JPWO2020045625A1 - イムノクロマトグラフキットおよび結核菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、結核菌を高感度かつ特異的に検出することができるイムノクロマトグラフキットおよび方法を提供することである。本発明によれば、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質と、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体と、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを含み、上記の第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、モノクローナル抗体である、結核菌の検出のためのイムノクロマトグラフキットが提供される。

Description

本発明は、標識物質、多孔性担体、銀を含む化合物、および銀イオンを還元し得る還元剤を含む、結核菌の検出のためのイムノクロマトグラフキットに関する。本発明はさらに、標識物質、多孔性担体、銀を含む化合物、および銀イオンを還元し得る還元剤を用いた結核菌の検出方法に関する。

免疫測定方法の中でもイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、一般的によく利用されている。イムノクロマトグラフ法で用いられている免疫反応としては、競合的反応またはサンドイッチ型反応が広く使われている。その中でも、イムノクロマトグラフ法ではサンドイッチ型反応が主流であり、その典型例においては、試料中の抗原よりなる被検物質を検出するために、以下のような操作が行われる。まず、被検物質である抗原に対する抗体により感作させた微粒子を固相微粒子としてクロマトグラフ担体に固定化することにより、あるいはこの抗体そのものをクロマトグラフ担体に直接固定化することにより、反応部位を有するクロマトグラフ担体を調製する。一方、標識微粒子に被検物質に対する抗体を感作させて感作標識微粒子を調製する。この感作標識微粒子を試料と共に、クロマトグラフ担体上でクロマトグラフ的に移動させる。以上の操作により、クロマトグラフ担体に形成された反応部位において、固定化された抗体が固定化試薬となり、これに被検物質である抗原を介して感作標識微粒子が特異的に結合する。その結果、感作標識微粒子が反応部位に捕捉されることにより生ずるシグナルの有無または程度を目視で判定することにより、試料中の被検物質の存在の有無または量を測定することができる。

イムノクロマトグラフ方法においては、感度が低いために抗原が検出されない偽陰性の問題を回避するために、検出シグナルを増幅させる場合がある。シグナル増幅の方法としては、標識としてアルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素を用いる方法、並びに金属コロイド標識および金属硫化物標識からなる群から選ばれる標識に、銀を含む化合物、および銀イオンを還元し得る還元剤を用いて増感する方法(銀増幅)が知られている。

結核における主要な抗原は、細胞膜および細胞壁の主要構成成分である糖脂質である。その中でも、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）を検出し、結核感染症を診断することが知られている。例えば、特許文献１には、リポアラビノマンナンに特異的に結合するモノクローナル抗体および上記抗体を用いた抗酸菌症のイムノアッセイが記載されている。特許文献２には、リポアラビノマンナンに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイが記載されている。特許文献３には、リポアラビノマンナンに特異的に結合するポリクローナル抗体を用いた結核菌検出法およびキットが記載されている。特許文献４には、リポアラビノマンナンに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた結核菌検出法およびキットが記載されている。非特許文献１には、リポアラビノマンナンの５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロフラノース構造（ＭＴＸ構造とも言う）を含むエピトープを認識するモノクローナル抗体を用いたリポアラビノマンナンの検出が記載されている。非特許文献２には、リポアラビノマンナンに特異的に結合するポリクローナル抗体を用いた結核菌検出法およびキットが記載されている。

国際公開ＷＯ２０１３／１２９６３４号公報 国際公開ＷＯ２０１７／１３９１５３号公報 特表２００８−５０７５４４号公報 国際公開ＷＯ２０１２／１０２６７９号公報

ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１２，１２：１０３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｍａｙ １；２００（９）：３０５３−３０６６．

リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）を検出し、結核感染症を診断する既存のキットおよび方法においては、診断感度の不足、並びにポリクローナル抗体を使用していることにより非結核性抗酸菌群との交差反応を起こすことによる、結核菌に対する特異度の不足などが指摘されている。診断感度の不足は、結核の治療の遅れに繋がり、また特異度の不足は、抗結核薬に抵抗性を持つ非結核性抗酸菌群に対する誤った治療に繋がるため、ＬＡＭを高感度かつ特異的に検出するキットおよび方法が望まれている。

本発明は、結核菌を高感度かつ特異的に検出することができるイムノクロマトグラフキットおよび方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質と、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体とを含む、結核菌の検出のためのイムノクロマトグラフキットにおいて、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを含め、かつ第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方を、モノクローナル抗体とすることによって、結核菌を高感度かつ特異的に検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質と、
リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体と、
銀を含む化合物と、
銀イオンを還元し得る還元剤とを含み、
上記の第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、モノクローナル抗体である、
結核菌の検出のためのイムノクロマトグラフキット。
［２］上記の第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、リポアラビノマンナンの５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロフラノース構造を認識するモノクローナル抗体である、［１］に記載のイムノクロマトグラフキット。
［３］上記の第一の抗体および第二の抗体がともに、モノクローナル抗体である、［１］または［２］に記載のイムノクロマトグラフキット。
［４］標識物質が、金属粒子である、［１］から［３］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［５］標識物質が、金、銀、白金、またはそれらの化合物である、［１］から［４］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［６］標識物質の平均粒子径が１ｎｍ〜５００ｎｍである、［１］から［５］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［７］銀を含む化合物が硝酸銀である、［１］から［６］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［８］銀イオンを還元し得る還元剤が、Ｆｅ^２＋である、［１］から［７］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［９］多孔性担体がニトロセルロース担体である、［１］から［８］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１０］銀イオンを還元し得る還元剤を検出するための発色試薬を有する、［１］から［９］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１１］上記発色試薬が、イオンに反応して発色する化合物である、［１０］に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１２］上記発色試薬が、Ｆｅ^２＋イオンと反応して発色する化合物である、［１０］または［１１］に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１３］上記発色試薬が、フェナントロリン骨格を有する化合物である、［１０］から［１２］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１４］上記発色試薬が、Ｈ^＋イオンと反応して発色する化合物である、［１０］または［１１］に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１５］上記発色試薬が、多孔性担体に担持されている、［１０］から［１４］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１６］上記発色試薬が、被検試料を含む水溶液または銀イオンを還元し得る還元剤を含む水溶液のいずれかを展開した際に、多孔性担体中を実質的に移動しない発色試薬である、［１０］から［１５］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１７］上記反応部位を有する多孔性担体と、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを内包するハウジングケースとを備える、［１］から［１６］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１８］破断可能な部材を備えたポットをさらに含み、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とがそれぞれ上記ポットに封入されている、［１］から［１７］の何れか一に記載のイムノクロマトグラフキット。
［１９］上記ポットが、外力によって破断される、［１８］に記載のイムノクロマトグラフキット。
［２０］試料中のリポアラビノマンナンと、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質との複合体を、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体上に展開する工程と、
上記反応部位において、上記複合体を捕捉する工程と、
上記反応部位において捕捉された上記複合体の標識物質を、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを用いて増幅する工程とを含み、
上記第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、モノクローナル抗体である、
結核菌の検出方法。
［２１］上記の第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、リポアラビノマンナンの５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロフラノース構造を認識するモノクローナル抗体である、［２０］に記載の結核菌の検出方法。
［２２］検出時に１μｍ以上２０μｍ以下の平均粒径を有する標識物質を検出する、［２０］または［２１］に記載の結核菌の検出方法。

