CN101528765A - 用于治疗胃肠动力障碍病症的促胃动素受体的大环拮抗剂 - Google Patents

用于治疗胃肠动力障碍病症的促胃动素受体的大环拮抗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了结合促胃动素受体(包括其亚型、异构型和/或变体)和/或为促胃动素受体(包括其亚型、异构型和/或变体)功能调节剂的构象界定的大环化合物。这些大环化合物至少具备足够的药理学特征以用作一系列疾病适应症的治疗剂。尤其是，这些化合物可用于治疗和预防特征为高胃动素血症和/或胃肠运动过度的病症，包括但不限于腹泻、癌症治疗相关的腹泻、癌症引起的腹泻、化疗引起的腹泻、放射性小肠炎、放射引起的腹泻、应激引起的腹泻、慢性腹泻、AIDS相关的腹泻、艰难梭菌相关的腹泻、旅行腹泻、移植物抗宿主病引起的腹泻、其它类型腹泻、消化不良、肠易激综合征、化疗引起的恶心和呕吐(呕吐)和手术后恶心和呕吐以及功能性胃肠病症。此外，所述化合物具备用于治疗特征为胃吸收或肠吸收差的疾病和病症如短肠综合征、乳糜泻和恶病质的功效。所述化合物还可用于治疗胃肠道的炎性疾病和病症，如炎性肠病、溃疡性结肠炎、Crohn病和胰腺炎。因此还提供了治疗这类病症的方法和包含本发明化合物的药物组合物。

Description

用于治疗胃肠动力障碍病症的促胃动素受体的大环拮抗剂
相关申请信息
本申请要求2006年9月11日提交的序号为60/825,237的美国临时专利申请的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及结合促胃动素受体(包括其亚型、异构型和/或变体)和/或为促胃动素受体(包括其亚型、异构型和/或变体)功能调节剂的新型构象-界定大环化合物。这些大环化合物具备适合的药理学特征以用作一定范围的疾病适应症的治疗剂。尤其是，这些化合物可用于治疗和预防特征为高胃动素血症(hypermotilenemia)或胃肠运动过度的病症，包括但不限于腹泻、癌症治疗相关的腹泻、癌症引起的腹泻、化疗引起的腹泻、放射性小肠炎、放射引起的腹泻、紧张引起的腹泻、慢性腹泻、AIDS相关的腹泻、艰难梭菌(C.difficile)相关的腹泻、旅行腹泻、移植物抗宿主病(graph versus host disease)引起的腹泻、其它类型腹泻、消化不良、肠易激综合征、功能性胃肠病症、化疗引起的恶心和呕吐(呕吐(emesis))和手术后恶心和呕吐。此外，所述化合物具备用于治疗特征为胃吸收或肠吸收差的疾病和病症如短肠综合征、乳糜泻和恶病质的功效。所述化合物还可用于治疗胃肠道的炎性疾病和病症，如炎性肠病、溃疡性结肠炎、Crohn病和胰腺炎。
背景技术
大量肽激素牵涉在胃肠(GI)道不同功能(包括吸收、分泌、血流和运动性)的控制中(Mulvihill，S.J.等在Basic and Clinical Endocrinology(基础和临床内分泌学)，第4版，Greenspan，F.S.；Baxter，J.D.编辑Appleton &Lange：Norwalk，CT，1994，pp 551-570)。由于脑和GI系统的相互作用对这些功能的正确调节是关键的，这些肽可就地在GI道产生或远在CNS中产生。
这些肽激素的一种——促胃动素，是线性的22-氨基酸肽，通过控制空腹胃肠的运动活性而在GI生理系统中起关键调节作用。因此，在哺乳动物(包括人类)空腹期间这种肽周期性地从十二指肠粘膜释放。更准确地，促胃动素经由收缩胃肠平滑肌以刺激胃排空、减少肠通过时间并开始小肠中肌移动复合波(MMC)的第III阶段而对胃运动性施加强大的效应。(Itoh，Z.编辑，Motilin(促胃动素)，Academic Press：San Diego，CA，1990，ASIN：0123757304；Itoh，Z.Peptides 1997，18，593-608；Nelson，D.K.Dig.Dis.Sci.1996，41，2006-2015；Peeters，T.L.；Vantrappen，G.；Janssens，J.Gastroenterology 1980，79，716-719；Itoh，Z.；Sekiguchi，T.Scand.J.Gastroenterol.Suppl.1983，82，121-134；Itoh，Z.；Aizawa，I.；Sekiguchi，T.Clin.Gastroenterol.1982，11，497-521；Luiking，Y.C.；Peeters，T.L.；Stolk，M.F.；Nieuwenhuijs，V.B.；Portincasa，P.；Depoortere，I.；Van Berge Henegouwen，G.P.；Akkermans，L.M.A.Gut 1998，42，830-835.)。
促胃动素可由主要位于人类窦和近端十二指肠的受体施加这些效应，尽管其受体在一些程度发现于整个GI道。(Peeters，T.L.；Bormans，V.；Vantrappen，G.Regul.Pept.1988，23，171-182；Poitras，P.；Miller，P.；Dickner，M.；Mao，Y.K.；Daniel，E.E.；St-Pierre，S.；Trudel，L.Peptides1996，17，701-707；Miller，P.；Trudel，L.；St-Pierre，S.；Takanashi，H.；Poitras，P.Peptides 2000，21，283-287；Takeshita E，Matsuura B，Dong M，Miller LJ，Matsui H，Onji M.J.Gastroenterol.2006，41，223-230.)因此，促胃动素激素牵涉在GI系统上部分和下部分的运动性中。此外促胃动素和其受体已见于CNS和外周，暗示在神经系统中还未被最终阐明的生理作用。(Peeters，T.L.；Tang，M.Peptides 2007，28，625-631；Liu，M.；Dong，L.；Duan，Z.；Zhu，W.-y.；Cui，Y.；Lei，L.J.Med.Colleges PLA 2005，20，32 1-326；Thielemans，L.；Depoortere，I.；Van Assche，G.；Bender，E.；Peeters，T.L.Brain Res.2001，895，119-128；Depoortere，I.；Peeters，T.L.Am.J.Physiol.1997，272，G994-G999和O′Donohue，T.L.等Peptides 1981，2，461-477.)。近来发现促胃动素受体在人类和大鼠小脑的浦肯野氏细胞中表达。(Chen，H.；Chen，L.；Wang，JJ.；Wei，H.J.；Yung，W.H.Neuro Report 2007，18，1345-1349.)已表明脑中的促胃动素受体在许多CNS功能中起调节作用，包括喂食和饮水行为、排尿反射、中枢和脑干神经元调节和垂体激素分泌(Itoh，Z.Peptide 1997，18，593-608；Asakawa，A.；Inui，A.；Momose，K.M.等Peptides 1998，19，987-990和Rosenfeld，D.J.；Garthwaite，T.L.Physiol.Behav.1987，39，753-756)。对幼儿的研究已表示促胃动素在能量平衡的长期调节中的作用。(Savino，R.；Grassino，E.C；Fissore，M.F.等Clin.Endocrinol.2006，65，158-162.)。
最近鉴定和克隆了人类促胃动素受体(国际专利申请公开WO99/64436；Feighner，S.D.；Tan，C.P.；McKee，K.K.等Science 1999，284，2184-2188)简化和加速了可为特定治疗目的调控其活性的药剂的探寻。由于促胃动素牵涉在控制胃运动性中，降低(在运动过度病症的情形)或增强(在运动不足病症的情形)促胃动素受体活性的药剂对于探寻大量GI适应症的新的有效药物的进一步考察是特别有吸引力的领域。(Besterman，H.S.J.Clin.Pathol.Suppl.1978，8，76-84；Tack，J.BasicPract.Res.Clin.Gastroenterol.2007，21，633-644.)
已经采用两种路线来寻找和开发促胃动素激动剂作为治疗剂来增强运动性。(Peeters，T.L.Neurogastroenterol.Motil.2006，18，1-5；Sandham，D.A.；Plannkuche,H.-J.Ann.Rep.Med.Chem.2006，47，211-219.)。这些中的第一种是促胃动素受体的肽激动剂，临床应用于治疗运动不足病症，尤其是胃轻瘫(Haramura，M.；Tsuzuki，K.；Okamachi，A.等Bioorg.Med.Chem.2002，10，1805-1811；美国专利号5,422,341；5,432,261；5,459,049；5,695,952；5,721,353；5,734,012；6,018,037；6,380,158；6,420,521，6,838,438；美国专利申请公开2001/041791；2003/176640；2004/254345；2005/065156；2005/080116，2005/106146；2005/208626；国际专利申请公开WO 98/42840；WO 01/00830；WO02/059141)。结构活性研究已确定天然肽中的关键残基(Peeters，T.L.；Macielag，M.J.；Depoortere，I.等Peptides 1992，13，1103-1107；Haramura，M.；Tsuzuki，K.；Okamachi，A.等Chem.Pharm.Bull.1999，47，1555-1559)，NMR研究已经确定了其溶液结构(Massad，T.；Jarvet，J.；Taner，R.等J.Biomol.NMR 2007，38，107-123)。此外，对促胃动素受体和对肽和非-肽激动剂与促胃动素受体相互作用的研究已经描绘出受体胞外域对结合的不同贡献。(Matsuura，B.；Dong，M.；Miller，LJ.J.Biol.Chem.2002，277，9834-9839；Matsuura，B.；Dong，M.；Naik，S.；Miller，LJ.；Onji，M.J.Biol.Chem.2006，281，12390-12396.)。Atilmotin是一种衍生自促胃动素C-末端14残基的肽类似物，已经在早期人类研究中显示出有希望的结果。(Park，M.I.；Ferber，I.；Camilleri，M.等Neurogastroenterol.Motil.2006，18，28-36；国际专利申请公开WO 2006/13 8023；WO2006/138026；美国专利申请公开2006/287243；2006/293243.)。
长期已知大环内酯抗生素红霉素具有刺激GI运动性的副作用，并因此已用于治疗胃轻瘫。随后显示该效应由在促胃动素受体上的相互作用而被介导。(Hasler，W.L.；Heldsinger，A.；Chungal，O.Y.Am.J.Physiol.1992，262，G50-G55；Peeters，T.L.Gastroenterology 1993，105，1886-1899；Weber，F.H.，Jr.；Richards，R.D.；McCallum，R.W.Am.J.Gastroenterol.1993，88，485-490.)。然而使用红霉素治疗会伴有恶心、腹泻、痉挛和腹部痛且进一步地必须限制持久使用以避免发展细菌耐药性。因此，作为目标为促胃动素激动剂治疗剂的第二主要策略，开发具有很少抗生素活性或不具抗生素活性而保持GI刺激效应的红霉素衍生物(通常指促动内酯(motilide))已经成为相当数目的研究工作的主题。(Faghih，R.；Nellans，H.N.；Plattner，J.J.Drugs of the Future 1998，23，861-872；Salat，P.；Parikh，V.Ind.J.Pharmacol.1999，31，333-339；Wu，Y.J.Curr.Pharm.Des.2000，6，181-223；Inatomi，N.；Sato，F.；Itoh，Z.；Omura，S.Mode of action of macrolides with motilin agonistic activity-motilides(具有促胃动素激动活性的大环内酯-促动内酯的作用方式).Macrolide Antibiotics(大环内酯抗生素)，第2版，Omura，S.编辑，Academic Press：San Diego，CA，2002，pp 501-531；美国专利号4,677,097；4,920,102；5,008,249；5,175,150；5,418,224；5,470,961；5,523,401；5,523,418；5,538,961；5,554,605；5,578,579；5,658,888；5,712,253；5,854,407；5,912,235；5,922,849；6,077,943；6,084,079；6,100,239；6,165,985；6,403,775；6,562,795；6,750,205；6,939,861；6,946,482；7,211,568；美国专利申请公开2002/025936；2002/094962；2003/220271；2004/138150；2004/147461；2005/119195；2006/270616；国际专利申请公开WO 01/60833；WO 02/051855；WO 2004/19879；WO 2005/18576；WO 2006/070937；WO 2006/127252.)。对这类促动内酯已在临床试验中观察到通常令人失望的结果，如EM-574(Satoh，M.；Sakai，T.；Sano，I.等J.Pharmacol.Exp.Ther.1994，271，574-579；Choi，M.G.；Camilleri，M.；Burton，D.D.；Johnson，S.；Edmonds，A.J.Pharmacol.Exp.Ther.1998，285，37-40)、ABT-229(阿兰西那(alemcinal)，Talley，N.J.；Verlinden，M.；Snape，W.等Aliment.Pharmacol.Ther.2000，14，1653-1661；Talley，N.J.；Verlinden，M.；Geenan，DJ.等Gut 2001，49，395-401；Chen，C.L.；Orr，W.C.；Verlinden，M.H.等Aliment.Pharmacol.Ther.2002，16，749-757；Netzer，P.；Schmitt，B.；Inauen，W.Aliment.Pharmacol.Ther.2002，16，1481-1490)和GM-611(米坦西诺(mitemcinal)，Peeters，T.L.Curr.Opin.Investig.Drugs.2001，2，555-557；Koga，H.；Takanashi，H.；Itoh，Z.；Omura，S.Drugs of the Future 2002，27，255-272；Takanashi，H.；Yogo，K.；Ozaki，K.；Koga，H.；Itoh，Z.；Omura，S.Pharmacology 2007，79，137-148；Ozaki，K.I.；Yogo，K.；Sudo，H.；Onoma，M.；Kamei，K.；Akima，M.；Koga，H.；Itoh，Z.；Omura，S.；Takanashi，H.Pharmacology 2007，79，223-235；Ozaki，K.；Sudo，H.；Muramatsu，H.；Yogo，K.；Kamei，K.；Koga，H.；Itoh，Z.；Omura，S.；Takanashi，H.Inflammopharmacology 2007，15，36-42；McCallum，R.W.；Cynshi，O.Aliment.Pharmacol.Ther.2007，26，107-116)，主要因为例如生物利用度差、化学不稳定和快速耐受性等问题。(Thielemans，L.；Depoortere，I.；Perret，J.等J.Pharmacol.Exp.Ther.2005，313，1397-1405；Mitselos，A.；Depoortere，I.；Peeters，T.L.Biochem.Pharmacol.2007，73，115-124.)。尽管如此，由于这类药剂的治疗潜力，对这类中促胃动素激动剂的寻找仍在继续，且最近已描述了KOS-2187(Carreras，C.W.；Liu，Y.；Chen，Y.等Gastroenterology 2005，128，A464；Carreras，C.W.；Burlingame，M.；Carney，J.等Can.J.Gastroenterol.2005，19，15)并显示避开了许多这些问题。还已构想了可用于分析这些类型分子治疗效力的方法(美国专利号6,875,576；美国专利申请公开2002/192709；国际专利申请公开WO 02/64092)。
类似地，已报道了非肽、非促动内酯促胃动素激动剂(美国专利号7,262,195；美国专利申请公开号2004/152732；2005/065156；国际专利申请公开WO 02/137127；WO 02/92592；WO 2005/027908；WO2005/027637；日本专利摘要公开号09249620)。其中，BMS-591348已被描述为具有避免困扰此前许多促胃动素激动剂研究中的快速耐受性问题的药理学特征(profile)。(Li，J.J.；Chao，H.G.；Wang，H.等J.Med.Chem.2004，47，1704-1708；Lamian，V.；Rich，A.；Ma，Z.；Li，J.Seethala，R.；Gordon，D.；Dubaquie，Y.Mol.Pharmacol.2006，69，109-118.)
另一方面，促胃动素受体的拮抗剂潜在地可用于治疗性治疗高胃动素血症和/或胃肠运动过度相关疾病，包括腹泻、癌症治疗相关的腹泻、癌症引起的腹泻、化疗引起的腹泻、放射性小肠炎、放射引起的腹泻、应激引起的腹泻、慢性腹泻、AEDS-相关的腹泻、艰难梭菌相关的腹泻、旅行腹泻、移植物抗宿主病(graph versus host disease)引起的腹泻、其它类型腹泻、消化不良、肠易激综合征、功能性胃肠病症、化疗引起的恶心和呕吐(呕吐)和手术后恶心和呕吐。目前对这些疾患的治疗在许多病例中无效。洛哌丁胺是一种阿片样激动剂，可用于轻微腹泻，在高百分比的患者中不起作用。奥曲肽是一种生长激素抑制素激动剂，标注外(off-label)地用作腹泻治疗，但注射使用相对昂贵，而且在许多情况也无效。另外还观察到患有急性腹泻(Besterman，H.S.；Christofides，N.D.；Welsby，P.D.等Gut 1983，24，665-671)和旅行腹泻(Besterman，H.S.；Cook，G.C.；Sarson，D.L.等Br.Med.J.1979，17，1252-1255)的患者的促胃动素水平升高。
腹泻是癌症患者经受的由手术、骨髓移植、化疗和放疗造成的常见和严重的副作用。(Stern，J.；Ippoliti，C.Sem.Oncol.Nurs.2003，19，11-16；Benson，A.B.，III；Ajani，J.A.；Catalano，R.B.等J.Clin.Oncol.2004，22，2918-2926；O′Brien，B.E.；Kaklamani，V.G.；Benson，A.B.III Clin.Colorectal Canc.2005，4，375-381.)。一些化疗方案，尤其是包括氟嘧啶和伊立替康的化疗方案，造成化疗引起的腹泻(CID)比例高达50-80％。(Arbuckle，R.B.；Huber，S.L.；Zacker，C.The Oncologist 2000，5，250-259；Saltz，L.B.J.Support.Oncol.2003，1，35-46；Goldberg-Arnold，R.J.；Gabrail，N.；Raut，M.；Kim，R.；Sung，J.C.Y.；Zhou，Y.J.Support.Oncol.2005，3，227-232；Sharma，R.；Tobin，P.；Clarke，S.J.Lancet Oncol.2005，6，93-102；Gibson，R.J.；Keefe，D.M.K.Support.Care Cancer 2006，14，890-900.)。CID的介入包括发病率和死亡率的增加。这呈现出显著问题，因为在2001年美国有超过140万人经受癌症化疗。对所有治疗阶段的癌症患者的大量混杂研究表示腹泻的患病率为14％。(M.D.AndersonSymptom Inventory(症状详细目录)，Cancer 2000，89(7)，1634-1646)。然而对某些类型的癌症，发生率更高。例如对于结肠直肠癌症，超过半数的患者经受严重级别(3级)或更高级别的腹泻。由设计为阻挠肿瘤细胞快速生长的药物导致的肠中组织损伤造成，该药物还影响肠壁内层的细胞。对这种损伤和相关的腹泻没有有效的治疗。
总之，10-20％的患者经历CID，而对一些化疗剂发生率可高达90％。在大约20％的患者中，不良效应如此严重以致需要停止治疗方案或减少治疗方案并经常需要住院。此外，由于患者不能正常地获取营养，通常必须采取胃肠外给养。因此，这对化疗效力有影响。事实上，结肠直肠癌症临床试验的综述揭示了更高死亡率，主要由于胃肠毒性。(Rothenberg，M.L.；Meropol，N,J.；Poplin，E.A.；VanCutsem，E.；Wadler，S.J.Clin.Oncol.2001，19，3801-3807.)。目前的药理学治疗仅对一些患者起作用，对更严重级别的腹泻效果要差得多。(MacNaughton，W.K.Aliment.Pharmacol.Ther.2000，14，523-528)。
急性放射性小肠炎(ARE)或放射引起的肠功能障碍发生于75％的经受放疗的患者，通常在治疗的第2周或第3周发生。其特征为腹部绞痛和腹泻，是一种严重和令人恐惧的副作用，造成总治疗时间增加和生活质量降低，甚至可导致死亡。对5-15％的患者，该疾患是慢性的。除了不舒服，这种副作用还通过增加总治疗时间而降低放疗的治疗益处。(MacNaughton，W.K.Aliment.Pharmacol.Ther.2000，14，523-528；Nguyen，N.P.；Antoine，J.E.；Dutta，S.；Karlsson，U.；Sallah，S.Cancer 2002，95，1151-1163；Gwede，CK.Sem.Nursing Oncol.2003，19，6-10.)。
事实上，慢性腹泻可作为多种医学疾患的结果而产生。(Schiller，L.R.Curr.Treat.Options Gastroenterol.2005，8，259-266；Spiller，R.Neurogastroenterol.Motil.2006，18，1045-1055.)。例如，慢性腹泻是人类免疫缺陷病毒感染患者尤其是晚期疾病患者的常见问题。这是一种发生于60-90％的AIDS患者的使人虚弱的副作用。(Cohen，J.；West，A.B.；Bini，E.J.Gastroenterol.Clin.North Am.2001，30，637-664；Oldfield，E.C.，III Rev.Gastroenterol.Disord.2002，2，176-88；Sestak，K.；Curr.HIVRes.2005，3，199-205；Thom，K.；Forrest，G.Curr.Opin.Gastroenterol.2006，22，18-23.)。此外，已知心理学因素如紧张会不利地影响GI道正常功能中起作用。(North，C.S.；Alpers，D.H.；Thompson，S.J.；Spitznagel，E.L.Dig.Dis.Sci 1996，41，633-640；Kamm，M.A.Eur.J.Surg.Suppl.1998，583，37-40；Botha，C；Libby，G.Br.J.Hosp.Med.(Lond.) 2006，67，344-349.)。
旅行腹泻影响去一些目的地(尤其是热带)的超过50％的旅行者，估计每年折磨超过1100万人。除了破坏商务、旅行和度假安排之外，这种疾患通常伴有其它临床现象如恶心、呕吐、腹痛、便急(fecalurgency)、血便和发烧。(Lima，A.A.M.Curr.Opin.Infect.Dis.2001，14，547-552；Al-Abri，S.S.；Beeching，N.J.；Nye，F.J.Lancet Infect.Dis.2005，5，349-360；DuPont，H.L.Gastroenterol.Clin.North Am.2006，35，337-353.)。
