。反应程序：(a)在新制备的碱反应缓冲液中制备指定的底物；(b)向上述基质溶液中提供任何所需的辅助因子；(c)将指定的激酶递送到底物溶液中并轻轻混合；(d)将化合物在DMSO中递送到激酶反应混合物中；(e)将33P-ATP(最终的比活度0.01μCi/μl)送入反应混合物中以引发反应；(f)孵育激酶反应120分钟。在室温下；(g)将反应物点在P81离子交换纸上(Whatman#3698-915)；(h)在0.1％磷酸中彻底清洗过滤器。
从外周血中分离出静息的CD4T细胞：
涉及人类受试者的所有方案均由乔治梅森大学机构审查委员会审查和批准。如前所述，通过两轮阴性选择从HIV-1阴性供体的外周血中纯化静息的CD4T细胞。简而言之，对于第一轮耗尽，我们使用针对人CD14，CD56和HLA-DR，DP和DQ(BD Biosciences)的单克隆抗体。对于第二轮耗尽，我们使用针对人CD8，CD11b和CD19(BD Biosciences)的单克隆抗体。通过使用Dynabeads Pan Mouse IgG(Invitrogen)耗尽抗体结合的细胞。对于记忆和幼稚CD4T细胞亚群的进一步阴性选择，在第二轮耗尽期间添加针对CD45RA(0.02μl/百万细胞)或CD45RO(0.1μl/百万细胞)(BD Biosciences)的单克隆抗体。纯化的细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清(Invitrogen)，青霉素(50U/ml)(Invitrogen)和链霉素(50μg/ml)(Invitrogen)的RPMI 1640培养基中培养。在感染或治疗前将细胞静置过夜。
病毒和病毒感染:
通过如所述克隆的原病毒DNA转染HeLa或HEK293T细胞来制备HIV-1(NL4-3)和HIV-1(AD8)的病毒原种。如前所述制备HIV-1(VSVG)。使用内部ELISA试剂盒，用ELISA一式三份测量病毒上清液中p24的水平。在Rev依赖性GFP和荧光素酶指示细胞Rev-CEM-GFP-Luc上测定病毒滴度(TCID50)。对于Rev-CEM-GFP-Luc的HIV感染，用100μM的LIMK抑制剂处理2×105个细胞1小时，然后加入LIMK抑制剂用103-104.5TCID50单位的HIV-1感染3小时。保持药物浓度。将感染的细胞洗涤两次，然后重悬于1ml新鲜培养基中，不添加抑制剂。将细胞温育2天，并通过流式细胞术(FACSCalibur，BD Biosciences)测量GFP阳性细胞的病毒感染。为了排除药物细胞毒性，在流式细胞术之前将碘化丙啶(PI)(2μg/ml，Fluka)添加到细胞悬浮液中，并且仅使用活细胞(PI阴性)来测量GFP表达。对于荧光素酶测定，将细胞重悬于100μl荧光素酶测定缓冲液(Promega)中，并使用GloMax-Multi Detection System(Promega)测量。对于静息CD4+T细胞的病毒感染，除非另有说明，用LIMK抑制剂处理106个细胞1小时。103.5至104.5TCID50单位的HIV-1用于感染106细胞。在感染期间，加入LIMK抑制剂以维持药物浓度。将细胞洗涤一次，然后重悬浮于新鲜培养基(每毫升106个细胞)中，并在没有刺激的情况下孵育5天。用抗CD3/CD28磁珠以每个细胞4个珠子活化细胞。在刺激后每两天或每天服用培养物上清液(100μl)。离心除去细胞，保存上清液用于p24ELISA。对于HSV-1感染，病毒在Vero细胞上繁殖。简言之，用HSV-1(MOI，0.001)感染细胞直至100％的细胞显示出细胞病变效应(CPE)。通过在4℃以2,000rpm离心5分钟收获具有HSV-1的细胞上清液，通过0.45μm过滤器过滤，然后在-80℃下储存。对于HSV-1感染，将Vero细胞接种在10cm培养皿中并培养过夜。将SR10015或DMSO加入细胞中2小时。用199V培养基连续稀释HSV-1，并加入细胞中感染2小时。洗涤细胞并在含有7.5μg/ml合并的人免疫球蛋白的新鲜培养基(DMEM加5％NBCS，Invitrogen)中培养。通过在含磷的磷酸盐缓冲盐水中漂洗两次来染色病毒噬斑。用甲醇固定细胞，并用KaryoMax Giemsa Stain溶液(Gibco)染色。对于VEEV-Luc(TC83)，VEEV(TC83)(BSL-2株)，VEEV(TrD)(BSL-3株)或RVFV-Luc(MP12)的感染，用R10015或DMSO预处理Vero细胞，感染病毒的MOI为0.1，后用R10015进行后处理。