CN101536016A - 光学微层析成像的焦平面跟踪 - Google Patents

Abstract

一种用于在光学层析成像系统中跟踪对象(414)的方法，其中该对象(414)被包含在具有旋转中心(422)的管(410)中，该对象(414)具有质心(415)，且该对象(414)偏离所述旋转中心。通过在所述对象(414)旋转时穿过扩展的景深扫描对象(414)来获得图像数据。根据图像数据来计算所述对象(414)的质心(415)离所述旋转中心的距离值，根据所获得的图像数据来计算旋转角度值(βR)。确定所述对象(414)的广度，将被扫描的扩展的景深限定为小于或等于所述对象(414)的广度，从而提高产生的伪投影图像中的图像分辨率。

Description

光学微层析成像的焦平面跟踪

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国卫生研究所/美国癌症研究所(NIH/NCI)授予的SBIR阶段I许可号HHSN2612004330106下由政府支持而做出的。美国政府拥有本发明一定的权利。

相关申请

本申请要求Meyer等人于2005年8月15日提交的标题为“OPTICALTOMOGRAPHY OF SMALL OBJECTS USING PARALLEL RAYILLUMINATION AND POST-SPECIMEN OPTICAL MAGNIFICATION”的共同未决的申请号为11/203,878的美国申请的优先权，且是该美国申请的部分延续。而该美国申请是Johnson和Nelson于2005年9月13日被授予的标题为“OPTICAL TOMOGRAPHY OF SMALL OBJECTS USING PARALLELRAY ILLUMINATION AND POST-SPECIMEN OPTICALMAGNIFICATION”的专利号为6,944,322的美国专利的部分继续申请，而该美国专利是Alan C.Nelson于2003年2月18日被授予的专利号为6,522,775的美国专利的部分继续申请，而后者与Alan C.Nelson于2001年3月28日提交的标题同样为“APPARATUS AND METHOD FOR IMAGINGSMALL OBJECTS IN A FLOW STREAM USING OPTICALTOMOGRAGHY”的序列号为60/279244的临时申请相关。Meyer等人的申请号为11/203,878的美国申请作为参考结合于此。申请号为6,944,322的美国专利和申请号为6,522,775的美国专利作为参考结合于此。

技术领域

本发明通常涉及光学层析(OT)成像系统，且更具体地，涉及微观光学层析成像，其中诸如生物细胞的小型对象被电磁频谱的可见光或紫外光部分中的光束照射、旋转并跟踪，以及产生投影图像。

背景技术

作为参考结合于此的Fauver等人的于2004年4月22日公开的专利申请US-2004-0076319-A1公开了一种用于在单个检测器曝光期间穿过试料(specimen)的厚度沿着垂直于焦平面的轴线连续扫描光学成像系统的焦平面的方法和设备。

这样的一个方法可以通过移动物镜来实现，由此穿过试料区域的厚度扫描焦平面，使得在单个检测器曝光间隔期间连续扫描整个试料厚度。因此生成分辨率可以取决于移动焦平面的焦点深度和侧面空间分辨率(即，焦平面内的分辨率)的伪投影图像。同时使用一对或多对光源和检测器阵列，从在达到180度的弧线上的几个视角(perspective)重复该过程。试料可以被旋转和/或平移以获得另外的视点。以这种方式，可以产生一组伪投影，所述伪投影可以输入到例如为滤波背投影的层析成像重建算法以生成三维图像。

已知技术对放置在旋转毛细管中心的试料起到很好的效果，这是因为在旋转期间试料不会从初始焦平面移开。但是，许多试料被放置为偏离中心，且会被从初始焦平面移开。这种偏移位置能够导致定焦偏差并对试料的在后成像获取重建带来不利影响。

发明内容

本发明提供一种用于在光学层析成像系统中跟踪对象的方法，其中该对象被包含在具有旋转中心的管中，该对象具有质心(centroid)，且该对象偏离旋转中心。在对象旋转时，通过穿过扩展的景深(depth of field)扫描该对象来获得图像数据。根据图像数据来计算对象质心距离旋转中心的距离值。根据获得的图像数据来计算旋转角值。通过将被扫描的扩展的景深限制到小于或等于对象广度(extent)来确定对象广度，由此提高得到的伪投影图像中的图像分辨率。

本发明通常涉及使用激光器或其它照射系统结合CCD或CMOS检测器产生的平行光束投影的三维光学层析成像，且更具体地，涉及流体中的或夹带在刚性介质中包括生物细胞的微观对象的三维层析成像。

附图说明

结合在说明书中并构成说明书一部分的附图示出了本发明的一些方面，且与说明书一起用于解释本发明的原理。而且，在附图中，相同的参考数字表示若干视图中的对应部分。在附图中：

图1示意性显示了根据本发明的实施方式的平行光束流光学层析成像系统的示例性图示；

图2示意性显示了根据本发明实施方式的可变运动平行光束光学层析成像系统的示例性图示；

图3示意性显示了根据本发明一个示例性实施方式的系统照明几何结构的示例性图示，包括单个源放大凹面光学镜对；

图4示意性显示了根据本发明替换实施方式的系统照明几何结构的示例性图示，包括单个源放大凸面光学镜对；

图4A示意性显示了根据本发明另一个可替换实施方式的系统照明几何结构的另一个示例性图示，包括单个源放大凸面光学镜对；

图5示意性显示了根据本发明的实施方式的具有多个源放大凹面光学镜对的照明几何结构和成像样本体积的示例性图示；

图5A示意性显示了根据本发明的实施方式的具有多个源放大凸面光学镜对的照明几何结构和成像样本体积的另一个示例性图示；

图6是根据本发明的实施方式的重建圆柱体的示例性图示的高度示意图；

图7示意性显示了用于说明根据本发明的实施方式的TDI图像传感器的操作的示例性流程图；

图8示意性显示了根据本发明的实施方式的平行射线光束光源系统的示例性图示；

图9示意性显示了根据本发明的实施方式的围绕流管的重建圆柱体的示例，该流管包含诸如细胞的流动对象；

图10示意性显示了包括沿着Z轴排列的一连串部分圆周的重建圆柱体的示例，该Z轴穿过包含管的物体，其中每一个部分圆周可以包含多个源检测器对；

图11示意性显示了本发明的系统和方法的另一个示例性实施方式，其中至少一个用于检查的试料被处理以移除非诊断元素并根据本发明的实施方式被固定并染色；

图12A和图12B示意性显示了分别具有平行光束照明和非平行光束照明的微毛细管304的端视图；

图13示意性显示了根据本发明的一个示例性实施方式的用于描述管中对象的布局(placement)的跟踪参数的示例性说明；

图14示意性显示了用于描述R，θ的错误标识的图中的偏差的示例性说明，所述错误标识导致感兴趣对象的焦平面的误标识；

图15示意性显示了根据本发明另一个可替换实施方式的表示在R_比和θ上的F_所有偏差相关的轮廓图；

图16示意性显示了根据本发明的实施方式的分割感兴趣对象并针对与感兴趣对象的伪投影图像PP0相关联的灰度像素来计算质心的图；

图17示意性显示了根据本发明的实施方式的质心的X分量从伪投影到伪投影的趋势的图形描述；

图18显示了根据本发明的实施方式的测量X_m与建模的X_m之间的紧密对应；

图19示意性显示了用于说明本发明的方法的焦点跟踪框图操作的示例性流程图；

图20示意性显示了在旋转期间的毛细管；

图21的a，b以及c显示了在光学层析成像显微镜中的在成像期间的单扁平细胞的图像。

具体实施方式

如附图中所示出的，对本发明的描述做出详细参考。虽然本发明结合这些附图来描述，但是并不打算将其限制于实施方式或这里公开的实施方式，而是打算涵盖包括在所附权利要求限定的本发明的实质和范围中的所有替换实施方式、修改以及对等物。

