CN101533015B - 结核抗体阵列检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结核抗体阵列检测方法及其阵列检测试剂盒，其检测方法包括：(1)将胶体金标记的抗人球蛋白IgG载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被由2种基因工程表达的结核分枝杆菌抗原形成的2条检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有结核分枝杆菌抗体则在检测载体上形成至少一条检测线，检测载体上控制线及1条或2条检测线为阳性，否则为阴性。该检测卡包括加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标抗人IgG抗体层。在检测层上包被有由2种基因工程表结核分枝杆菌抗原形成的2条检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线。本发明的方法为“一步法”、多靶点，快速检测方法，灵敏度高、特异性强；且快速、简便，无需专门设施。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于诊断、检测结核抗体的阵列检测方法，以及用于该方法的结核抗体阵列试剂盒和其制备方法。
背景技术
各种资料显示全球约三分之一人口感染了结核菌。每年约有800万新病例，年死亡人数超过150万。为此结核成为2000～2001年WHO防治传染病的重点控制对象。2000年12月20日卫生部公布了第四次全国结核病流行病学抽样调查结果：我国结核病情相当严重，在部分地区甚至有蔓延的趋势。据调查全国有1/3以上人口感染了结核菌，其中有10％的人已经发病；如不采取有效措施，在未来十年内，可能有3000万人感染结核。目前我国传染性结合患病率为157.8人/10万，且呈蔓延趋势，现已有传染性肺结核病人65万人。
控制结核病的重点是监控痰涂片阳性结核病患者，使发病患者及早得到治疗。对结核菌感染者进行早期监控和治疗防止发病。
目前诊断结核的方法主要有：痰涂片结核菌检查、结核菌素试验(PPD)、结核杆菌聚合酶链反应(PCR)和结核杆菌抗体检测等方法。在上述方法中痰涂片方法的特异性最高达100％，但敏感性低为22.2％。结核菌素实验(PPD试验)敏感性有所提高，但存在特异性差；结核杆菌聚合酶链反应(PCR)虽然具有较高的敏感性和特异性，但推广有一定困难，而且试验仪器设备昂贵，对操作人员和环境要求高，人为误差较大。结核杆菌抗体检测的敏感性高达60％～80％，但也同样存在特异性不高的问题。因此，在结核的诊断中，几种方法可以相互配合。
在上述几种方法中相比，结核抗体检测方法比较简便，快速。有利于结核 早期诊断，但单一抗原检测敏感性有限。目前临床已经应用的结核抗体检测方法有酶联法免疫吸附试验ELISA，但ELISA法实验过程需要2～3步，结果判定需1～2小时，而且需要专门实验设施和专业操作人员。
本发明的公开
本发明的第一目的是为了提供一种结核抗体阵列检测方法，该方法为“一步法”、多靶点、快速检测方法，灵敏度高、特异性强：而且检测速度快，操作简便，无需专门设施。其特点在于应用两种具有互补作用的抗原作检测抗原，其敏感性大于单一检测抗原，适用于结核病的临床检测、流行病学调查等。
本发明的第二目的是为了一种结核抗体阵列检测试剂盒，该试剂盒为结核抗体检测提供一种简便、快速、多靶点的“一步法”阵列检测试剂盒，利用该试剂盒检测结核抗体的灵敏度高、特异性强，而且速度快，操作简便，无需专门设施，其敏感性大于单一检测抗原。
本发明的第三个目的是为了提供一种结核抗体阵列检测试剂盒的制备方法，该方法简便、稳定性好、重复性好。
本发明的第一目的可通过如下措施来实现：
一种结核抗体阵列检测方法，包括下述步骤：(1)将胶体金标记的抗人球蛋白IgG载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被由2种基因工程表达的结核分枝杆菌抗原形成的2条检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有结核分枝杆菌抗体则在检测载体上形成至少一条检测线，检测载体上控制线及1条或2条检测线为阳性，否则为阴性。
本发明的第二目的可通过如下措施来实现：
一种结核抗体阵列检测诊断试剂盒，试剂盒由检测卡和样品稀释液组成。 检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。
所述的检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标抗人IgG抗体层。在检测层上包被有由2种基因工程表达的结核分枝杆菌抗原形成的2条检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线。
本发明的第三个目的可通过如下措施来实现：
一种结核抗体阵列检测诊断试剂盒的制备方法主要包括金标抗体层和检测层及其上包被控制线和检测线的制备，以及检测条和检测卡的组装。
所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤：i胶体金的制备：在浓度为0.004％～0.012％的氯金酸中加入其体积的1.3％～2％、浓度为1％～3％的柠檬酸三钠，煮沸10～20分钟，可得到15～50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗人IgG单克隆抗体，在胶体金溶液中用0.2m碳酸钾溶液调PH8.0～8.4，按4～12mg/100ml加入抗人IgG单克隆抗体，搅拌后，再在溶液中按0.1％～0.6g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2～4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10～15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60～80分钟离心得沉淀物；v将沉淀物按4～10ml/100ml溶于0.02MPh7.4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0.2％～0.6％的动物血清蛋白和0.01％～0.06％叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥过滤形成金标抗体层。
所述的检测层的制备，在制备的纯化兔或羊抗鼠IgG抗体和2种基因工程表达的结核分枝杆菌抗原中加入固定剂，用专用喷膜机在纤维素膜上形成1条控制线和2条检测线；其制备方法是在浓度为0.8-2.4mg/ml的抗原或抗体溶液中加入0.1％-0.3％的固定剂，利用专用喷膜机将抗原或抗体在NC膜上喷线，喷膜 后37℃干燥，再用含10％小牛血清的0.01mPH7.0PBS液封闭30分钟，0.01mPH7.0PBS漂洗、37℃干燥得检测层。