感染后24小时收集病毒上清液，并通过噬斑测定法分析。或者对于表达荧光素酶的病毒，在表达后24小时评估荧光素酶活性，并将DMSO处理的样品设定为100％。对于EBOV(Zaire)感染，将HFF-1细胞用R10015预处理2小时，并用EBOV(Zaire)(MOI，0.5)感染。感染后48小时终止感染，用福尔马林溶液固定细胞。通过用初级小鼠抗体和次级Alex488-标记的抗小鼠IgG抗体免疫染色EBOV GP蛋白来鉴定感染的细胞。细胞也用Hoechst(Invitrogen)染色，用于细胞核和细胞膜细胞质染色(Invitrogen)细胞质。每孔的细胞核数用于确定细胞活力。图像由PE Opera共聚焦平台以10x物镜拍摄，并使用Acapella和GeneData软件进行分析。
用于去掉LIMK，cofilin和PAK1/2的Western印迹:
在NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)中裂解一百万个细胞，通过SDS-PAGE分离，然后转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen)上。将膜在TBST中洗涤3分钟，然后在室温下用起始封闭缓冲液(Pierce)封闭30分钟。为了用不同抗体探测，将印迹与兔抗LIMK1抗体(Cell Signaling)，兔抗p-coflin抗体(Cell Signaling)或小鼠抗PAK1/2抗体(CellSignaling)一起孵育。将这些抗体在2.5％牛奶/TBST中稀释，并在4℃下摇动过夜。将印迹洗涤三次，持续15分钟，然后与抗兔或抗小鼠辣根过氧化物酶偶联的二抗(KPL)(1：5000)一起孵育1小时，然后用SuperSignal West Femto最大灵敏度底物(Pierce)进行显色。。对于上样对照，也剥离相同的印迹并用针对GAPDH(Abcam)的抗体(1：1000)重新探测。使用CCD相机(FluorChem 9900成像系统)(Alpha Innotech)拍摄图像
CD4和CXCR4的表面染色：
用FITC标记的针对人CD4的单克隆抗体(克隆PRA-T4)或CXCR4(克隆12G5)(BDBiosciences)染色细胞。将细胞在冰上在PBS+0.1％BSA中染色30分钟，用冷PBS-0.5％BSA洗涤，然后在FACSCalibur(BD Biosciences)上分析。
定量实时PCR:
使用Bio-Rad iQ5实时PCR检测系统定量HIV病毒DNA，使用正向引物5'LTR-U5，反向引物3'gag和探针FAM-U5/gag。使用预合格的全长原病毒质粒pNL4-3作为DNA标准。如前所述测量病毒DNA和2-LTR环。为了测量2-LTR-圆，用引物和探针MH536，MH535和MH603通过实时PCR扩增DNA。
趋化性测定：
将50万个Jurkat T细胞重悬于100μlRPMI-1640培养基中，然后加入24孔transwell板(Corning)的上室中。在下室中填充600μl与SDF-1(40ng/ml)预混合的培养基。将板在37℃下温育2小时，然后取出上室，计数下室中的细胞。在指出的情况下，在测定之前将不同浓度的R10015与DMSO对照一起加入培养上清液中。
FITC-鬼笔环肽染色F-肌动蛋白和流式细胞仪：
使用鬼笔环肽-FITC(Sigma)进行F-肌动蛋白染色如前所述进行。简而言之，每个染色使用1×10 6个细胞进行。将细胞沉淀，固定，并用CytoPerm/Cytofix缓冲液(BDBiosciences)在室温下透化20分钟，并用冷Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences)洗涤两次，然后用5μl0.3mMFITC标记的鬼笔环肽染色。(Sigma)在黑暗中冰上30分钟。用冷Perm/洗涤缓冲液洗涤细胞两次，然后重悬于1％多聚甲醛中，并在FACSCalibur(BD Biosciences)上分析。
病毒进入分析：
如前所述进行基于BlaM-Vpr的病毒进入测定。我们还使用了如所述的基于Nef-荧光素酶的进入测定法。简言之，将细胞(1×106)用100μML10015处理1小时，然后用相同的R10015浓度在37℃下用200ng含Nef-荧光素酶的病毒感染3小时，然后用培养基洗涤三次。将细胞重悬于100μl荧光素酶测定缓冲液(Promega)中，并使用GloMax-Multi DetectionSystem(Promega)在活细胞中测量荧光素酶活性。