这里在涉及生物细胞的特定示例方面对本发明做出进一步描述。但是应当理解，这里的示例用于说明本发明的原理，本发明并不受此局限。在一个实例中，在微观体积中构造光密度的三维分布能够量化并确定感兴趣的结构、分子或分子探测器的位置。通过使用标记的分子探测器，可以测量贴附于微观对象中的特定结构上的探测器的数量。处于说明的目的，诸如生物细胞的对象可以被贴上至少一个染色的或标记的分子探测器，并且所测量的该探测器的量和位置可以产生关于细胞病态的重要信息，包括但不限于诸如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等各种癌症。

当在光学微观过程环境中使用时，这里常用的以下术语具有以下含义：

“毛细管”具有其通常接受的意思，并被规定为包括内径为100微米或更小的微毛细管或等同物。这样的毛细管由美国亚利桑那州美国玻利米柯技术公司(Polymicro Technologies，LLC.，AZ)制造。

“对象”表示单体细胞或其它实体。一个或多个对象可以包括试料。

“伪投影”包括表述采样广度体积大于光学镜的固有景深的单个图像。

“试料”意思是从个体患者的单个测试或过程中获得的完全的产物，(例如，提交的用于分析的唾液、组织检查或鼻腔药棉)。试料可以由一个或多个对象组成。试料诊断的结果成为病症诊断的一部分。

“样本”表示即将用于分析的已完成的细胞制备，包括所有或部分试样(aliquot)或试料。

在本发明的一个示例中，选择的照明直到通过对象体积之前是平行或近似平行的，该对象体积可以包含将被成像的细胞或其它试料或对象。在通过对象之后，后置试料光学镜发散光强度的自然发生的(emergent)图案以在垂直于系统的光轴的任何平面产生光强度的放大的图案并位于后置试料光学镜的下游。但是，本发明不限于平行光束照射，且实际上，这里描述的实施方式对各种波长的多种照射形式都是有用的。

参考图1，示意性显示了根据本发明的实施方式的平行光束流光学层析成像(PBOT)系统的示例性说明。本发明提供一种用于对流体或夹带在刚性介质中的小型对象进行成像的设备和方法，该设备和方法使用点光源或平行光束投影、图像传感器(例如时延积分(TDI)图像传感器或CCD或CMOS固态图像传感器等)、以及层析成像图像重建。在一个示例性实施方式中，光学层析成像(OT)系统包括流体血细胞计数器，例如包括重建圆柱体12，该重建圆柱体12围绕包含管2的物体。根据光学层析成像系统的类型，包含管2的物体，例如可以包括细胞夹带管(其中细胞被保持在胶中)或用于细胞流动的毛细管。

PBOT系统4参照坐标系统40被定位，该坐标系统40具有X，Y和Z方向上的坐标。在操作中，感兴趣对象1，例如细胞，例如包括人体细胞，被注入到注射管3中。包含管2的物体在注射端5变得更宽并且包括压力盖6。鞘液体7在管8处被引入以在包含管2的物体中产生层流。第一光子源9a和第一光检测器10a与脉冲高度分析器11一起工作以用作触发装置。脉冲高度分析器11用以在例如细胞的对象移动通过管时提供用于该对象的开端或前沿的第一信号30a以及用于该对象的末端或后沿的第二信号30b。在脉冲高度分析器11中，信号30a、30b、31a以及31b被表示为光强度“I”相对于“TIME(时间)”函数。脉冲高度分析器11可以是常规设计的电子电路等。脉冲高度分析器11产生多个信号14，信号14被发送到计算机13，在与移动的对象的速度和光检测器与重建圆柱体12之间的距离相关的延迟之后，计算机13在线15上发送触发信号到重建圆柱体12，以启动和终止特定感兴趣对象的数据收集。此外，第二光子源9b和第二光检测器10b可以方便地被设置在距离第一组光子源和光检测器下游的已知距离，由此对象触发第三信号31a和触发第四信号31b之间的间隔可以方便地用于计算对象的速度以及用作同步TDI图像传感器线传输速率的定时信号。定时信号在多个信号14中被传送到计算机13。可以是任何有用的个人计算机或等同物的计算机13在线16上依次发送同步信号到重建圆柱体12。应当理解，线15和线16表示PBOT系统与计算机之间的通信和控制线，用于在计算机与PBOT系统之间传输数据、图像信息、控制信号以及其它信号。以这种方式，例如对象沿着流动轴20的运动可以由电荷从TDI传感器的一个阶段到另一个阶段的传输速率来匹配，这在以下参考图7更详细地描述和显示。

现在参考图2，图2示意性显示了根据本发明的一个示例性实施方式的可变运动平行光束光学层析成像系统的示例性图示。可变运动PBOT系统100利用机械定位器一次将一个夹带在管中的刚性介质中的细胞提供给成像系统。与参考图1描述的流系统相比，在可变运动PBOT系统100中，只需要一个包括光子源9和光检测器10的触发机构，这是因为诸如人体细胞的对象的速度可以被精确控制以在重建圆柱体12中将光源与图像传感器同步。这里触发由脉冲高度分析器11和计算机13进行处理并用于启动和停止数据收集。除了需要更少的输入和输出之外，脉冲高度分析器11是与脉冲高度分析器11类似的电子电路设计。如双箭头线表示的，在该实施方式中包含管2的物体通过计算机控制的电机17驱动的螺杆传动18沿着穿过重建圆柱体12的Z轴平移。包含在管2中的对象还可以通过计算机控制的电机17在Z轴周围旋转。计算机控制的电机17从计算机13接收控制信息19。本领域技术人员应当理解，只要具有这里公开的益处，能够平移并旋转包含管2的物体的任何机构都能被用以替代螺杆传动。使用图像处理、图像分析和/或计算机层析成像图像重建技术可以直接分析或处理来自重建圆柱体12的信号，以提供关于细胞和其它感兴趣对象的二维或三维信息。

现在参考图3，图3示意性显示了用于对感兴趣对象1进行成像的平行光束光学层析成像系统中使用的重建圆柱体12A中的系统照明几何结构。重建圆柱体12A包括平行射线光束照射源35，用于以多个平行射线光束36照射感兴趣对象1。外管32具有光平输入面60和凹面输出面29，其中凹面外表面29发散在穿过感兴趣对象1之后从外管32出来的射线61。包含管2的物体位于外管32内，其中感兴趣对象1被保持在包含管2的物体内。

