CN113171363A - Y-39983 HCl在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Y‑39983HCl在抗病毒药物中的应用，属于药物领域。该发明包括通过NanobiT技术发现Y‑39983HCl具有抑制BST‑2与Vpu蛋白结合及抑制BST‑2蛋白降解的新功能。Y‑39983HCl在保护BST‑2蛋白的同时还可有效抑制病毒的感染。本发明对含有降解BST‑2功能的病毒均具有广谱抑制作用，可用于于抗病毒药物研发。

Description

Y-39983 HCl在制备抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别设计Y-39983 HCl在抗病毒药物中的应用
背景技术
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染CD4+T细胞，导致免疫功能被破坏，进而导致机会性感染和肿瘤的恶性传染病。目前已获准上市的药物主要针对病毒各周期的病毒蛋白，包括融合抑制剂(FIs)、核苷和非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂。尽管不断优化的联合抗逆转录病毒治疗(cART)，患者的死亡率和发病率显著降低，但患者仍可能因依赖性、药物不良反应和经济水平有限而停止治疗。因此，有必要寻找抗病毒治疗的新靶点，建立高效可行的活性评价模型，并通过高通量筛选技术筛选出副作用小、耐药性小的化合物。
BST-2(也称为CD317或HM1.24)是一种具有180个氨基酸的II型跨膜蛋白。BST-2的N-末端跨膜结构域嵌入宿主细胞膜，C-末端结构域与病毒包膜连接，因此产生的病毒颗粒被锚定在感染细胞上，阻止病毒的释放和传播。BST-2的抗病毒活性不仅针对逆转录病毒，还针对许多其他包膜病毒。Vpu是HIV-1中编码的四个辅助基因之一，Vpu和BST-2的TM区以高度特异性相互作用，招募β-trcp，引起核内蛋白酶体途径的降解，并以高尔基体作为宿主限制因子的靶点。Vpu对BST-2的下调也抑制了继发性抗HIV反应，如干扰素的产生和抗体依赖性细胞毒性，这些都是由BST-2蛋白介导的。因此，阻断BST-2与Vpu之间的相互作用可以抑制Vpu介导的BST-2的下调。病毒的多种蛋白包括Nef、Vpu、nsP1等均可以降解BST-2,而新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的Nsp1蛋白能够帮新冠病毒阻断免疫的机制。因此找到拮抗BST-2的特效药物为抗HIV-1乃至新型冠状病毒治疗提供了一种有前景的策略。
Y-39983 HCl是选择性ROCK抑制剂。体外Y-39983抑制ROCK依赖性MYPT1的磷酸化(主要是在Thr853的磷酸化)，并同时伴随MLC磷酸化的减少。它能减少其Thr696和Thr853的磷酸化并导致肌动球蛋白收缩的减少。在体内，Y-39983能够显著抑制实验性变态反应性脑脊髓炎的临床症状并阻止其复发，增加髓磷脂蛋白质类的数量。它的处理减少了脱髓鞘，对轴突损伤没有显著改变，这可能是因为ROCK底物的失活，ROCK的底物包括p-MLC、LIMK2、CRMP-2，这些底物对神经突增生、生长圆椎、髓鞘少突胶质细胞具有重要作用。
发明内容
为了解决以上急需广谱特异性抗病毒药物的问题，本申请提供了一种Y-39983HCl在制备抗病毒药物中的应用。
一种Y-39983 HCl在制备抑制细胞膜蛋白BST-2与Vpu结合的药物中的应用。
本发明还提供了Y-39983 HCl在制备抑制细胞膜蛋白BST-2降解的药物中的应用。或Y-39983 HCl在制备保护细胞膜蛋白BST-2的药物中的应用。
Y-39983 HCl对抑制细胞膜蛋白BST-2被降解的活性随Y-39983 HCl的浓度增大而增大。
Y-39983 HCl浓度为6.25μM时，对Vpu蛋白和BST-2蛋白结合的抑制率为73.2％。
Y-39983 HCl在制备抑制病毒感染药物中的应用。