CD25和CD69的表面染色：
将50万个静息CD4T细胞培养5天，并用抗CD3/CD28珠子(每个细胞4个珠子)刺激24小时。细胞用PE标记的针对人CD25(克隆RpA-T4)或CD69(克隆12G5)的单克隆抗体(BDBiosciences)染色。将细胞在冰上在PBS+0.1％BSA中染色30分钟，用冷PBS-0.5％BSA洗涤，然后在FACSCalibur(BD Biosciences)上分析。
将Limk抑制剂对接到Limk1的晶体结构中：
使用LigPrep(Schrodinger，LLC，NY)制备抑制剂18b用于滑动对接。使用MaestroV 9.8(Schrodinger，LLC，NY)中的蛋白质制备向导，通过除去水分子和结合的配体，并加入氢原子，制备PDB ID 3S95的链A.在原始配体周围产生对接网格，盒子尺寸为对接没有任何限制地进行。使用Prime(Schrodinger，LLC，NY)将最高得分的对接姿势合并至蛋白质以进行能量最小化。
Limk1生化分析和激酶分析：
所有Limk抑制剂和激酶分析的生化测定在Reaction Biology Corporation中进行，并遵循其网站上描述的方案。化合物以10-剂量IC50模式进行测试，其中3倍系列稀释从10μM开始用于IC50测量。在1μM下测试化合物，在分析测定中进行重复实验。对照化合物Staurosporine以10剂量IC50模式进行测试，其中3倍连续稀释从10μM开始。反应在10μMATP，1μM底物辅因子和50nM Limk1(终浓度)下进行。
A7r5细胞中的细胞内Western测定：
将A7r5(15,000细胞/孔)置于100μl10％FBS DMEM：F12培养基中的透明底PackardView黑色96孔板中，并使其附着过夜。第二天，将细胞在1％FBS DMEM培养基中血清饥饿2小时，然后用化合物处理1小时。然后将细胞在室温(RT)下在PBS中的4％多聚甲醛中固定20分钟，不摇动。然后用0.1M甘氨酸洗涤它们一次以中和多聚甲醛5分钟。将细胞用0.2％TritonX-100的PBS溶液在室温下在轨道振荡器上透化20分钟，然后用PBS洗涤一次5分钟。然后将它们与PBS中的Licor封闭缓冲液(在PBS中1：1稀释)一起孵育1-1.5小时，在室温下摇动。将细胞与第一抗体p-cofilin Ab(Cell Signaling#3311)在Licor封闭缓冲液中1：100稀释，在4℃温育过夜。第二天，在室温下在轨道振荡器上用PBS-0.1％Tween 20(PBST)洗涤溶液洗涤它们两次，每次5分钟，然后用含有0.05％Tween-20的Licor封闭缓冲液一次洗涤5分钟。振荡器在RT。然后将细胞与二抗山羊抗兔IR800(1：500稀释)在室温下在黑暗中(用箔覆盖平板)在含有Licor封闭缓冲液的吐温-20中孵育1小时。然后，在室温下用PBST洗涤细胞两次，每次5分钟，然后用含有0.05％Tween-20的Licor封闭缓冲液洗涤一次。然后将孔与ToPro 3染色(核酸染色)一起温育，在Licor封闭缓冲液中1：4000稀释或在室温下在黑暗中用0.05％Tween-20稀释Licor封闭缓冲液30分钟。最后，用PBS洗涤板两次，并使用OdysseyLICOR红外扫描仪进行分析。
PC-3细胞系中的Cofilin磷酸化细胞分析:
将PC3细胞以0.5×10 6个细胞/mL的密度在10％FBS RPMI1640培养基中的60mm培养皿中培养。然后，用DMSO和指定浓度的Limk抑制剂处理细胞。在温育24小时后，将细胞用冰冷的PBS冲洗两次，并通过在4℃以10,000rpm旋转5分钟收集。通过将细胞悬浮于SDS样品缓冲液，120mmol/L Tris，4％SDS，20％甘油，0.1mg/mL溴酚蓝和100mmol/L DTT(pH6.8)中来制备细胞裂解物。在短暂超声处理后，将裂解物在95℃加热5分钟。通过12％SDS-PAGE分离细胞裂解物并转移至Immobilon-P膜(Millipore Corp.)。使用对磷酸-Cofilin特异性的抗体(Cell Signaling，#3313)和-肌动蛋白(GeneScript，#A00702)抗体以及来自小鼠或兔(Amersham Biosciences)的完整免疫球蛋白的相应第二抗体进行免疫染色。使用PierceECL Western Blotting Substrate(Thermo Scientific)通过化学发光检测免疫反应蛋白。我们使用Multigauge ver 3.0软件(Fujifilm)量化蛋白质的实际水平。将凝胶用考马斯亮蓝R-250(0.25％)染色1小时，然后脱色(来自Bio-Rad的所有溶液)以检查凝胶上蛋白质样品的加载量。