这里以双箭头示意性表示的电机34被耦合以旋转包含管2的物体，从而提供感兴趣对象1的不同视图。检测器阵列39被设置以接收来自凹面输出面29的射线61。在一个实施方式中，平行射线光束照射源35包括激光器。在另一个示例性实施方式中，可以选择激光器以在电磁频谱的可见光部分中发射射线。在再一个示例性实施方式中，可以选择激光器以在电磁频谱的紫外线部分中发射射线。检测器阵列39可以有利地包括从组中选择的传感器，该组由固态传感器、电荷耦合装置(CCD)传感器、互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器以及时延积分传感器组成。

在本发明的另一个实施方式中，被成像的细胞或其它对象被提供在流动管、毛细管、线形容器或夹带管中。在平行光束光学层析成像系统的一个实施方式中，感兴趣对象1包括具有细胞核30的人体细胞。该细胞还可以包含亚细胞特征或成分。至少一个发荧光或吸收分子探测器31可被限定为一个或多个细胞成分。

包含管2的物体，例如流动管、毛细管、线形管或夹带管位于外管32内，基本与该外管32是同心圆，该外管32具有基本是矩形的外横截面，且可以具有矩形或圆形的内横截面。外管32也可能有其它横截面几何形状。包含管2的物体的弯曲表面作为柱面透镜，会带来投影系统中可能不想要的聚焦效应。具有本公开的益处后，本领域技术人员将理解如果光源与外管32之间的空间37和管32与检测器表面39之间的空间33被填充了具有折射指数与包含管2的物体的折射指数匹配的材料，则基本可以减少包含管2的物体造成的光子的偏移。此外，管可以光耦合到空间填充材料。这种光耦合可以用例如油或胶来完成。空间33中折射指数匹配的液体，例如油，可以通过端口38方便地被引入以完全填充包含细胞或其它微观对象的管2与外管32之间的空间。折射指数匹配的液体、管2和32以及任意胶或围绕将被成像的细胞的流动液体介质具有相同的或近似相同的折射指数。包含在管2内的对象可以在计算机控制下在具有轴向运动和转动的折射指数匹配的液体和外管32内被旋转和/或平移。

在操作中，激光器或其它光源35产生平行照射光束36，该光束36撞击在外管32上，可选地由空间37中的折射指数匹配的耦合元素传递。在没有散射的情况下，光经过穿过管2和32的平行光径。由于光径中所有材料的折射指数都是匹配的，因此经过折射指数匹配的液体和要被成像的体积中的对象空间的光线是平行的。管2和32都包括关于照明波长的透明或几乎透明的材料。管2和32都可以包括熔融石英、玻璃或其它类似的光学材料。

矩形外管32的出口面29可以方便地被设置具有分散或放大光学镜，在一个预期的实施方式中，该光学镜可以是在熔融石英或其它光学材料中的圆形对称磨光的凹进或凹陷。该凹陷用作平凹透镜，使光线路径61在其出口面29变得分散。这样的凹陷或任何其它的光学元件或光学元件的组合包括多重态或其它等效元件，被设计成执行相同功能，在这里被称为后置试料光学镜。后置试料光学镜通常包括放大光学镜。

使用已知光学设计原理，后置试料光学镜的曲率半径可以被确定并被设计成给予离开的光线路径61期望的离散度。离散度和后置试料光学镜与TDI、CCD、CMOS或其它图像传感器39之间的距离共同确定投影图像的放大倍数。所需的放大倍数由期望的投影图像的空间分辨率与检测器像素大小之间的关系来确定，且放大倍数最好是远大于像素大小与期望的投影空间分辨率的商的两倍。

例如，在本发明的一个预期的实施方式中，如果投影中的期望的空间分辨率是0.5微米而检测器像素大小是10微米，则放大倍数最好是明显大于40倍。在该示例中，令人满意的放大倍数是80倍、100倍或者甚至更大。

对于本发明的预期的实施方式，其中后置试料光学镜是外管32的出口面29上的圆形对称磨光凹陷，且其中该后置试料光学镜用作平凹面分散透镜，该透镜的前焦平面在无限远处。不存在后焦平面。因此，放大的投影图像、伪投影图像或包含关于在光穿过要被成像的细胞或其它对象1时光的吸收的信息的影像图可以通过在TDI、CCD或CMOS检测器或其它数字成像检测器39上获取出来的发射的光强度的图案来产生。检测器的光转换面可以位于垂直于系统的光轴的任何平面且在后置试料光学镜的下游。此外，通过检测器平面的放置可以选择放大倍数：在对象下游的检测器平面离对象越远，放大倍数越大。

在本发明的实施方式中，例如图3和4示意性描绘的，具有单个源-检测器对，通过从不同视角获得图像来执行细胞或其它微观对象的二维或三维层析成像。在获得在关于光轴的第一旋转角保持静止的包含管2的物体的第一投影后，该包含管2的物体可以关于轴以不连续的角度被旋转，如双箭头34所示。有用的轴被标识为图2中的Z轴，和/或在图3和图4中指向纸外，即垂直于系统的光轴以在关于光轴的第二旋转角定位细胞或其它对象1。随后发射的投影图像可以在旋转包含管2的物体之后获得。随着包含管2的物体以不连续递增重复旋转，旋转和成像过程可以重复进行。在每一个角可以记录二维投影图像，直到获得足够数量的投影以产生细胞或其它对象1或它们的部分的三维图像，或产生描绘在成像对象内部的吸收图案薄片的二维图像。

通过用已知三维图像重建算法对多个二维投影图像进行图像处理来产生三维重建。通过处理从多个投影中提取的数据行来产生穿过成像对象的横向薄片的二维图像，其中这些数据行被定向为与如图1和图2中描绘的X轴和Y轴的旋转形式平行。数据行通常被称为检测器数据行。相对于圆锥光束几何形状，本发明描述的方法的一个优点是能够根据检测到的投影数据行来重建穿过细胞或其它对象的轴向切面(transaxia1)薄片，其中许多检测器数据行对通过对象空间的每一个横向图像平面起作用。

现在参考图4，图4示意性显示了本发明预期的重建圆柱体12B中的系统照明几何形状的替换实施方式，其中要被成像的细胞或其它对象1被提供在流管或夹带管2中。重建圆柱体12B包括采用多个平行射线光束36来照射感兴趣对象1的平行射线光束照射源35。外管32A具有光平输入面60和凸面输出面28，其中凸面外表面28聚集在穿过感兴趣对象1之后从外管32出来的射线。如在关于图3描述的上述实施方式中，包含管2的物体位于外管32A内，其中感兴趣对象1被保持在包含管2的物体内或流过包含管2的物体。以双箭头示意性表示的电机34可以方便地被耦合以旋转和/或平移包含管2的物体，以提供感兴趣对象1的不同视图。小孔光圈127被设置在凸透镜的焦点128处并用于产生出来的射线125的锥形光束。如上所述，检测器阵列39被设置以从小孔127接收出来的射线125的锥形光束。在一个示例性实施方式中，外管32A可以有利地具有端口38且围绕包含管2的物体的空间33填充有液体，例如具有与外管32A和包含管2的物体相同的折射指数的油。