艰难梭菌(Clostridium difficile)是造成约三分之一抗生素相关的腹泻病例的病原，估计每年在美国造成$10亿的损失。抗生素相关的腹泻在住院环境更常见，达29％的患者发展该疾患，导致逗留时间更长、护理费用增加和死亡率增加。(Bartlett，J.G.N.Engl.J.Med.2002，346，334-339；Kelly，C.P.；Pothoulakis，C；LaMont，J.T.N.Engl.J.Med.1994，330，257-262；Kyne，L.；Farrell，R.J.；Kelly，CP.Gastroenterol.Clin.N.Am.2001，30，753-777；Malnick，S.D.H.；Zimhony，O.Ann.Pharmacother.2002，36，1767-1775；Hull，M.W.；Beck，P.L.Can.Fam.Phys.2004，50，1536-1540；Schroeder，M.S.Am.Fam.Phys.2005，71，921-928；Voth，D.E.；Ballard，J.D.Clin.Microbiol.Rev.2005，18，247-263.)。对虚弱的老年患者，这是一种死亡率高达25％的严重疾患。近来，艰难梭菌相关的腹泻(CADD)的发生率和严重度开始显著增加。(Frost.F.；Craun，G.F.；Calderon，R.L.Emerg.Infect.Dis.1998，4，619-625；Olfield，E.C.Rev.Gastroenterol.Disord.2006，6，79-96.)。
腹泻也在患有移植物抗宿主病(GVHD)的患者中引起。GVHD是外源造血干细胞移植的一种常见的可能威胁生命的并发症。胃肠GVHD通常涉及结肠并使得这些患有严重疾病的患者的处理更复杂。(Flowers，M.E.；Kansu，E.；Sullivan，K.M.Hematol Oncol Clin North Am.1999，13，1091-1112；Ross，W.A.；Couriel，D.Curr.Opin.Gastroenterol.2005，21，64-69.)。此外，腹泻是进行其它类型移植后的常见副作用，发生率从10％至43％。腹泻还是免疫抑制疗法的常见副作用。(Ginsburg，P.M.；Thuluvath，P.J.Liver Transpl.2005，11，881-890.)。
肠易激综合征(IBS)是最常见的功能性GI病症，估计全世界患病率为10-15％。(Saito，Y.A.；Schoenfeld，P.；Locke，G.R.Am.J.Gastroenterol.2002，97，1910-1915；Gilkin，R.J.，Jr.Clin.Ther.2005，27，1696-1709；Lacy，B.E.；De Lee，R.J.Clin.Gastroenterol.2005，39，S230-S242；Talley，N.J.Intern.Med.J.2006，36，724-728；Ohman，L.；Simren，M.Dig.Liver Dis.2007，39，201-215.)。每年可归于IBS的费用估计为300亿美元，包括100亿美元的看病和处方药的直接费用和误工的大量费用。(Talley，N.J.；Gabriel，S.E.；Harmsen，W.S.等Gastroenterology 1995，109，1736-1741；Maxion-Bergemann，S.；Thielecke，F.；Abel，F.；Bergemann，R.Pharmacoeconomics 2006，24，21-37.)。IBS患者被再分类为主要-腹泻(IBS-d)、主要-便秘(IBS-c)或在这两种类型中交替的(IBS-m)。对这些各种亚组的治疗通常必须以不同和特定的疗法进行。未能证明解痉药(Antispasmodics)、三环抗抑郁药、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、轻泻药、止泻药和膨胀剂(bulking agent)广泛有效，并且它们倾向于治疗症状而非治疗潜在的病理生理学。(Schoenfeld，P.Gastroenterol.Clin.NorthAm.2005，34，319-335；Cremonini，F.；Talley，N.J.Nat.Clin.Pract.Gastroenterol.Hepatol.2005，2，82-88；Andersen，V.；Camilleri，M.Drugs2006，66，1073-1088.)。IBS患者的促胃动素血浆水平已显示升高。(Simren，M.；Bjornsson，E.S.；Abrahamsson，H.Neurogastroenterol.Motil.2005，17，51-57.)。因此促胃动素拮抗剂对IBS患者会是有用的治疗药物。它们可能更适合IBS-d，在较低程度上适合IBS-m。IBS-d表现为便急和频繁的排便(每天＞3次)。患有IBS-d的患者占整个IBS患者群体的约三分之一。
消化不良是另一种极常见的GI病症，特征为慢性或复发的上GI痛苦，没有明显的生理原因(Tack，J.；Bisschops，R.；Sarnelli，G.Gastroenterology 2004，127，1239-1 255；Kleibeuker，J.H.；Thijs，J.C.Curr.Opin.Gastroenterol.2004，20，546-550；Talley，N.J.；Vakil，N.等Am.J.Gastroenterol.2005，100，2324-2337；Talley，N.J.；Vakil，N.；Moayyedi，P.Gastroenterology 2005，129，1756-1780；Smith，M.L.Dig.Liver Dis.2005，37，547-558；Saad，R.J.；Chey，W.D.Aliment.Pharmacol.Ther.2006，24，475-492；Suzuki，H.；Nishizawa，T.；Hibi，T.J.Gastroenterol.2006，41，513-523.；Mahadeva，S.；Goh，K.L.World J.Gastroenterol.2006，12，2661-2666；Monkemuller K，Malfertheiner P.World J.Gastroenterol.2006，12，2694-2700；Mizuta，Y.；Shikuwa，S.；Isomoto，H.；Mishima，R.；Akazawa，Y.；Masuda，J.；Omagari，K.；Takeshima，F.；Kohno，S.J.Gastroenterol.2006，41，1025-1040；Chua，A.S.World J.Gastroenterol.2006，12，2656-2659.)。典型的症状包括胃潴留(gastric fullness)、肿胀、痛、恶心和呕吐。在西方国家该疾病的患病率高达每年20％。它占所有去初级护理内科医生就诊的5％，占所有去GI专家就诊的30％。与IBS一样，患者群体可根据症状分类为各亚组。(Choung，R.S.；Locke，G.R.III；Schleck，C.D.；Zinsmetister，A.R.；Talley，N.J.Am.J.Gastroenterol.2007，102，1983-1989.)。然而，最大的患者亚组(达60％)患有消化不良而没有已知的器官原因，或称为″功能性消化不良(FD)″。FD对生活质量和健康护理资源有主要影响。与IBS类似，目前不存在治疗FD的广泛接受的疗法。(Stanghellini，V.；De Ponti，F.；De Giorgio，R.等Drugs 2003，63，869-892；Cremonini，F.；Delgado-Aros，S.；Talley，N.J.Best Pract.Res.Clin.Gastroenterol.2004，18，717-733；McNally，M.A.；Talley，N.J.Curr.Treatment Opt.Gastroenterol.2007，10，157-168.)。在消化不良患者还观察到循环血浆促胃动素水平升高。(Kusano，M.；Sekiguchi，T.；Kawamura，O.；Kikuchi，K.；Miyazaki，M.；Tsunoda，T.；Horikoshi，T.；Mori，M.Am.J.Gastroenterol.1997，92，481-484；Kamerling，I.M.；Van Haarst，A.D.；Burggraaf，J.；Schoemaker，R.C.；Biemond，I.；Heinzerling，H.；Jones，R.；Cohen，A.F.；Masclee，A.A.Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.2003，284，G776-G781.)。与IBS一样，促胃动素拮抗剂会减轻促胃动素在这类患者的效应。
化疗引起的恶心和呕吐(CINV)或呕吐是癌症治疗造成的最严重不良效应之一，通常被引证为是患者最害怕的副作用。接受癌症化疗的患者的70-80％经受CINV。除了显著恶化生活质量，该疾患通常还需要修改或推迟化疗方案，伴随对治疗效力的负面影响。尽管近来减轻CINV影响的新方法的开发和有效性有进展，但对于目前治疗不足够的患者仍迫切需要替代策略。(Lindley，C.M.；Hirsch，J.D.；O′Neill，C.V.；Transau，M.D.；Gilbert，C.S.；Osterhaus，J.T.Qual.Life Res.1992，1，331-340；Martin，M.Oncology 1996，53，26-31；Kovac，A.L.Drug Safety 2003，26，227-259；Grunberg，S.M.J.Support.Oncol.2004，2，1-12；Jordan，K.；Kasper，C.；Schmoll，H.-J.Eur.J.Canc.2005，41，199-205；Herrstedt，J.；Dombernowsky，P.Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.2007，101，143-150.)。
手术后恶心和呕吐(PONV)是手术的常见并发症，发生于30-50％的患者。PONV可导致非计划的或延长的住院、电解质异常和手术缝合线绷紧、以及对生活质量的显著的负面影响。因此它增加健康护理费用并降低患者满意度。在医疗团体中已充分认识到处理PONV的重要性并需要有效治疗。(Osoba，D.；Zee，B.；Warr，D.等Support.Care Cancer 1997，5，303-313；Kovac，A.L.Drugs 2000，59，213-243；Gan，T.J.J.Am.Med.Assoc.2002，287，1233-1236；Tramer，M.R.Best Pract.Res.Clin.Anaesthesiol.2004，18，693-701；Habib，A.S.；Gan，T.J.Can.J.Anesth.2004，51，326-341；Golembiewski，J.；Chernin，E.；Chopra，T.Am.J.Health-Syst.Pharm.2005，62，1247-1260.)。
除了其对运动性的作用，促胃动素还牵涉在诱导胃肠道内的分泌中。促胃动素在犬的胃和胰脏分泌中起作用。(Konturek，S.J.；Dembinski，A.；Krol，R.；Wunsch，E.Scand.J.Gastroenterol.1976，11，57-61；Magee，D.F.；Naruse，S.J.Physiol.1984，355，441-447；Lee，K.L.；Shiratori，K.；Chen，Y.F.；Chang，T.-M.；Chey，W.Y.Am.J.Physiol.1986，14，G759-764.)。类似地，在人类中肠的促分泌素活性已对[Nle13]-促胃动素作了描述。(Kachel，G.W.；Frase，L.L.；Domschke，W.；Chey，W.Y.；Krejs，G.J.Gastroenterology 1984，87，550-556.)。因此促胃动素受体拮抗剂可表现抗分泌效应并作为止泻剂起作用。已证明抗分泌剂是有效的抗腹泻治疗剂。(Farthing，M.J.G.Exp.Opin.Invest.Drugs 2004，13，777-785；Farthing，M.J.G.Dig.Dis.2006，24，47-58.)。这种既作为抗-运动性又作为抗-分泌剂的双重作用使得促胃动素拮抗剂成为治疗腹泻疾患的更有效治疗剂。
除了治疗特征为运动过度的病症，使用促胃动素拮抗剂还可用于治疗特征为胃吸收和肠吸收差的疾病和病症。促胃动素拮抗剂将减慢胃肠蠕动，从而允许GI接触时间更长，以吸收必需的营养。这类疾病和病症包括乳糜泻，这是一种折磨几乎1％人群的慢性病症。乳糜泻是一种特征为炎症的GI病症，导致小肠粘膜内层的损伤。当含谷蛋白食物中发现的蛋白质——麸蛋白被遗传敏感的个体摄取时造成炎症。粘膜损害和随后的营养吸收不良可导致多种并发症。(Alaedini，A.；Green，P.H.R.Ann.Intern.Med.2005，142，289-298；Koning，F.Gastroenterology 2005，129，1294-1301；Chand，N.；Mihas，A.A.J.Clin.Gastroenterol.2006，40，3-14；Westerberg，D.P.；Gill，J.M.；Dave，B.等J.Am.Osteopath.Assn.2006，106，145-151；Jones，R.B.；Robins，G.G.；Howdle，P.D.Curr.Opin.Gastroenterol.2006，22，117-123；Green，P.H.R.；Jabri，B.Ann.Rev.Med.2006，57，207-221；Hill，I.D.Curr.Treat.Options Gastroenterol.2006，9，399-408.)。目前唯一的治疗是改变成无谷蛋白的饮食。
短肠综合征是一种切除小肠相当部分后发生的医学疾患，特征为营养不良。(Misiakos，E.P.；Macheras，A.；Kapetanakis，T.；Liakakos，T.J.Clin.Gastroenterol.2007，41，5-18.；Buchman，A.L.Gastroenterology.2006，130(Suppl.1)，S5-S15；Jackson，C；Buchman，A.L.Curr.Gastroenterol.Rep.2005，7，373-378；Scolapio，J.S.Curr.Opin.Gastroenterol.2004，20，143-145；Buchman，A.L.；Scolapio，J.；Fryer，J.Gastroenterology 2003，124，1111-1134；Westergaard，H.Sem.Gastrointest.Dis.2002，13，210-220.)。该综合征对儿童尤其令人痛苦，死亡率和发病率都很高。(Vanderhoof，J.A.；Young，R.J.；Thompson，J.S.Pediatric Drugs2003，5，625-631；Vanderhoof，J.A.J.Ped.Gastroenterol.Nutri.2004，39，5768-5771；Sukhotnik，I.；Coran，A.G.等Pediatr.Surg.Int.2005，21，947-953.)。对SBS目前没有批准的药理学药剂，其通常经由肠适应或复原治疗以改善SBS患者的营养状态。(DiBaise，J.K.；Young，R.J.；Vanderhoof，J.A.Am.J.Gastroenterol.2004，99，1823-1832.)。
此外，通过使用促胃动素拮抗剂来改善营养吸收的能力可用于治疗恶病质，恶病质是一种在严重疾病如癌症、AIDS、慢性心力衰竭和其它心血管病、肾病中以及在老年人中常见的消耗性病症。癌症恶病质是一种治疗疾患，特征为体重减轻和肌肉消耗，折磨着所有癌症患者的大约50％，是超过20％患者死亡的主要原因。此外，该疾患已显示为造成死亡的强的独立风险因素。(Kern，K.A.；Norton，J.A.JPEN 1980，12，286-298；Tisdale，M.J.J.Natl.Cancer Inst.1997，89，1763-1773；Gagnon，B.；Bruera，E.Drugs 1998，55，675-688；Inui，A.CA Cancer J.Clin.2002，52，72-91.)。类似地，患有慢性心力衰竭的患者有患上类似消耗性综合征的严重风险。(Springer，J.；Filippatos，G.；Akashi，Y.J.；Anker，S.D.Curr.Opin.Cardiol.2006，21，229-233；Akashi，Y.J.；Springer，J.；Anker，S.D.Curr.Heart Fail.Rep.2005，2，198-203；Anker，S.D.；Steinborn，W.；Strassburg，S.Ann.Med.2004，36，518-529.)。该疾患还影响比例日益增加的老年人。(Morley，J.E.J.Gerontology，Ser.A：Biol.Sci.Med.Sci 2003，58A，131-137.)。
此外，肠炎症与肠运动性改变之间的相关性已充分确定。而且，促胃动素还牵涉在GI系统的炎性病症中。在炎性肠病(Besterman，H.S.；Mallinson，C.N.等Scand.J.Gastroenterol.1983，18，845-852)、溃疡性结肠炎(Greenberg，G.R.；Buchan，A.M.；McLeod，R.S.；Preston，P.；Cohen，Z.Gut 1989，30，1721-1730)和慢性胰腺炎(Besterman，H.S.；Adrian，T.E；Bloom，S.R.等Digestion 1982，24，195-208)患者中观察到促胃动素水平升高。此外在兔结肠炎模型中观察到促胃动素和mRNA表达增加。(Depoortere，I.；Van Assche，G.；Peeters，T.L.Neurogastroenterol.Motil.2001，13，55-63.)。还从肠切除(Besterman，H.S.；Adrian，T.E..；Mallinson，C.N.Gut 1982，23，854-861)和回肠造口术(Kennedy，H.J.；Sarson，D.L.；Bloom，S.R.等Digestion 1982，24，133-136)后的患者获得血浆促胃动素浓度增加。还显示非胆固醇抗炎药物可引起高胃动素血症(hypermolitinemia)，扰乱消化间期的肌移动复合波，并促使形成胃溃疡。(Narita，T.；Okabe，N.；Hane，M.等J.Vet.Pharmacol.Ther.2006，29，569-577.)。因此，促胃动素拮抗剂可用作抗炎剂，尤其是用在GI道，相对于现有治疗具有有益的特征。
尽管促胃动素拮抗剂提供了作为治疗运动过度和吸收不良病症新方法的潜力，对其的研究仍落后于针对激动剂的研究。大量肽化合物已被描述为促胃动素受体的拮抗剂[(ANQ-11125：Peeters，T.L.；Depoortere，I.；Macielag，M.J.；Marvin，M.S.；Florance，J.R.；Galdes，A.Biochem.Biophys.Res.Comm.1994，198，411-416)；(OHM-11526：Farrugia，G.；Macielag，M.J.；Peeters，T.L.；Sarr，M.G.；Galdes，A.；Szurszewski，J.H.Am.J.Physiol.1997，273，G404-G412；Depoortere，I.；Macielag，M.J.；Galdes，A.；Peeters，T.L.Eur.J.Pharmacol.1995，286，241-247)；(MA-2029：Mitselos，A.；Depoortere，I.；Peeters，T.L.Biochem.Pharmacol.2007，73，115-124)；Poitras，P.；Miller，P.；Gagnon，D.；St-Pierre，S.Biochem.Biophys.Res.Comm.1994，205，449-454；美国专利号5,470,830；6,255,285；6,586,630；6,720,433；美国专利申请公开2003/176643；国际专利申请公开WO 99/09053；WO 00/17231；WO 00/44770；WO 02/64623)。这些肽拮抗剂具有肽作为药物分子的已知缺陷，尤其是差的口服生物利用度和降解代谢。
肽衍生物的环化是可用于在代谢稳定性和构象自由两方面改良线性肽的方法。环状分子趋于对代谢酶更耐受。已报道了这种环状肽促胃动素拮抗剂，尤其是GM-109。(Takanashi，H.；Yogo，K.；Ozaki，M.；Akima，M.；Koga，H.；Nabata，H.J.Pharm.Exp.Ther.1995，273，624-628；Haramura，M.；Okamachi，A.；Tsuzuki，K.；Yogo，K.；Ikuta，M.；Kozono，T.；Takanashi，H.；Murayama，E.Chem.Pharm.Bull.2001，49，40-43；Haramura，M.；Okamachi，A.；Tsuzuki，K.；Yogo，K.；Ikuta，M.；Kozono，T.；Takanashi，H.；Murayama，E.J.Med.Chem.2002，45，670-675；美国专利号7,018,981；美国专利申请公开2003/191053；国际专利申请公开WO 02/16404；日本专利摘要公开号07138284)。
大环模拟肽(peptidomimetics)此前已被描述为促胃动素受体拮抗剂并已概述了它们用于治疗多种GI病症和调节肌移动复合波的应用。(国际专利申请公开WO 2004/111077；美国专利申请公开2005/054562；美国临时专利申请60/938,655；美国临时专利申请60/939,280；Marsault，E.；Hoveyda，H.R.；Peterson，M.L.；Saint-Louis，C；Landry，A.；Vezina，M.；Ouellet，L.；Wang，Z.；Ramaseshan，M.；Beaubien，S.；Benakli，K.；Beauchemin，S.；Deziel，R.；Peeters，T.；Fraser，G.L.J.Med.Chem.2006，49，7190-7197；Marsault，E.；Benakli，K.；Beaubein，S.；Saint-Louis，C；Deziel，R.；Fraser，G.Bioorg Med.Chem.Lett.2007，17，4187-4190.)。这些模拟肽大环促胃动素拮抗剂不同于前述的环状肽促胃动素拮抗剂，因为发现这种含有D-氨基酸的肽衍生物无活性。相反，对于本发明的三肽模拟化合物，D-立体化学对三个构建元件(building element)中的两个有利。而且，分子的拴系物(tether)部分提供了非肽组成部分以及不同的结构。
本发明的模拟肽大环已被证实具有对促胃动素受体的结合活性和功能活性。尽管结合能力和靶亲合性是药物发现和开发中的因素，优化药代动力学(PK)和药效学(PD)参数对开发可行的药剂也很重要。制药工业中研究的焦点领域是更好地理解以这种方式确定分子适当性的潜在因素，通常俗称为其″类药性(drug-likeness)″。(Lipinski，C.A.；Lombardo，F.；Dominy，B.W.；Feeney，P.J.Adv.Drug Delivery Rev.1997，23，3-25；Muegge，I.Med.Res.Rev.2003，23，302-321；Veber，D.F.；Johnson，S.R.；Cheng，H-Y.；Smith，B.R.；Ward，K.W.；Kopple，K.D.J.Med.Chem.2002，45，2615-2623.)。例如，分子量、log P、膜渗透性、氢键供体和受体的数目、总极性表面积(TPSA)和可旋转键的数目都与药物开发中成功的化合物相关联。此外，血浆蛋白结合的试验测量值、与细胞色素P450酶的相互作用和药代动力学参数被用于制药工业以选择和推进新药物候选者。
然而，大环结构类的这些参数还未被广泛探究或报道。这对这类分子的药物开发产生了巨大挑战。已发现本发明的大环化合物具有期望的药理学特性，同时保持对促胃动素受体的足够的结合亲合性和选择性，如实施例中所示。这些联合的特性使得它们更适于被开发为药剂。
还已报道了性质为非肽和非大环的其它促胃动素拮抗剂。[(RWJ-68023：Beavers，M.P.；Gunnet，J.W.；Hageman，W.；Miller，W.；Moore，J.B.；Zhou，L.；Chen，R.H.K.；Xiang，A.；Urbanski，M.；Combs，D.W.；Mayo，K.H.；Demarest，K.T.Drug Design Disc.2001，17，243-251)；Johnson，S.G.；Gunnet，J.W.；Moore，J.B.等Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，3362-3366；美国专利号5,972,939；6,384,031；6,392,040；6,423,714；6,511,980；6,624,165；6,667,309；6,967,199；美国专利申请公开2001/041701；2001/056106，2002/002192；2002/013352；2002/103238；2002/111484；2003/203906；2005/148584；2007/054888；国际专利申请公开WO 99/21846；WO 01/68620；WO 01/68621；WO 01/68622；WO01/85694)。其中已在人类中试验RWJ-68023，但结果糟糕，可能是由于该分子的效力水平。(Kamerling，I.M.C.；van Haarst，A.D.；Burggraaf，J.等Br.J.Clin.Pharmacol.2003，57，393-401.)。