所述的固定剂选自甲醛、丙酮中的一种。
本发明相比现有技术具有如下优点：
1、本发明的检测结核抗体的方法为多靶点、一步法，较单一抗原检测法具有更高度的灵敏度和特异性，其检测快速，结果判定在3～15分钟内完成，无需专门设施。
2、本发明的阵列检测试剂盒检测结核抗体时具有高度的特异性和高灵敏度，检测过程操作迅速、快捷、方便，适合结核感染人群的临床诊断和流行病学调查。
3、本发明的结核抗体阵列检测试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。
图面说明
图1是本发明检测卡的结构示意图
1-检测卡 2-加样孔 3-观察孔
图2是本发明检测卡的内部结构示意图
4-加样端吸水层 5-金标抗体层 6-控制线
7-检测线1 7a-检测线2 8-检测层 9-吸水端
吸水层 10-衬板
本发明的实施方式
本发明还将结合实施例作进一步详述：
实施例一：
一种结核抗体阵列检测方法，包括下述步骤：(1)将胶体金标记的抗人 球蛋白IgG载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被由2种基因工程表达的结核分枝杆菌抗原形成的2条检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有结核分枝杆菌抗体则在检测载体上形成至少一条检测线，检测载体上控制线及1条或2条检测线为阳性，否则为阴性。
参照图1，一种结核抗体阵列检测卡1
参照图2，所述结核抗体阵列检测条是在衬板10上设有加样端吸水层4、检测层8和吸水端吸水层9，在检测层8和吸水端吸水层9之间设有金标抗人IgG抗体层5；在检测层8上包被有检测线7、7a和控制线6。其中加样端吸水层4由多层玻璃纤维或无纺布制成，吸水端吸水层9由多层滤纸制成。检测层8为纤维素膜，该纤维素膜可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维膜。金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。
一种结核抗体阵列检测卡的制备方法包括金标抗体层5和检测层8上检测线7、7a和控制线6的包被，然后在衬板10上组合结核抗体阵列检测卡。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水层4和吸水端吸水层9；在其中段粘贴包被检测线和控制线的检测层8，在加样端吸水层4与检测层8的交接部位，夹贴金标抗体层5纤维载体，纤维载体4/5部分夹在加样吸水层4中间，1/5部分叠在检测层8上。然后按4-5毫米宽、8厘米长规格切条，在组装在塑料卡盒内，盒盖上加样孔2正对检测条加样端吸水层4，观察孔3正对检测层8。
所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤：i胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、在浓度为1％的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，可得到15～50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗人IgG单克隆抗体，取100ml胶体金溶液，用0.2m碳酸钾溶液调PH8.4，入6mg抗人IgG单克隆抗 体，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白(BSA)，继续搅拌5分钟，4℃静置2～4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10～15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心得沉淀物；v将沉淀物溶于4ml 0.02M PH7.4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0.25％BSA和0.02％叠氮钠；vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥2小时形成金标抗体层5。
所述胶体金标记抗体为抗人IgG单克隆抗体。
所述的检测层8是在硝酸纤维膜(NC)上设有2种基因工程表达的结核分枝杆菌抗原构成的检测线7、7a和有羊抗鼠IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取基因工程表达的结核分枝杆菌抗原，调浓度为1mg/ml，加入0.2％甲醛，用专用喷膜机在NC膜中断喷检测线7和7a，两线相距0.2cm；取羊、兔抗鼠IgG抗体，调浓度为2mg/ml，加入0.2％甲醛，用专用喷膜机在NC膜中断，距检测线0.3cm处喷控制线6，检测线和控制线均按20ul/ml设置喷量，喷膜在37℃干燥2小时，再用含10％小牛血清的0.01mPH7.0PBS液封闭37℃30分钟，0.01mPH7.0PBS漂洗、37℃干燥。
实施例二：
结核抗体检测方法及其阵列检测试剂盒与例一同。
该试剂盒的制备方法除制备控制线的抗体为兔抗鼠IgG外，其他条件与例一同。
Claims (1)
1.一种结核抗体阵列检测诊断试剂盒，该试剂盒由检测卡(1)和样品稀释液组成，检测卡(1)由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡盒内，其特征在于所述结核抗体阵列检测卡(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层(4)、检测层(8)和吸水端吸水层(9)，在检测层(8)和吸水端吸水层(9)之间设有金标抗人IgG抗体层(5)；在检测层(8)上包被有2条检测线(7、7a)和1条控制线(6)；所述的2条检测线(7、7a)是在硝酸纤维膜上设有由2种基因工程表达的结核分支杆菌抗原构成的；所述的控制线(6)由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的；所述检测线和控制线的制备方法为在浓度为0.8-2.4mg/mL的抗原溶液中加入0.1％-0.3％的固定剂，利用喷膜机将抗原或抗体在NC膜上喷线，喷膜后37℃干燥，再用含10％小牛血清的0.01M pH7.0的PBS液封闭30分钟，0.01M pH7.0的PBS漂洗、37℃干燥得到；所述固定剂选自甲醛、丙酮中的一种。
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