现在参考图4A，图4A示意性显示了本发明预期的重建圆柱体12D内的系统照明几何结构的另一个替换实施方式，其中要被成像的细胞或其它对象1可以被提供在流管或夹带管2中。重建圆柱体12D包括关于图4的上述实施方式中的所有元件，还包括光学元件126。该光学元件126可以有利地包括位于小孔光圈127与传感器阵列39之间的平凹光学镜或其它分散或放大光学镜。如图4所示，小孔光圈127位于凸透镜28的焦点128处，并被放置成产生出来的射线125的锥形光束。出来的射线125由平凹光学元件126接收，由此进一步被分散成射线光束225。如上所述，检测器阵列39被放置成从小孔光圈127接收出来的射线225的锥形光束。

图5示意性显示了本发明另一个实施方式预期的具有多个源-放大凹形光学镜对的照明几何结构和成像样本体积的示例性图示。用于对感兴趣对象1进行成像的平行光束光学层析成像系统通常包括上述参考图3的照明几何结构和用于照射感兴趣对象1的多个平行射线光束照射源1-N 35，其中N至少为2。多个平行射线光束照射源1-N 35的每一个在关于感兴趣对象1的不同视角产生多个平行射线光束。多个平行射线光束照射源1-N 35的每一个可以是单个光源，例如激光器，或至少一个激光器，其光穿过一个或多个光纤或光纤束，如以下关于图8所描述的。外管41具有多个光平输入面63和多个对应的凹形输出面65，其中多个对应的凹形输出面65使在穿过感兴趣对象1之后从外管41出来的光线分散，由此产生感兴趣对象1的放大的投影图像。可替换地，如以上关于图3所述的，后置试料光学镜可以包括任何放大光学元件或元件的组合，包括多重透镜或其它等同物。

在这里所述的其它示例中，包含管2的物体位于外管41内，其中感兴趣对象1保持在包含管2的物体内，且多个检测器阵列1-N 39被放置成接收出来的射线36E。多个检测器阵列1-N 39中的每一个被设置成从多个凹形输出面65中的一个或多个接收出来的射线36E。

图5A示意性显示了本发明实施方式预期的具有多个源-放大凸形光学镜对的照明几何结构和成像的样本体积的另一个示例性图示。图5A被构造成与图5基本相似，不同之处在于外管51A具有多个光平输入面66和多个对应的凸形输出面67，其中多个对应的凸形输出面67聚集在穿过感兴趣对象1后从外管41A出来的射线68。包含管2的物体位于外管41A内，其中感兴趣对象1保持在包含管2的物体内。多个小孔光圈127位于凸形输出面67的各个焦点69处，其中多个小孔光圈127中的每一个从多个对应的凸形输出面67中的一个接收射线以产生出去的锥形光束70。

多个检测器阵列1-N 39被放置成接收锥形光束70。多个检测器阵列1-N39中的每一个如上所述的被构建且被放置成从多个小孔光圈127中的一个或多个接收出来的射线。

参考图6，图6显示了本发明实施方式预期的重建圆柱体12C的有用设计。这里，一圈点光源27在包含管2的物体周围被放置且一圈图像传感器25被设置成位于包含点光源27的平面的上方、其上或下方的平面中。虽然在图示中只示出了四个点光源和四个传感器，但是应当理解一圈光源和一圈图像传感器可以有利地包括更多数量，以足够进行成像对象的层析成像重建。图像传感器可以位于点光源的平面的下方、上方或之中。通过在分开的平面上放置点光源27和图像传感器25，圆柱体相对侧上的点光源不会在物理位置上干扰其它照射光束。每一个点光源可以方便地产生平行射线光束135，如以上参考图3、4、4A、5和5A所述的，该平行射线光束135在穿过成像对象后被放大。

在移动穿过重建圆柱体的过程中，细胞1经过至少一个光子点光源。本发明的关键特征是多个具有可选择波长的光子点光源27围绕包含管的物体放置并与该物体共圆心。光子点光源与相对的CCD、CMOS、TDI或其它图像传感器25结合操作，这些图像传感器25对光谱的可选择部分敏感，由此允许获取穿过细胞1发射的光的投影。以这种方式，可以产生一组投影射线135，该投影射线可以被描述为连接光源点和单个传感元件的直线。沿着特定投影射线离开光源点的光子数量与在特定传感元件处接收到的光子数量之间的差与丢失或削弱的光子数量有关，该丢失或削弱是由于与沿着投影射线路径的包含管2的物体中的细胞和其它物质的互相作用而造成的。

但是，光散射、光子能量变化、有缺陷的几何结构和较差的准直可能导致复杂情况，且当多个光源点被同时激发时，来自不同光源的光子可以到达特定的传感元件。随着小心构建重建圆柱体，例如通过为点光源图形明智选择如上所述的几何形状以及其相对的检测器，并通过适当定时或复用多个点光源的激活和传感器阵列的读出，可以最小化由这些问题导致的光子污染。

通过系统校准可以部分解决光子污染，例如没有细胞出现。即，可以轮流点亮每一个光源且可以测量光源对每一个传感器的影响，由此提供偏差数据以用于标准化系统。附加的校准步骤可能需要例如，成像乳胶聚合物小球或其它微球体或扁圆球状体，其光学特性是已知的且遍布细胞成像的感兴趣密度范围。

现在参考图7，图7示意性显示了说明TDI图像传感器的操作的流程图50的示例。对应于细胞图像单元的电荷被往下传输到与图像同步的TDI传感器的一列像素单元。电荷传输按顺序发生，直到从列中积累的电荷在传感器26的底部寄存器处被读出。

在本发明预期的光学层析成像系统的一个实施方式中，多个TDI传感器25被定向，由此每个传感器具有线传输方向52，该方向52与沿着Z轴的细胞运动方向20平行。通过来自计算机13的定时信号或时钟信号，TDI图像传感器线传输速率与细胞的速度同步。

图7的流程图显示了运动的细胞1以及其沿着时间线1334在不同时刻关于TDI传感器25的位置。在时刻＝0，细胞1只在TDI传感器25的上方且没有感测到图像。在时刻＝1，细胞1被TDI传感器25部分成像。细胞1的影像图51一次被成像一条线。从时刻＝0到时刻＝5，对应于每条图像线的电荷22被传输到传感器像素单元23的下一条线，该像素单元23与TDI图像传感器下的图像线的运动同步。以这种方式，对应于每一个像素的电荷在TDI传感器25的每一个列24下被积累直到在时刻＝5在底部寄存器26处被读出。

TDI传感器被定向使得线传输方向52与沿着Z轴的细胞运动方向20平行。TDI图像传感器线传输速率与细胞速度同步。根据TDI图像传感器中的线数量或阶数，额外的光生电荷被积累且信号被增强(例如达到96层(fold)96阶的TDI传感器，例如Dalsa IL-E2传感器)。

光源

现在参考图8，图8示意性显示了本发明实施方式预期的平行射线光束光源的示例性图示。在该示例中，平行射线光束光源包括与光纤110耦合的激光器105。光纤110可以包括单独的光纤或光纤束或等同物。在操作中，多个光纤110接收激光束107并将平行射线光束36传送到环绕流管或毛细管的光源位置。以这种方式，通过将来自单个激光器的光束通过多个光纤以为所述光束规定路线，可以减少如以上参考图5和图5A描述的多个光源系统所需的激光器数量。可以在光纤110的输入端或输出端或这两端结合诸如透镜和/或镜子的光学元件。