本発明のイムノクロマトグラフキットおよび方法によれば、結核菌を高感度かつ特異的に検出することができる。

図１は、イムノクロマトグラフキットの一例を示す斜視図である。 図２は、イムノクロマトグラフキットの一例を示す分解概略斜視図である。 図３は、検査用ストリップ、第１のポットおよび第２のポットの位置関係を示す模式側面図である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。

本発明による結核菌の検出のためのイムノクロマトグラフキットは、
リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質と、
リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体と、
銀を含む化合物と、
銀イオンを還元し得る還元剤とを含むキットであって、第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、モノクローナル抗体であるキットである。

本発明による結核菌の検出方法は、
試料中のリポアラビノマンナンと、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質との複合体を、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体上に展開する工程と、
反応部位において、複合体を捕捉する工程と、
反応部位において捕捉された上記複合体の標識物質を、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを用いて増幅する工程とを含む方法であって、
第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、モノクローナル抗体である、方法である。

本発明のイムノクロマトグラフキットおよび結核菌の検出方法によれば、結核菌の定性分析または定量分析を行うことができ、これにより結核の診断を行うことができる。

第一の抗体および第二の抗体の組み合わせとしては、
第一の抗体がモノクローナル抗体であり、第二の抗体がポリクローナル抗体である場合；
第一の抗体がポリクローナル抗体であり、第二の抗体がモノクローナル抗体である場合；並びに
第一の抗体がモノクローナル抗体であり、第二の抗体がモノクローナル抗体である場合を挙げることができる。上記の中でも、第一の抗体がモノクローナル抗体であり、第二の抗体がモノクローナル抗体である場合が好ましい。

リポアラビノマンナンに対する第一の抗体およびリポアラビノマンナンに対する第二の抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、リポアラビノマンナンによって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、リポアラビノマンナンによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］または一本鎖抗体（ｓｃＦｖなど）を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。

リポアラビノマンナンに対する第一の抗体およびリポアラビノマンナンに対する第二の抗体のうちの少なくとも一方は、リポアラビノマンナンの５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロフラノース構造（ＭＴＸ構造とも言う）を認識するモノクローナル抗体であることが好ましい。

リポアラビノマンナンに対する第一の抗体の一例としては、国際公開ＷＯ２０１７／１３９１５３に記載のＡ１９４−０１抗体を使用することができる。Ａ１９４−０１抗体に関する国際公開ＷＯ２０１７／１３９１５３に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。

Ａ１９４−０１抗体の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を以下に記載する。
軽鎖CDR1: RSIRSA (配列番号１)
軽鎖CDR2： GAS (配列番号２)
軽鎖CDR3：QQYDFWYTF (配列番号３)
重鎖CDR1：GFNFEDFG (配列番号４)
重鎖CDR2：ISWNGANI (配列番号５)
重鎖CDR3：IDWYRDDYYKMDV (配列番号６)

Ａ１９４−０１抗体の重鎖および軽鎖の塩基配列およびアミノ酸配列の配列番号を以下に示す。

重鎖の塩基配列(配列番号７)
重鎖のアミノ酸配列（配列番号８）
軽鎖の塩基配列（kappa)（配列番号９)
軽鎖のアミノ酸配列（kappa)（配列番号１０)

リポアラビノマンナンに対する第二の抗体の一例としては、国際公開ＷＯ２０１３／１２９６３４の段落番号［００８０］において ＭｏＡｂ１として記載される配列を有する抗体（以下、ＭｏＡｂ１抗体と称する）を挙げることができる。ＭｏＡｂ１抗体に関する国際公開ＷＯ２０１３／１２９６３４に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。非特許文献２によれば、ＭｏＡｂ１抗体は、リポアラビノマンナンの５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロフラノース構造（ＭＴＸ構造とも言う）を含むエピトープを認識するモノクローナル抗体である。

ＭｏＡｂ１抗体としては、下記(a)〜(c)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(d)〜(f)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカーを介して接合してなる構造を有する抗体が含まれる。
（a）配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1
（b）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2
（c）配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3
（d）配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1
（e）配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2
（f）配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3

ＭｏＡｂ１抗体の重鎖可変領域は、好ましくは配列番号１７で示される１１９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、また軽鎖可変領域は、好ましくは配列番号１８で示される１１２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する。

１．イムノクロマトグラフ
一般には、イムノクロマトグラフ（以下、クロマトグラフとも言う）方法とは以下のような手法で被検物質を簡便・迅速・特異的に判定および測定する手法である。すなわち、被検物質と結合可能な固定化試薬（具体的には抗体）を有する検出部位の少なくとも１つを有する標識物質捕捉領域を有することが可能な抗体固定化メンブレン（多孔性担体）を固定相として用いる。この多孔性担体上で、被検物質に対する第一の抗体によって修飾された標識物質を含む液を移動層としてクロマトグラフ的に移動させると共に、被検物質と標識物質とが特異的に結合しながら、検出部位を有する標識物質捕捉領域まで到達する。標識物質捕捉領域の検出部位において、被検物質と標識物質の複合体が、固定化された第二の抗体に特異的に結合することにより、被検試料中に被検物質が存在する場合にのみ、第二の抗体に標識物質が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被検試料中に被検物質が存在することを定性的および定量的に分析する手法である。

本発明におけるクロマトグラフ方法においては、標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬、具体的には、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを使用し、標識物質捕捉領域上の固定化試薬に結合した被検物質と標識物質の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフを行うことができる。

２．被検試料
本発明のクロマトグラフ方法およびキットを用いて分析することのできる被検試料としては、被検物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体（スワブ）、うがい液、または動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。本発明における被検物質は、リポアラビノマンナン、リポアラビノマンナンの部分構造、またはリポアラビノマンナンを含む結核菌群、抗酸菌群などである。

３．被検試料の前処理
本発明のクロマトグラフ方法では、被検試料をそのままで、あるいは、被検試料を適当な方法で濃縮した形で、あるいは被検試料に適当な前処理用成分を添加した形で、あるいは、被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。本発明で用いられる抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、または緩衝液等）、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。

４．構成
本発明のクロマトグラフキットにおいては、クロマトグラフ用ストリップを組み込み使用することができる。使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。