事实上，此前研究较多的促胃动素拮抗剂RWJ-68023和GM-109都不具备针对该受体的有效药物制品的较佳完全特征(full profile)，包括对促胃动素受体的高结合亲合性和功能活性、好的Caco-2膜渗透性、合适的药代动力学特征[合理的血浆半衰期(t1/2)和清除值(ClT)]、口服生物利用度、足以方便配制的溶解度和体内效力。相反，已发现本发明的大环促胃动素拮抗剂具备至少一些(如果不是所有)上述有利特性。
发明概述
本发明提供了具有改进的药理学特征的新型构象-界定的大环化合物。这些化合物可作为促胃动素受体的拮抗剂起作用。
根据本发明各方面，本发明涉及下式I的化合物和其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：
Figure A20078003349400651
其中：
Y是
其中(L5)和(L6)分别表示结合式I的L5和L6的键；
Ar选自以下基团：
Figure A20078003349400653
R1选自低级烃基和环烃基；
R2选自低级烃基、取代的低级烃基、环烃基和取代的环烃基；
R3、R4、R5和R6独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R7选自氢、低级烃基、羟基和氨基；
R10a和R1b独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
X1、X2、X6、X7、X8和X9独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
X3、X4和X5独立地选自氢、羟基、烃氧基、卤素、三氟甲基和低级烃基；
L1、L2、L3和L4独立地选自CH和N；前提是环中氮的总数必须是0、1、2或3；
L5和L6独立地选自O、CR8aR8b和NR9组成的组；其中R8a和R8b独立地选自氢和低级烃基；且R9选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
在本发明的特定方面，式I的Ar选自基团：
Figure A20078003349400661
在本发明另一方面，式I的R1选自甲基、乙基、异丙基和环丙基。
在本发明另一些方面，式I的R2选自(CH2)mCH3、(CH2)n1R11、CH2N3、(CH2)n2NR12R13、(CH2)n3C(＝NR14)NR15R16、(CH2)n4NR17C(＝NR18)NR19R20和(CH2)n5NHC(＝O)NR21R22，其中m是0、1、2或3；n1、n2、n3、n4和n5独立地为1、2、3或4；R11、R13、R16、R17、R20、R21和R22独立地选自氢和低级烃基；R12、R15和R19独立地选自氢、低级烃基、羧烃基、羧芳基和磺酰基；R14和R18独立地选自氢、低级烃基、羧烃基、羧芳基、磺酰基和氰基。
在本发明其它方面，式I的R2选自以下基团：
Figure A20078003349400671
其中M选自CH2、O、NH和NCH3。
在本发明另一方面，式I的L1、L2、L3和L4各为CH，L5为O，且L6为CH2。
在本发明其它方面，式I的R3、R4、R5和R6各为氢；或R3为甲基且R4、R5和R6各为氢；或R3为羟基甲基且R4、R5和R6各为氢；或R3、R4和R6各为氢且R5为甲基；或R3和R5各为甲基且R4和R6各为氢。
在本发明另一方面，式I的Y选自：
其中(L5)和(L6)分别表示结合L5和L6的键。
在另一方面，本发明涉及下式II的化合物：
其中R25选自氢、烃基、芳基、环烃基、杂环和杂芳基；R26选自氢、烃基、芳基、酰基、羧烃基、羧芳基、磺酰基和用于氨基酸的标准保护基团；R27选自氢和烃基；且R28选自以下基团：
Figure A20078003349400681
其中M选自CH2、O、NH和NCH3。
在其它方面，本发明涉及下式III的化合物：
Figure A20078003349400682
其中X10和X11独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
R40、R41、R42和R43独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R44选自氢、烃基、酰基、羧烃基、羧芳基、磺酰基和用于胺官能团的保护基团；
R45选自氢和烃基；
R46选自氢、烃基、酰基、磺酰基和用于羟基官能团的保护基团；
L11、L12、L13和L14独立地选自CH和N；前提是环中氮的总数必须是0、1、2或3；
L15和L16独立地选自O、CR47R48和NR49；其中R47和R48独立地选自氢和低级烃基；且R49选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
在本发明另一方面中，式III的化合物可用于提供式I的化合物。式III的化合物还可用于提供包括构件结构(building block structure)如氨基酸构件结构和式III化合物的大环化合物。
在另一方面，本发明还涉及使用本文所述的并用来制备预防和/或治疗本文所述病症的药物的化合物的方法。
本发明的前述方面和其它方面在以下陈述的说明书中更详细解释。
附图说明
图1显示本发明的代表性氨基酸构件(building block)的合成路线。
图2显示本发明的另一种代表性氨基酸构件的合成路线。
图3显示本发明的代表性构件的合成路线。
图4显示本发明的另一种代表性构件的合成路线。
图5显示本发明的代表性拴系物构件的合成路线。
图6显示本发明的另一种代表性拴系物构件的合成路线。
图7显示固相合成本发明大环化合物的一般路线。
图8显示液相合成本发明大环化合物的一般路线。
图9显示本发明的代表性化合物的合成路线。
图10显示本发明的另一种代表性化合物的合成路线。
图11显示本发明的另一种代表性氨基酸构件的合成路线。
图12显示本发明的代表性化合物的合成路线。
图13呈现描绘本发明示例性化合物药代动力学参数的图，具体为：静脉施用2.0mg/kg化合物502与环糊精后(图A)，皮下注射2.0mg/kg化合物502无环糊精后(图B)，静脉施用1.9mg/kg化合物552与环糊精后(图C)，皮下施用2.0mg/kg化合物552无环糊精后(图D)，口服施用8.0mg/kg化合物552与环糊精后(图E)，静脉施用2.0mg/kg化合物563与环糊精后(图F)，口服施用7.7mg/kg化合物563与环糊精后(图G)。
图14显示本发明的代表性拴系物构件的合成路线。
图15显示本发明的另一种代表性拴系物构件的合成路线。
图16显示本发明的另一种代表性拴系物构件的合成路线。
图17显示本发明的代表性化合物的合成路线。
图18呈现描绘本发明代表性化合物对促胃动素-引起的鼩鼱(shrew)结肠中收缩(图A)和[Nle13]-促胃动素-引起的鼩鼱结肠中收缩(图B)的作用的图。
图19呈现描绘本发明代表性化合物在化疗引起的腹泻的犬模型中的作用的图。
发明详述
本发明的前述方面和其它方面将根据本文所述其它实施方式而更详细描述。应理解本发明可以不同形式实现，不应该认为局限于本文所列实施方式。更确切地，提供这些实施方式以使本公开彻底和完整，并向本领域技术人员全面传达本发明的范围。
本文在本发明的描述中所用的术语仅是为了描述特定实施方式，不意味着限制本发明。本发明的描述和所附权利要求书中所用的单数形式″一(a)″、″一(an)″和″一(the)″意为包括复数形式，除非上下文清楚地另外指出。此外，本文所用的术语″和/或″包括相关列出条目的一种或多种的任意和所有联合，并可缩写为″/″。
除非另外限定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有的含义与本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解的含义相同。
本文引述的所有出版物、美国专利申请、美国专利和其它参考文件以引用的方式完整地并入本文。
术语″烃基″指具有1至20碳原子的直链或支链的饱和或部分不饱和碳氢化合物基团，在一些情况具有1至8碳原子。术语″低级烃基″指包含1至6碳原子的烃基基团。烃基基团的例子包括但不限于甲基、乙基、异丙基、叔丁基、3-己烯基和2-丁炔基。″不饱和″指存在1、2或3个双键或三键，或两者的联合。这种烃基基团还可如下所述地任选地被取代。
当下标用在本文界定的烃基或其它碳氢化合物基团时，下标指该基团包含的碳原子数目。例如C2-C4烃基指具有2、3或4碳原子的烃基基团。
术语″环烃基″指环中具有3至15碳原子的饱和或部分不饱和的环状碳氢化合物基团，在一些情况具有3至7碳原子，并指包含所述环状碳氢化合物基团的烃基基团。环烃基基团的例子包括但不限于环丙基、环丙基甲基、环戊基、2-(环己基)乙基、环庚基和环己烯基。本文界定的环烃基还包括具有多个碳环的基团，每个碳环可为饱和或部分不饱和的，例如十氢萘基(decalinyl)、[2.2.1]-二环庚基或金刚烷基。所有这种环烃基基团还可如下所述地任选被取代。
术语″芳族″指具有包含4n+2电子的共轭的π电子系统的不饱和的环状碳氢化合物基团，其中n是大于或等于1的整数。芳族分子通常是稳定的，并被描绘为具有共振结构的平面原子环，该共振结构由交替的双键和单键组成，例如苯或萘。
术语″芳基″指以单个或稠合碳环系统的具有6至15环原子的芳族基团，在一些情况具有6至10环原子，并指包含所述芳族基团的烃基基团。芳基基团的例子包括但不限于苯基、1-萘基、2-萘基和苄基。本文界定的芳基还包括具有多个芳基环的基团，这些环可为稠合的，如萘基和蒽基，或未稠合，如联苯基和三联苯基。芳基还指二环或三环的碳环，其中这些环之一是芳族的，其余的可为饱和、部分不饱和或芳族的，例如茚满基或四氢萘基(tetralinyl)。所有这种芳基基团还可如下所述地任选地被取代。
术语″杂环″或″杂环的″指具有3至15原子的饱和或部分不饱和的单环、二环或三环基团，在一些情况具有3至7原子，至少一个环中具有至少一个杂原子，所述杂原子选自O、S或N。杂环基团的每个环可包含一个或两个O原子、一个或两个S原子、一个至四个N原子，条件是每个环中杂原子的总数为四或更少，且每个环包含至少一个碳原子。完成二环或三环的杂环基团的稠合环可仅包含碳原子且可为饱和或部分不饱和的。N和S原子可任选地被氧化且N原子可任选地被季铵化。杂环还指包含所述单环、二环或三环的杂环基团的烃基基团。杂环的例子包括但不限于2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-吗啉基。所有这种杂环基团还可如下所述地任选地被取代。
术语″杂芳基″指以单个或稠合环系统的具有5至15环原子的芳族基团，在一些情况具有5至10环原子，至少一个环中具有至少一个杂原子，所述杂原子选自O、S或N。杂芳基基团的每个环可包含一个或两个O原子、一个或两个S原子、一个至四个N原子，条件是每个环中杂原子的总数为四或更少，且每个环包含至少一个碳原子。完成二环或三环基团的稠合环可仅包含碳原子且可为饱和的、部分不饱和或芳族的。在氮原子的孤立电子对不牵涉在完成芳族π电子系统的结构中，N原子可任选地被季铵化或氧化为N-氧化物。杂芳基还指包含所述环状基团的烃基基团。单环杂芳基基团的例子包括但不限于吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。二环杂芳基基团的例子包括但不限于吲哚基、苯并噻唑基、苯丙噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基基团的例子包括但不限于氮芴基、苯并吲哚基(benzindolyl)、菲咯啉基(phenanthrollinyl)、吖啶基、菲啶基和呫吨基。所有这种杂芳基基团还可如下所述地任选地被取代。
术语″羟基″指基团-OH。
术语″烃氧基″指基团-ORa，其中Ra是烃基、环烃基或杂环。例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、环己氧基和四氢吡喃氧基。
术语″芳氧基″指基团-ORb，其中Rb是芳基或杂芳基。例子包括但不限于苯氧基、苄氧基和2-萘氧基。
术语″酰基″指基团-C(＝O)-Rc，其中Rc是烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。例子包括但不限于乙酰基、苯甲酰基和呋喃甲酰基。
术语″氨基酰基″指衍生自氨基酸的酰基基团。
术语″氨基″指-NRdRe基团，其中Rd和Re独立地选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基和杂芳基。或者是Rd与Re一起形成3至8元的杂环，任选地被未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、巯基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基或脲基取代，且任选地包含1至3个选自O、S或N的另外杂原子。
术语″酰氨基″指基团-C(＝O)-NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基和杂芳基。或者是，Rf与Rg一起形成3至8元的杂环，任选地被未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、巯基、亚酰酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基或脲基取代，且任选地包含1至3个选自O、S或N的另外杂原子。
术语″脒基″指基团-C(＝NRh)NRiRj，其中Rh选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基和杂芳基；且Ri和Rj独立地选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基和杂芳基。或者是，Ri与Rj一起形成3至8元的杂环，任选地被未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、巯基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基或脲基取代，且任选地包含1至3个选自O、S或N的另外杂原子。
术语″羧基″指基团-CO2H。
术语″羧烃基″指基团-CO2Rk，其中Rk是烃基、环烃基或杂环。
术语″羧芳基″指基团-CO2Rm，其中Rm是芳基或杂芳基。
术语″氰基″指基团-CN。
术语″甲酰基″指基团-C(＝O)H，还表示-CHO。
术语″卤″、″卤素″或″卤化物″分别指氟代、氟或氟化物、氯代、氯或氯化物、溴代、溴或溴化物和碘代、碘或碘化物。
术语″羟基甲基″指基团-CH2OH。
术语″巯基″指基团-SRn，其中Rn是氢、烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。
术语″硝基″指基团-NO2。
术语″氧″指二价基团＝O，其代替同一碳原子上的两个氢原子以形成羰基基团。
术语″亚磺酰基″指基团-S(＝O)RP，其中Rp是烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。
术语″磺酰基″指基团-S(＝O)2-Rq1，其中Rq1是烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。
术语″三氟甲基″指基团-CF3。
术语″氨基磺酰基″指基团-NRq2-S(＝O)2-Rq3，其中Rq2是氢、烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基；且Rq3是烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。
术语″磺酰氨基″指基团-S(＝O)2-NRrRs，其中Rr和Rs独立地选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。或者是，Rr与Rs一起形成3至8元的杂环，任选地被未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、巯基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基或脲基取代，且任选地包含1至3个选自O、S或N的另外杂原子。
术语″氨基甲酰基″指式-N(Rt)-C(＝O)-ORu的基团，其中Rt选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基；且Ru选自烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。
术语″胍基″指式-N(Rv)-C(＝NRw)-NRxRy的基团，其中Rv、Rw、Rx和Ry独立地选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。或者是，Rx与Ry一起形成3至8元的杂环，任选地被未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、巯基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基或脲基取代，且任选地包含1至3个选自O、S或N的另外杂原子。
术语″脲基″指式-N(Rz)-C(＝O)-NRaaRbb的基团，其中Rz、Raa和Rbb独立地选自氢、烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基。或者是，Raa和Rbb一起形成3至8元的杂环，任选地被未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、巯基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基或脲基取代，且任选地包含1至3个选自O、S或N的另外杂原子。
术语″任选地取代的″意为清楚地指出指定基团是未取代的或被一个或多个合适取代基取代的，除非清楚地指定了任选取代基，在那种情况下术语指出该基团是未取代的或被指定取代基取代的。如以上所定义的，除非另外指出(如，指出指定基团是未取代的)，各基团可为未取代的或取代的(即它们是任选地取代的)。
术语″取代的″当与术语烃基、环烃基、杂环、芳基和杂芳基一起使用时指该基团的一个或多个氢原子被取代基代替的烃基、环烃基、杂环、芳基或杂芳基基团，所述取代基独立地选自未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、卤、氧、巯基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基、脲基和式-NRccC(＝O)Rdd、-NReeC(＝NRff)Rgg、-OC(＝O)NRhhRii、-OC(＝O)Rjj、-OC(＝O)ORkk、-NRmmSO2Rnn或-NRppSO2NRqqRrr的基团，其中Rcc、Rdd、Ree、Rff、Rgg、Rhh、Rii、Rjj、Rmm、Rpp、Rqq和Rrr独立地选自氢、未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基或未取代的杂芳基；且其中Rkk和Rnn独立地选自未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基或未取代的杂芳基。或者是，Rgg与Rhh、Rjj与Rkk或Rpp与Rqq一起形成3至8元的杂环，任选地被未取代的烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环、未取代的芳基、未取代的杂芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、酰基、氨基、酰氨基、羧基、羧烃基、羧芳基、巯基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰氨基、脒基、氨基甲酰基、胍基或脲基取代，且任选地包含1至3个选自O、S或N的另外杂原子。此外，对芳基和杂芳基基团的术语″取代的″包括该基团的一个氢原子被氰基、硝基或三氟甲基代替作为一种选择。
只要不超出任何原子的正常价数且取代产生稳定化合物，就可进行取代。通常，当存在基团的取代形式时，这种取代的基团优选地不被进一步取代，或如果被取代，则取代基仅包括有限数目的取代基团，在一些情况包括1、2、3或4个这种取代基。
当本文任何组成成分(constituent)或任何式中的任何变量出现多于一次时，其在每次出现时的定义独立于其在每次另外出现时的定义。而且，只有当取代基和/或变量的组合产生稳定化合物时这种组合才是被允许的。
″稳定化合物″或″稳定结构″指化合物足够牢固以致能经受分离至有用的纯度水平和配制为有效治疗剂。
术语″氨基酸″指本领域技术人员已知的通常天然的(遗传编码的)或合成的氨基酸及其通常的衍生物。当应用于氨基酸时，″标准″或″蛋白″指处于天然构型的遗传编码的20种氨基酸。类似地，当应用于氨基酸时，″非天然″或″不常见″指广泛选择的非天然、稀有或合成氨基酸，如Hunt，S.在Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids(氨基酸的化学和生物化学)，Barrett，G.C.编辑，Chapman and Hall：New York，1985中描述的。
术语″残基″有关氨基酸或氨基酸衍生物时指下式的基团：
Figure A20078003349400751
其中RAA是氨基酸侧链，且这种情况n＝0、1或2。
术语″片段″有关二肽、三肽或更高级肽衍生物时分别指包含2个、3个或更多氨基酸残基的基团。
术语″氨基酸侧链″指来自标准的或非天然氨基酸的任何侧链，标为RAA。例如，丙氨酸的侧链是甲基，缬氨酸的侧链是异丙基，色氨酸的侧链是3-吲哚基甲基。
术语″激动剂″指加倍蛋白质、受体、酶或类似物的内源配体的至少一些效力的化合物。
术语″拮抗剂″指抑制蛋白质、受体、酶或类似物的内源配体的至少一些效力的化合物。
术语″变体″当应用至受体时指包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和包含多个组成成分的其它生物复合体。这些组成成分可相同或不同。
术语″肽″指包括两个或多个共价结合在一起的氨基酸的化合物。
术语″模拟肽″指设计为模拟肽的化合物，但通过添加或代替肽的一个或多个官能团而包含结构差异，以调节其活性或其它特征，如溶解度、代谢稳定性、口服生物利用度、亲脂性、渗透性等。这可包括肽键代替、侧链修饰、截短、添加官能团等。当化学结构不是衍生自肽但模拟其活性时，通常称为″非-肽模拟肽″。
术语″肽键″指酰胺[-C(＝O)-NH-]官能性，藉此肽中的单独氨基酸通常彼此共价键合。
术语″保护基团″指可用于保护分子上可能的反应性官能团如胺、羟基或羧基在分子中别处发生化学变化时免受化学反应的任何化合物。本领域技术人员已知大量这种保护基团，例子可见于″Protective Groups inOrganic Synthesis(有机合成中的保护基团)，″Theodora W.Greene和PeterG.Wuts编辑，John Wiley & Sons，New York，第三版，1999[ISBN0471160199]。氨基保护基团的例子包括但不限于苯二甲酰亚氨基、三氯乙酰基、苄氧基羰基、叔丁氧基羰基和金刚烷氧基羰基。在一些实施方式，氨基保护基团为氨基甲酸酯氨基保护基团，其被定义为当结合至氨基基团时形成氨基甲酸酯的氨基保护基团。在其它实施方式，氨基氨基甲酸酯保护基团为烯丙氧基羰基(Alloc)、苄氧基羰基(Cbz)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)和α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基(Ddz)。近来研究的新的氮保护基团：Theodoridis，G.Tetrahedron 2000，56，2339-2358。羟基保护基团的例子包括但不限于乙酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三苯甲基(Trt)、叔丁基和四氢吡喃基(THP)。羧基保护基团的例子包括但不限于甲基酯、叔丁酯、苄基酯、三甲基甲硅烷基乙基酯和2，2，2-三氯代乙基酯。
术语″固相化学反应″指进行化学反应，其中反应的一个成分共价键合至聚合物材料(如下定义的固体支持物)。在肽和寡核苷酸化学反应传统领域之外，在固相上进行化学反应的反应方法已广泛已知和建立。
术语″固体支持物″、″固相″或″树脂″指用于进行固相化学反应的机械和化学稳定的聚合基质。这表示为″树脂″、″P-″或如下符号：
Figure A20078003349400771