在操作中，每一个激光束的直径可以大约为半个到几个毫米，允许单个激光器耦合每一个激光光源外的具有大约30微米到100微米的开口的多个光纤。

每一个光源可以具有相同的一般特性，优选地：

·光源可以近似小圆形点光源；

·光源可以是激光器、激光二极管或发光二极管；

·光源可以具有已知频谱容量的亮度；

·从光源发射出的光子可以形成已知几何形状的光束，例如所有的光子射线都平行的线束(pencil)光束；

每一个光源为一个投影角度产生数据。在一个示例数据收集几何结构中，沿着轴是包含管的物体的中心轴的螺旋线排列的多个光源在细胞移动穿过模块时从多个投影角度产生数据。根据传感器的几何结构，一些点光源以不同的角度在相同的圆周周围被放置，由此投影不会在传感器处重叠。期望的光源数量是每一个平面重建(x-y平面)或立体重建中所需分辨率的函数。此外，通过使用不同的二极管或其它激光器或通过对白光源或其它宽带光源、例如汞或氙弧灯进行带通滤波，可以选择光源的波长。可以使用一些选项来产生光源点，例如：

·激光器或激光二极管；

·激光器-光纤束组合；

·激光器前的窗孔或其它高强度光子源；

·在小孔的入口侧和出口侧使用光子的表面等离子体振子聚焦的窗孔；

·具有小横截面的光纤；

·来自光子源前面的短焦距透镜的虚拟点光源；

·照射无机发光材料(phosphor)表面上的点的电子束(CRT形式)；以及

·上述各种组合。

使用分散光束的几何结构，点光源离感兴趣对象1(例如细胞)越近，放大倍数越大，这是因为对象离光源越近，该对象对着的几何角度越宽。在简单的投影系统中，放大倍数近似为M＝(A+B)/A，其中A是点光源与对象(细胞)之间的距离，而B是对象与检测器之间的距离。反过来，如果预先知道系统设计需要的分辨率，则可以为该特定分辨率优化几何结构。作为背景，本领域技术人员被引向主编为Blass，M.的Handbook of Optics：Fiber Optics and Nonlinear Optics(第二版，卷IV，麦格劳·希尔出版公司，2001)。

现在参考图9，图9示意性显示了本发明实施方式预期的围绕包含诸如细胞的流动对象1的流管2的重建圆柱体12E的示例。重建圆柱体12E包括例如，包括多个平行射线光束源72的螺旋线70，该平行射线光束源72被放置在预定的螺旋状的坑中。传感元件39被放置成在光线穿过细胞或其它感兴趣对象1并被后置试料光学元件放大之后从点光源接收该光线，如以上参考图3、4、4A、5和5A所述的。

虽然多个平行射线光束源72的排列是螺旋状的，但是本发明预期的重建圆柱体中使用的平行射线光束源阵列可以采取很宽种类的几何图案，这部分取决于电子器件的速度、细胞速度以及在传感器(检测器)实现无重叠投影信号的几何结构。

例如，参考图10，图10显示了包括一系列部分圆周74的重建圆柱体12F，该圆周74沿着穿过包含管2的物体的Z轴排列，其中每一个部分圆周74可以包含多个源-检测器对。

固定光学点光源72结合围绕管的圆周安装的与该点光源72相对的检测器39可以在细胞流过光源时采样穿过整个细胞的多个投影角。通过对光源和发射或削弱传输的和/或分散的和/或发射的光的发射或读出进行定时或对其发射和读出两者都进行定时，每一个检测到的信号与在流动细胞的Z方向上沿着轴的特定已知位置相符。以这种方式，以已知速度沿着垂直于光源(该光源被引起发射或以同步方式被检测)的已知轴流动的细胞可以从光学上被分割成穿过该细胞的投影，该投影可以被重建以形成x-y平面上的2D薄片。通过堆叠或从数学上组合连续的薄片，该细胞的3D图片会出现。还有可能结合细胞运动和围绕流动轴的光源(或多个光源)的定位来生成可以例如以螺旋状方式重建的数据，从而产生细胞的3D图片。通过堆叠从线形(1D)投影中重建的连续的平面图像或直接根据平面(2D)投影可以完成三维重建。细胞的3D图片可以产生亚细胞结构和位置以及标记的分子探测器的数量的定量测量，从而提供诊断信息。

焦平面和对象跟踪

这里描述的本发明可以进一步地预期对感兴趣对象进行成像的光学层析成像系统。光学层析成像系统包括光源，该光源用于以多个射线光束照射感兴趣对象；包含管的物体，其中感兴趣对象保持在包含管的物体内，由此该感兴趣对象被多个射线光束照射以产生从包含管的物体出去的射线。检测器被设置成接收出来的射线并产生成像数据。用于跟踪感兴趣对象的装置被耦合以接收并响应该成像数据。

感兴趣对象的图像可以包括投影图像或伪投影图像。通常通过从沿着光轴被整合(integrate)的一连串焦平面中整合一连串图像来产生伪投影图像。焦平面优选地被背对背排列。这里描述的跟踪装置可以包括用于跟踪伪投影图像中心的装置、用于跟踪投影图像中心的装置或用于跟踪焦平面的装置。

现在参考图11，图11显示了本发明的影像图光学层析成像系统的另一个示例性实施方式，其中至少一个用于检查的试料301(例如细胞或多个细胞)被处理以移除非诊断单元，并且被固定并染色。试料301然后被悬浮在胶状介质302中。胶混合物中的细胞接着被插入到内径约为40微米-60微米的玻璃微毛细管304中。在一个实施方式中，对胶施加压力以将试料301移动到高倍显微镜(这里由物镜306表示)的光路径中。在替换实施方式中，管可以相对于该物镜平移，而试料相对于管保持静止。

一旦试料位于合适的位置，管304被旋转以允许获取在管旋转的预定范围内取得的期望对象的多个高分辨率图像。在一个有用的实施方式中，在180度的管旋转范围内获得大约250个图像。当沿着光轴整合时，图像形成伪投影图像。通常使用滤波的背投影来处理图像以产生试料的3D层析成像描述。基于层析成像重建，特征可以被计算并用于检测具有癌症特性和癌症先兆特性的细胞。这些特征被用在分类器中，分类器的输出表示受调查对象是癌症细胞的可能性。在其它事物之间，高质量重建和分类取决于在步骤三中采取的对所有图像的良好定焦。本发明提供一种用于建立对此处所述的处理过程期间取得的所有伪投影的良好定焦的方法。

现在参考图12A和图12B，分别显示了以平行光束照射和非平行光束照射的微毛细管304的端视图。在任一种情况下，为了将光离开感兴趣对象(例如试料301)之后的光衍射最小化，最好是转动管，由此最小化对象与物镜之间的距离，该物镜在图像获取周期期间被整合。因此图像获取必须在感兴趣对象、试料301处在位于零轴310内的位置P1时开始，其中零轴310与物镜306的光轴交叉，优选地与物镜306的光轴垂直。感兴趣对象然后如表示移动路径312的虚线所示的旋转，在位置P2停止。注意的是这样做系统的焦点平面(plane of focus)必须改变以对应于移动路径312。