本発明において使用することができるクロマトグラフ用ストリップとしては、結核菌を含む被検試料の展開方向の上流方向から下流方向に向かって、標識物質保持領域、標識物質捕捉領域を有している。好ましい態様においては、クロマトグラフ用ストリップは、更に、発色試薬を有する領域を有している。本発明において、より好ましい態様としては、発色試薬を有する領域は、標識物質捕捉領域の下流方向に位置している態様であり、更には、試料添加パッド、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）、多孔性担体である抗体固定化メンブレン（例えば、標識物質捕捉領域を有する抗体固定化メンブレン）、および吸水パッドをこの順に、粘着シート上に配置する態様が好ましく用いられる。多孔性担体である抗体固定化メンブレンとしては、結核菌と特異的に結合する抗体を固定化した検出部位を少なくとも１つ有する領域である標識物質捕捉領域を有し、所望により、コントロール用抗体または抗原を固定化した領域であるコントロール部位（コントロール領域と記載することもある）を更に有していてもよい。

本発明で用いることができる標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドは、標識物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸水パッド（例えば、グラスファイバーパッド）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。

４−１．標識物質
本発明で用いる標識物質としては、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体を標識するのに用いる標識として、金属を含む標識物質を用いることが好ましい。標識物質は、金属粒子であることがさらに好ましい。本発明で用いることができる金属の種類としては、好ましくは、金、銀、白金の貴金属や、鉄、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、または水銀を用いることができ、それらの化合物を用いることができる。更に好ましくは金、銀、白金の貴金属を用いることができる。本発明において使用できる金属を含む標識物質の好ましい形態としては、金属コロイド標識または金属硫化物標識を用いることができる。本発明においては、金属コロイド標識としては、好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、または水酸化アルミニウムコロイドなどを用いることができ、金属硫化物標識としては、好ましくは、鉄、銀、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、または水銀の各硫化物を用いることができる。本発明においては更に好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、最も好ましくは金コロイドを用いることができる。金属コロイド標識として金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Nature Physical Science，241(1973)20等）により金コロイド粒子を調製することができる。

金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、３〜１００ｎｍがさらに好ましく、５〜６０ｎｍが特に好ましい。本発明に用いられる金属コロイドの平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。

平均粒径の測定方法としては、 粒径範囲および測定の容易さから、動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。

本発明によれば、検出用の標識物質として金属コロイド標識または金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるクロマトグラフにおいて、金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、被検物質と検出用標識物の複合体の形成後に、無機銀塩や有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオン、および銀イオンを還元し得る還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が金属系標識を核として金属系標識上に沈着するので、金属系標識が増幅され、被検物質の分析を高感度に実施することができる。即ち、本発明のクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析する。

４−２．抗体
本発明では、標識物質は、第一の抗体で修飾されている。 本発明のクロマトグラフキットは、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を標識物質捕捉領域に有している。

本発明において、第一の抗体を用いて標識物質を修飾する方法としては、例えば、金属コロイドと抗体との結合の場合は、以下に記載されている従来公知の方法（例えばＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，７ （１９８２）６９１−６９６）に従い、行うことができる。具体例としては、金属コロイドと抗体を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、金属コロイドで標識した抗体を得ることができる。

４−３．多孔性担体
本発明で用いることができる多孔性担体としては、特に、ニトロセルロース担体（ニトロセルロース膜など）、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。

本発明においては、多孔性担体の標識物質捕捉領域に、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を固定化させた検出部位を有する。リポアラビノマンナンに対する第二の抗体は、多孔性担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させて検出部位を形成させてもよいし、あるいはラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子を多孔性担体の一部にトラップさせて固定化させ、検出部位を形成してもよい。なお、多孔性担体は、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を固定化した後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理を施して使用することが好ましい。本発明の多孔性担体は、結合部位を複数有している態様も好ましく用いることができ、更には標識物質捕捉領域の一部として、所望により、上述のコントロール部位を有していてもよい。

４−４．標識物質保持パッド
本発明においては、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド、好ましくは金コロイド保持パッドをクロマトグラフキットに組み込んで使用する態様が好ましい。標識物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、および不織布等を好ましく使用することができ、前述のように調製した標識物質を一定量含浸し、乾燥させて標識物質保持領域とすることができる。

４−５．試料添加パッド
本発明のクロマトグラフキットは更に、試料添加パッドを組み込み使用することが好ましい。試料添加パッドは、添加された被検物質を含む試料を受け入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる態様が好ましい。試料添加パッドの材質としては、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、および綿布等の均一な特性を有するものが挙げられる。また、分析の際、試料中の被検物質が試料添加パッドの材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもできる。本発明においては、試料添加パッドは、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドを兼ねていてもよい。

４−６．吸水パッド
本発明においては、吸水パッドをクロマトグラフキットに好ましく組み込んで用いることができる。吸水パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸水パッドに届いてからのクロマトの速度は、吸水パッドの材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被検物質の測定に合った速度を設定することができる。

５．銀イオンを還元し得る還元剤を検出するための発色試薬
本発明で用いるクロマトグラフキットにおいては、発色試薬は、多孔性担体に担持されていることが好ましい。

本発明において、銀イオンを還元し得る還元剤を検出するための発色試薬としては、例えば、イオンに反応して発色する化合物を使用することが好ましい。第１の増幅試薬については本明細書中で後記するが、例えば、第１の増幅試薬が、２価の鉄イオン（Ｆｅ^２＋）を含む試薬である場合には、その発色試薬としては、Ｆｅ^２＋イオンと反応して発色する化合物を使用することができる。Ｆｅ^２＋イオンと反応して発色する化合物としては、Ｆｅ^２＋イオンと錯形成することで発色できる化合物を使用することができる。Ｆｅ^２＋イオンと反応して発色する化合物の具体例としては、フェナントロリン骨格を有する化合物［例えば、１，１０−フェナントロリン、５−メチルフェナントロリン、５−ニトロフェナントロリン、バソフェナントロリン（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）、またはバソフェナントロリンジスルホン酸など］、あるいはビピリジン骨格を有する化合物［例えば、２，２’−ビピリジンなど］を使用することができ、好ましくはフェナントロリン骨格を有する化合物を使用することができる。また、被検試料を含む水溶液と第１の増幅試薬を含む水溶液のｐＨが異なる場合には、第１の増幅試薬を検出するために、Ｈ＋イオンにより構造変化が起こって色味が変化する試薬を好ましく使用することができる。特に第１の増幅試薬を含む水溶液が酸性（ｐＨ７より小さい、Ｈ＋イオン濃度が高い）である場合には、酸性領域用のｐＨ指示薬として公知の発色試薬であるＨ＋イオンと反応して発色する化合物（例えば、メチルオレンジ、メチルレッド、コンゴーレッドおよびメチルイエローなどのジアゾ系の発色試薬、並びに、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープルおよびブロモチモールブルーなどのサルトン系の発色試薬）等を、増幅試薬を含む水溶液のｐＨに合わせて適宜選択して使用することが好ましい。上記の中でも、１，１０−フェナントロリン、バソフェナントロリンまたはブロモクレゾールグリーンをより好ましく使用できる。