Cof-SS T细胞系中的Cofilin磷酸化细胞测定：
将CEM-SS T细胞(1.0×10 6)用Limk抑制剂以10μM和1μM分别在37℃处理4小时。将细胞在NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)中裂解，然后超声处理。将样品在90℃加热10分钟，通过SDS-PAGE分离，然后转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen)上。将膜在TBST中洗涤3分钟，然后在室温下用起始封闭缓冲液(Pierce)封闭30分钟。将印迹与在2.5％乳-TBST中稀释的兔抗-磷酸辅因子(ser3)抗体(1：500稀释)(Cell Signaling)一起温育，并在4℃下摇动过夜。将印迹洗涤三次，持续15分钟，然后与山羊抗兔800cw标记的抗体(Li-corBiosciences)(在封闭缓冲液中1：5000稀释)在4℃温育1小时。将印迹洗涤三次，持续15分钟，并用Odyssey Infrared Imager(Li-cor Biosciences)扫描。还剥离相同的印迹并用针对GAPDH(Abcam)的抗体作为上样对照重新探测。
PC-3细胞的体外侵袭实验：
涂有GFR Matrigel(BD Biosciences)的Transwell小室用于测量细胞侵袭。在测定前一天，将基质胶在37℃下在潮湿的培养箱中固化。PC3细胞(每孔1×10 3个细胞)在插入物上侧的无血清RPMI1640培养基中生长。向下孔填充补充有10％FBS和Limk抑制剂(1μM)的RPMI 1640。将PC3细胞在37℃下在含有5％CO 2的潮湿气氛中温育48小时。然后用PBS冲洗transwell膜三次，并将细胞在室温(RT)下在2.5％EM级戊二醛中固定15分钟，不摇动。通过抽吸除去戊二醛后，将细胞用PBS中的0.5％Triton X-100在室温下透化3分钟，并用PBS冲洗它们三次。然后，将细胞在室温下用Gill's苏木精No.1染色15分钟，并用蒸馏水洗涤三次。为了除去任何残留的污渍，用酸性醇洗涤细胞3分钟，然后用蒸馏水冲洗两次。用0.04％NH 4OH暴露细胞直至在膜上观察到蓝色，然后用蒸馏水漂洗两次。将膜干燥过夜，并在Leica DMI3000B显微镜下观察染色的细胞。
PC-3细胞的体外迁移试验：
在测定前一天，将PC3细胞在10％FBS RPMI1640培养基中的6孔培养皿中培养至>90％汇合。用盘子底部的标记画出线条。使用无菌的1mL移液管尖端，通过垂直于上述步骤中绘制的线移动的细胞，将培养皿划伤三个单独的伤口。用PBS轻轻冲洗细胞两次并加入RPMI1640培养基，并在Leica DMI3000B显微镜下使用相差对照拍摄照片。然后，用指定浓度的Limk抑制剂处理细胞并孵育24小时。如上所述，拍摄照片以检测闭合伤口区域，并通过ImageJ软件(Ver 1.48)分析闭合伤口区域。
评估
本领域普通技术人员可以评估本文公开和要求保护的任何化合物抑制LIM激酶的有效性，以及使用上述方法或科学文献中发现的各种细胞试验。因此，普通技术人员可以制备和评价任何要求保护的化合物而无需过多的实验。
任何被发现是LIM激酶有效抑制剂的化合物同样可以在动物模型和人体临床研究中使用研究者的技能和经验来测试，以指导剂量和治疗方案的选择。
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A Tonolab pen was used for IOP measurements.Initial baseline IOP ofthe treated eye was 28mmHg.The maximal IOP decrease of the treated eye was～6mmHg from 1to 4hours.
本文提及的所有专利和出版物均以引用的方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体和单独地指出通过引用整体并入。