在一个有用的实施方式中，焦点跟踪系统被结合到本发明光学层析成像系统和方法，并操作以在对象中心对准零轴310时触发伪投影图像的获取。焦点跟踪系统还操作以调节焦点，使得该焦点跟踪系统在围绕管旋转时跟踪对象中心。注意这里描述的跟踪系统可以在光学层析成像系统中使用，该光学层析成像系统使用任何合适形式的照明或光学器件，包括平行光束照明或光学器件、扇形光束、点光源以及其它本领域技术人员公知的等效光源。

现在参考图13，图13示意性显示了描述管中的对象的位置的跟踪参数，包括：

R—管中心到对象中心的半径；

θ—西塔，在开始图像获取时测量的对象相对于0度轴的角位移或者角偏差值(图像获取最优选地在θ为0时开始，因此在图像获取开始时的任何其它值是角偏差的指示)。

现在参考图14，图中示意性图示了偏差，特点是R，θ的错误标识导致感兴趣对象的焦点平面的误标识。由于对象在圆形路径上运动，因此在R正确标识到对象中心且在对象中心对准零轴时应当开始图像获取。当对象被认为定位在零轴上但实际与零轴有为θ的偏移时，偏差就会产生。如果θ不为零(0)，则对象真正的移动路径314与假定的移动路径316之间有差别。在这种情况下，所示的关系R＝R_真cos(θ)也会把R的值估低。虽然在图像获取开始时对象处于焦点中，但是如果随着对象旋转过180°而没有对θ偏移做出调节，则增加的偏差会在对象中心与跟踪系统指派的焦平面之间扩大。

用于对象的焦点平面F可以被建模为：

等式1

F＝F_管中心-R_真cos(θ)sin(πPP/249)，其中PP是图像编号：PP＝0、1、2、...、249。

当R是真实值(R_真)且θ＝0时，该路径对应于对象的真实并期望的路径。该轨迹可以在等式2中被建模为：

等式2

F_真＝F_管中心-R_真sin(πPP/249)

使用等式1和2，焦点中的偏差F_偏差可以被建模为(F-F_真)的差。

等式3

F_偏差＝R_真sin(πPP/249)(1-cos(θ))

通过对所有PP整合等式3，可以发现用于评估焦点偏差的总的严重性的度量。

等式4

F_所有偏差＝(2π*R_真/249)*(1-cos(θ))

设R_真/R_管＝R_比，该等式的后半部分(second half)被描述为-30°≤θ≤30°且0≤R_比≤0.8的轮廓图。这在图15中被描述且给出了在R_比和θ上F_所有偏差关系曲线的含义。注意到出于该示例的目的，249表示获得了250个伪投影图像的情况。如果获得不同数量的伪投影图像，则常数249必须做相应调整。

通过视觉检查的R，θ的估计是偏差倾向工作，因为在观察到可感知的对象移动之前需要相当大的θ偏差。另一方面，在θ不确定的情况下要确定到真实的对象中心的距离是很难的。因此本发明的目标是提供一种方法用于

1.估计R，以及

2.建立触发图像获取的方法，由此在对象中心经过零轴310时采集数据。

现在参考图16，图16显示了分割感兴趣对象并针对与感兴趣对象的伪投影图像PP0相关联的灰度像素来计算质心的图。估计R首先要做的事是找到对象质心。这可以通过分割感兴趣对象并用与感兴趣对象相关联的灰度像素来计算质心。

1.阈值：通过找到方框区域320中平均亮度等级来找到伪投影PP0的阈值。

2.连通分量算法被应用到阈值图像332以分割所有非零像素都连通的对象。该过程产生标记的图像324。注意的是外来的非连通特征，例如特征323，通过阈值和连通分量算法基本被移除和/或变黑(darkened)。

3.基于识别感兴趣对象中的像素325而选择对应于感兴趣对象的分量。

4.对象326的选择产生掩模，该掩模之后被应用到原始灰度值图像。通过基于逆转的灰度值计算质心C_m来找到对象中心。

在一个示例性实施方式中，通过使用包括第一75个像素的方框区域从左上角向下移动75个像素再移动到相对边来测量平均亮度等级从而确定平均亮度等级。阈值被设定在方框区域中像素平均灰度值的85％左右。当然本发明不受此限制且本领域技术人员可以使用等效的阈值设定方法。

选择感兴趣对象的步骤可以基于用户输入，例如，用户激活计算机显示器屏幕上的像素或自动具有图形识别算法或等效软件算法。一旦感兴趣对象在获得第一个伪投影期间被选择，则通过毛细管的窗口325可以被建立，其中窗口做得比感兴趣对象更大以提供整个对象的视图，但不是包含不感兴趣信息的图像的一部分。这样，在之后的图像获取期间，只需要通过窗口观察对象并可以跳过选择步骤。

现在参考图17，图17显示了质心的X分量从伪投影到伪投影的趋势的曲线描述。根据上述的方法可以找到单个伪投影图像的质心。在开始图像获取的时候，通过分析质心的X分量X_m从伪投影到伪投影的趋势来计算对象的R和θ。由于对象运动路径是圆形的，因此当该运动从物镜视角观察时，旋转的对象中心的移动可以由余弦函数来描述。

X_m趋势数据可以被建模为

：

等式5

$X_m^{\′}=R^{*}\cos (\mathrm{\πPP}(1+\mathrm{\ζ})/249+\mathrm{\π}+\mathrm{\θ})+34.7+A+B^{*}\mathrm{PP}+C^{*}{\mathrm{PP}}^2$

在等式5中，该模型的参数的特性如表1所示。

 

模型参数	描述
		R	微毛细管中心与对象中心之间的距离
θ	角偏差
		ζ	控制器偏差。当控制器使对象旋转过不为180°的其它值时，ζ为不为0的值
PP	伪投影编号：0、1、...、249
		34.7	伪投影帧高度的一半(单位：微米)。微毛细管壁应当集中在该值。
A	围绕管中心的微毛细管的平均偏移(所有PP)
		B	在微毛细管旋转时该微毛细管的线性平移
C	在微毛细管旋转时该微毛细管的二阶平移

表1：模型参数描述

焦点跟踪参数解决方案

根据以下等式，对所有的250个伪投影通过最小化X_m与

之间的RMS偏差可以解决表1中的参数。

等式6

在等式6中，粗体字X_m用于表示所有PP上的X_m的集合。对于图17的情况，进行产生以下模型参数的探究。图18显示了测量的X_m与建模的

之间的紧密对应。

 

模型参数	参数值
		R	18.58μ
θ	18.48°
		ζ	-0.035
A	1μ
		B	-0.004μ/PP
C	-1.49e-5μ/PP2

表2：模型参数值

对于该解决方案，可以得到3.35e-3的总RMS偏差。注意的是参数B和C可以在等式中去掉(或设为0)而基本不影响结果。因此，本发明的方法的有用的实施可以在不考虑参数B和C的情况下执行。