発色試薬としては、被検試料を含む水溶液または銀イオンを還元し得る還元剤を含む水溶液のいずれかを展開した際に、多孔性担体中を実質的に移動しない発色試薬であることが好ましい。従って、発色試薬のＬｏｇＰ（水とオクタノール中での分配係数）が４．０以上であることが好ましく、５．０以上であることがより好ましい。ＬｏｇＰとしては実測値を用いてもよいが、簡便に判断する方法として、化学構造等から得られる計算値を用いることもできる。ＬｏｇＰを計算する方法としては、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ社のＣｈｅｍＤｒａｗＰｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ １２で使用されている計算方法が好ましい。代表的な発色試薬の応答性およびＬｏｇＰ（ＣｈｅｍＤｒａｗＰｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ １２による）を以下の表１に示した。

発色試薬を有する領域が、多孔性担体の検出部位を有する標識物質捕捉領域より下流に位置していることが好ましい。発色試薬をクロマトグラフキット内に保持する方法としては、後述する吸水パッドを発色試薬溶液に浸し減圧乾燥する方法、不溶性担体の標識物質捕捉領域よりも下流方向にライン状に塗布する方法などがある。
被検試料を含む水溶液または第１の増幅試薬を含む水溶液のいずれかを展開した際に、発色試薬が不溶性担体を実質的に移動する場合には、発色試薬を吸水パッドに含有させて使用することが好ましい。

被検試料を含む水溶液または第１の増幅試薬を含む水溶液のいずれかを展開した際に、発色試薬が不溶性担体中を実質的に移動しない場合には、標識物質捕捉領域を有する不溶性担体に発色試薬を担持させることが好ましい。
標識物質捕捉領域に第１の増幅試薬が到達したことをより小さいタイムラグで表示することを可能とするため、本発明においては発色試薬を不溶性担体に担持させる態様がより好ましい。

本発明において、被検物質を含む被検試料が添加される領域と、標識物質捕捉領域とを、被検物質を含む被検試料の展開方向に対して上流から下流の方向にこの順番で有するとは、被検試料を毛管現象や、吸水パッドを使用した場合の吸引力等を利用して展開させる場合に、被検物質を含む被検試料の展開方向に対して、上流方向、下流方向と定義する。本発明の具体的な態様では、標識物質保持領域から標識物質保持領域に向かって被検試料等を展開した場合に、標識物質保持領域の方向を上流方向、標識物質捕捉領域の方向を下流方向と定義する。

本発明の好ましい態様においては、標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうちの第１の増幅試薬を、標識物質捕捉領域の上流方向から標識物質捕捉領域の下流方向に展開し、発色試薬を有する領域における物理的または化学的変化を検出することによって、標識物質捕捉領域が第１の増幅試薬で満たされていることを確認する。発色試薬を有する領域における物理的または化学的変化としては、第１の増幅試薬と発色試薬との反応によって生じる発色や蛍光の変化等を検出することができる。好ましくは発色を検出することができる。このような物理的または化学的変化は、視覚的に検出してもよいし、検出機器を利用して検出してもよい。

６．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。まず、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体およびリポアラビノマンナンに対する第二の抗体を予め調製しておく。また、第一の抗体で、予め標識物質を修飾しておく。第二の抗体を、適当なクロマトグラフ担体（多孔性担体）（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、またはセルロ−ス膜等）上に固定して標識物質捕捉領域とし、リポアラビノマンナンを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と接触させると、その被検試料中にリポアラビノマンナンが存在する場合には、第二の抗体との結合（例えば、第二の抗体との抗原抗体反応）が起こる。被検物質と第二の抗体との結合と同時または結合後に、更に第一の抗体で修飾した標識物質を過剰量接触させると、被検試料中にリポアラビノマンナンが存在する場合には、固定化された第二の抗体とリポアラビノマンナンと第一の抗体で修飾した標識物質とからなる複合体が形成される。

サンドイッチ法では、固定化された第二の抗体とリポアラビノマンナン、およびリポアラビノマンナンと標識物質を修飾した第一の抗体との反応が終了した後、免疫複合体を形成しなかった標識物質を除去し、続いて、例えば、不溶性担体の標識物質捕捉領域をそのまま観察しその標識物質を検出、または定量し、被検試料中の被検物質の有無判定または量を測定することができる。本発明においては、例えば、還元剤および銀イオン含有化合物を供給することにより、かかる複合体を形成した標識物質からの信号を増幅し検出する。

７．増幅試薬
増幅試薬は、標識物質や被検物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる試薬であり、試薬を含有する溶液の状態、即ち増幅液として使用することができる。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。

詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を、増幅試薬を含有する増幅液として用いることができ、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅液として用いることができる。

本発明では、２種の増幅試薬を用いる。標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうち、第１の増幅試薬を第１の増幅液に、第２の増幅試薬を第２の増幅液に含有させておき、第１の増幅液および第２の増幅液を順次、添加することにより増幅を行うことが好ましい。第１の増幅液は、標識物質保持パッドおよび試料添加パッドよりも上流方向に位置する、還元剤溶液を送液するためのパッドに添加することが好ましい。

増幅液の具体例としては、銀イオンを還元し得る還元剤を含む第１の増幅液、および、銀を含む化合物を含む第２の増幅液の組み合わせを用いることができる。
以下、第１の増幅液に含まれる銀イオンを還元し得る還元剤と第２の増幅液に含まれる銀を含む化合物等について説明する。

７−１．銀を含む化合物
銀を含む化合物としては、銀イオン含有化合物、例えば、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。

無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に０．００１モル／ｍ²〜０．２モル／ｍ²、好ましくは０．０１モル／ｍ²〜０．０５モル／ｍ²含有されることが好ましい。

７−２．銀イオンを還元し得る還元剤
銀イオンを還元し得る還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Ｆｅ^２＋、Ｖ^２＋、Ｔｉ^３＋、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Ｆｅ^２＋を還元剤として用いる系では、クエン酸やＥＤＴＡを用いて酸化物であるＦｅ^３＋の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはＦｅ^２＋の金属塩が好ましい。

なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練している者にとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。

還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。

８．その他の助剤
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ₉Ｈ₁₉-Ｃ₆Ｈ₄-Ｏ-（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₅₀Ｈである。