Y-39983 HCl的浓度6.25μM时，有较好的抑制病毒感染效果，所述病毒含有拮抗BST-2的功能；所述病毒为HIV-1、流感病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、腺病毒。
本发明的有益效果：
本发明究采用NanobiT法检测Vpu和BST-2的相互作用，发现Y-39983 HCl可以显著抑制Vpu和BST-2两蛋白的结合。Y-39983 HCl浓度为6.25μM时，对细胞活性的抑制率为21.2％，对蛋白BST-2结合的抑制率为73.2％。采用免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光共同证实Y-39983 HCl可以保护BST-2免于降解。本研究首次报道Y-39983 HCl具有抑制BST-2降解的功能，对含有拮抗BST-2功能的病毒具有广谱的抑制作用，可用于抗病毒药物的研发。
附图说明
图1为Y-39983 HCl不同剂量处理细胞的活性抑制率图；
图2为Y-39983 HCl不同剂量对Vpu、BST-2蛋白结合的抑制率；
图3为Y-39983 HCl处理细胞免疫印迹结果图；
图4为Y-39983 HCl处理细胞流式结果图；
图5为Y-39983 HCl处理细胞免疫荧光汇总图；(A.对照组B.转染Vpu组C.Y-39983HCl处理组D.Y-39983 HCl处理组)。
图6为Y-39983 HCl处理细胞免疫荧光定量结果图；
图7为Y-39983 HCl处理抗病毒感染效果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，本发明包括但不仅限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合具体实例对本发明进行进一步说明，但本发明本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1.1细胞与质粒
HEK293T细胞、TZM-bl细胞、Hela细胞均由本实验室保存。NanobiT载体购自Promega，假病毒包装质粒11051、11035均由本实验室保存。
1.2主要试剂
用于体外实验的Y-39983 HCl购自Selleck Chemicals公司，纯度为＞99％。
1.3 Y-39983 HCl毒性检测
为了检测化合物Y-39983 HCl的毒性，向HEK293T细胞加入终浓度为0μmol/L-50μmol/L的化合物Y-39983 HCl。在处理后48小时，使用CCK-8检测细胞活性。DMSO处理的对照组细胞的百分比计算细胞相对活性。使用GraphPad Prism 8.0软件计算药物的IC50值。如图1所示通过细胞的活性计算药物6.25μM时，对细胞活性的抑制率为21.2％。
1.4通过NanobiT检测Y-39983 HCl对Vpu、BST-2结合的抑制效果
为了筛选能够抑制Vpu和BST-2蛋白结合的化合物并确定其浓度，将HEK293T细胞每毫升1×105个的浓度接种在96孔板中，以完整培养基(DMEM+10％FBS)培养，并使用lipo3000转染在N端或C端区域(1:1比例)含有Vpu和BST-2的质粒100ng。转染12小时后，用终浓度为0μmol/L-50μmol/L的化合物Y-39983 HCl处理细胞，并在37℃、5％CO2下培养36小时。添加Nano-Glo活细胞检测底物(N2012，Promega)，并使用酶标仪(Perkinelmer 2300-001A)测试发光信号。用(药物处理组荧光值/对照组荧光值)计算的抑制率绘制了热图，如图2所示，结果表明，Y-39983 HCl能抑制Vpu与BST-2的相互作用。且化合物的最佳最终浓度为6.25μM，抑制率为73.2％。
1.5免疫印迹验证Y-39983 HCl抑制BST-2蛋白的降解