合适聚合物材料的例子包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙二醇、接枝至或共价键合至聚苯乙烯的聚乙二醇(也称为PEG-聚苯乙烯、TentaGelTM，Rapp，W.；Zhang，L.；Bayer，E.In Innovations and Perspectivesin Solid Phase Synthesis.Peptides，Polypeptides and Oligonucleotides(固相合成中的新方法和展望。肽、多肽和寡核苷酸)；Epton，R.编辑；SPCCLtd.：Birmingham，UK；p 205)、聚丙烯酸酯(CLEARTM)、聚丙烯酰胺、聚氨基甲酸酯、PEGA[聚乙二醇聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)共聚物，Meldal，M.Tetrahedron Lett.1992，33，3077-3080]、纤维素等。这些材料可任选地包含其它化学剂以形成交联键以便机械上稳定该结构，例如用二乙烯基苯(DVB，通常0.1-5％，优选地0.5-2％)交联的聚苯乙烯。作为非限制性例子该固体支持物可包括氨基甲基聚苯乙烯、羟基甲基聚苯乙烯、二苯甲基胺聚苯乙烯(BHA)、甲基二苯甲基胺(MBHA)聚苯乙烯和包含自由化学官能团(最经常为-NH2或-OH)用于进一步衍生作用或反应的其它聚合物骨架。该术语还意味着包括具有高比例(″负载″)的这些官能团的″超级树脂(Ultraresins)″，如从聚乙烯亚胺和交联分子制备的那些(Barth，M.；Rademann，J.J.Comb.Chem.2004，6，340-349)。在合成结束时，通常丢弃树脂，尽管已显示它们能再次使用，如在Frechet，J.M.J.；Haque，K.E.Tetrahedron Lett.1975，16，3055中。
总之，用作树脂的材料是不溶聚合物，但一些聚合物取决于溶剂而具有不同溶解度，也可用于固相化学反应。例如聚乙二醇可以这种方式使用，因为它在许多可在其中进行化学反应的有机溶剂中可溶，但在其它溶剂如乙醚中不溶。因此，反应可在溶液中均相地进行，然后通过加入乙醚使聚合物上的产物沉淀，作为固体处理。这已被称为″液相″化学反应。
术语″连接体″当关于固相化学反应使用时指一种化学基团，其共价键合至固体支持物并连接在支持物和基质之间，通常是为了允许基质从固体支持物释放(裂解)。然而它还可用于对连接固体支持物的键赋予稳定性或仅作为间隔元件。市场上有许多已连接有连接体的固体支持物。
用于氨基酸的缩写和肽的名称遵循生物化学命名IUPAC-IUB委员会在J.Biol.Chem.1972，247，977-983中的规则。该文件已被更新：Biochem.J.，1984，219，345-373；Eur.J.Biochem.，1984，138，9-37；1985，152，1；Internat.J.Pept.Prot.Res.，1984，24，p 84下；J.Biol.Chem.，1985，260，14-42；Pure Appl.Chem.，1984，56，595-624；Amino Acids andPeptides，1985，16，387-410；和在Biochemistry Nomenclature and RelatedDocuments(生物化学命名和相关文件)，第二版，Portland Press，1992，pp39-67。这些规则的增订出版于JCBN/NC-IUB Newsletter 1985，1986，1989；见Biochemistry Nomenclature and Related Documents(生物化学命名和相关文件)，第二版，Portland Press，1992，pp 68-69。
术语″有效量″或″有效″代表一种剂量，其导致疾病或病症的症状缓解，如由临床测试和评价、患者观察和/或类似方法注意到的，和/或代表一种剂量，其导致生物活性或化学活性可检测的变化。可检测的变化可由本领域技术人员对相关机制或方法检测和/或进一步定量。如本领域通常理解的，剂量将取决于施用途径、症状和患者体重而改变，但也取决于被施用的化合物。
″联合″施用两种或多种化合物是指这两种化合物施用的时间足够接近以致其中一种的存在改变另一种的生物效应。两种化合物可同时(一起)或顺序地施用。同时施用可通过在施用前混合各化合物而实现，或通过在同一时间点在不同解剖学位置施用或使用不同施用途径而实现。本文使用的短语″一起施用″、″联合施用″、″同时施用″或″同时地施用″意为各化合物在相同时间点施用或彼此紧接着施用。在后一种情况，两种化合物施用的时间足够接近以致观察到的结果与各化合物在相同时间点施用所得到的结果难以区分。
术语″药学上活性的代谢物″意为指经由体内代谢指定化合物产生的药理学活性的产物。
术语″溶剂合物″意为指指定化合物的药学上可接受的溶剂合物形式，其保持了该化合物的生物有效性。溶剂合物的例子包括但不限于与水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸或乙醇胺结合的本发明化合物。
术语″同时″或″一起″当应用于疾病或病症时，指该疾病或病症是在受治疗者患有该疾病或病症的至少一些时间(但不必是全部时间)的相同时间点发生。
术语″顺序地″当应用于疾病或病症时意为指该疾病或病症不是在相同时间点发生但彼此紧接着发生。
1.化合物
本发明的新型大环化合物包括包含构件结构的大环化合物，该构件结构包括经受环化以形成大环化合物的拴系物部分。构件结构可包括氨基酸(标准和非天然)和如本文所述的拴系物部分。拴系物部分可选自造成下述结构的化合物：
其中(NHA)表示至式I中CH(CHR7Ar)键合的氮原子的键；(NHB)表示至式I中羰基(C＝O)键合的氮原子的键；R31选自氢、甲基和羟基甲基；R32选自氢、甲基和羟基。
本发明的大环化合物还包括下式I的那些化合物和其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：
Figure A20078003349400811
其中：
Y是
Figure A20078003349400812
其中(L5)和(L6)分别表示结合式I的L5和L6的键；
Ar选自以下组成的组：
Figure A20078003349400813
R1选自低级烃基和环烃基；
R2选自低级烃基、取代的低级烃基、环烃基和取代的环烃基；
R3、R4、R5和R6独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R7选自氢、低级烃基、羟基和氨基；
R10a和R10b独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
X1、X2、X6、X7、X8和X9独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
X3、X4和X5独立地选自氢、羟基、烃氧基、卤素、三氟甲基和低级烃基；
L1、L2、L3和L4独立地选自CH和N；前提是环中氮的总数必须是0、1、2.或3；
L5和L6独立地选自O、CR8aR8b和NR9；其中R8a和R8b独立地选自氢和低级烃基；且R9选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
本发明包括分离的化合物。分离的化合物指一种化合物，其在一些实施方式占混合物中化合物的至少10％、至少25％、至少50％或至少70％。在一些实施方式，化合物、其药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物在生物测定中检测时对人类促胃动素受体表现统计上显着的结合和/或拮抗活性。
在化合物、盐或溶剂合物是固体的情形，本领域技术人员理解本发明化合物、盐和溶剂合物可以不同晶体或多晶形式存在，所有这些都规定在本发明和指定式的范围内。
本文公开的式I化合物具有不对称中心。本发明化合物可以单独立体异构体、外消旋体和/或对映体和/或非对映体的混合物存在。所有这些单独立体异构体、外消旋体和其混合物都规定在本发明的范围内。然而在特定实施方式，本发明化合物以光学纯的形式使用。本文所用的术语″S″和″R″构型是由IUPAC 1974 Recommendations for Section E，Fundamentals of Stereochemistry(立体化学基本原则，对E部分的建议)(Pure Appl.Chem.1976，45，13-30.)定义的。
除非另外示意为指定方向，本发明包括所有立体异构体形式。化合物可制备为单独的立体异构体或立体异构体的混合物。非消旋形式可由合成或拆分而获得。例如化合物可由标准技术被拆分为各组成对映体，例如通过形成盐而形成非对映对。化合物还可由共价键合至手性部分而被拆分。随后非对映体可由色谱分离和/或结晶分离而被拆分。在手性附加部分的情况，随后可移除它。作为一个选择，可通过使用手性色谱法而拆分化合物。在一些情况还可使用酶的拆分方法。
如本领域技术人员通常理解的，″光学纯的″化合物是仅包含单独对映体的化合物。本文所用的术语″旋光的″意指化合物包括的一种对映体比另一种对映体至少足够过量，以致混合物旋转平面偏振光。旋光化合物具有旋转偏振光平面的能力。一种对映体超过另一种通常表示为对映体过量(e.e.)。在描述旋光化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀″d″和″l″或(+)和(-)用于表示化合物的光学旋转(即，偏振光平面被旋光化合物旋转的方向)。″l″或(-)前缀表示化合物是左旋的(即，向左或逆时针地旋转偏振光平面)而″d″或(+)前缀表示化合物是右旋的(即，向右或顺时针地旋转偏振光平面)。光学旋转的符号(-)和(+)与分子的绝对构型R和S不相关。
具有期望的药理学特征的本发明的化合物应是旋光的且可包括至少90％(80％e.e.)、至少95％(90％e.e.)、至少97.5％(95％e.e.)或至少99％(98％e.e.)的单独异构体。
类似地，本文公开的化合物中还可存在双键的许多几何异构体和类似物，除非另外指定，所有这种稳定异构体均被包括在本发明中。本发明还包括式I、II和/或III的互变异构体和旋转异构体。
使用以下符号表示所指环的一个或多个氢原子被所定义的取代基R取代。
Figure A20078003349400831
使用以下符号表示单键或任选的双键：
Figure A20078003349400832
。
2.合成方法
式I化合物可使用传统液相合成技术或固相化学方法合成。对这种一般类型大环结构的合成方法描述于国际专利申请WO 01/25257、WO2004/111077、WO 2005/012331、WO 2005/012332、WO 2006/009645和WO 2006/009674，包括WO 2004/111077和WO 2005/012331中描述的纯化方案。对本发明化合物的代表性方案展示在实施例中。
A.总论
除非另外指明，使用的试剂和溶剂是试剂级或更高级别的，是从各市场供应商获得的。使用的DMF、DCM(CH2Cl2)、DME、CH3CN和THF是
Figure A20078003349400833
(EMD Chemicals，Inc.，Merck KgaA的成员，Darmstadt，Germany)的或合成级的，除了用于(i)脱保护、(ii)树脂封端反应和(iii)洗涤的。用于氨基酸(AA)偶合反应的NMP是分析级的。DMF在使用前通过置于真空至少30分钟而充分脱气。均相催化剂从Strem Chemicals，Inc.(Newbury Port，MA，USA)获得。Cbz-、Boc-和Fmoc-保护的氨基酸和侧链保护的衍生物，包括N-甲基和非天然氨基酸的那些，从市场供应商获得或用本领域已知标准方法合成。Ddz-氨基酸由标准方法合成，或从Orpegen(Heidelberg，Germany)或Advanced ChemTech(Louisville，KY，USA)购得。Bts-氨基酸用确定的方案合成。分析TLC在包含荧光指示剂的硅胶60F254(厚0.25mm)的预涂板上进行并使用所指出的方法和试剂使其可见，例如使用紫外光(UV)和/或钼酸铈(CMA)溶液(混合100mL硫酸、10g硫酸铈铵和25g钼酸铵而制备)。
术语″在减压下浓缩/蒸发/除去″指使用旋转蒸发器除去溶剂和挥发性成分，在水泵压力(通常10-30torr)下或对所除去的溶剂合适的由机械油真空泵提供的更强真空(″高真空，″通常＜1torr)下。″在真空″或在″高真空″干燥化合物指在低压(＜1torr)使用油真空泵干燥。″快速色谱法″使用硅胶60(230-400目，EMD Chemicals，Still，W.C；Kahn，M.；Mitra，A.J.Org.Chem.1978，43，2923-2925)进行，是本领域技术人员熟知的方法。″干燥柱(Dry pack)″指在还未用溶剂预处理的硅胶上进行色谱法，通常应用于较大规模的纯化，其中在期望产物和任何杂质之间存在Rf的大差异。对于固相化学过程，″以标准方式干燥″是指树脂首先在空气中干燥(1h)，随后在真空下(通常油泵)干燥直到获得完全干燥(～30min至O/N(过夜))。在对空气和水敏感的反应中使用的玻璃制品在使用前在烤箱中干燥至少O/N(过夜)并在干燥器中冷却。
B.氨基酸
氨基酸、Boc-和Fmoc-保护的氨基酸和侧链保护的衍生物，包括N-甲基和非天然氨基酸的衍生物，从市场供应商获得[例如：AdvancedChemTech(Louisville，KY，USA)、Bachem(Bubendorf，Switzerland)、ChemImpex(Wood Dale，IL，USA)、Novabiochem(Merck KgaA的子公司，Darmstadt，Germany)、PepTech(Burlington，MA，USA)、Synthetech(Albany，OR，USA)、AstaTech(Bristol，PA，USA)]或由本领域技术人员已知标准方法合成。Ddz-氨基酸从Orpegen(Heidelberg，Germany)或Advanced ChemTech(Louisville，KY，USA)购得或以标准方法使用Ddz-OPh或DdZ-N3合成。(Birr，C；Lochinger，W.；Stahnke，G.；Lang，P.Justus Liebigs Ann.Chem.1972，763，162-172.)。Bts-氨基酸使用已知方法合成。(Vedejs，E,；Lin，S,；Klapara，A.；Wang，J.J.Am.Chem.Soc.1996，118，9796-9797；Vedejs，E.；Kongkittingam，C.J.Org.Chem.2000，65，2309-2318；以及国际专利申请号WO 01/25257、WO 2004/111077)。N-烃基氨基酸尤其是N-甲基氨基酸，从多个卖主(Bachem，Novabiochem，Advanced ChemTech，ChemImpex，Peptech)购得。此外，N-烃基氨基酸衍生物由文献方法获取。(Hansen，D.W.，Jr.；Pilipauskas，D.J.Org.Chem.1985，50，945-950.)。氮丙啶-2-羧酸使用文献报道方法得到。(Baldwin，J.E.等Tetrahedron 1993，49，6309-6330；Nakajima，K.等Bull.Chem.Soc.Jpn.1978，57，1577-1578.)。3-氯代酪氨酸使用文献方法合成。(Yu，G.；Mason，H.J.；Galdi，K.等Synthesis 2003，403-407.)。
特地为在这些大环中使用而构造了其它氨基酸，如式II的那些：
Figure A20078003349400851
其中R25选自氢、烃基、芳基、环烃基、杂环和杂芳基；R26选自氢、烃基、芳基、酰基、羧烃基、羧芳基、磺酰基和用于氨基酸的标准保护基团；R27选自氢和烃基；且R28选自以下基团：
其中M选自CH2、O、NH和NCH3。
构造这类代表性氨基酸的方法提供于实施例。这些氨基酸中的一些可看作是精氨酸和/或其胍部分的模拟物(Peterlin-Masic，L.；Kikelj，D.Tetrahedron 2001，57，7073和本文引述的参考文献)。
C.拴系物
拴系物从此前在国际专利申请号WO 01/25257、WO 2004/111077、WO 2005/012331、WO 2006/009645和WO 2006/009674中描述的方法获得。合成本文所述代表性拴系物的方案还展示于以下的实施例。可用于本发明化合物的拴系物可包括如上引述的参考文献中描述的合适拴系物以及已知的和/或本文所述新型拴系物。示例性拴系物包括但不限于以下：
Figure A20078003349400861
及其制备中的中间产物，其中PG1选自氢和用于胺官能团的保护基团，PG2选自氢和用于羟基官能团的保护基团。
可以使用这些拴系物合成本发明示例性化合物的具体方案提供于实施例中。
D.大环合成
用于合成本发明大环化合物的具体的固相技术已描述于国际专利申请公开号WO 01/25257、WO 2004/111077、WO 2005/01233 1和WO2005/012332。液相合成途径，包括适合更大规模制造的方法，描述于国际专利申请公开号WO 2006/009645和WO 2006/009674。这些用于本发明代表性化合物的方法进一步描述于实施例。表1展示了本发明90种代表性化合物合成方法的概述。用于构造大环分子的反应方法示于第2列并涉及合成策略的特定路线，例如使用图7所示的固相策略或图8所示并描述于实施例9的液相方法。第3-6列指示用于每种化合物的单独氨基酸和拴系物构件，使用标准命名法或在本申请中别处展示的构件名称。AA1指形成式I化合物-NR10a-CH(CHR7Ar)-C(＝O)-部分的构件；AA2指形成式I化合物-NH-CHR1-C(＝O)-部分的构件；AA1指形成式I化合物-NH-CHR2-C(＝O)-部分的构件；拴系物指形成式I化合物在NR10a和NR10b之间的其余部分的构件，通常包括NR10a。应注意，对于1-取代的拴系物，例如T38、T90、T91、T92、T93、T94、T95、T96、T97、T98和T99，引入其的反应化学颠倒了在该中心处的立体化学。因此，(R)-取代的拴系物构件产生具有(S)-立构中心的式I化合物。类似地，(S)-取代的拴系物构件产生具有(R)-立构中心的式I化合物。拴系物T90和T91与AA1一起如同实施例6和5中分别作为片段F2和F1被引入。组装环化前体所需的有关的脱保护和偶合步骤使用标准方案和WO 2004/111077、WO 2006/009645及WO 2006/009674中描述的对构件的性质合适的方案进行。应用合适的脱保护顺序后获得最终的大环。如果在环化后需要进行任何反应，将它们列在第7列。表1中展示的所有大环化合物都被纯化并达到内部验收标准(Internal acceptance criteria)。
Figure A20078003349400891
Figure A20078003349400911
接下来的表展示了对化合物501-589获得的分析数据(表2)，由纯化产物的LC-MS分析确定。使用本文所述的生物检测方法，进一步检查了这些化合物与人类促胃动素受体相互作用的能力。
表2：本发明代表性化合物的分析数据
  化合物No+   分子式  计算MW(g/mol)   发现的MS[(M+H)+]
  501   C30H42N5O4Cl   572.1   572
  502   C31H42N5O4F3   605.7   606
  503   C30H40N7O4F3   619.7   620
  504   C31H42N7O4F3   633.7   634
  505   C31H42N7O4F3   633.7   634
  506   C30H41N6O4Cl   585.1   585
  507   C30H42N7O4Cl   600.2   600
  508   C31H44N5O4Cl   586.2   586
  509   C31H39N6O4SCl   627.2   627
  510   C31H39N6O4Cl   595.1   595
  511   C31H39N6O4Cl   595.1   595
  512   C29H40N5O4Cl   558.1   558
  513   C31H43N4O4F   554.7   555
  514   C31H44N5O4F   569.7   570
  515   C31H44N5O4F   569.7   570
  516   C30H42N7O4Cl   600.2   600
  517   C30H42N7O4Cl   600.2   600
  518   C29H39N6O4Cl   571.1   571
  519   C31H42N7O4Cl   612.2   612
  520   C31H43N4O4Cl   571.2   571
  521   C32H44N7O4Cl   626.2   626
  522   C31H41N8O4Cl   625.2   611
  523   C32H41N8O4F3   658.7   659
  524   C33H40N7O4F3   655.7   656
  525   C33H44N5O5F3   647.7   648
  526   C32H40N7O4F3   643.7   644
  527   C31H39N8O4F3   644.7   645
  528   C33H42N7O4F3   657.7   658
  529   C31H44N5O4F   569.7   570
  530   C33H47N4O4F   582.7   583
  531   C31H43N4O4F   554.7   555
  532   C33H44N5O4F3   631.7   632
  533   C33H46N5O4F   595.7   596
  534   C33H46N5O5F   611.7   612
  535   C33H42N7O4F   619.7   620
  536   C32H42N7O4F   607.7   608
  537   C29H36N7O4F3   603.6   604
  538   C29H38N7O4F   567.7   568
  539   C33H40N5O4F3   627.7   628
  540   C33H42N5O4F   591.7   592
  541   C31H43N4O5F   570.7   571
  542   C29H38N5O4F3   577.6   578
  543   C29H40N5O4F   541.7   542
  544   C30H42N5O4F   555.7   556
  545   C30H40N7O4F   581.7   582
  546   C31H44N5O4F   569.7   570
  547   C30H40N5O4F3   591.7   592
  548   C30H42N5O4F   555.7   556
  549   C32H46N5O4F   583.7   584
  550   C34H44N7O4F   633.8   634
  551   C31H43N4O4F   554.7   555
  552   C31H43N4O5Cl   587.1   587
  553   C34H50N4O5   594.8   595
  554   C32H43N4O4F   566.7   567
  555   C32H41N4O4F   564.7   565
  556   C32H45N4O4F   568.7   569
  557   C29H39N4O4F   526.6   527
  558   C30H41N4O4F   540.7   541
  559   C32H43N4O4F   566.7   567
  560   C31H43N4O4F   554.7   555
  561   C31H42N4O4F2   572.7   573
  562   C32H46N4O5   566.7   567
  563   C31H42N4O4F2   572.7   573
  564   C31H42N4O4F2   572.7   573
  565   C30H42N5O4F   555.7   556
  566   C32H41N4O4F   564.7   565
  567   C32H43N4O4F   566.7   567
  568   C29H39N4O5F   542.6   543
  569   C30H41N4O5F   556.7   557
  570   C32H45N4O4F   568.7   569
  571   C29H42N4O4S   542.7   543
  572   C29H42N4O4S   542.7   543
  573   C30H42N5O4F   555.7   556
  574   C30H42N5O4F   555.7   556
  575   C31H41N4O4F3   590.7   591
  576   C29H40N5O6SCl   622.2   622
  577   C29H39N6O5Cl   587.1   587
  578   C29H41N7O5   567.7   568
  579   C31H45N5O5   567.7   568
  580   C30H42N5O4Cl   572.1   572
  581   C31H44N5O4Cl   586.2   586
  582   C30H40N4O5I2   790.5   791
  583   C30H42N4O6   554.7   555
  584   C31H41N4O4F   552.7   553
  585   C32H43N4O4Cl   583.2   583