増幅試薬をクロマトキットに点着する方法としては、還元剤溶液を送液するためのパッドに、第１の増幅液としての還元剤溶液を点着し、第２の増幅液としての銀イオン溶液を標識物質捕捉領域を含む領域に上から点着して、銀イオン溶液を不溶性担体の厚み方向に浸潤させる方法が好ましい。
２種の増幅試薬をクロマトキットに内蔵する方法としては、各増幅試薬を含む溶液を含むポットを、各増幅試薬を点着する部位の上部に配置する方法が挙げられる。還元剤溶液(第１の増幅液)を、還元剤溶液を送液するためのパッドの上部に置き、銀イオン溶液（第２の増幅液）を含むポットを銀イオン溶液充填孔のすぐ上部に設置することが好ましい。このように配置することにより、それぞれのポットを押すことで液が流れ、所定の部位に点着することができる。

９．イムノクロマトグラフキット
本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質を予め多孔性担体上に具えているものでもよいし、あるいは、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質を多孔性担体とは別に具えているものでもよい。この場合、多孔性担体とは別に具えられた、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質を、被検試料と混合した後に多孔性担体上を展開するなどの方法で測定を行うことができる。
本発明のイムノクロマトグラフキットはさらに、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを含む。

本発明のイムノクロマトグラフキットは、反応部位を有する多孔性担体と、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを内包するハウジングケースとを備えていてもよい。
本発明のイムノクロマトグラフキットは、破断可能な部材を備えたポットをさらに含み、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とがそれぞれ上記ポットに封入されていてもよい。この場合、上記ポットが、外力によって破断することができる。

図１は、本発明の一例を示すイムノクロマトグラフキット１００の概略斜視図であり、図２は、図１のイムノクロマトグラフキット１００の分解概略斜視図である。
図１および図２に示すように、本実施形態のイムノクロマトグラフキット１００は、試料液を展開させる、被検物質の検査領域を有する不溶性担体２を含む検査用ストリップ１と、検査領域における検出信号を増幅するための、第１の増幅液４１および第２の増幅液４６がそれぞれ封入された、シート部材を備えた一面を有する第１のポット４０および第２のポット４５とがハウジングケース９に内包されてなる。ハウジングケース９は、検査用ストリップ１が配置される収容部２１を備えた下部ケース２０と、下部ケース２０と周縁で接合された上部ケース１０と、上部ケース１０と下部ケース２０との間に配置された中間部材３０とを備えてなる。なお、本イムノクロマトグラフキット１００を説明するに当たっては、上部ケース１０側を上、下部ケース２０側を下と定義する。

中間部材３０は、第１のポット４０を受容し、第１の増幅液４１を不溶性担体２上に滴下させるための増幅液充填孔を底面に備えたポット収容部３２を有している。また、ポット収容部３２内の第１のポット４０のシート部材４３に面する位置にシート部材４３を破断する突起状の破断部３４が設けられている。本例においては、ポット収容部３２の上方に第１のポット４０が、そのシート部材４３を有する面が下面となるように配置されており、そのシート部材４３に対向するポット収容部３２の底面に破断部３４が設けられている（図３参照）。

また中間部材３０のポット収容部３２の底面の下流側に延在する流路形成部３５を備えている。流路形成部３５は、検査領域Ｌ_１、確認領域Ｌ_２および増幅指標領域Ｌ_３の上方位置に一致して配置され、これらの領域Ｌ_１〜Ｌ_３を視認可能とするために透明な材料で形成されている。

上部ケース１０は、第１のポット４０に対向する部分に、外部から押圧力が加えられることにより、第１のポット４０側に変形してその第１のポット４０のシート部材４３を中間部材３０の破断部３４により破断させる第１の凸状変形部１２を備えている。また、上部ケース１０は、第２のポット４５に対向する部分に、外部から押圧力を加えることにより、第２のポット４５側に変形して第２のポット４５のシート部材４８を破断する第２の凸状変形部１４を備えている。

また、上部ケース１０には、試料液滴下用開孔１６が設けられており、この開孔１６から検査用ストリップ１の標識保持パッド３上に試料液が滴下される。開孔１６と標識保持パッド３との位置が一致するように、標識保持パッド３の位置を調整することで、標識保持パッド３上に確実に試料液を点着することが可能となる。また、上部ケース１０は、中間部材３０の流路形成部３５に対応する位置に３つの領域Ｌ_１〜Ｌ_３を視認するための観察窓１８を備えている。

下部ケース２０には、検査用ストリップ１が配置される収容部として、多孔性担体２が載置される多孔性担体収容部２１およびその下流側に吸収パッド６が載置される吸収パッド収容部２２が設けられている。また、多孔性担体収容部２１の上流側には第２のポット４５が収容される第２のポット収容部２４が設けられている。

図３は、検査用ストリップ１、中間部材３０および２つのポット４０、４５の位置関係を示す模式的断面図である。検査用ストリップ１は、図３に示すように、試料液を展開させる多孔性担体２と、不溶性担体２上に固定された抗体で修飾された標識物質を含む標識保持パッド３と、多孔性担体２の一端に接触して配置された第２の増幅液４６を多孔性担体２に送液する送液用パッド４と、多孔性担体２の他端に接触して配置された吸収パッド６とを備えている。多孔性担体２はバック粘着シート７上に固定されて支持されている。そして、多孔性担体２は、標識保持パッド３と吸収パッド６との間に、検査領域Ｌ_１、確認領域Ｌ_２、増幅指標領域Ｌ_３を標識保持パッド３側から順に有する。

なお、本明細書において検査領域Ｌ_１、確認領域Ｌ_２および増幅指標領域Ｌ_３が形成されてなる多孔性担体２をクロマトグラフ担体と称する場合がある。また、本明細書においては、図３に記載のように送液用パッド４側を上流、吸収パッド６側を下流として定義する。

中間部材３０は検査用ストリップ１の下流端側の上部に位置されており、第１のポット４０はシート部材４３を下にして、中間部材３０のポット収容部３２中に配置されている。第２のポット４５はシート部材４８を上にして、下部ケース２０の検査用ストリップ１の上流端の下方に収容されている。

図３に示されているように、中間部材３０の流路形成部３５の裏面３６と、検査用ストリップ１の不溶性担体２との間には、隙間（クリアランス）Ｄが形成される。この隙間Ｄは０．０１ｍｍ〜１ｍｍの範囲にあることが好ましい。０．０１ｍｍ以上であれば増幅液等を充分浸潤させることができ、１ｍｍ以下であれば毛細管力が発揮され、第１の増幅液４１により不溶性担体２と中間部材３０の隙間を均一に満たすことが可能である。

第１の増幅液４１が封入された第１のポット４０は、例えば樹脂材料から構成された一面に開口を有する容器４２に第１の増幅液４１が充填され、その容器４２の開口が破断可能なシート部材４３により覆われ封止されている。
第２の増幅液４６が封入された第２のポット４５も同様に、例えば樹脂材料から構成された一面に開口を有する容器４７に第２の増幅液４６が充填され、その容器４７の開口が破断可能なシート部材４８により覆われ封止されている。
第１のポット４０および第２のポット４５における破断可能なシート部材４３、４８としては、アルミ箔やアルミラミシートなどのラミネートフィルムが好適に使用される。ここで、破断とは、破れた後に再生しない状態をいう。