已经使用的术语和表达用作描述的术语而非限制，并且无意在使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，而是认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在由所附权利要求限定的本发明的范围内。

Claims (14)

1.一种调节LIM激酶的方法，包括使LIM激酶与有效量或浓度的式(I)化合物接触
其中
R1是卤素，氰基(C1-C6)烷氧基，C1-C6)烷基，C2-C6)链烯基或(C2-C6)炔基，其中任何烷基，链烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
n1＝0,1,or 2；
环A是包含一个或两个氮原子的6元饱和环，其中氮原子位于与连接基L键合的环A的位置，或当L是直接键时环B的位置，和环系Ar；或环A是5-或6-元芳基环，5-或6-重复的杂芳基环，或稠合的6：5杂芳基环系；环A被n2R2基团取代，其中R2是卤素，卤代(C1-C6)烷基，氰基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基或(C2-C6))炔基，其中任何烷基，链烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；n2＝0,1,or 2；
L环A和环B之间是直接键合，或L是N(R3)C(＝O)N(R3)，其中每个R3独立地是H或(C1-C6)烷基，其中R3烷基可以被取代羟基，(C1-C6)烷氧基，氨基，单-或二-(C1-C6)烷基氨基，或4-至7-元杂环基环；
环B为5-或6-元芳基环，5-元或6-元杂芳基环，或稠合的6：5杂芳基环系；环B被n4个R4基团取代，其中R4是卤素，氰基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷氧基羰基，(C3-C7)环烷氧基羰基，R'NHC(＝O)或R'2NC(＝O)，其中任何烷基，链烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中化合物(I)的化学式是化学式为(IA)化合物：
其中
Y is CR3or N；
X is NR3,CH2,CHR1,O,or S；
其中R1,n1,R2,n2,R3,R4,and n4,都按照权利要求1来定义。
3.如权利要求1所述的方法，其中化合物(I)的化学式是化学式为(IB)化合物：
X是NR3,CH2,CHR1,O,或者S；
其中R1,n1,R2,n2,R3,R4,和n4,都按照权利要求1来定义。
4.如权利要求1所述的方法，其中化合物是化学式(I)：
或其药学上可接受的盐。
5.一种治疗患者病症的方法，其中在医学上指示调节LIM激酶，包括给患者施用有效
量的化学式为(I)的化合物：
其中
R1是卤素，氰基(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基，其中任何烷基，烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
n1＝0,1,or 2；
环A是包含一个或两个氮原子的6元饱和环，其中氮原子位于与连接基L键合的环A的位置，或当L是直接键时环B的位置，和环系Ar；或环A是5-或6-元芳基环，5-或6-重复的杂芳基环，或稠合的6：5杂芳基环系；环A被n2R2基团取代，其中R2是卤素，卤代(C1-C6)烷基，氰基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基或(C2-C6))炔基，其中任何烷基，链烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
n2＝0,1,or 2；
L是环A和环B之间的直接键，或L是N(R3)C(＝O)N(R3)，其中每个R3独立地是H或(C1-C6)烷基，其中R3烷基可以被取代羟基，(C1-C6)烷氧基，氨基，单-或二-(C1-C6)烷基氨基，或4-至7-元杂环基；