  586   C32H43N4O4Cl   583.2   583
  587   C32H43N4O4F   566.7   567
  588   C32H43N4O4F   566.7   567
  589   C32H43N4O4F   566.7   567
  590   C33H45N4O4Cl   597.2   597
注意
1.分子式和分子量是用ActivityBase软件(ID Business Solutions，Ltd.，Guildford，Surrey，UK)从结构自动计算的。
2.[M+H]+使用标准方法从LC-MS分析获得。
3.所有分析是对已制备纯化的材料进行。
E.分析方法
除非另外指明，1H和13C NMR光谱在Varian Mercury 300MHz光谱仪(Varian，Inc.，Palo Alto，CA)上记录，并以溶剂的残余质子信号为内参比。使用如下标准缩写展示1H NMR数据：以ppm计的化学位移(δ)(多重性、积分、偶合常数)。以下缩写用于表示信号多重性：s＝单重态、d＝二重态、t＝三重态、q＝四重态、quint＝五重态、b或br＝宽峰、m＝多重态。关于溶液中分子构型的信息可使用本领域技术人员已知的合适二维NMR技术确定。(Martin，G.E.；Zektzer，A.S.Two-Dimensional NMRMethods for Establishing Molecular Connectivity：A Chemist′s Guide toExperiment Selection，Performance，and Interpretation(用于建立分子相关度的二维NMR方法：选择试验、性能和解释的化学家指南)，John Wiley& Sons：New York，1988，ISBN 04711 87070.)。
HPLC分析在Waters
Figure A20078003349400951
系统2695上进行，以1mL/min运行，使用
Figure A20078003349400952
MS C18柱(或相当的)4.6x50mm(3.5μm)和所指出的梯度方法。Waters 996 PDA对纯度评估提供UV数据(Waters Corporation，Milford，MA)。LCPackings(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA)分流器(50∶40∶10)使物流分为三部分。第一部分(50％)被转至质谱仪(
Figure A20078003349400953
Platform II MS，装有APCI探测仪)以证实身份(identity)。第二部分(40％)进入蒸发光散射检测仪(ELSD，Polymer Laboratories，现在是Varian，Inc.的成员，Palo Alto，CA，PL-ELS-1000TM)用于评估纯度，最后一部分(10％)进入化学发光氮检测仪(CLND，
Figure A20078003349400954
Model 8060，Antek Instruments，Houston，TX，Roper Industries，Inc.的部分，Duluth，GA的部分)以定量和评估纯度。捕获数据并使用Waters
Figure A20078003349400955
软件包的最新版本处理数据。
使用Waters Breeze(或相当的)系统以合适手性HPLC柱评估对映体和非对映体纯度。尽管可使用其它填充(packing)材料，但对这些分析特别有用的柱是：Chiralpak AS-RH和Chiralcel OD-RH(Chiral Technologies，West Chester，PA，USA)。
对最终脱保护的大环化合物使用Waters
Figure A20078003349400956
系统在MS C18柱(或相当的)19x100mm(5μm)上进行制备HPLC纯化。使用配置有Waters 2767注射仪/收集仪和以2mL/min运行的Waters515泵的At-Column-Dilution完成注射。质谱仪、HPLC和质量导向(mass-directed)的馏分收集由带有
Figure A20078003349400958
的
Figure A20078003349400959
软件版本3.5控制。MS分析显示为包含产物的馏分(13x125mm管)在减压下蒸发，最经常地在离心蒸发器系统(
Figure A200780033494009510
HT-4(Genevac Inc，ValleyCottage，NY)、ThermoSavant
Figure A200780033494009511
或相当的(ThermoElectron Corporation，Waltham，MA)上蒸发，或者也可以冻干。随后化合物由LC-MS-UV-ELSD-CLND分析彻底分析进行身份证实、纯度和量评估。
在带有一次性二氧化硅或C18柱(允许同时运行最多十六(16)样品)的Isco
Figure A200780033494009512
1 6x系统(Teledyne Isco，Inc.，Lincoln，NE)上进行自动中等压力色谱纯化。在Waters
Figure A200780033494009513
Platform II或ZQTM系统上记录MS光谱。以VG Micromass ZAB-ZF光谱仪记录HRMS光谱。储存化学和生物信息并使用
Figure A20078003349400961
数据库软件(ID BusinessSolutions Ltd.，Guildford，Surrey，UK)分析。
F.手性纯度确定
根据本领域技术人员已知的技术采用HPLC确定立体异构体纯度的一般方法并进一步针对本发明化合物进行优化。
手性方法A：Grad35A-05(柱：Chiralcel AS-RH，0.46cmx15cm)：
1.在35％ACN、65％50mM CH3COONH4水溶液下的40min等度平台(isocratic plateau)洗脱。
2.5min梯度至70％ACN、30％50mM CH3COONH4水溶液。
3.在70％ACN、30％50mM CH3COONH4水溶液的10min等度平台。
4.5min梯度至35％ACN、65％50mM CH3COONH4水溶液。
5.在35％ACN、65％50mM CH3COONH4水溶液的10min等度平台。
6.流速：0.5mL/min
7.柱温：室温
8.样品温度：室温
手性方法B：Grad40A-05(柱：Chiralcel OD-RH，0.46cmx15cm)：
1.在40％ACN、60％50mM CH3COONH4水溶液40min等度平台。
2.5min梯度至70％ACN、30％50mM CH3COONH4水溶液。
3.在70％ACN、30％50mM CH3COONH4水溶液10min等度平台。
4.5min梯度至40％ACN、60％50mM CH3COONH4水溶液。
5.在40％ACN、60％50mM CH3COONH4水溶液10min等度平台。
6.流速：0.5mL/min
7.柱温：室温
8.样品温度：室温
手性方法C：Grad 55A-O5 (柱：Chiralcel OD-RH，0.46cmx15cm)：
1.40min等度的(isocratic)55％/45％的ACN/50mM CH3COONH4水溶液
2.5min梯度至70％/30％的ACN/50mM CH3COONH4水溶液
3.10min等度的70％/30％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
4.5min梯度至55％/44％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
5.10min等度的55％/45％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
6.流速：0.5mL/min
7.柱温：室温
8.样品温度：室温
手性方法D：Grad Iso100B 05(柱：Chiralcel OD-RH，0.46cmx15 cm)：
1.40min等度的27％/73％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
2.5min梯度至70％/30％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
3.10min等度的70％/30％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
4.5min梯度至27％/73％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
5.10min等度的27％/73％ACN/50mM CH3COONH4水溶液
6.流速：0.5mL/min
7.柱温：室温
8.样品温度：室温
3.生物方法
使用下文描述的竞争性放射配体结合测定、荧光测定或水母发光蛋白功能测定评价本发明化合物与人类促胃动素受体相互作用的能力。这类方法可以高通量方式进行以允许同时评价多种化合物。
对促胃动素受体的具体测定方法和它们在通常鉴定其激动剂和拮抗剂中的应用是已知的。(Peeters，T.L.；Depoortere，I.；Macielag，M.J.；Marvin，M.S.；Florance，J.R.；Galdes，A.Biochem.Biophys.Res.Comm.1994，198，411-416；Farrugia，G.；Macielag，M.J.；Peeters，T.L.；Sarr，M.G.；Galdes，A.；Szurszewski，J.H.Am.J.Physiol.1997，273，G404-G412；Depoortere，I.；Macielag，M.J.；Galdes，A.；Peeters，T.L.Eur.J.Pharmacol.1995，286，241-247；Poitras，P.；Miller，P.；Gagnon，D.；St-Pierre，S.Biochem.Biophys.Res.Comm.1994，205，449-454；Haramura，M.；Okamachi，A.；Tsuzuki，K.；Yogo，K.；Ikuta，M.；Kozono，T.；Takanashi，H.；Murayama，E.J.Med.Chem.2002，45，670-675；Beavers，M.P.；Gunnet，J.W.；Hageman，W.；Miller，W.；Moore，J.B.；Zhou，L.；Chen，R.H.K.；Xiang，A.；Urbanski，M.；Combs，D.W.；Mayo，K.H.；Demarest，K.T.DrugDes.Disc.2001，17，243-251.)。
还在以下描述了确定与人类促胃动素受体相互作用的本发明化合物的功能活性、药理学特征和体内活性的合适方法。
A.竞争性放射配体结合测定(促胃动素受体)
对人类促胃动素受体的竞争性结合测定以与文献中描述的测定相似地进行。
材料：
·细胞膜从稳定地转染人类促胃动素受体的CHO细胞制备，并以1.5μg/测定点的量使用。[PerkinElmerTM SignalScreen Product #6110544]
·[125I]-促胃动素(PerkinElmer，#NEX-378)；终浓度：0.04-0.06nM
·促胃动素(BachemTM，#H-4385)；终浓度：1μM
·Multiscreen Harvest板-GF/B(MilliporeTM，#MAHFB1H60)
·深孔聚丙烯滴定板(Beckman CoulterTM，#267006)
·TopSeal-A(PerkinElmer，#6005185)
·底封(Bottom seal)(Millipore，#MATAH0P00)
·MicroScint-0(PerkinElmer，#6013611)
·结合缓冲液：50mM Tris-HCl(pH 7.4)、10mM MgCl2、1mMEDTA、0.1％BSA
测定体积：
·150μL稀释于结合缓冲液中的细胞膜
·10μL稀释于结合缓冲液中的化合物
·10μL稀释于结合缓冲液中的放射配体([125I]-促胃动素)
化合物的最终测试浓度(N＝11)：
10、5.0、2.0、1.0、0.50、0.20、0.10、0.050、0.020、0.010、0.0050μM。
化合物处理：
提供在干冰上冻结的化合物，以10mM的母液浓度稀释于100％DMSO中并储存在-20℃直到测试那天。测试当天，允许化合物在室温融化并随后根据期望的测试浓度稀释于测定缓冲液中。在这些条件下，测定中最大的最终DMSO浓度为0.5％。
测定方案：
在深孔板中，稀释的细胞膜(1.5μg/mL)与10μL结合缓冲液(总结合，N＝5)、1μM促胃动素(非特异结合，N＝3)或合适浓度的测试化合物混合。通过向各孔加入10μL[125I]-促胃动素(终浓度0.04-0.06nM)而开始反应。用TopSeal-A密封各板，轻柔旋动，在室温培育2小时。通过使用TomtecHarvester将样品过滤通过预浸泡(0.3％聚乙烯亚胺，2h)的MultiscreenHarvest板而停止反应，以500μL冷的50mM Tris-HCl(pH 7.4)洗涤9次，然后板在通风柜中空气干燥30分钟。在板上施加底封，然后向每个孔加入25μL MicroScint-0。随后以TopSeal-A密封板，每个孔在TopCount微板闪烁和发光计数仪(PerkinElmer)上计数30sec，其中结果表示为每分钟计数(cpm)。
使用可变斜率非线性回归分析以GraphPadTM
Figure A20078003349400991
(GraphPadSoftware，San Diego，CA)分析数据。对[125I]-促胃动素使用0.16nM的Kd值(此前在膜表征中确定的)计算Ki值。
Figure A20078003349400992
其中总结合和非特异结合分别代表不存在或存在1μM促胃动素时获得的cpm。
本发明代表性化合物对人类促胃动素受体的结合活性示于表3。表3的化合物结构展示为带有对式I一般结构界定的各种基团。
表3：本发明代表性化合物对人类促胃动素受体的结合活性
  化合物No.   Ki(nM)   化合物No.   Ki(nM)
  501a   B   543   B
  501b   B   544   A
  502a   A   545   A
  502b   B   546   A
  503a   A   547   A
  503b   B   548   A
  503c   A   549   C
    504     B     550     A
    505     A     551     A
    506a     B     552     A
    506b     B     553     A
    507     B     554a     A
    508     B     554b     C
    509     B     554c     B
    510     B     555     A
    511a     B     556     A
    511b     C     557     A
    512a     B     558     A
    512b     C     559     A
    513     B     560     A
    514     C     561     A
    515a     A     562     A
    515b     B     563     B
    516a     A     564     A
    516b     B     565     A
    516c     C     566     A
    517a     C     567     A
    517b     C     568     B
    518     B     569     A
    519a     B     570     A
    519b     B     571     A
    520     B     572     A
    521     B     573     B
    522     B     574     B
    523     B     575     B
    524     B     576     C
    525     B     577     C
    526     B     578a     C
    527     B     578b     D
    528     B     579     C
    529     A     580a     B
    530     B     580b     B
    531     B     581     B
    532     A     582a     C
    533     B     582b     D
    534     B     583     C
    535     B     584     B
    536     B     585     A
    537     A     586     B
    538     A     587     B
    539     A     588     A
    540     A     589a     C
    541     A     589b     D
    542     B     590     B
a使用标准方法确定结合活性，Ki值如下表示：A≤10nM、B≤100nM、C≤1000nM、D＞1000nM
B.水母发光蛋白功能测定(促胃动素受体)
本发明化合物功能活性的评价可根据文献方法进行或如下所述进行。(Carreras，CW.；Siani，M.A.；Santi，D.V.；Dillon，S.B.Anal.Biochem.2002，300，146-151.)。
材料：
·使用表达人类促胃动素受体的AequoScreenTM(EUROSCREEN，Belgium)细胞系(细胞系ES-380-A；受体获取号#AF034632)制备细胞膜。将人类促胃动素受体转染入共表达Gα16和线粒体靶向的水母发光蛋白(Ref.#ES-WT-A5)的CHO-K1细胞而构建该细胞系。
·促胃动素(Bachem，#H-4385)
·测定缓冲液：含有15mM HEPES和0.1％BSA(pH 7.0)的DMEM-F12(Dulbeccoe改良的Eagles培养基)
·Coelenterazine(腔肠素)(Molecular ProbesTM，Leiden，TheNetherlands)
化合物的最终测试浓度(N＝5)：
10、3.16、1.0、0.316、0.10μM。
化合物处理：
将化合物以干膜形式和大约1.2μmol的量提供于预先格式化的96-孔板。以10mM的浓度溶解化合物于100％DMSO中并储存在-20℃直到进一步使用。子板以500μM浓度在30％DMSO和0.1％BSA中准备并储存在-20℃直到测试。测试当天，允许化合物在室温融化并随后根据期望的测试浓度稀释于测定缓冲液。在这些条件下，测定中最大的最终DMSO浓度为0.6％。
细胞制备：
以补充了5mM EDTA的无Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)从培养板收集细胞，在1000xg沉淀2分钟，以5x106细胞/mL的密度重悬于测定缓冲液(见上述)中并在5μM coelenterazine(腔肠素)存在下过夜培养。上样(loading)后，细胞以测定缓冲液稀释至5x105细胞/mL的浓度。
测定方案
对激动剂测试，将50μL细胞悬浮液与50μL合适浓度的测试化合物或促胃动素(参考激动剂)混合于96-孔板中(双份样品)。受体活化产生的光发射使用功能药物筛选系统6000′FDSS 6000′(HamamatsuPhotonics K.K.，Japan)记录。
对拮抗剂测试，激动剂测试结束后将大约EC80浓度的促胃动素(即0.5nM；100μL)注射至包含测试化合物的细胞悬浮液(双份样品)中15-30分钟，受体活化产生的光发射如上段所述地测量。
结果表示为相对光单位(RLU)。使用GraphPadTM
Figure A20078003349401021
(GraphPadSoftware，San Diego，CA)以基于等式E＝Emax/(l+EC50/C)n的非线性回归分析(S形剂量响应)分析浓度响应曲线，其中E是在所给激动剂浓度(C)测量的RLU值，Emax是最大响应，EC50是产生50％刺激的浓度，n是斜率指数。对激动剂测试，测试化合物每种浓度的结果表示为相对于在EC80的浓度(即0.5nM)的促胃动素引起的信号的活化百分比。对拮抗剂测试，测试化合物每种浓度的结果表示为相对于在EC80的浓度(即0.5nM)的促胃动素引起的信号的抑制百分比。
通过使用CEREP(Poitiers，France)商业提供的一种广靶筛选软件″ExpresSProfile″，可获得受体选择性的广泛评价。在该筛选中，对来自四种不同靶类的50种单独受体进行单点(10μM)结合测定：非-肽G-蛋白质偶联受体(GPCR)、肽GPCR、离子通道和胺转运子。
本发明代表性化合物对人类促胃动素受体的结合活性示于表4。表4的化合物结构展示在表3中，带有对式I一般结构界定的各种基团。
表4：本发明代表性化合物对人类促胃动素受体的功能活性
  化合物No.   IC50(nM)a   化合物No.   IC50(nM)a
  502   B   543   C
  503   C   544   A
  504   C   545   A
  505   B   546   A
  511   C   547   B
  512   C   548   B
  513   C   550   A
  515   B   552   A
  516   C   555   A
  529   B   557   B
  530   C   563   B
  532   C   564   A
  533   B   565   B
  534   B   568   B
  535   B   569   B
  536   C   570   A
  537   A   571   B
  538   A   572   A
  539   A   573   B
  540   A   574   D
  541   B   585   B
  542   B   586   C
a使用标准方法确定功能活性，IC50值如下表示：
A≤1nM、B≤10nM、C≤100nM、D≤1000nM
C.FlashPlate促胃动素[35S]-GTPγS功能测定
材料：
·细胞膜从稳定地转染人类促胃动素受体的CHO细胞制备，并以1.5μg/测定点的量使用。[PerkinElmer SignalScreen Product #6110544]
·GTP-γS(Sigma，#G-8634)
·[35S]-GTP-γS(PerkinElmer，#NEX-030H)
·促胃动素(Bachem，#H-4385)
·96-孔FlashPlate微孔板(PerkinElmer，#SMP200)
·深孔聚丙烯滴定板(Beckman Coulter，#267006)
·TopSeal-A(PerkinElmer，#6005185)
·测定缓冲液：50mM Tris(pH 7.4)、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM EDTA、1μM GDP、0.1％BSA
测定体积：
·25μL稀释于测定缓冲液中的化合物
·25μL测定缓冲液(激动剂测定)或稀释于测定缓冲液中的0.6μM促胃动素(0.1μM终浓度)(拮抗剂测定)
·100μL稀释于测定缓冲液中的[35S]-GTPγS
化合物的最终测试浓度(N＝12)：
50、20、10、5.0、2.0、1.0、0.50、0.20、0.10、0.050、0.020、0.010μM。
化合物处理：
提供在干冰上冻结化合物，以10mM的母液浓度稀释于100％DMSO中并储存在-20℃直到测试那天。测试当天，允许化合物在室温融化并随后根据期望的测试浓度稀释于测定缓冲液中。在这些条件下，测定中最大的最终DMSO浓度为0.5％。
测定方案：
CHO细胞膜固定于96-孔FlashPlate微孔板中。根据上述测定体积，将测试化合物、GTPγS、促胃动素和[35S]-GTPγS混合于各孔。
对于测量激动剂活性的测定，各孔中除了25μL缓冲液(基础值，N＝4)，1.0μM(终浓度)促胃动素(Emax值，N＝3)，25μM(终浓度)GTPγS(非特异值，N＝4)或合适浓度的测试化合物(N＝3)之外还加入另外25μL缓冲液。
对于测量拮抗剂活性的测定，各孔中除了25μL缓冲液(基础值，N＝3)，1.0μM(终浓度)促胃动素(Emax值，N＝3)，25μM(终浓度)GTPγS(非特异值，N＝4)或合适浓度的测试化合物(N＝3)之外还加入另外25μL缓冲液(未刺激的对照)或促胃动素(0.10μM终浓度)。
通过向各孔加入100mL[35S]-GTPγS而开始反应。密封各板(TopSeal-A)并在黑暗中于室温下培育150min。然后在TopCount NXT上对板的每孔计数30秒。