１０．検出時の標識物質の平均粒径の算出方法
検出時（増幅後）、テストライン部を切り出し、試料裏面をカーボンペーストで試料台に取り付けた後、断面を切り、カーボン蒸着し、走査型電子顕微鏡にて、形状と大きさを観察する。例えば、日立ハイテクノロジーズ製ＦＥ-ＳＴＥＭ Ｓ−５５００で、加速電圧10ＫＶで反射電子による試料表面の観察を走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）で行うことができる。その後、シグナル粒子を１００粒子選び、粒子の投影面積の円相当直径を測定し、平均値を算出し、検出時の平均粒径とする。
検出時の標識物質の平均粒径は好ましくは１μｍ以上２０μｍ以下であり、さらに好ましくは３μｍ以上２０μｍ以下である。

以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。

以下の実施例および比較例のイムノクロマトグラフキットは、被検物質としてリポアラビノマンナン抗原を検出するための結核菌抗原検出用イムノクロマトグラフキットである。

(１）イムノクロマトグラフキットの作製
（１−１）被検物質に結合可能な第１の物質が修飾された標識物質としての抗リポアラビノマンナン抗体修飾金コロイドの作製
直径５０ｎｍの金コロイドを含有する溶液（品番：ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社製）９ｍＬに５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４バッファー（ｐＨ８．０）を１ｍＬ加えてｐＨの調整を行い、その後、２０μｇ／ｍＬの抗リポアラビノマンナンモノクローナル抗体（国際公開ＷＯ２０１７／１３９１５３(DETAILED DESCRIPTION D.Anti-LAM and Anti-PIM6/LAM Antibodies 1.A194-01) に記載のA-194-01の作製方法に従って作製した抗体A194-01）含有溶液１ｍＬを加えて１０分間攪拌した。その後、１０分間静置した後に、１質量％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ(polyethylene glycol)；重量平均分子量（Ｍｗ．）：２００００、品番：１６８−１１２８５、富士フイルム和光純薬（株）社製）含有水溶液を５５０μＬ加えて１０分間攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ（Bovine serum albumin）；ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番：Ａ−７９０６、ＳＩＧＭＡ社製）の水溶液を１．１ｍＬ加えて１０分間攪拌した。この溶液を遠心分離装置（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立（株）社製）を用いて、８０００×ｇ、４℃の条件で３０分間遠心分離した。容器の底に１ｍＬを残して上澄み液を取り除き、超音波洗浄機により容器の底に残った１ｍＬ液中に含まれる金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス塩酸）バッファー（ｐＨ８．２）、０．０５％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ）に分散し、再び同じ遠心分離装置を用いて同様の条件で遠心分離を行い、上澄み液を取り除き、超音波分散後、金コロイド保存液に分散し、抗体修飾金コロイド（５０ｎｍ）溶液を得た。

（１−２）標識保持パッドとしての抗リポアラビノマンナン抗体修飾金コロイド保持パッドの作製
（１−１）で作製した抗リポアラビノマンナン抗体修飾金コロイドを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー(ｐＨ８．２)の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００）の濃度が０．０５質量％、スクロースの濃度が５質量％、そして光路長１０ｍｍとしたときの金コロイドの５２０ｎｍの光学濃度が０．１となるように水で希釈し、金コロイド塗布液とした。この塗布液を、５ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ＧｌａｓｓＦｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社製）１枚あたり１ｍＬずつ均一に塗布し、２４時間減圧乾燥することで抗リポアラビノマンナン抗体修飾金コロイド保持パッドを得た。

（１-３）検体調整試薬の作製
検体調整用チューブ(トラストメディカル社)に、０．２重量％カゼイン（０３０−０１５０５、富士フイルム和光純薬（株）社製）、２重量％Ｔｗｅｅｎ４０(T２５３１、東京化成工業(株)社製)を含む８００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．５）(３４７−０２８４４、富士フイルム和光純薬（株）社製)を調製し、５０μＬ添加し、２５℃１０％Ｒｈ（相対湿度）以下の環境で３日間乾燥させた後、２４時間減圧乾燥することで固体状態にした。使用時には検体２００μＬを用いるため、各物質の終濃度は、それぞれ、０．０５重量％カゼイン、０．５重量％Ｔｗｅｅｎ４０、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｃｉｎ緩衝液（ｐＨ８．５）となる。

（１−２）で作製した、標識保持パッドとしての抗リポアラビノマンナン抗体修飾金コロイド保持パッドを４ｍｍ×５ｍｍに切り、上記チューブに各1枚ずつ入れ、熱溶着シール(凸版印刷株式会社)を用いて封止した。

(１−４）クロマトグラフ担体の作製
多孔性担体として、６０ｍｍ×３００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１３５（キャピラリーフローレート=１３５秒／ｃｍ、ミリポア社製）を用い、このメンブレン上に以下のような方法により、検査領域、確認領域および増幅指標領域を形成してクロマトグラフ担体を作製した。

ニトロセルロースメンブレンの６０ｍｍの短辺のうちの下流側から１５ｍｍの位置に、１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗リポアラビノマンナンモノクローナル抗体（国際公開ＷＯ２０１３／１２９６３４にて ＭｏＡｂ１として記載される配列をもつ抗体を、［実施例５〜１２］４．測定方法 （4-1）二価抗体の作製に従って作製した抗体）溶液をライン状に塗布し検査領域とした。さらに６０ｍｍの短辺のうちの下流側から１１ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ウサギＦ（ａｂ'）２、 品番３０９-００６-００３、富士フイルム和光純薬（株）社製）溶液をライン状に塗布し確認領域とした。さらに６０ｍｍの短辺のうちの下流側から９ｍｍの位置に、３０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したブロモクレゾールグリーン(富士フイルム和光純薬（株）社製)をライン状に塗布し増幅指標領域とした。それぞれの塗布の後にニトロセルロースメンブレンを、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。乾燥が終了した後、ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番030-01505、富士フイルム和光純薬（株）社製）を含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））５００ｍＬを入れたバットに、上記のように乾燥したニトロースメンブレンを浸漬させてそのまま３０分間静置した。その後ニトロセルロースメンブレンを取り出して、別のバットに準備した洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔris−ＨＣl（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬ中にニトロセルロースメンブレンを浸し、そのまま３０分間静置した。その後、ニトロセルロースメンブレンを液から取り出し、２５℃の環境で２４時間乾燥させた。