环B为5-或6-元芳基环，5-元或6-元杂芳基环，或稠合的6：5杂芳基环系；环B被n4个R4基团取代，其中R4是卤素，氰基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷氧基羰基，(C3-C7)环烷氧基羰基，R'NHC(＝O)或R'2NC(＝O)，其中任何烷基，链烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC取代。(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求5所述的方法，其中化学式(I)的化合物，是一种化学式(IA)化合物
其中
Y is CR3or N；
X is NR3,CH2,CHR1,O,or S；
其中R1,n1,R2,n2,R3,R4,and n4,都按照claim 5来定义。
7.如权利要求5所述的方法，其中化学式(I)的化合物，是一种化学式(IB)化合物
X是NR3,CH2,CHR1,O,或者S；
其中R1,n1,R2,n2,R3,R4,和n4,按照claim1的定义。
8.如权利要求5所述的方法，其中化学式(I)的化合物，是一种化学式(IB)化合物
或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中条件是病情感染，转移病症，细菌感染，阿尔茨海默病，青光眼，牛皮癣，性传播疾病或吸毒成瘾。
10.如权利要求9所述的方法，其中条件是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，埃博拉病毒(EBOV)感染，裂谷热病毒(RVFV)感染，委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)感染或单纯疱疹1病毒(HSV-1)感染；其中细菌感染是衣原体感染。
11.一种化学式(I)化合物
其中
R1是卤素，氰基(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基，其中任何烷基，烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代；其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
n1＝0,1,or 2；
环A是包含一个或两个氮原子的6元饱和环，其中氮原子位于与连接基L键合的环A的位置，或当L是直接键时环B的位置，和环系Ar；或环A是5-或6-元芳基环，5-或6-重复的杂芳基环，或稠合的6：5杂芳基环系；环A被n2R2取代，其中R2为卤素，卤代(C1-C6)烷基，氰基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基或(C2-C6)炔基，其中任何烷基，链烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
n2＝0,1,or 2；
L是环A和环B之间的直接键，或L是N(R3)C(＝O)N(R3)，其中每个R3独立地是H或(C1-C6)烷基，其中R3烷基可以被取代羟基，(C1-C6)烷氧基，氨基，单-或二-(C1-C6)烷基氨基，或4-至7-元杂环基；
环B是5-或6-元芳基环，5-元或6-元杂芳基环，或稠合的6：5杂芳基环系；环B被n4个R4基团取代，其中R4是卤素，氰基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷氧基羰基，(C3-C7)环烷氧基羰基，R'NHC(＝O)或R'2NC(＝O)，其中任何烷基，链烯基或炔基可以是未取代的或取代的；其中任何一个或两个亚甲基可以被任何独立选择的NR'，S，O，C(＝S)，C(＝O)，OC(＝O)，OC(＝O)O，OC(＝O)NR'，C(＝O)C(＝O)，SO2NR'，S(O)，S(O)2或C(＝O)NR'NR'取代，其中每个独立选择的R'是H或(C1-C6)烷基或(C3-C7)环烷基；
或其他一种药学上可接受的盐。
12.如权利要求11所述的化合物,其中化合物(I)的化学式是一种化合物(IA)
其中
Y是CR3或N；
X是NR3,CH2,CHR1,O,或S；
其中R1,n1,R2,n2,R3,R4,和n4,如权利要求1所定义。
13.如权利要求11所述的化合物，其中化合物(I)的化学式是一种化合物(IB)
X是NR3,CH2,CHR1,O,或S；
其中R1,n1,R2,n2,R3,R4,和n4,被权利要求1所定义。
14.如权利要求11所述的化合物，其中式(I)的化合物是
或其药学上可接受的盐。
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