通过GraphPadTM 3.0(GraphPad Software，San Diego，CA)使用非线性回归分析(S形剂量响应)分析数据以计算IC50/EC50值。
Figure A20078003349401051
其中顶和底对应GraphPad Prism计算的剂量响应曲线的顶值和底值。
D.兔十二指肠收缩性测定
根据文献方法对兔十二指肠的条带(strip)进行本发明化合物的活体外活性的评价。(Van Assche，G.；Depoortere，I.；Thijs，T.；Janssens，J.J.；Peeters，T.L.Eur.J.Pharmacol.1997，337，267-274；Matthijs，G.；Peeters，T.L.；Vantrappen，G.Naunyn-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1989，339，332-339.)。还可采用对这类研究的相关方法。(Tomomasa，T.；Yagi，H.；Kimura，S.；Snape，W.J.，Jr；Hyman，P.E.Pediatric Res.1989，26，458-461；Takanishi，H.；Yogo，K.；Ozaki，M.；Akima，M.；Koga，H.；Nabata，H.J. Pharm.Exp.Ther.1995，273，624-628.)。
将十二指肠的片段垂直地悬挂在填充有Krebs缓冲液的10mL器官室中并连接至等渗力传感器(预负载1g)。稳定阶段后，以10-4M乙酰胆碱攻击肌肉带并清洗。重复该步骤直到获得稳定最大收缩(2-3次)，间隔至少20分钟。
到达稳定基线后，将测试化合物加至该浴。培育15分钟后，通过向该浴加入对数递增浓度的促胃动素而记录对促胃动素的剂量响应(终浓度10-9至10-6M)。还进行空白试验(不存在测试化合物)。在剂量响应曲线的末尾，提供超最大剂量的乙酰胆碱(10-4M)，该响应用作参考值(100％收缩)。
联合不同浓度测试化合物的试验结果并分析以便从Schild曲线推导出pA2值。
E.化疗引起腹泻的动物模型
可使用合适动物模型评价本发明化合物的体内效力。大鼠模型已经用于评价化合物在化疗引起的腹泻(CID)中的效力。(Takasuna，K.；Kasai，Y.；Kitano，Y.等Jpn.J.Cance Res.1995，86，978-984；Tavakkolizadeh，A.；Shen，R.；Abraham，P.等J.Surg.Res.2000，91，77-82；Horikawa，M.；Kato，Y.；Sugiyama.Pharm.Res.2002，19，1345-1353.)。类似地，小鼠模型也已用于测试用于改善化疗剂的胃肠毒性的药剂。(Boushey RP，Yusta B，Drucker DJ.Cancer Res 2001，61，687-93；Zhao，J.；Huang，L.；Belmar，N.；Buelow，R.；Fong，T.Clin.Canc.Res.2004，10，285 1-2859.)。此外，已知犬在用普通化疗剂治疗期间患有腹泻。(Kawato，Y.；Sekiguchi，M.；Akahane，K.；Tsutomi，Y.；Hirota，Y.；Kuga，H.；Suzuki，W.；Hakusui，H.；Sato，K.J.Pharm.Pharmacol.1993，45，444-448；Kato，T.；Shimamoto，Y.；Uchida，J.；Ohshimo，H.；Abe，M.；Shirasaka，T.；Fukushima，M.Anticancer Res.2001，21，1705-12.)。然而，大鼠和小鼠不具备功能性促胃动素受体，不是促胃动素拮抗剂的合适动物模型，但可用于区分对促胃动素受体的效应和非特异效应。犬是合适的模型物种，因为它具备功能性促胃动素受体，此前已用于牵涉促胃动素调节的研究。适合这种评价的其它物种包括仓鼠、猪、兔、鼩鼱、豚鼠和负鼠。此外，与对大鼠和小鼠描述的方法类似的方法可适于犬科动物或其它模型以测试本发明的化合物。因此，本发明化合物对犬或其它动物模型中腹泻发生的频率和严重度的治疗效力可用作本发明化合物有效性的量度。
犬模型
该研究的目的是确定本发明代表性大环化合物在静脉施用至雄性beagle犬(Canis familiaris)达32天后在化疗引起的腹泻(CID)中的效力。与用于该疾患的现有药剂(奥曲肽和洛哌丁胺)进行比较是另一目标。
试验设计
二十一只(21)初次接受实验的雄性Beagle犬随机地分配为7组并如下治疗：
表5.治疗组
Figure A20078003349401071
缩写：IF，静脉输注；IV，静脉弹丸注射；NA，不适用；TA1，伊立替康(对组1是即用型溶液，对组2至4、6和7是伊立替康盐酸盐)；TA2，化合物552。
注意：aTA1(伊立替康溶液或伊立替康盐酸盐)用于在组1至4、6和7的动物引起腹泻。对于组1中动物，用TA1治疗包括三(3)个循环：循环1，以4mg/kg/天的剂量水平经植入的导管输注1小时施用伊立替康溶液，连续5天，然后休息9天。循环2，以4mg/kg/天的剂量水平经植入的导管输注1小时施用伊立替康溶液，连续4天，并在第5天以8mg/kg/天的剂量水平经植入的导管弹丸注射(经大约1分钟)施用伊立替康溶液，然后休息5天；循环3，向组1加入一只备用动物。以伊立替康盐酸盐粉末制备伊立替康制剂，以4mg/kg/天的剂量水平经植入的导管弹丸注射连续5天向四只动物施用。观察这四只动物9天，并在无食物过夜阶段后处死。
对组2至4、6和7中的动物，以伊立替康盐酸盐粉末制备伊立替康制剂，经植入的导管弹丸注射施用达2个治疗循环，持续28-天的研究阶段。在每个治疗循环，以6mg/kg的每日单剂量治疗动物连续5天，然后休息9天无治疗。在开始以伊立替康治疗之前(组4)或在开始伊立替康引起的腹泻后(组2、3、6和7)，如下所述地以TA2(化合物552)(组2至4)、奥曲肽(组6)或洛哌丁胺(组7)治疗这些动物。完成治疗/观察阶段和随后的无食物过夜阶段后，将所有存活动物处死。
bTA2(化合物552)经由植入的导管在45分钟内输注施用至组中所有动物。如果早上在组中3只动物的任何一只观察到腹泻，以化合物552的治疗于腹泻开始当天开始，或如果在下午观察到腹泻，则于第二天开始。然后以化合物552的治疗持续28-天研究阶段的其余时间。每日剂量(即对组2和3分别为5.0和15.0mg/kg/天)分为2个相等剂量(即对组2和3分别为每次2.5和7.5mg/kg)并每天间隔至少6小时输注。在每次输注化合物552之间，动物以2.5mL/小时的速率接受注射用的0.9％氯化钠(USP)。
c以与组2和3相同的程序施用TA2(化合物552)至组中所有动物，在开始TA1(伊立替康)治疗的4天前开始施用，并持续28-天研究阶段。每日剂量(5.0mg/kg/天)分为2个相等剂量(每次2.5mg/kg)并每天间隔至少6小时输注。在每次输注化合物552之间，动物以2.5mL/小时的速率接受注射用的0.9％氯化钠(USP)。
d动物媒介物对照组(5％注射用葡萄糖，USP)中的动物以供伊立替康和化合物552用的媒介物治疗。伊立替康的媒介物经由输注管以缓慢弹丸注射(大约持续1分钟)施用达两个治疗循环。在每个治疗循环，以每日单剂量治疗动物连续5天，然后休息9天。化合物552的媒介物按照对化合物552施用的给药程序施用或施用23天(从第6天至第28天)。
e如果早上在组中3只动物的任何一只观察到腹泻，则该组中所有动物在伊立替康引起的腹泻开始当天皮下注射奥曲肽，或如果在下午观察到腹泻，则在第二天皮下注射奥曲肽。在28-天研究阶段的其余时间继续该治疗。每日剂量(0.021mg/kg/天)分为3个相等剂量(每次0.007mg/kg)并分别在早上、中午和傍晚由皮下注射施用。每次施用间隔至少4小时(±30分钟)。
f如果早上在组中3只动物的任何一只观察到腹泻，则该组中所有动物在伊立替康引起的腹泻开始当天经口管饲给药洛哌丁胺，或如果在下午观察到腹泻，则在第二天经口管饲给药洛哌丁胺。在28-天研究阶段的其余时间保持该治疗。每日剂量(0.18mg/kg/天)分为3个相等剂量(每次0.06mg/kg)并分别在大约早上、中午和傍晚经口管饲施用。每次施用间隔至少4小时(±30分钟)。
伊立替康(Seminars in Oncology 1996，23，11-20)以及洛哌丁胺和奥曲肽(The Oncologist 1998，3，50-53)的剂量水平根据所述文献数据选择。
制备测试化合物和对照
以合适的间隔制备测试化合物、对照和对比物。所有将用于施用于测试动物的制剂在2-8℃冷冻储存。获得用于静脉注射的即用型伊立替康无菌溶液，包含浓度为20mg/mL的三水合伊立替康盐酸盐。以5％注射用葡萄糖(USP)稀释20mg/mL制剂以获得用于给药组1(仅循环1和循环2)动物的伊立替康制剂(0.5mg/mL)。冷冻储存给药制剂(2至8℃)，避光并在48小时内使用。
对于伊立替康的其余治疗(即对组1的循环3；组2至4；组6和7)，从固态伊立替康(伊立替康盐酸盐)制备母液伊立替康制剂并用于制备如下所述的给药制剂：
制备媒介物产品：注射用无菌水中4.5％山梨醇(w/v)和0.09％乳酸 (w/v)
采用以下方案。该程序是用于制备10mL。该程序必要时可放大规模：
1.准确称量/测量450mg山梨醇和9mg乳酸并置于合适大小的容器中。
2.向容器逐渐加入注射用无菌水至终体积的大约90％。充分混合。
3.测量pH。如有必要，以氢氧化钠和/或盐酸调节pH至3.0-3.8。
4.定量加足至终体积。充分混合。
制备伊立替康母液制剂(10mg/mL)
采用以下方案：
1.准确称量合适量的伊立替康盐酸盐并置于合适大小的无菌容器中。
2.将合适体积的媒介物溶液(终体积的大约90％)加至测试物粉末。在搅拌盘上混合直到伊立替康盐酸盐完全溶解。可使用水浴(即45-55℃)或短时超声处理以帮助溶解。
3.测量pH。如有必要，以氢氧化钠和/或盐酸调节pH至3.0-3.8。
4.定量加足至终体积。充分混合。
5.以上溶液以0.22μm滤器无菌过滤至无菌容器。获得双份样品(各1.0mL)并冷冻储存(大约-80C)直到运输。制备后如果不立即使用，将母液冷冻储存(2-8℃)，并在制备一周内使用。
6.以5％注射用葡萄糖(USP)稀释母液制剂而获得用于对动物给药的制剂。冷冻储存给药制剂(2至8℃)，避光并在48小时内使用。
奥曲肽提供为无菌冻干粉剂并以注射用无菌水重构以产生母液(10mg/mL)。冷冻储存(2至8℃)母液。在给药的每天，以注射用无菌水稀释母液至终浓度为0.1mg/mL。洛哌丁胺盐酸盐溶解于注射用盐水以产生终浓度为0.1mg/mL的洛哌丁胺碱(注意：1g洛哌丁胺盐酸盐＝0.929g洛哌丁胺碱。对制剂制备使用1.076的校正因子)。每周制备洛哌丁胺盐酸盐溶液。化合物552配制为10％的羟基丙基-β-环糊精(97％)水溶液。为了验证制剂中测试物的浓度，研究期间以合适的间隔收集代表性样品(双份1.0mL，除了奥曲肽仅各收集0.1mL)。
测试动物
从供应商(例如Marshall BioResources，North Rose，New York)获得共21只雄性动物和2只备用雄性，在治疗开始时5至7个月大，在治疗开始时重6-9kg。收到动物和开始治疗之间使动物习惯新环境，以使犬在开始研究前习惯实验室环境，对组1大约3周，对组2至4大约5周，对组5至7大约3周。每只犬圈养在装有适当地补充水瓶的自动供水系统的不锈钢笼中。每个笼用表示研究、组和动物数目、性别和剂量水平的彩色编码笼卡清楚地标注。供应商将每只动物独特地以一个耳廓腹面上纹身标记。除了在指定程序期间以外，控制动物室内环境(目标范围：温度21±3℃，相对湿度50±20％，12小时光照，12小时黑暗，每小时更换空气10-15次)。连续地监控温度和相对湿度，每天记录4次。
在最少2小时但最多4小时的喂食阶段每天一次地向每只犬提供标准合格的商品犬食(chow)(例如400g Teklad合格的25％Lab Dog Diet#8727C)。在适应环境期间，使动物缓慢适应2小时喂食方案。制造商控制并常规地测量饮食中各组成成分和污染物(如重金属、黄曲霉毒素、有机磷酸盐、杀虫剂和氯化烃)的浓度。除了在指定程序期间以外，向动物随意提供市政自来水(已用反渗透和紫外光纯化，并经0.2μm滤器进一步过滤)。
准备动物
在预治疗阶段，在开始治疗前大约2-3周将所有犬准备进行手术。手术程序的前夜对这些动物禁止进食，在手术的早上移去水以插入静脉导管。对犬肌内注射预-麻醉混合物(cocktail)(如布托啡诺、乙酰丙嗪和甘罗溴铵)以准备手术位点。手术前和手术期间，由吸入异氟烷而麻醉动物。静脉导管由一段医用级管组成，插入大腿静脉并进入腔静脉。在颈背使用套管针使得导管外向化，产生从鼠蹊部区域至背-颈部区域的皮下通道。从麻醉恢复期间，给每只动物穿上干净的外罩。导管由外罩和拴系系统连接至旋转装置，由另一段医用级管连接至注射器。泵和储器容纳在特殊设计的盒子里，盒子放在笼外面。
手术前一天和手术后2天，每只犬预防性地接受肌内注射抗生素(例如苄星青霉素G和普鲁卡因青霉素G)。需要时每天一次对手术位点施加局部杀菌剂。在整个研究阶段，每天检查位于颈背部的导管出口位点。当必要时，刮净该位点，除去碎片并涂以局部杀菌剂/抗生素。每月更换外罩，或如果认为必要则更频繁地更换。从手术恢复后，动物以2.5mL/h的速率接受注射用0.9％氯化钠(USP)，直到开始输注化合物552。在预治疗阶段期间以合适频率更换包含生理盐水溶液的注射器/包。
施用测试、对照/媒介物和对比物
对于组1中的动物，用测试物No.1(伊立替康)治疗由三(3)个循环组成：循环1，以4mg/kg/天的剂量水平经植入的导管输注1小时施用伊立替康，连续5天，然后休息9天。循环2，以4mg/kg/天的剂量水平经植入的导管输注1小时施用伊立替康，连续4天，并在第5天以8mg/kg/天的剂量水平经植入的导管弹丸注射(经大约1分钟)施用伊立替康，然后休息5天；循环3，向组1加入一只备用动物。以伊立替康盐酸盐粉末制备伊立替康制剂，以4mg/kg/天的剂量水平经植入的导管弹丸注射连续5天向四只动物施用。对组2至4、6和7中的动物，以伊立替康盐酸盐粉末制备伊立替康制剂，经植入的导管弹丸注射施用达2个治疗循环，持续28-天的研究阶段。在每个治疗循环，以6mg/kg的每日单剂量治疗动物连续5天，然后休息9天无治疗。对组5中所有犬施用伊立替康的对照/媒介物，按照施用伊立替康的相同给药程序施用。对组1的循环1和循环2前4天的剂量体积为8mL/kg，对组1循环2最后一天的为2mL/kg，对组2至4、6和7为3mL/kg。计算输注至每只犬的实际体积并根据每只动物的最近实际体重调整。
在开始TA1(伊立替康)治疗前4天和在整个28天研究阶段，测试物No.2(化合物552)经由植入的导管静脉输注施用至组4中所有动物持续45分钟。遵循同样的给药方案，如果早上在组中3只动物的任何一只观察到腹泻，则在伊立替康引起的腹泻开始当天施用TA2(化合物552)于组2和3的所有动物，或如果下午在组中3只动物的任何一只观察到腹泻，则在第二天施用，并持续于28-天研究阶段的其余时间。每日剂量(即对组2至4分别为5.0、15.0和5.0mg/kg/天)分为2个相等剂量(即对组2至4分别为每次2.5和7.5和2.5mg/kg)并间隔至少6小时输注。每个剂量以10mL/kg/h的剂量体积输注。按照对化合物552施用的相同给药程序和方案向组5所有犬施用化合物552的媒介物达23天(从第6天至第28天)。计算输注的实际体积并根据每只动物的最近实际体重调整。必要时以合适间隔更换注射器/包，在开始输注前和输注结束时记录重量。
如果早上在组6中3只动物的任何一只观察到腹泻，则该组中所有动物在腹泻开始当天开始皮下注射施用奥曲肽，或如果下午在组6中3只动物的任何一只观察到腹泻，则在腹泻开始第二天开始皮下注射奥曲肽。在28-天研究阶段的其余时间继续该治疗。每日剂量(0.021mg/kg/天)分为3个相等剂量(每次0.007mg/kg)并分别在大约早上、中午和傍晚由皮下注射施用。每次施用间隔至少4小时(±30分钟)。每次施用的剂量体积为0.07mL/kg。计算实际剂量体积并根据每只动物的最近实际体重调整。
如果早上在组7中3只动物的任何一只观察到腹泻，则该组中所有动物在腹泻开始当天开始以经口管饲施用洛哌丁胺，或如果下午在组7中3只动物的任何一只观察到腹泻，则在腹泻开始第二天开始经口管饲洛哌丁胺。在28-天研究阶段的其余时间保持该治疗。每日剂量(0.18mg/kg/天)分为3个相等剂量(每次0.06mg/kg)并分别在大约早上、中午和傍晚经口管饲施用。每次施用间隔至少4小时(±30分钟)。每次施用的剂量体积为0.6mL/kg。计算实际剂量体积并根据每只动物的最近实际体重调整。
在研究的治疗阶段，通过以2.5mL/h的速率在每次伊立替康、化合物552或媒介物治疗之间输注注射用0.9％氯化钠USP而维持每只动物中的输注线。
在适应环境期间，除了在详细临床检查天以外，每天记录两次笼侧(Cage-side)临床迹象(不健康、行为改变、粪便变化等)。在治疗/观察阶段，除了在详细临床检查天(记录1次(PM))以外，每天记录两次(am和pm)笼侧临床迹象。预治疗时一次、在治疗/观察期间每周一次和处死前对每只犬进行详细临床检查。对手术位点给予特别关注。
在初次伊立替康治疗前一周和在整个28-天研究期间每天两次记录粪便稠度的观察结果并如下分级：
表6.粪便稠度的观察结果
    粪便观察结果     分级
    正常     1
    松散     2
    液态     3
    液态，带有粘液或血液等     4
只要有可能，每天记录呕吐和排泄(discharges)的次数、腹泻严重度以及粪便稠度。腹泻-引起的脱水症状由输注Ringer溶液治疗，由兽医处置。
分配组之前和在开始治疗前大约一周对所有动物记录一次体重。在给药前最多1天和其后在治疗/观察阶段每周两次以及在处死(禁食)前最后对所有动物记录体重。在治疗前的星期和在整个治疗/观察阶段每天测量食物消耗。在以化合物552治疗第一天的第一次(am)输注后和在以化合物552治疗最后一天的第二次(pm)输注后，从组2和3的每只犬获取一系列血液样品(各大约2.0mL)。(注意：在以化合物552治疗第一天的第二次(pm)输注在完成最后一次取血后进行)。为了此目的，静脉穿刺使每只犬流血，将样品收集到包含抗凝血剂K2 EDTA的试管。将试管置于湿冰上直到处理。每次在开始输注前、开始输注化合物552后5、15、30、45、50、65、95、135分钟、3和6小时收集样品。收集后，以大约1500xg在大约4℃离心样品至少10分钟，回收所得的血浆，分为两等份并冰冻储存(在大约-80℃)直到运输。
将研究进行过程中获得的数值数据进行组平均值和标准偏差的计算，并与所有单独数值和非数值结果一起报告。使用Levene Median分析数据的方差齐性，使用Kolmogorov-Smirnov检验分析数据的正态性。使用方差分析来分析同类数据，使用Dunnett′s检测分析组间差异的显著性。使用Kruskal-Wallis检验分析异类数据，并使用Dunn′s检验评价对照和治疗组之间组间差异的显著性。报道了p≤0.05的显著性水平。
结果
如图19所示，化合物552作为强效和选择性促胃动素拮抗剂，在犬中伊立替康引起的CID治疗中显示了比现有护理标准更高的效力。证明该化合物更有效，作用开始更快以及持续时间更长。
作为上述试验的部分，确定了接受低和高静脉剂量的化合物552的雄性beagle犬中化合物552的血浆浓度。制备用于固相萃取分析的血浆样品并用LC-MS/MS分析。对于接受2.5mg/kg的动物，在以化合物552治疗的第一天和最后一天，开始45-min输注后的30min观察到的平均Cmax分别为约1.5和1.8μg/mL。对于施用7.5mg/kg的高剂量组观察到平均Cmax发生在开始45-min输注后的15和45min之间，在以化合物552治疗的第一天和最后一天分别为约3.4和5.0μg/mL。对低剂量组(每次2.5mg/kg)，在给药的第一天(78,233ng.min/mL)和最后一天(83,047ng.min/mL)的平均AUC0-t相近，对高剂量组(每次7.5mg/kg)，在给药的第一天的平均AUC0-t(246,073ng.min/mL)成比例地更高。对高剂量组在给药最后一天的平均AUC0-t(380,758ng.min/mL)更高，然而更高的平均值是由于一只动物表现出特别高的AUC0-t。血浆浓度数据证实了在CID效力研究期间beagle犬中对化合物552剂量-相关的暴露。
在这些模型中也可采用其它治疗方案来引起腹泻。
F.细胞色素P450抑制的测定
细胞色素P450酶牵涉在药物的I期代谢中。大多数药物间相互作用是基于代谢的，而且这些相互作用通常涉及抑制细胞色素P450。6种CYP450酶(CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4)表现为通常负责大多数药物的代谢和相关的药物间相互作用。确定本发明化合物对细胞色素P450代谢酶的各种代谢上重要的异构型的结合的测定装置是商业上可获得的，例如NoAb BioDiscoveries(Mississaugua，ON，Canada)和Absorption Systems(Exton，PA，USA)。同样，文献中已描述或综述了大量合适方法。(White，R.E.Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.2000，40，133-157；Li，A.P.Drug.Disc.Today 2001，6，357-366；Turpeinen，M.；Korhonen，L.E.Tolonen，A.等Eur.J.Pharm.Sci.2006，29，130-138.)
试验方法的关键方面如下：
·测定在从表达单独人类CYP-450亚型的昆虫细胞制备的微粒体(，BD Gentest，Becton-Dickinson)上进行，具体地：
-CYP亚型：1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4
-对CYP-3A4通常测试两种底物，由于这种酶表现出复杂的抑制动力学
·测定由荧光检测监控微粒体与特定CYP底物培育后荧光代谢物的形成。
·以双份样品，在8个测试浓度使用3倍连续稀释(浓度范围0.0457至100μM)测试本发明化合物。
·对每种CYP-450酶，以双份在8个浓度测试特定抑制剂作为阳性对照。
·50％抑制代谢物形成的抑制剂或测试化合物浓度(IC50)由非线性回归分析抑制百分比vs.对数浓度(M)曲线计算。
本发明代表性化合物的结果概述于表5。
表7.本发明代表性化合物的兔十二指肠可收缩测定结果
  化合物     可收缩能力(pA2)   结合Ki(nM)
  502     7.92   A
  551     8.29   A
  553     8.71   A
a结合活性如下表示：A≤10nM、B≤100nM、C≤1000nM、D＞1000nM
G.血浆蛋白质结合
药物的药代动力学和药效学特征很大程度上是药物与血浆或血清蛋白质(如白蛋白和α1-酸糖蛋白)可逆结合的函数。通常，只有未结合的药物可用于扩散或运输穿过细胞膜并与药理学目标相互作用。另一方面，血浆蛋白质结合低的药物通常具有大体积的分布和快速清除，因为只有未结合的药物可用于血管小球过滤和在一些情况可用于肝清除。因此血浆蛋白质结合的程度可影响效力、分布和排泄。对大多数药物产品，血浆蛋白质结合的理想范围是87-98％。
使用人类血浆进行蛋白质结合研究。简略地，使用96-孔微孔板来在37℃培育不同浓度的测试物60min。结合和未结合级分由平衡透析分离，其中保持在未结合级分中的浓度由LC-MS或LC-MS-MS分析定量。具有已知血浆蛋白质结合值的药物如奎宁(～35％)、华法林(～98％)和萘普生(～99.7％)用作参考对照。
本发明代表性化合物的结果概述于表6。
表8：本发明代表性化合物对CYP P450同工酶的抑制
Figure A20078003349401161
an/a表示IC50值远高于100μM
H.确定Caco-2渗透性
衍生自人类结肠直肠癌的Caco-2细胞系已成为用于预测药物跨人肠吸收的确认的体外模型。(Sun，D,；Yu，L.X.；Hussain，M.A.；Wall，D.A.；Smith，R.L.；Amidon，G.L.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2004，7，75-85；Bergstrom，C.A.Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.2005，96，156-61；Balimane，P.V.；Han，Y.H.；Chong，S.AAPS J.2006，8，E1-13；Shah，P.；Jogani，V.；Bagchi，T.；Misra，A.Biotechnol.Prog.2006，22，186-198)。在半透膜上培养时，Caco-2细胞分化为高度功能化的上皮屏障，与小肠柱状上皮具有显著的形态学和生物化学相似性。完全分化的细胞单层可用于评估新型化合物的膜运输特征。此外，从Caco-2细胞运输研究获得的表观渗透性系数(Papp)已显示出与人类肠吸收合理地相互关联。
使用Caco-2细胞确定本发明化合物渗透性的测定是商业上可获得的，例如NoAb BioDiscoveries(Mississaugua，ON，Canada)和AbsorptionSystems(Exton，PA，USA)。
或者是，平行人造膜渗透性测定(PAMPA)可用于评估肠渗透性。(Avdeef，A.Expert Opin.Drug.Metab.Toxicol.2005，1，325-42.)