抗リポアラビノマンナン抗体を固定化した部分が、被検物質に結合する第２の物質を含む検査領域、抗マウスＩｇＧ抗体を固定化した部分が、第１の物質に結合可能な物質を含む確認領域、ブロモクレゾールグリーンを固定した部分が、第１の増幅液と反応する物質を含む増幅指標領域にそれぞれ相当する。

（１−５) 検査用ストリップの作製
バック粘着シート（６０ｍｍ×３００ｍｍ（Adhesives Research社製）)に、（１−４）で作製したクロマトグラフ担体を貼り付けた。次に、クロマトグラフ担体の短辺のうちの下流側から２６ｍｍの位置に幅３ｍｍの両面テープ(日東電工)を固定した。その後、両面テープの下流端と８ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ＧｌａｓｓＦｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社製）の下流端が重なるようにして金コロイド保持パッドをクロマトグラフ担体に固定した。送液用パッド（２５ｍｍ×３００ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社製））をクロマトグラフ担体の上流側に、送液用パッドとクロマトグラフ担体が７ｍｍ重なるように貼り付けた。こうして作製した部材を、３００ｍｍの長辺と垂直な方向に対して平行に、幅が５ｍｍとなるようにギロチン式カッター（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社製）で切断し、６０本の検査用ストリップ（但し、吸収パッドを含まない。）を作製した。

（１−６）増幅液の作製
（１−６−１）第２のポットに封入する増幅液（還元剤溶液）の作製
水２９０ｇに、硝酸鉄(III)九水和物（富士フイルム和光純薬（株）社製、０９５−００９９５）を水に溶解して作製した１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２３．６ｍＬ、クエン酸（富士フイルム和光純薬（株）社製、０３８−０６９２５）１３．１ｇを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（１０重量％）溶液を３６ｍＬ加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（富士フイルム和光純薬（株）社製、０９１−００８５５）を６０．８ｇ加えた。このように調製した溶液を第２のポットに封入する第２の増幅液である還元剤溶液とした。

（１−６−２）第１のポットに封入する増幅液（銀イオン溶液）の作製
水６６ｇに、硝酸銀溶液８ｍＬ（１０ｇの硝酸銀を含む）と１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２４ｍＬを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（１０重量％）５．９ｍＬ、ドデシルアミン（富士フイルム和光純薬（株）社製、１２３−００２４６）０．１ｇ、界面活性剤Ｃ_１２Ｈ_２５−Ｃ_６Ｈ_４−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_５ＯＨ ０．１ｇをあらかじめ４７．６ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを第１のポットに封入する第１の増幅液である銀イオン溶液とした。

（１−７）吸収パッドの作製
１２ｍｍ×１０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（ガラス濾紙、アドバンテック社製）を６０枚準備し、吸収パッドとした。

（１−８）イムノクロマトグラフキットの部品の作製
図１〜図３に示すようなイムノクロマトグラフキット１００を構成する下部ケース２０、上部ケース１０、中間部材３０、および第１のポット４０、第２のポット４５を、ポリプロピレンを材料として射出成形によりそれぞれ作製した。上部ケースは住友化学（株）社製オレフィン系エラストマーであるタフセレン（登録商標）を５０質量％含有するポリプロピレンを材料として射出成形により作製した。なお、上部ケース１０は、２つの変形可能な部位（第１の凸状変形部と第２の凸状変形部と）を備え、この２つの変形部は上部ケース１０と分離する部分はなく、すべての境界部で上部ケース１０の一部として射出成形で作製した。
なお、実施例の上部ケースは、図１および図２に示す第１の凸状変形部１２が２本の突起部を有し、第２の凸状変形部１４が１本の突起部を有する構成とした。

（１−９）実施例のイムノクロマトグラフキットの作製
下部ケース２０、（１−５）で作製した検査用ストリップ１と（１−７）で作製した吸収パッド６を、図１〜図３に示すように固定した。次に、第１のポット４０、第２のポット４５に、それぞれ、（１−６−２）、（１−６−１）で作製した第１のポット４０に封入する増幅液４１、第２のポット４５に封入する増幅液４６を充填し、シート部材４８としてのアルミ箔でポット４５を、シート部材４３としてのアルミ箔でポット４０をそれぞれ封止し、図１〜図３に示すように、第２のポット４５を、シート部材４８を上にして下部ケース２０に、第１のポット４０を、シート部材４３を下にして中間部材３０に装着した。そして、上部ケース１０と下部ケース２０とを外周同士が接触するように嵌め合わせた状態で、上部ケースと下部ケースとの接触部を超音波溶着により接合させた。このとき、溶着部位は密閉状態で均一にすべての部位で溶着されていることを確認した。このようにしてイムノクロマトグラフキットを作製した。

(１−１０)比較例
比較例として、市販の被検物質としてリポアラビノマンナン抗原を検出するための結核菌抗原検出用イムノクロマトグラフキットとして、Alere Determine TB LAM Ag(Alere社)を用いた。

（２）評価１：検出感度の評価
（２−１）検体の調液
健常人の尿検体(ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社)をプールした尿検体に、結核菌より抽出されたリポアラビノマンナン(０２２４９-６１、ナカライテスク社)を添加し、各リポアラビノマンナン濃度の検体を調液した。

（２−２）比較例を用いた測定
比較例の使用法に従い、検体６０μLをキットに点着し、２５分間反応させた。反応終了後、目視にて陽性または陰性を判定した。ライン状の確認領域を目視した際の着色度合いを、着色が濃い「＋＋＋」、着色がある「＋＋」、薄い着色がある「＋」、着色がない「−」として判別した。最も薄い濃度で判別できた濃度を最小検出感度とした。

（２−３）実施例を用いた測定
検体調整試薬に、検体２００μLを添加し、４０分間反応させた。反応終了後、検体調整試薬のチューブから、検体４０μLをキットに点着した。
検体の点着直後に、第２の凸状変形部１４を押下することで、第２のポット４５に封入した増幅液４６を封止しているシート部材４８であるアルミ箔を破り、第２のポット４５の中に送液用パッド４を浸すことにより、毛細管現象を利用して第２の増幅液４６を多孔性担体２に供給した。

増幅指標領域Ｌ３が緑からオレンジに変色した後、第１の凸状変形部１２（実施例２では第１の凸状変形部１１４）を押下して第１のポット４０を中間部材３０のポット収容部３２の破断部３４に向けて移動させることにより、第１のポット４０を封止しているシート部材４３であるアルミ箔を破断部３４により押し破り、第１の増幅液４１である銀イオン溶液を中間部材３０の開口部から多孔性担体２に供給して、銀増幅反応を行った。銀増幅反応は数十秒で完了する。
銀増幅反応終了後、目視にて陽性または陰性を判定した。判定は、リポアラビノマンナン量に比例して増減する抗リポアラビノマンナンモノクローナル抗体塗布ライン呈色度合いを肉眼で判断し、ライン状の確認領域を目視した際の着色度合いを、着色が濃い「＋＋＋」、着色がある「＋＋」、薄い着色がある「＋」、着色がない「−」として判別した。最も薄い濃度で判別できた濃度を最小検出感度とした。
また、銀増幅反応終了後の標識粒子の平均粒径を、走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ製ＦＥ-ＳＴＥＭ Ｓ−５５００）にて算出したところ、１０μｍであった。