为探讨化合物Y-39983 HCl对细胞BST-2蛋白的保护作用，将质粒CLV和NSB共同转染HEK293T细胞，转染4小时后加入最终浓度为6.25μM的化合物，药物处理36小时后在冰上用100μL的RIPA裂解缓冲液(Solarbio)裂解15分钟。使用BCA蛋白质分析试剂盒(Solarbio)测定蛋白质浓度。裂解液添加NuPAGETMLDS样品缓冲液(Invitrogen)和NuPAGETM样品还原缓冲液(Invitrogen)在95℃煮沸5分钟。总蛋白在12％PROTEAN-TGX凝胶(BIO-RAD)上电泳分离。将蛋白质转移到PVDF膜上，用BST-2抗体(Abcam)或β-ACTIN(Abcam)一抗孵育。用HRP标记的羊抗兔二抗进一步孵育，然后用增强化学发光法进行曝光。如图3所示，Vpu组相比对照组，Vpu蛋白可与BST-2蛋白结合并导致BST-2蛋白的降解，Y-39983 HCl可以显著抑制细胞的BST-2蛋白的降解。
1.6流式细胞术验证Y-39983 HCl抑制BST-2蛋白的降解
为探讨化合物Y-39983 HCl对细胞膜表面BST-2蛋白的保护作用，将质粒CLV和NSB共同转染HEK293T细胞，转染4小时后加入最终浓度为6.25μM的化合物，药物处理36小时后，用PBS-EDTA消化细胞。用PE anti-BST-2抗体孵育细胞半小时，PBS重悬细胞洗涤细胞两次后，流式细胞仪检测细胞表面BST-2的表达情况。如图4所示，Vpu蛋白可导致BST-2蛋白的降解且Y-39983HCl可以显著提升细胞表面BST-2蛋白表达。
1.7免疫荧光检测
为探讨化合物保护BST-2蛋白的的作用，将质粒CLV和NSB共同转染HEK293T细胞，转染4小时后加入最终浓度为6.25μM的化合物，药物处理36小时后，进行免疫荧光实验。细胞用4％多聚甲醛固定，用0.5％Triton X-100渗透。山羊血清封闭后，用抗BST-2抗体染色。与Alexa-fluor 594结合的二级抗体用于检测。采用高内涵分析仪(BD)对细胞进行拍照、计数及荧光定量分析。如图5、6所示，Y-39983 HCl处理组(5.C、5D)相较于Vpu组(5.B)可以显著提升细胞表面BST-2蛋白表达。
1.8病毒感染检测
为研究化合物Y-39983 HCl抑制病毒的感染的作用，向Hela细胞转染Vpu质粒4小时后，使用11051、11035质粒共转染Hela细胞并加入终浓度6.25μmol/L的化合物Y-39983HCl。48小时后分别吸取包装假病毒的上清液处理TZM-bl细胞感染细胞并加入终浓度10μM的DEAE。感染48小时后加入荧光素酶底物检测病毒感染情况。如图7所示，病毒蛋白Vpu导致BST-2蛋白降解的同时会导致病毒感染的提升，而化合物Y-39983 HCl处理相较于Vpu组可以降低病毒的感染效果。

Claims (9)

1.Y-39983HCl在制备抗病毒药物中的应用。
2.Y-39983HCl在制备抑制细胞膜蛋白BST-2与Vpu结合的药物中的应用。
3.Y-39983HCl在制备抑制细胞膜蛋白BST-2降解的药物中的应用；或Y-39983HCl在制备保护细胞膜蛋白BST-2的药物中的应用。
4.按照权利要求3所述的应用，Y-39983HCl对抑制细胞膜蛋白BST-2被降解的活性随Y-39983HCl的浓度增大而增大。
5.按照权利要求3所述的应用，Y-39983HCl浓度为6.25μM时，对Vpu蛋白和BST-2蛋白结合的抑制率为73.2％。
6.Y-39983HCl在制备抑制病毒感染药物中的应用。
7.根据权利要求1或6所述的应用，Y-39983HCl的浓度6.25μM时，有较好的抑制病毒感染效果
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述病毒含有拮抗BST-2的功能；
9.根据权利要求7所述的应用，所述病毒为HIV-1、流感病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、腺病毒。
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