方法
由在置于两个(供体和受体)室之间的膜上生长细胞来确定跨Caco-2细胞层的渗透性。通常将候选药物加至细胞层的顶(A)侧，随着培养时间测量它们在基底外侧(B)的出现。这个方向的渗透性代表肠吸收。还可确定从Caco-2细胞的基底外侧至顶侧的渗透性。顶至基底外侧Papp比基底外侧至顶Papp高表示载体介导的运输。当观察到基底外侧至顶Papp相对于顶至基底外侧Papp高时表示P-gp介导的运输。
双份试样测试本发明的化合物在顶至基底外侧和基底外侧至顶方向的渗透性(10μM)。开始时(0min)和随后在37℃培育的60min内从供体室和受体室收集样品，在-70℃冷冻储存直到生物分析。Caco-2渗透性测定产生的每种测试化合物的样品进一步用LC-MS-MS分析。平行确定[3H]-甘露醇和[3H]-普萘洛尔的渗透性作为对照。
每种化合物和放射标记的标准品的渗透性系数(Papp)使用以下等式确定：
P app = dQ dT × 1 / C i × 1 / A
其中dQ/dT代表渗透率，Ci表示供体室中初始浓度，A表示滤器表面积。从加入至供体室之前取得的重复样品的平均浓度确定Ci。将受体室中测量的化合物累积量对时间绘图并以线性回归分析确定曲线斜率而计算渗透率。对每种化合物和标准品报告重复和平均的顶至基底外侧和基底外侧至顶Papp。
本发明代表性化合物的结果概述于表7。
表9：本发明代表性化合物的Caco-2渗透性测定
化合物   Papp A至Bcm/sec x10-6   Papp B至Acm/sec x10-6 B至A/A至B
  502   5   11   2
  508   1   5   5
  511   15   17   1
  512   0.3   11   37
  515   3   9   3
  531   19   18   1
  554   15   18   1
  580   5   7   1
  590   2   11   6
I.本发明代表性化合物的药代动力学分析
本发明化合物的药代动力学行为可由本领域技术人员熟知的方法确定。(Wilkinson，G.R.″Pharmacokinetics：The Dynamics of DrugAbsorption，Distribution，and Elimination(药代动力学：药物吸收、分布和排泄的动力学)″在Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics(治疗的药理学基础)，第十版，Hardman，J.G.；Limbird，L.E.，Eds.，McGraw Hill，Columbus，OH，2001，第1章.)。如下方法用于研究本发明化合物静脉、皮下和口服施用的药代动力学参数(消除半衰期、总血浆清除等)。
收集血浆
大鼠：雄性，Sprague-Dawley(～250g)
大鼠/治疗组：6(2个亚组，各3只大鼠，交替取血)
测试化合物的每个样品以适合给药的制剂(如与环糊精)以溶液提供。本领域技术人员会明白，需要时可对本方案进行合适的修改以适当地测试所分析化合物的特征。
典型剂量
1.静脉(i.v.)：2mg/kg
2.皮下(s.c)：2mg/kg
3.口服(p.o.)：8mg/kg
表10：代表性静脉血液取样计划。
Figure A20078003349401181
表11：代表性皮下和口服血液取样计划。
血浆收集
1.所有给药组相同方案
2.对每组，2亚组(A和B)3只大鼠/亚组
以上述的时间间隔，从每只动物收集0.7mL血液。预期该体积的血液将产生至少0.3mL血浆样品。使用EDTA作为全血收集用的抗凝剂。冷冻全血样品，立即离心处理以获得血浆。
冷冻储存血浆样品(-70℃)直到分析。以合适制备方案由LC-MS在血浆样品中进行母体化合物的分析检测：使用固相萃取(SPE)柱(OasisMCX，Oasis HLB)或液-液萃取来萃取。
HPLC-MS方法
柱：来自Waters的Atlantis dC18，2.1x30mm
流动相：
A：95％MeOH，5％水，0.1％TFA
B：95％水，5％MeOH，0.1％TFA
流速：0.5mL/min
梯度(线性)：
  时间(min)   A   B
  0   30％   70％
  0.5   30％   70％
  2.8   100％   0％
  3.8   100％   0％
  4.0   30％   70％
  5.0   30％   70％
基于标准曲线和用内标验证的方法测定分析物。
表12.本发明代表性化合物的药代动力学参数
  化合物   施用方式a   排泄(t1/2，min)   清除(mL/min/kg)   生物利用度(口服)b
  502   i.v.   102   57   na
  502   s.c.   146   79   na
  551   i.v.   139   33   na
  551   p.o.d   70-125   6％
  552   i.v.   24   45   na
  552   s.c.   103   39   na
  552   p.o.c   307   10％
  563   i.v.   55   27   na
    563     p.o.c     117     21％
    568     s.c.     132     42     na
    568     i.v.     25     65     na
ai.v.＝静脉(10个时间点持续150min)；s.c.＝皮下(10个时间点持续360 min)，p.o.＝口服(10个时间点持续240min)
bna＝不适用
c10％β-环糊精存在下进行
d无环糊精下进行
对化合物502、552和563时间过程的结果提供于图13A-13G。
J.评价从鼩鼱胃、十二指肠和结肠分离的肌肉带的可收缩活性。
此前的研究已证实促胃动素在从兔胃窦(Van Assche，G.；Depoortere，I.；Thijs，T.；Janssens，J.J.；Peeters，T.L.Concentration-dependentstimulation of cholinergic motor nerves or smooth muscle by[Nle13]-motilinin the isolated rabbit gastric antrum(分离的兔胃窦中[Nle13]-促胃动素浓度依赖性地刺激胆碱能运动神经或平滑肌).Eur.J.Pharmacol.1997，337，267-274.)或从十二指肠环肌(如上在方法3-D中所述的)分离的平滑肌带中刺激可收缩活性。促胃动素(阈值浓度10-8M)通过与胆碱能神经传递的神经节后相互作用增强由电场刺激(4Hz)引起的收缩。在更高浓度，促胃动素导致直接与窦平滑肌相互作用的强直性收缩。类似地研究了促胃动素和[Nle13]-促胃动素(Calbiochem)作为促胃动素受体的选择性激动剂，对从鼩鼱的胃窦、十二指肠的环肌和结肠分离的平滑肌带的效力。免疫化学研究已显示麝鼩GI道中的内分泌细胞表达促胃动素(Kanamori，Y.；Nakazawa，S.；Kitoh，J.；Hoshino，M.The distributinn of endocrine cellsin the mucosa of the gastrointestinal tract of the house musk shrew，Suncusmurinus(Insectivora)(内分泌细胞在家养麝鼩(臭鼩)(食虫类)胃肠道粘膜中的分布).Cell.Tissue Res.1989，258，365-71；Kitamura，N.；Yamada，J.；Watanabe，T.；Yamashita，T.An immunohistochemical study on thedistribution of endocrine cells in the gastrointestinal tract of the muskshrew，Suncus murinus(对内分泌细胞在麝鼩(臭鼩)胃肠道中分布的免疫化学研究).Histol Histopathol.1990，5，83-88.)。对鼩鼱禁食8-10h，吸入CO2处死，立即分离胃、十二指肠和结肠并置于充有95％O2和5％CO2的Krebs缓冲液中。具体地，使用解剖显微镜从窦区、十二指肠和结肠分离无粘膜的环肌带。使用PowerLab数据获取系统在最优张力平衡后记录器官浴中的等长收缩。电场刺激(EFS：0.5ms脉冲时间、1-32Hz脉冲频率)用于引起神经介导的收缩。尤其是，对每种动物制备四个结肠段(10-12mm)。将各段以1g初始张力悬挂在10-mL器官浴中并平衡90min。进行试验以研究促胃动素和[Nle13]-促胃动素(10-9-10-7M)：a)对基础紧张性和发展自发相位收缩的效力；b)对EFS引起的神经介导的可收缩响应的效力。在0.3μM的浴浓度施加的促胃动素或[Nle13]-促胃动素引起的收缩作用在治疗的前4min内达到最大值并在8-10min内降低。结果证实促胃动素受体牵涉在鼩鼱GI肌肉收缩性的调节中。
为了确定测试化合物对鼩鼱GI道不同区域(胃窦、回肠和结肠)的效力并评价测试化合物在该模型系统中的拮抗亲合性，在如上述的器官浴中测量不同浓度的测试化合物拮抗促胃动素或[Nle13]-促胃动素引起的收缩的能力。如图18所示，化合物552剂量依赖性地抑制促胃动素和[Nle13]促胃动素活化促胃动素受体在从鼩鼱分离的结肠段中引起的收缩。化合物552(0.01μM-10μM)导致剂量依赖性地抑制对0.3μM促胃动素或0.3μM[Nle13]-促胃动素的收缩性响应。对每个试验，数据是平均值±SEM，动物的数目如对每个治疗所指出的。化合物552未引起基础可收缩活性的显著变化(数据未显示)。
K.应激引起的腹泻或PGE2-引起的腹泻的动物模型
动物模型可用于研究以本发明代表性化合物治疗对不同方式引起的(尤其是应激或PGE2引起的)腹泻症状的缓解或预防发展的效力。由于大鼠和小鼠不表达促胃动素受体，麝鼩(臭鼩(Suncus murinus))是一种表达促胃动素受体并适于这种研究的合适动物模型。此外，负鼠、兔或猪也是这类评价的合适动物模型。
动物
本研究中使用实验室麝鼩(臭鼩)。麝鼩不群居，放在一起时具有攻击性行为，因此将动物单独圈养在树脂玻璃笼，笼中有松树刨花和碎纸作为床(合适处理程序参见Temple，J.L.The musk shrew(Suncusmurinus)：a model species for studies of nutritional regulation ofreproduction(麝鼩(臭鼩)：用于研究营养调节生殖的模式物种).ILAR J.2004，45，25-34)。整个研究中温度保持在70-72°F，保持14∶10h的光亮∶黑暗周期。由于鼩鼱在黎明和黄昏时最活跃，在光亮阶段的第一个小时内开始试验。根据物种需求随意提供食物和水：食物：3份普瑞纳猫粮和1份貂粮(例如Wisconsin″Mink Complete Pellets-Grow-Fur″：粗蛋白质＜34％、粗脂肪＞20％、粗纤维＞4％)。食物放在笼中小塑料盘里。水：略酸性(pH 5.5)蒸馏水，以减少自来水供应的污染。每周更换笼和水瓶。开始研究前使所有动物习惯于动物场所至少1周。
实验设计和方法
首先，获得关于鼩鼱正常食物摄取量和粪粒排量的信息。使动物适应于处理，在12只鼩鼱的组中测量每日食物摄取量和粪粒排量。将动物带至实验室它们的圈养笼中，并停留3h。在此时间，将每只动物带出笼并用折叠毛巾覆盖。轻轻按压并提升背部顶部的皮肤以模拟用于施用皮下注射的步骤。然后动物回到圈养笼中，随后排粪2h。当建立PGE2-引起的排便模型时，该数据用作对初次接受试验的动物的参考。适应处理时，将鼩鼱随机分为两组(每组n＝6)并经过不同步骤以引起表明腹泻的粪粒排量。在第一组，在室温将鼩鼱置于单独约束笼1h。在抑制活动的1h期间和束缚应激后1h内测量粪便排量(粒数)。使用3级评分系统评价稠度：0，正常；1，软；2无定形。(Saito，T.；Mizutani，F.；Iwanaga，Y.；Morikawa，K.；Kato，H.Laxative and anti-diarrheal activity ofpolycarbophil in mice and rats(缓泻药和聚卡波非在小鼠和大鼠中的抗腹泻活性).Jpn.J.Pharmacol.2002，89，133-141.)。在第二组，施用PGE2(0.3mg/kg，i.p.)引起粪便排量增加并监测粪便稠度变化2小时。使用3级评分系统评价粪便稠度。根据Saito对小鼠获得的文献结果，应在PGE2给药后15-30min内产生软或无定形粪便。还记录了从PGE2施用到引起腹泻(首次出现软的水样粪便)所测量的时间。此外，在施用PGE2或约束之前和之后测量粪粒的湿重/干重比。
为了研究测试化合物或其媒介物对束缚应激引起的加速排便(作为应激引起的腹泻的模型)的影响，动物(每剂量水平8只)以测试化合物(0.1、1和10mg/kg s.c.或其它合适剂量和施用方式)或媒介物治疗。在室温将动物置于单独约束笼中1h，如上所述地测量粪便排量。试验前让动物自由获取食物和水。
为了研究测试化合物或其媒介物对PGE2-引起的腹泻的效力，将动物随机分为8组，每组以测试化合物(0.1、1和10mg/kg s.c.或其它适合剂量和施用方式)或媒介物治疗。施用PGE2(0.3mg/kg，i.p.)而引起腹泻并如上评价粪便稠度的变化。让动物习惯于环境，自由获取食物和水。
统计分析
所有值表示为对每个治疗组的8次成功试验的平均值±SE。由单向ANOVA和Dunnett′s多重比较检验(与媒介物对照的差异)确定值的统计显著性。认为＜5％(p＜0.05)的概率是显著的。
L.炎症的动物模型
大量炎症(尤其是GI道炎性疾病和病症)的动物模型已在本领域中充分建立并可用于评价本发明代表性化合物对治疗胃肠炎症的效力。(Wirtz，S.；Neurath，M.F.Int.J.Colorectal.Dis.2000，15，144-160；Powrie，F.；Ulbig，H.Novartis Found.Symp.2004，263，164-178；Jurjus，A.R.；Khoury，N.N.；Reimund，J.-M.J.Pharmacol.Toxicol.Methods 2004，50，81-92；Eckmann，L.Ann.NY Acad.Sci.2006，1072，28-38；Byrne，F.R.；Viney，J.L.Curr.Opin.Drug Disc.Develop.2006，9，207-217.)。
4.药物组合物
本发明的大环化合物或其根据本发明的药理学上可接受的盐可配制为不同剂型的药物组合物。为了制备本发明的药物组合物，根据药物制剂领域技术人员已知的技术，将一种或多种化合物(包括其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物)或其药学上可接受的盐作为活性成分与合适载体和添加剂紧密混合。
药学上可接受的盐指本发明化合物的盐形式，以允许其应用或配制为药品并保持指定化合物的游离酸和碱的生物有效性，并且不是生物上或其他方面不合要求的。这类盐的例子描述于Handbook ofPharmaceutical salts：Properties，Selection，and Use(药物盐手册：特征、选择和应用)，Wermuth，CG.和Stahl，P.H.(编辑)，Wiley-Verlag HelveticaActa，Zurich，2002[ISBN 3-906390-26-8]。这类盐的例子包括碱金属盐和游离酸和碱的加成盐。药学上可接受的盐的例子非限制地包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、丙磺酸盐、甲苯磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐。
如果本发明化合物是碱，可由本领域技术人员已知的任何适合方法制备期望的盐，包括以无机酸或有机酸处理游离碱，无机酸如但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、碳酸、硫酸、硝酸、磷酸和类似物，有机酸如但不限于甲酸、乙酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、延胡索酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、硬脂酸、抗坏血酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid)如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羟基酸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸、芳香酸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、环己基-氨基磺酸或类似物。
如果本发明化合物是酸，可由本领域已知的任何适合方法制备期望的盐，包括以无机碱或有机碱处理游离酸，所述碱如胺(伯胺、仲胺或叔胺)；碱金属或碱土金属氢氧化物或类似物。适合盐的示例性例子包括衍生自氨基酸如甘氨酸、赖氨酸和精氨酸；氨；伯胺、仲胺和叔胺如乙二胺、N，N′-二苄基乙二胺、二乙醇胺、胆碱和普鲁卡因，和环状胺如哌啶、吗啉和哌嗪的有机盐；以及衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
取决于预期的施用方式，用于这种药物组合物的载体和添加剂可采取多种形式。因此，用于口服施用的组合物可为例如固态制剂，如片剂、糖包衣片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、粒剂、粉末剂和类似物，适合的载体和添加剂为淀粉、糖、粘合剂、稀释剂、粒化剂、润滑剂、崩解剂和类似物。由于它们易于使用和高度的患者顺应性，片剂和胶囊剂对许多医学疾患代表最有利的口服剂型。
类似地，液态制剂的组合物制备包括溶液、乳剂、分散剂、悬浮剂、糖浆、酏剂和类似物，适合载体和添加剂为水、醇、油、二元醇、防腐剂、调味剂、着色剂、悬浮剂和类似物。用于胃肠外施用的典型制剂包括活性成分和载体如无菌水或胃肠外可接受的油，包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油，还可包括其它帮助溶解或保存的添加剂。在溶液情形，其可冻干为粉末，然后在使用前即刻重构。对分散剂和悬浮剂，合适载体和添加剂包括水性胶、纤维素、硅酸盐或油。
根据本发明实施方式的药物组合物包括适合口服、直肠、局部、吸入(如，由气溶胶)、含服(如舌下)、阴道、局部(即，皮肤和粘膜表面，包括气道表面)、透皮施用和胃肠外(如皮下、肌内、真皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、鞘内、脑内、颅骨内、动脉内或静脉)的药物组合物，尽管在给定情形最适合的途径将取决于被治疗疾患的性质和严重度和所用特定活性剂的性质。
注射用组合物将包括活性成分和适合载体，包括丙二醇-乙醇-水、等渗水、注射用无菌水(USP)、emulPhorTM-乙醇-水、cremophor-ELTM或本领域技术人员已知的其它适合载体。这些载体可单独使用或联合其它常见增溶剂如乙醇、丙二醇或本领域技术人员已知的其它试剂一起使用。
当本发明大环化合物将以溶液或注射液形式应用时，可将化合物溶解或悬浮在任何常规稀释剂中使用。稀释剂可包括，例如生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖水溶液、右旋糖水溶液、醇、脂肪酸酯、甘油、乙二醇、植物或动物来源的油、石蜡和类似物。可根据本领域技术人员已知的任何常规方法制备这些制剂。
鼻施用的组合物可配制为气溶胶、滴剂、粉末剂和凝胶剂。气溶胶制剂通常包括活性成分在生理学可接受的水性或非水性溶剂中的溶液或细小悬浮液。这种制剂通常以密封容器中无菌形式的单剂量或多剂量的量提供。密封容器可为与雾化装置一起使用的药筒或填充器(refill)。或者是，密封容器可为单分配装置如单次使用鼻吸入器、泵雾化器或装有设置为递送治疗有效量的计量阀的气溶胶分配器，以便在内含物已用完时即丢弃。当剂型包括气溶胶分配器时，它将包含推进剂如压缩气体，例如空气，或包括氟氯烃或氟代烃等有机推进剂。
适合含服或舌下施用的组合物包括片剂、糖锭剂和锭剂，其中活性成分与载体如糖和阿拉伯胶、黄蓍树胶或明胶和甘油一起配制。
直肠施用的组合物包括包含常规栓剂基料如可可脂的栓剂。
适合透皮施用的组合物包括软膏、凝胶剂和贴剂。
本领域技术人员已知的其它组合物也可用于透皮或皮下施用，如膏药。
进一步地，制备这种包含一种或多种活性成分混合配制组合物所需的组分的药物组合物时，可并入药理学上可接受的其它常规添加剂，例如赋形剂、稳定剂、杀菌剂、润湿剂、乳化剂、润滑剂、甜味剂、着色剂、调味剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂和类似物。可提及为添加剂的有例如淀粉、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、沉淀碳酸钙、结晶纤维素、羧甲基纤维素、糊精、明胶、阿拉伯胶、EDTA、硬脂酸镁、滑石、羟丙基甲基纤维素、焦亚硫酸钠和类似物。
在一些实施方式中，以单元剂型提供组合物，如片剂或胶囊剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供了包括一个或多个容器的药盒，该容器包括包含有效量的本发明一种或多种化合物的药物剂量单元。
本发明进一步提供包括本文所述化合物的前药。术语″前药″意指一种化合物，其在生理条件下或由溶剂分解或代谢转化为药学上活性的指定化合物。″前药″可以是本发明的化合物，其已被化学衍生以使(i)其保持其母体药物化合物的一些、全部生物活性或不保持，且(ii)其在受治疗者中代谢以产生母体药物化合物。本发明的前药还可为″部分前药″，因为化合物已被化学衍生化以使(i)其保持其母体药物化合物的一些、全部生物活性或不保持，且(ii)其在受治疗者中代谢以产生化合物的生物活性的衍生物。可使用衍生化合物以提供前药的已知技术。这种方法可利用形成与化合物的可水解的偶合。
本发明还提供了，本发明化合物可与用于预防和/或治疗代谢和/或内分泌病症、胃肠病症、心血管病症、肥胖和肥胖相关病症、中枢系统病症、遗传病症、增生过多病症和炎性病症的治疗剂联合施用。示例性治疗剂包括镇痛剂(包括阿片样镇痛剂)、麻醉剂、抗真菌剂、抗生素、抗炎药(包括非类固醇抗炎剂)、驱肠虫剂、止吐药、抗组胺剂、抗高血压药、抗精神病药、抗关节炎药、镇咳药、抗病毒剂、心活性药物、泻药、化疗剂(如DNA-相互作用剂、抗代谢物、微管蛋白-相互作用剂、激素剂和药剂如天门冬酰胺酶或羟基脲)、肾上腺皮质激素(类固醇)、抗抑郁剂、抑制剂(depressant)、利尿剂、安眠药、矿物质、营养补剂、拟副交感神经药、激素(如促肾上腺皮质激素释放激素、促肾上腺皮质激素、生长激素释放激素、生长激素、促甲状腺激素(thyrptropin)-释放激素和甲状腺刺激激素)、镇静剂(sedative)、磺酰胺、兴奋剂、拟交感神经药、镇定剂、血管收缩剂、血管扩张剂、维生素和黄嘌呤衍生物。
适合根据本发明治疗的受治疗者包括但不限于鸟类和哺乳动物受治疗者，优选为哺乳动物。本发明的哺乳动物包括但不限于犬科、猫科、牛、山羊、马、羊、猪、啮齿类(如大鼠和小鼠)、兔类、灵长类、人类、和类似物种、和在子宫内(in utero)的哺乳动物。需要根据本发明被治疗的任何哺乳动物受治疗者都是适合的。人类受治疗者是优选的。两种性别的和处在任何发育阶段(即初生婴儿、幼儿、少年、青少年、成年)的人类受治疗者都可根据本发明被治疗。
根据本发明示例性鸟类包括鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑、雉、走鸟类(如鸵鸟)和驯化鸟类(如鹦鹉和金丝雀)、和卵内(in ovo)鸟。
本发明主要关于治疗人类受治疗者，但本发明也可为兽医目的实施于动物受治疗者，尤其是哺乳动物受治疗者如小鼠、大鼠、犬、猫、家畜和马。本发明可进一步用于药物筛选和药物开发目的。
在用于治疗哺乳动物(即人类或动物)疾患(促胃动素受体的拮抗剂对该疾患有效)的治疗应用中，本发明的化合物或其合适的药物组合物可以有效量施用。由于化合物的活性和治疗效果的水平不同，施用的实际剂量将根据公认的因素确定，如年龄、受治疗者疾患、递送途径和受治疗者体重。剂量可从约0.1至约100mg/kg，每天口服施用1-4次。此外，化合物可以每剂量大约0.01-20mg/kg注射施用，每天施用1-4次。治疗可持续数周、数月或更长。对具体情况确定最佳剂量在本领域技术人员的能力范围内。
5.应用方法
本发明的式I化合物可用于预防和治疗特征为运动过度或高胃动素血症的一系列胃肠病症。
在特定实施方式，本发明的大环化合物可用于治疗腹泻、癌症治疗相关的腹泻、化疗引起的腹泻、放射性小肠炎、放射引起的腹泻、应激引起的腹泻、慢性腹泻、AIDS相关的腹泻、艰难梭菌相关的腹泻、旅行腹泻、移植物抗宿主病(graph versus host disease)引起的腹泻和其它类型腹泻。
在其它实施方式，本发明涉及对人类和其它哺乳动物治疗肠易激综合征、炎性肠病、消化不良、功能性胃肠病症、化疗引起的恶心和呕吐(呕吐)、手术后的恶心和呕吐、Crohn病、胃食管反流(gastroesophogealreflux)病症、溃疡性结肠炎、胰腺炎、幼儿肥厚性幽门狭窄、类癌综合征、吸收不良综合征、糖尿病、肥胖、胃肠吻合术后综合征(postgastroenterectomy syndrome)、萎缩性结肠炎或胃炎、胃潴留、胃肠排空综合征、乳糜泻、短肠综合征、恶病质和导致肥胖的饮食病症的方法，该方法包括施用治疗有效量的式I化合物。
本文所用的″治疗″不一定表示治愈或完全消除与其相关的病症或症状。
本发明的化合物可进一步用于制备用于治疗牵涉胃肠蠕动病症的一系列医学疾患的药物。
现在将参考以下实施例描述本发明的进一步的实施方式。应理解，这些实施例是为了阐明本发明的实施方式而不限制本发明的范围。
实施例1
合成Boc-Dap(噻唑-2-基)的标准程序(Boc-AA1，图1)
步骤1-1.[2-羟基-1-(甲氧基-甲基-氨基甲酰基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(AA1-1)。向Boc-Ser-OH(AA1-0，3.0g，0.015mol)的DMF(40mL)溶液加入DIPEA(2.6mL，15.0mmol)和HBTU(5.53g，15.0mmol)，然后在室温搅拌混合物直到获得均匀溶液。然后加入N，O-二甲基羟基胺盐酸盐(1.60g，16.5mmol)和DIPEA(2.85mL，16.0mmol)。在室温搅拌溶液O/N。加入0℃NaHCO3饱和水溶液而使混合物骤冷，然后以乙酸乙酯萃取。有机相在Na2SO4上干燥并在减压下浓缩至干燥。使用乙酸乙酯为洗脱液的快速色谱法以85％产率得到AA1-1。
TLC(100％乙酸乙酯)：Rf＝0.40(CMA)。
步骤1-2.噻唑-2-基-氨基甲酸苄基酯(AA1-2)。向2-氨基噻唑(AA1-A，3.0g，30.0mmol)和三乙基胺(6.30mL，45.0mmol)在0℃的搅拌溶液加入氯甲酸苄酯(5mL，36mmol)。反应体系在室温下搅拌O/N。依次以NaHCO3饱和水溶液和水洗涤反应混合物，并在减压下浓缩至干燥。所得的黄色固体从乙醇结晶以70％产率得到AA1-2。
步骤1-3.Boc-Dap(Z-噻唑-2-基)(Boc-AA1)。该程序是基于在GautamPanda等SynLett 2004，4，714-716中对其他物质提出的程序。Boc-Ser-Weinreb酰胺AA1-1(3.0g，12.0mmol)和三苯基膦(4.75g，18mmol)在无水THF(100mL)中的混合物在冰浴中冷却。将DIAD(3.63g，18mmol)的THF(20mL)溶液逐滴加入至该混合物。混合该溶液5min后，缓慢加入AA1-2(5.65g，24mmol)的THF(50mL)溶液。允许混合物升温至室温并搅拌O/N。在减压下除去溶剂。以快速色谱法(石油醚∶乙酸乙酯，8∶2)纯化粗制残余物以得到40％产率的AA1-3。
TLC(石油醚/乙酸乙酯8∶2)：Rf＝0.30(CMA)
下一反应顺序是基于文献中所述程序(Evans，D.A.等TetrahedronLett.1987，28，6141.)。向AA1-3(1.0g，2.15mmol)的THF(50mL)和水(10mL)溶液加入LiOH(150mg，3.22mmol)并在0℃搅拌反应12h。以饱和NH4Cl水溶液猝灭反应混合物并以乙酸乙酯萃取。快速色谱法(乙酸乙酯∶甲醇，8∶2)得到80％产率的Boc-AA1。
TLC(乙酸乙酯∶甲醇，8∶2)：Rf＝0.40(CMA)；
1H NMR(CD3OD)：δ1.28(s，9H)，4.48(m，2H)，4.63(m，1H)，5.30(s，2H)，7.09(m，1H)，7.34-7.39(m，4H)，7.47(m，1H)；
LC-MS(Grad_A4)：tR＝7.67分钟；对C19H23N3O6S计算的质量：421.4674，实测值：421
实施例2
合成Boc-咪唑-1-基-Ala(AA2)的标准程序
Figure A20078003349401291
步骤2-1.Boc-丝氨酸-β-内酯(AA2-1)。该程序是基于文献中发现的程序(Vederas，J.C.等J.Am.Chem.Soc.1987，109，4649-4659)。在氮氛下向装有机械搅拌器的干燥250mL 3-颈烧瓶加入三苯基膦(4.5g，17.1mmol，1.1当量)，接着加入100mL无水THF∶CH3CN(1∶9)混合物。搅拌混合物直到获得溶液，然后冷却至-55℃(浴温度)并逐滴加入偶氮二羧酸二甲酯(DMAD，1.9mL，17.1mmol，1.1当量)持续10min。加入后，搅拌混合物20min并逐滴加入Boc-Ser-OH(3.18g，15.5mmol，1.0当量)的50mL无水THF∶CH3CN(1∶9)溶液持续30min。在-55℃搅拌混合物1.5h，然后除去浴并允许溶液缓慢升温至室温。混合物到达室温后，在减压下蒸发溶剂。快速色谱法[梯度，己烷∶EtOAc，(80∶20)至(60∶40)]纯化所得的黄色油以得到白色固体的2.10g AA2-1，产率72％。最好在反应当天纯化粗制材料以避免分解。可加入DCM以帮助溶解粗制残余物。
TLC(Hex/EtOAc，60/40)：Rf＝0.55(CMA)
步骤2-2.1-三甲基甲硅烷基咪唑(AA2-2)。在氩氛下向咪唑(5.0g，0.074mol，2当量)的150ml甲苯溶液逐滴加入HMDS(11.46mL，0.055mol，1.5当量)持续20min，然后加热反应混合物至回流达3h。然后在减压下浓缩反应混合物至干燥。蒸馏残余物得到无色油状的AA2-2，产率85％。为了最好的结果，该产物应在氩氛下储存在0℃。
步骤2-3.Boc-咪唑-1-基-Ala(AA2).类似于Vederas，J.C.等J.Am.Chem.Soc.1985，107，7105-7109中所述的方法，在氩氛下以AA2-1(0.5g，2.67mmol，1当量)的无水CH3CN(10mL)溶液逐滴处理三甲基甲硅烷基咪唑AA2-2(0.488g，3.50mmol，1.3当量)的无水CH3CN(10mL)溶液持续5min，然后搅拌混合物28h。然后在冰-水浴中冷却反应并加入10ml氯化铵(0.1M)的冷水溶液。将混合物升至室温并搅拌5min。以DCM(3x50mL)萃取水相并在C18柱(10g)上经受色谱法[梯度，水∶甲醇，(100∶00)至(90∶10)]以提供0.48g白色固体的AA2，55％产率。
TLC(乙酸乙酯∶甲醇∶水，8∶2∶1)：Rf＝0.30(CMA)；
1H NMR(D2O)：δ1.20(s，9H)，4.20(m，2H)，4.50(M，1H)，7.30(s，1H)，7.32(s，1H)，8.50(s，1H)；
LC-MS(Grad_A4)：tR＝3.02min；对C11H17N3O4计算的质量：255.2704；实测值：255.