焦点跟踪实施

现在参考图19，图19显示了本发明的方法的焦点跟踪框图。之前部分的分析显示了通过用等式5的模型配备用于X_m的测量值可以估计用于合适焦点跟踪的参数而具有较小的偏差。在本发明预期的光学层析成像系统中，当期望的对象进入视线时，需要找到R并估计该对象中心何时经过零轴，由此可以开始用于重建的图像获取。在对象被识别以获取后收集一组k个图像，pp1-ppk，其中k可以是对重建3D图像有用的任意图像数量。该组k个图像被收集以具有R的初始估计。在对象以任何特定方式被放置时不需要收集该组k个图像，因为该组k个图像将被用于估计R的真实值并建立触发点，该触发点收集将用于重建的伪投影图像。在步骤332，为伪投影pp1-ppk中的对象找到X分量X_m1、X_m2、X_m3、...X_mk的质心值，且记录每一个图像的收集时刻t1、t2、t3、...t_k。在步骤334，计算t_k时刻的R和θ值。在步骤338，基于该数据以及用于PP收集的时钟336估计θ的实时值。在步骤340，检测该值与值0的近似性。在步骤350，当θ在下一个时钟周期被预期为0时，激活用于获取250个伪投影集的触发。

通过比较值ζ与标准，可以检查控制器旋转微毛细管的合适的功能。ζ超过该标准会启动服务呼叫并使数据被丢弃。

参数A给出了微毛细管中心的平均偏差。该值可以与为其制定的规格相比较。超过该规格的A值会停止数据收集并警告用户该管需要重新回到中心位置。

现在参考图20，图20示意性显示了用于图示本发明另一个实施方式的旋转期间的毛细管。该毛细管410具有直径为d的内壁412和旋转中心422，该旋转中心422是该毛细管的中心。

包括对象414的试料通过基本填满毛细管410的合适的胶416或等效物质被保持在相对于毛细管内壁412的位置。物镜420被设置以观察对象414。虽然不限于此，但是对象414可以包括例如生物试料，该生物试料包括细胞或更具体地包括细胞内的感兴趣结构，例如用吸收性染料染色的细胞核。

在多个位置P₀、P_n、P₉₀以及P₁₈₀显示了对象414，其中多个位置中的每一个位置示出了在毛细管410旋转期间在不同时刻的位置。例如，位置P₀表示对象414的质心与将毛细管一分为二的焦平面重合的位置。焦平面F₀可以有利地位于垂直于物镜420的光轴的平面中。相反地，位置P₉₀位于沿着物镜420的光轴或与焦平面F₀成90°角的平面中。F₀与F_n之间的距离h在90°时最大，等于值a。位置P_n对应于与焦平面F₀成角度β_n的位置。只显示了毛细管的内壁。试料的路径取决于其到旋转中心422的距离。

在本发明用于调节焦平面跟踪的过程的一个有用的示例性实施方式中，焦点首先被设定在F₀，通过定焦在内管壁上在管壁离得最远的截面(section)处可以得到该F₀。用于确定F₀的可选方法是在内管壁处找到光反差反向零交叉。最优的焦点可以通过操作者通过透镜观察得到，或更优选地，通过机器视觉算法在由计算机控制调节焦点时定位图像内的最清晰的边缘来得到。然后管旋转427直到试料位于离中心422的最大距离且处于与管壁在最宽间隔处的相同的焦平面F₀中。感兴趣结构的质心被设置并以光标来标记或使用标准机器视觉算法来标记。使用可用机器视觉工具来测量质心到旋转中心的距离。有用的机器视觉工具可以根据语言来构建，该语言例如是美国德克萨斯州奥斯汀美国国家仪器有限公司(National Instruments of Austin，TX)的Labview^TM软件。测量的距离值用于使用等式F_n＝F₀+(a sin(β_n))以对应的旋转角(β_n)来计算焦平面(h_n)的改变。然后h_n被转换成信号，该信号被发送到压电物镜定位器421，该压电物镜定位器421根据试料的平移的质心以正弦函数来移动物镜。

例如，如果a被测量为10μm，则旋转1°，试料就远离焦平面0.174μm。在90°，F_n距离F₀为10μm，而在180°，F₀和F_n相同。

现在参考图21a，b和c，其中显示了在光学投影层析成像显微镜中成像期间单个扁平细胞的图像。细胞包括细胞核nuc，nuc在毛细管壁tw内被细胞质cyt围绕。图21a显示了在起始位置的细胞，其中细胞旋转到该细胞的细胞核离管中心的距离最大时的位置。图21b显示了旋转90°后的细胞。细胞核现在出现在管的中心。图21c显示的细胞的细胞核的位置在180°旋转循环的末端。在图21a至图21c中，管壁tw被显示为在细胞之上以及之下的水平线。虚线表示毛细管的中心(tw＝管壁，cyt＝细胞质，nuc＝细胞核)。

测试焦平面跟踪的方法是将对象414放在起始位置P₀。对质心415进行标记，然后旋转试料直到该试料被精确定位在两个管壁的中间，而没有改变焦点。在一种实施中，在毛细管开始旋转之前就开始数据获取。一旦旋转管，对象应当在旋转循环的中间时刻到达焦点。如果获得伪投影，则对象应当在250个伪投影的编号为125的伪投影时刻到达焦点。

在旋转期间诸如对象运动方向和对象速度的变量也可以帮助确定对象半径和角度。一般来说，通过单个曝光期间在照相机上扫描物镜获得的诸如伪投影的扩展的景深图像可以被用于产生图像，这是因为不需要对象位置的先验知识。图像的最大景深为管的内径。

由于过度扫描常常导致扩展的景深图像中的分辨率和对比度的丢失，因此最好是优化景深扩展使得在不需要明显过度扫描的情况下包含对象。可以通过测量对象的广度来确定优化的景深扩展。然后对象的广度可以用于最小化扫描范围以产生扩展的景深伪投影图像。使用在对象跟踪校准期间获得的图像数据(或如果需要可以获得另外的图像数据)，可以确定对象广度。通过沿着垂直于管轴的方向在至少两个角度确定对象的广度，可以找到最小扫描范围。选择的两个视角必须相差90度。

例如，通过在0度位置找到对象广度，可以通过将对象旋转到90度位置来找到最小扫描范围。同样地，通过在对象处于90度位置时测量对象广度，可以在0和180度确定最小扫描范围。除了通过90度的最小旋转采集多个图像来确定最大对象广度，在第一旋转角度θ和第二旋转角度θ+90°可以采取对象广度的两个扩展景深测量，并且对象广度的最差情况值可以根据以下关系来计算：

减小物镜扫描范围可能需要为用于3D重建的伪投影中的校准精确性或对比度保存提升图像质量。在这种情况下，扫描范围被细分为多个部分，以及获得的多个扩展的景深图像。

在本发明的方法的另一个实施方式中，控制信号根据对象的平移的质心以正弦曲线方式(sinusoidally)移动物镜。管具有旋转循环，距离值和一组角度值可以用于计算物镜位置的成比例的正弦函数。该正弦函数具有与旋转循环成比例的波长。

在本发明的方法的另一个实施方式中，产生旋转的对象的投影图像的步骤包括在层析成像重建期间将投影图像集中在重建圆周内。正弦函数可以由例如正弦函数的导数的另外的函数来调整，以进一步控制物镜的扫描从而形成伪投影。使用诸如导数的辅助函数，用于在旋转期间更精确地保存所产生的感兴趣对象、细胞、结构或其它项的图像中的更高空间频率和图像对比度。