(３)結果１
評価１の結果を表２に示す。

表２から、比較例の検出感度０．２５ｎｇ／ｍＬに対し、実施例では検出感度０．０５ｎｇ／ｍＬとなり、実施例では、比較例と比べて検出感度が約５倍向上することが示された。

（４）評価２：特異性の評価
（４−１）検体調液
以下の表３に示す、ヒト結核菌、結核菌群、非結核性抗酸菌群を、マイコブロス(極東製薬工業（株）社製)にて、濁度計 Ｖｉ−ｓｐｅｃII(極東製薬工業（株）社製)を用いて、５３０ｎｍでの波長でのＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ：光学濃度）を約０．２になる時点で培養を終了した。これを検体とした。

測定に関しては、「（２）評価１：検出感度評価」における、（２−２）比較例を用いた測定、および（２−３）実施例を用いた測定と同様に実施した。判定に関しては、反応終了後、目視にて陽性または陰性を判定した。ライン状の確認領域を目視した際に、着色がある場合「＋」、着色がない場合「−」として判別した。

(５)結果２
評価２の結果を表４に示す。

リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）を検出することにより結核感染症を診断に対して、ポリクローナル抗体を使用した既存のキットを用いた方法を行う場合の課題である、非結核性抗酸菌群との交差性に起因する特異度の不足に関して、モノクローナル抗体を使用した実施例２において、驚くべきことに非結核性抗酸菌群との交差性が改善し、特異度を向上するという効果が、表４の結果から明らかになった。
一方、複数のエピトープに結合可能なポリクローナル抗体に対して、単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体を使用することで、抗原検出の感度が低下することによる診断感度の不足が懸念されたが、銀増幅反応を行うことによって、非結核性抗酸菌群に対する特異度の向上を維持しつつ、ポリクローナル抗体を使用した比較例２と同等の感度でリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）を検出できることが確認された。
即ち、本発明では、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質と、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体とを含む、結核菌の検出のためのイムノクロマトグラフキットにおいて、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを含め、かつ第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方を、モノクローナル抗体とすることによって、結核菌を高感度かつ特異的に検出することができた。

１ 検査用ストリップ
２ 多孔性担体
３ 標識保持パッド（グラスファイバーパッド）
４ 送液用パッド
６ 吸収パッド
７ バック粘着シート
９ ハウジングケース
１０ 上部ケース
１２ 第１の凸状変形部
１４ 第２の凸状変形部
１６ 試料液滴下用開孔
１８ 観察窓
２０ 下部ケース
２１ 多孔性担体収容部
２２ 吸収パッド収容部
２４ 第２のポットの収容部
３０ 中間部材
３２ 第１のポットの収容部
３４ 破断部
３５ 流路形成部
３６ 流路形成部３５の裏面
４０ 第１の増幅液用の第１のポット
４１ 第１の増幅液
４２ 容器
４３ シート部材
４５ 第２の増幅液用の第２のポット
４６ 第２の増幅液
４７ 容器
４８ シート部材
１００ イムノクロマトグラフキット
Ｌ_１ 検査領域
Ｌ_２ 確認領域
Ｌ_３ 増幅指標領域
Ｄ 隙間（クリアランス）

Claims (22)

1. リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質と、
   リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体と、
   銀を含む化合物と、
   銀イオンを還元し得る還元剤とを含み、
   前記の第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、モノクローナル抗体である、
   結核菌の検出のためのイムノクロマトグラフキット。
2. 前記の第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、リポアラビノマンナンの５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロフラノース構造を認識するモノクローナル抗体である、請求項１に記載のイムノクロマトグラフキット。
3. 前記の第一の抗体および第二の抗体がともに、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載のイムノクロマトグラフキット。
4. 標識物質が、金属粒子である、請求項１から３の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
5. 標識物質が、金、銀、白金、またはそれらの化合物である、請求項１から４の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
6. 標識物質の平均粒子径が１ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１から５の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
7. 銀を含む化合物が硝酸銀である、請求項１から６の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
8. 銀イオンを還元し得る還元剤が、Ｆｅ^２＋である、請求項１から７の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
9. 多孔性担体がニトロセルロース担体である、請求項１から８の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
10. 銀イオンを還元し得る還元剤を検出するための発色試薬を有する、請求項１から９の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
11. 前記発色試薬が、イオンに反応して発色する化合物である、請求項１０に記載のイムノクロマトグラフキット。
12. 前記発色試薬が、Ｆｅ^２＋イオンと反応して発色する化合物である、請求項１０または１１に記載のイムノクロマトグラフキット。
13. 前記発色試薬が、フェナントロリン骨格を有する化合物である、請求項１０から１２の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
14. 前記発色試薬が、Ｈ^＋イオンと反応して発色する化合物である、請求項１０または１１に記載のイムノクロマトグラフキット。
15. 前記発色試薬が、多孔性担体に担持されている、請求項１０から１４の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
16. 前記発色試薬が、被検試料を含む水溶液または銀イオンを還元し得る還元剤を含む水溶液のいずれかを展開した際に、多孔性担体中を実質的に移動しない発色試薬である、請求項１０から１５の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
17. 前記反応部位を有する多孔性担体と、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを内包するハウジングケースとを備える、請求項１から１６の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
18. 破断可能な部材を備えたポットをさらに含み、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とがそれぞれ前記ポットに封入されている、請求項１から１７の何れか一項に記載のイムノクロマトグラフキット。
19. 前記ポットが、外力によって破断される、請求項１８に記載のイムノクロマトグラフキット。
20. 試料中のリポアラビノマンナンと、リポアラビノマンナンに対する第一の抗体で修飾した標識物質との複合体を、リポアラビノマンナンに対する第二の抗体を保持した反応部位を有する多孔性担体上に展開する工程と、
    前記反応部位において、前記複合体を捕捉する工程と、
    前記反応部位において捕捉された前記複合体の標識物質を、銀を含む化合物と、銀イオンを還元し得る還元剤とを用いて増幅する工程とを含み、
    前記第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、モノクローナル抗体である、
    結核菌の検出方法。
21. 前記の第一の抗体および第二の抗体のうちの少なくとも一方が、リポアラビノマンナンの５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロフラノース構造を認識するモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の結核菌の検出方法。
22. 検出時に１μｍ以上２０μｍ以下の平均粒径を有する標識物質を検出する、請求項２０または２１に記載の結核菌の検出方法。

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