本发明的方法的其它变形通常识别出焦平面运动可能不等于物镜的运动。更具体地，是与光学投影层析成像有关的穿过对象的焦平面的运动。在一个示例性变形中，由于成像偏差可能是第一阶球面像差引起的，因此如上所述的基础正弦波函数焦平面调节被预先扭曲以具有预先补偿值，以在整个视区将轴移动校正在最佳焦点。

在另一个示例中，调节焦平面的预先补偿查找表通过使用位于视区的不同区域的隔离的微球体来执行。在另一个示例中，使用特定毛细管夹层的预先补偿校准在扫描每一个样本之前被执行。在又一个示例中，在管旋转时而不是使用夹层中静止的管来解决管的偏心率时执行调节焦平面的预先补偿。在另一个示例中，焦平面是用于在细胞旋转时胶的厚度变化的预先补偿。

这里以相当多的细节描述了本发明以符合专利法规并给本领域技术人员提供应用本发明新颖的原理所需的信息，并构建并使用所需的示例性及专用的部分。然而应当理解的是可以通过特定的不同设备来执行本发明，且装置和重建算法以及对设备细节和操作过程的各种修改可以在不脱离本发明正确的精神和范围的情况下实现。

Claims (18)

1、一种用于在光学层析成像系统中跟踪对象(414)的方法，其中所述对象(414)被包含在具有旋转中心(422)的管(410)中，所述对象(414)具有质心(415)，且所述对象(414)偏离所述旋转中心，该方法包括以下步骤：

通过在所述对象(414)旋转时穿过扩展的景深扫描所述对象(414)来获得图像数据；

计算所述对象(414)的质心(415)离所述旋转中心的距离值，其中所述距离值是根据所获得的图像数据来计算的；

计算在所选择的位置(P_n)中的所述对象(414)的旋转角度值(β_n)，其中所述旋转角度值(β_n)是根据所获得的图像数据来计算的；

确定所述对象(414)的广度；以及

将被扫描的扩展的景深限定为小于或等于所述对象(414)的广度，从而提高产生的伪投影图像中的图像分辨率。

2、根据权利要求1所述的方法，其中获得图像数据的步骤包括将物镜(420)定焦在焦平面(F_n)上，所述方法还包括将所述距离值和一组旋转角度值(β_n)转换成用于控制所述物镜(420)的平移的控制信号以使得所述焦平面跟踪所述对象(414)的中心的步骤。

3、根据权利要求2所述的方法，其中确定所述对象(414)的广度的步骤根据以下关系来计算：

其中

object_extent表示所述对象(414)的广度；

extent_θ表示在选择的旋转角θ处得到的所述对象(414)的广度的第一测量结果；以及

extent_θ+90°表示在选择的旋转角θ+90°处得到的所述对象(414)的广度的第二测量结果。

4、根据权利要求2所述的方法，其中所述物镜(420)根据所述对象(414)的平移的质心(415)而以正弦曲线方式移动。

5、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋转循环，且所述距离值和一组角度值用于计算物镜(420)位置的正弦函数，该正弦函数具有与所述旋转循环成比例的波长。

6、根据权利要求5所述的方法，其中通过附加函数来调节所述正弦函数以控制所述物镜(420)的扫描，从而形成伪投影。

7、根据权利要求1所述的方法，该方法还包括产生旋转的对象(414)的投影图像的步骤。

8、根据权利要求1所述的方法，其中在旋转期间在所述对象(414)内的至少一个结构的所产生的图像中保持更高的空间频率和图像对比度。

9、根据权利要求1所述的方法，该方法还包括以下步骤：

在一组视角处扫描所述对象(414)的至少一个特征，以产生一组图像；

根据所述一组图像来确定存在0度视角，在该0度视角处所述至少一个特征在离管轴最大距离处被测量；以及

相对于所确定的0度视角校准伪投影系统。

10、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)包括管轴，所述方法还包括以下步骤：

在一组视角处扫描所述对象(414)的至少一个特征，以产生一组图像；

根据所述一组图像来确定90度位置(P₉₀)，在该90度位置(P₉₀)所述至少一个特征出现在所述管(410)中间的第一图像中且与所述物镜(420)最接近；

对应于将所述管(410)旋转90度以返回到0度位置，选择第二图像；

测量所述第二图像来得到对象离所述管轴的距离以确定半径；以及

相对于所确定的0度位置校准伪投影系统。

11、根据权利要求1所述的方法，该方法还包括以下步骤：

在一组视角处扫描所述对象(414)的至少一个特征，以产生一组图像；

根据所述一组图像，针对对应于所述一组视角的图像测量所述至少一个特征离管轴的距离；以及

针对所述一组视角中的至少一个视角，计算适合找到半径和角度的余弦函数。

12、根据权利要求1所述的方法，该方法还包括以下步骤：

获得图像并将所述对象(414)的至少一个特征定位在所述管(410)中初始定位的位置；

测量所述至少一个特征离管轴的距离；

沿着物镜(420)的光轴扫描该物镜(420)，以找到所述至少一个特征的深度；以及

根据所述距离和深度测量结果来确定所述至少一个特征的半径和角度。

13、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有内管壁(412)，所述方法还包括以下步骤：

通过定焦在所述内管壁(412)上截面处来将焦点设定在初始焦平面(F₀)，在所述截面处所述初始焦平面位于穿过管(410)的中心轴横切所述管(410)的平面上；

旋转所述管(410)直到具有质心(415)的感兴趣结构呈现接近所述内管壁(412)中的一个；

标记所述感兴趣结构的质心(415)；

测量所述质心(415)到所述旋转中心的距离(a)；

根据等式F_n＝F_o+(a sin(β_n))在每一个旋转角(β)计算焦平面的改变(h_n)；以及

将h_n转换成传送到物镜定位器(421)的信号，该物镜定位器(421)根据所述感兴趣结构的平移的质心(415)来以正弦函数形式移动所述物镜。

14、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋转循环，且所述距离值和一组角度值用于计算物镜(420)位置的正弦函数，所述正弦函数具有与所述旋转循环成比例的波长，且其中所述正弦函数以预先补偿值被预先扭曲，以在整个视区将轴移动校正在最佳焦点。

15、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋转循环，且所述距离值与一组角度值用于计算物镜(420)位置的正弦函数，所述正弦函数具有与所述旋转循环成比例的波长，且其中使用位于视区的不同区域的隔离的微球体来校准用于调节所述正弦函数的预先补偿查找表。

16、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋转循环，且所述距离值与一组角度值用于计算物镜(420)位置的正弦函数，所述正弦函数具有与所述旋转循环成比例的波长，且其中在扫描每一个样本之前执行使用特定毛细管夹层的预先补偿校准。

17、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋转循环，且所述距离值与一组角度值用于计算物镜(420)位置的正弦函数，所述正弦函数具有与所述旋转循环成比例的波长，且其中在所述管(410)旋转时执行用于调节所述正弦函数的预先补偿。

18、根据权利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋转循环，且所述距离值与一组角度值用于计算物镜(420)位置的正弦函数，所述正弦函数具有与所述旋转循环成比例的波长，且其中所述正弦函数是在所述管(410)旋转期间用于胶的厚度变化的预先补偿。

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