实施例3
合成Boc-吡唑-1-基-Ala(AA3)的标准程序
Figure A20078003349401301
该程序是基于文献中所述的程序(Vederas，J.C等J.Am.Chem.Soc.1985，107，7105-7109)。在氩氛下以内酯AA3-1(如前述地合成，0.50g，2.67mmol，1.0当量)的无水CH3CN(10mL)溶液逐滴地处理吡唑(0.80g，11.5mmol，1.5当量)的无水CH3CN(10mL)溶液持续5min，在50℃搅拌所得混合物12h。然后在减压下浓缩反应体系至干燥并以快速色谱法(乙酸乙酯∶甲醇，8∶2)纯化粗制残余物以提供1.0g(60％产率)白色固体的AA3。
TLC(乙酸乙酯∶甲醇，8∶2)：Rf＝0.30(CMA)；
LC-MS(Grad_A4)：tR＝5.14min；对C11H17N3O4计算的质量：255.2704，实测值：255。
实施例4
合成Ddz-Dap(Boc-Me)-OH的标准程序(Ddz-AA4，图2)
步骤4-1.Z-丝氨酸-β-内酯(AA4-2)。以此前对Boc衍生物AA3-1所述的相似方式制备该中间产物。在氮氛下向装有机械搅拌器的干燥250mL 3-颈烧瓶加入三苯基膦(4.5g，17.1mmol，1.1当量)，接着加入100mL无水THF∶CH3CN(1∶9)溶剂混合物。搅拌混合物直到获得溶液，然后冷却至-55℃(浴温度)，逐滴加入偶氮二羧酸二甲酯(DMAD，1.9mL.17.1mmol，1.1当量)持续10min。完成加入后，搅拌混合物20min，然后逐滴加入Z-Ser-OH (AA4-1，3.7g，15.5mmol，1.0当量)的50mL无水THF∶CH3CN(1∶9)溶液持续30min。在-55℃搅拌反应混合物1.5h，然后除去冷却浴并允许溶液缓慢升温至室温。混合物达到室温后，在减压下蒸发溶剂。以快速色谱法[梯度，己烷/EtOAc，(80∶20)至(60∶40)]纯化所得的黄色油以提供2.5g白色固体的AA4-2，72％产率。优选在当天进行纯化粗品油以避免分解。可加入DCM以帮助溶解残余物。
TLC(己烷/EtOAc(60/40)：Rf＝0.55(UV，CMA)
步骤4-2.Z-Dap(Me)-OH盐酸盐(AA4-3)。在氮氛下向干燥的500mL圆底烧瓶装入60ml无水CH3CN，接着装入N-甲基三甲基甲硅烷基胺(AA4-0，如步骤4-6中所述的合成，1.9mL，13.3mmol，1.5当量)。加入AA4-2(2.0g，8.9mmol，1.0当量)的40mL无水MeCN溶液至烧瓶并在氮氛下在室温搅拌混合物直到TLC指示无痕量的起始材料[己烷∶EtOAc(60∶40)，UV，CMA]。然后冷却混合物至0℃，加入180mL冷0.1M HCl。允许混合物升温至室温并搅拌30min。在减压下蒸发溶剂，所得的残余物与甲苯共沸两次然后真空下干燥以提供3.1g为淡黄色泡沫状的粗制AA4-3。不经任何纯化使用该粗制材料。
步骤4-3.Z-Dap(Boc-Me)-OH(AA4-4)。向包含粗制AA4-3(8.9mmol，1.0当量基于理论产率)的烧瓶加入90mL无水DCM。冷却混合物至0℃并逐滴加入二异丙基乙基胺(DEPEA，7.8mL，44.5mmol，5.0当量)，其帮助溶解粗制物质。一次性加入二碳酸二叔丁酯(2.1g，9.8mmol，1.1当量)，然后将混合物升温至室温并搅拌O/N。在减压下蒸发溶剂，将所得的残余物吸收入50mL Et2O∶NaOH(1M，1∶1)混合物。确认pH为9至10，如果不是则调节至该水平。以Et2O(2x25mL)洗涤分离的水相，以1M HCl酸化至pH 2并以EtOAc(3x25mL)萃取。以盐水(2x25mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤，在减压下蒸发并真空下干燥以提供2.5g(80％产率)为白色泡沫的AA4-4。
步骤4-4.H-Dap(Boc-Me)-OH(AA4-5)。在氮氛下将AA4-4(2.5g，7.1mmol，1.0当量)的75mL MeOH溶液加入至10％钯碳(250mg，10％w/w)。然后对混合物吹入氢直到反应完成。[TLC BuOH∶AcOH∶水(4∶1∶1)，UV，水合茚三酮]。然后以氮清洗混合物，在(World MineralsInc.，Santa Barbara，CA)垫上过滤并以MeOH(3x25mL)充分漂洗。在减压下蒸发滤液并真空下干燥以提供1.5g(93％)淡黄色固体的AA5-5。
步骤4-5.Ddz-Dap(Boc-Me)-OH(Ddz-AA4)。向AA4-5(1.9g，8.7mmol，1.0当量)的20mL MeOH溶液加入Triton B(4.3mL，9.5mmol，1.1当量)。在室温搅拌混合物30min，然后在减压下浓缩。将残余物与甲苯(2x)共沸以除去多余水和MeOH。所得的浆状物溶解于一次性加入的20mL无水DMF和Ddz-OPh(3.1g，9.5mmol，1.1当量)。在氮氛下在50℃搅拌混合物36-48h。然后在高度真空下除去DMF，将残余物稀释于水(50mL)。以Et2O洗涤所得的水相(检查以确保pH为9，如有必要则调节)直到TLC指示水相中无苯酚。冷却碱性水相至0℃，加入Et2O(50mL)，以柠檬酸盐缓冲液(1.0M，pH 3.5)酸化水相。以Et2O(2x50mL)萃取分离的水相。然后顺序地以柠檬酸盐缓冲液(2x50mL)、水(2x50mL)和盐水(1x50mL)洗涤合并的有机相，以MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩以提供2.5g(65％)淡褐色固体的Ddz-AA4。
1H NMR(DMSO-d6)：δ12.65(s，1H)，7.45-7.35(dd，1H)，6.50(s，2H)，6.35(2，1H)，4.10(q，1H)，3.70(s，6H)，3.65-3.55(dd，1H)，3.25-3.15(dd，1H)，2.75(d，3H)，1.60(d，6H)，1.35(s，9H).
步骤4-6.合成N-甲基三甲基甲硅烷基胺(AA4-0)。甲胺(25.0mL，0.56mol，2.5当量)在-20℃冷凝，然后在氮氛下在-20℃加入至250mL无水Et2O中。在-20℃向溶液逐滴加入新蒸馏的(从LAH)氯代三甲基硅烷(28.1mL，0.22mol，1.0当量)。形成白色沉淀。完成加入后，将反应体系升温至室温并搅拌4h。然后冷却混合物至0℃并冷过滤。以无水Et2O(2x50mL)洗涤过滤的盐，然后滤液蒸馏通过45cm Vigreux柱以除去Et2O。残余物然后在15cm Vigreux柱上再蒸馏以分离9.7g(44％)无色液体的N-甲基三甲基甲硅烷基胺(bp 68-72℃)。
实施例5
合成片段F1的标准程序(图3)
步骤5-1.3-(3-氟代苯基)-2-羟基-丙酸苄酯(F1-2)。将亚硝酸钠(3.77g，54.6mmol)分批加入至L-3-氟代苯基丙氨酸(F1-1，5.0g，27.3mmol)的乙酸(82mL)溶液，该溶液通过浸入带有热电偶的冰-水浴而保持在室温。在室温搅拌溶液1hr，然后在减压下浓缩。然后加入水至残余物，以Et2O萃取产物，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩以产生2.57g(42％)的相应酸。将粗产物溶解于甲苯(120mL)，然后加入对甲苯磺酸(pTSA，216mg，1.14mmol)和BnOH(5.62mL，56.9mmol)，溶液以Dean-Stark设备回流O/N。所得的溶液冷却至室温，在减压下浓缩并以快速色谱法(梯度，100％己烷至己烷/乙酸乙酯，4/1)纯化以产生1.63g(52％)的苄基酯F1-2和不纯馏分(3.14g)。
TLC：Rf＝0.5(4/1己烷/乙酸乙酯)；
1H NMR(CDCl3)：δ2.77 (br s，1H，OH)；2.95(dd，J＝4.39和13.67Hz，1H，CH 2CHOH)；3.11(dd，J＝6.45和13.78Hz，1H，CH 2CHOH)；4.48(m，1H，CH2CHOH)；5.18(s，2H，PhCH 2 O)；6.86至6.93(m，3H)；7.17至7.20(m，1H)；7.31至7.39(m，5H)；
LC-MS(Grad_A4)：tR＝7.16min；(M+Na)+297。
步骤5-2.{3-[2-(2-氨基-3-甲基-丁氧基)-苯基]-丙基}-氨基甲酸叔丁酯(F1-5)。在氮氛下在0℃将偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD，3.13mL，15.9mmol)逐滴加入至三苯基膦(4.17g，15.9mmol)在THF(150mL)中的充分搅拌的溶液里。在0℃搅拌混合物30min，然后升温至室温。PPh3-DIAD加合物应沉淀为白色固体。将Cbz-缬氨醇(F1-4，3.43g，14.5mmol)的THF(150mL)溶液加入至该溶液，接着加入碘代苯酚(F1-3，3.18g，14.5mmol)并在氮氛下搅拌所得的溶液O/N。然后在减压下浓缩溶液，以快速色谱法(梯度，9/1至8/2己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物以产生相应加合物(2.98g，47％)。将其溶解于CH3CN(70mL)并加入Boc-丙炔胺(1.31g，8.48mmol)至溶液。向该溶液吹入氩气15min，然后加入Et3N(23mL)。向所得的溶液吹入氩气5min，然后加入CuI(45mg)和PdCl2(PPh3)2(145mg)，在氩氛下搅拌所得的溶液O/N。在减压下浓缩溶液，以Et2O溶解，顺序地以柠檬酸盐缓冲液(2x)、饱和NaHCO3(2x)水溶液和盐水(1x)洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(8/2己烷/乙酸乙酯)纯化所得的油以产生相应的炔(2.39g，76％)。粗产物还可不经进一步纯化用于下一反应。
1H NMR(CDCl3)：δ1.01(d，J＝6.7Hz，3H，CH 3CH)；1.02(d，J＝6.7Hz，3H，CH3CH)；1.22至1.28(m，1H)；1.43(s，9H，(CH3)3C)；2.01至2.16(m，1H，CHCH(CH3)2)；3.79至3.84(m，1H)；3.99至4.03(m，1H)；4.08至4.15(m，2H)；5.04(br.S，1H)；5.12(s，2H，PhCH 2O)；5.28(d，J＝9.4Hz，1H)；6.83(d，J＝8.2Hz，1H)；6.90(t，J＝7.6Hz，1H)；7.21至7.37(m，7H)；
LC-MS(Grad_A4)：tR＝12.45min，(M+H-Boc)+367。
将该炔(2.39g，5.13mmol)溶解于95％EtOH(50mL)。加入PtO2(116mg)，以H2(2x)清洗溶液，然后在H2(120psi)下加压并搅拌O/N。将所得的溶液减压，过滤通过
Figure A20078003349401341
(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)，以乙酸乙酯洗涤并在减压下浓缩。将残余物溶解于乙酸乙酯(50mL)。加入10％Pd/C(500mg)，以H2(2x)清洗溶液，然后在H2(120psi)下加压并搅拌O/N。将所得的混合物减压，过滤通过
Figure A20078003349401342
(WorldMinerals Inc.，Santa Barbara，CA)，以乙酸乙酯洗涤，在减压下浓缩并以快速色谱法(梯度，100％乙酸乙酯至10％MeOH/90％乙酸乙酯)纯化残余物以产生相应的胺F1-5(1.15g，67％)。
1H NMR(CDCl3)：δ0.99(d，J＝6.39Hz，6H，(CH 3)2CH)；1.44(s，9H，(CH 3)3C)；1.79(quint.，J＝6.45Hz，(CH3)2CH)；2.66(t，J＝7.62Hz，2H)；2.98至3.00(m，1H)；3.09至3.11(m，2H)；3.80(t，J＝8.21Hz)；3.99(dd)；5.04至5.06(m)；6.82至6.91(m，2H)；7.11至7.18(m，2H)。
步骤5-3.2-{1-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-苯氧基甲基]-2-甲基-丙基-氨基}-3-(3-氟代苯基)-丙酸苄基酯F1。在0℃将新蒸馏的(CF3SO2)2O(29.5μL，175μmol)加入至醇F1-2(45mg，164μmol)的CH2Cl2溶液持续5min，接着加入2，6-二甲基吡啶(22μL，189μmol)。在0℃搅拌所得的溶液10min，然后加入DIPEA(32μL，181μmol)并立即接着加入胺F1-5(55mg，164μmol)的CH2Cl2(1mL)溶液持续15min。在氮氛下在室温搅拌所得的溶液O/N。然后加入CH2Cl2，顺序地以水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤有机溶液，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法纯化所得的油以产生苄基酯F1(40mg，41％)。
实施例6
合成片段F2的标准程序
按照如图4所示的对片段F1描述的相同合成路线制备相关片段F2。
实施例7
合成受保护的拴系物Ddz-T38(S)的标准程序(图5)
步骤7-1.碘代醇T38-2(S)。向2-碘代苯酚(T38-1，19.0g，86.2mmol，1.0当量)的丙酮(150mL)溶液加入碳酸钾(13.1g，94.8mmol，1.1当量)，接着加入(S)-(-)-环氧丙烷(T38-A，30.1mL，0.431mol，5.0当量)。在75℃在密封高压烧瓶中搅拌混合物过夜。将混合物冷却至室温，过滤且用丙酮漂洗滤器两次。在减压下浓缩合并的滤液和漂洗液，将所得的残余物溶解于Et2O(150mL)。以1N NaOH(3x100mL)和盐水(2x100mL)洗涤有机层，在硫酸镁上干燥，过滤并在减压下蒸发以提供23.9g定量产率的黄色油状T38-2(S)。这步骤中使用(R)-(+)-环氧丙烷经相同程序导致形成对映体的受保护的拴系物[Ddz-T38(R)]。
步骤7-2.Ddz-氨基-炔[T38-4(S)]。向T38-2(S)(23.9g，86.0mmol，1.0当量)和Ddz-丙炔胺(T38-3，29.8g，107.5mmol，1.25当量)的CH3CN(130mL)溶液吹入氩气10min。然后加入蒸馏的(与CaH2搅拌O/N后)三乙胺(45mL)至溶液，向混合物吹入氩气清洗5min。加入重结晶的碘化铜(I)(572mg，3.0mmol，0.035当量，Organometallic in Synthesis，AManual(合成中的有机金属，手册)，Manfred Schlosser，第二版，2002，p.669.)和反式-二氯代双(三苯基膦)钯(II)(2.1g，3.0mmol，0.035当量)，在氩氛下在室温搅拌反应混合物O/N。由TLC监控反应[(EtOAc/Hex，60/40)，Rf＝0.62，UV，CMA]。将混合物过滤通过硅胶垫并以EtOAc漂洗。在减压下浓缩合并的滤液和漂洗液直到干燥并以DCM∶Et2O混合物(15∶85，300mL)稀释残余的油状物。顺序地以1.0M柠檬酸盐缓冲液(3x150mL)、饱和NaHCO3(2x150mL，小心，产生压力)和盐水(1x150mL)洗涤有机相，然后以硫酸镁干燥，过滤并在减压下蒸发。以快速色谱法[梯度，EtOAc∶Hex∶Et3N(30∶70∶0.5)至EtOAc∶Hex∶Et3N(60∶40∶0.5)]纯化粗产物以提供35.0g定量产率的为褐色浆状的T38-4(S)。
步骤7-3.Ddz-氨基-醇[Ddz-T38(S)]。在氮氛下向T38-4(S)(35.0g，81.9mmol，1.0当量)的95％EtOH(400mL)溶液加入氧化铂(1.86g，8.2mmol，0.1当量)。将氢吹入混合物O/N并搅拌。以1H NMR监控反应直到完成。当反应完成时，将氮吹入10min以除去多余的氢。然后将混合物过滤通过
Figure A20078003349401361
(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)垫并以95％EtOH洗涤直到洗脱不到材料[TLC(EtOAc/Hex，60/40)]。在减压下除去溶剂。将产物稀释于DCM(300mL)中并加入MP-TMT清除剂树脂(5当量，基于催化剂的量)。搅拌混合物O/N，过滤并以DCM漂洗树脂两次。在减压下蒸发合并的滤液和漂洗液以提供34.1g(89％)黄色至橙色油状的Ddz-T38(S)。
1H NMR(CDCl3)：δ7.20-7.10，(m，2H)，6.95-6.80(m，2H)，6.55(bs，2H)，6.35(s，1H)，5.18(bt，1H)，4.12(m，1H)，3.95(m，2H)，3.80(s，6H)，3.15(bq，2H)，2.65(t，2H)，1.98(bs，2H)，1.65(bs，6H)，1.25(m，3H).
13C NMR(CDCl3)：δ160.8，156.6，155.8，149.6，130.4，127.5，121.3，111.7，103.2，98.4，80.7，73.5，66.6，55.5，40.2，30.5，29.3，29.1，27.3，19.5.
LC-MS(Grad_A4)：tR＝8.46min
注意T38(S)用于制备具有(R)-立构中心的式I化合物。类似地，T38(R)用于合成具有(S)-立构中心的式I化合物，如进一步在实施例10和11中描述的。
此外，可使用与实施例7的方法相似的方法，分别从3-氟代-2-碘代苯酚和6-氟代-2-碘代苯酚、或相应的2-溴代苯酚开始，获得拴系物T92和T93的受保护的衍生物。
实施例8
合成受保护的拴系物Boc-T81(1R，8S)的标准程序(图6)
步骤8-1.3-(2-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙烯酸乙基酯(T81-2)。在0℃向氢化钠(油中65％，26.4g，661mmol，以己烷彻底洗涤以除去油)的THF(746mL)悬浮液加入(EtO)2P(O)CH(Me)CO2Et(144mL，661mmol)。在室温搅拌混合物30min，然后冷却溶液至0℃，缓慢加入醛T81-1(60.0g，441mmol)。在O/N期间搅拌反应并由TLC[(乙酸乙酯∶己烷，2∶7)，Rf＝0.49(UV，CMA)]监控。加入氯化铵的饱和溶液，以Et2O(3x)萃取水相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(乙酸乙酯/己烷，2/8)纯化残余物以提供为黄色油状的T81-2(97-100％产率)。
步骤8-2.3-(2-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙酸乙基酯(T81-3)。向T81-2(7.3g，23mmol)的95％乙醇(100ml)溶液小心地加入10％Pd/C(730mg)。向溶液吹入氢，然后在氢氛下搅拌溶液O/N。将悬浮液过滤通过硅胶垫并以乙酸乙酯洗涤。在减压下浓缩合并的滤液和洗涤液以得到T81-3，其适合用于下一步骤而不经任何进一步纯化(产率：86-90％)。
步骤8-3.3-(2-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙-1-醇(T81-4)。在0℃向T81-3(55.1g，248mmol)的THF(1.2L)溶液分批加入LiAlH4(18.8g，496mmol)。完成加入后，在0℃搅拌溶液15min，并由TLC[(30％EtOAc，70％己烷)，Rf＝0.30(UV，CMA)]监控直到完成。非常缓慢地加入水(18.8mL)(在氮流下)接着加入15％氢氧化钠(18.8mL)溶液，然后加入水(56mL)。过滤残余盐并在减压下浓缩滤液以提供醇T81-4(99％)，其在下一步骤使用而不经任何进一步纯化。
步骤8-4.乙酸3-(2-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙基酯[T81-5(S)]和3-(2-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙-1-醇(T81-5(R)]。酶Amano PS(1.7g)和外消旋醇T81-4(30.7，0.67mol)与TBME(292mL)在包含磁性搅拌棒而无盖的反应烧瓶中混合。在另一烧瓶中，将TBME置于水提取器中并用于在24h后恢复反应体积(由于蒸发而损失)。在饱和MgCl2(制备5-10mL MgCl2在水中的饱和溶液并储存在水提取器中不加盖)存在下在水提取器中搅拌混合物24h。24h后，将预平衡的溶剂加入至反应烧瓶以补偿蒸发造成的损失。加入乙酸乙烯酯(56mL，3.7当量)至反应烧瓶，，立即用隔膜密封烧瓶。在室温搅拌混合物直到由LC-MS(2h后开始取小份直到5.5h(此时通常已完成反应))确定获得42％的转化。将反应混合物过滤通过中级多孔玻璃烧结的漏斗。以己烷洗涤残余物并在减压下浓缩合并的滤液和洗涤液。以快速色谱法(梯度，乙酸乙酯/己烷，10/90至50/50)纯化残余物以提供乙酸酯T81-5(S)(18.3 g)和醇T81-5(R)。为了确定对映体纯度，将小量的乙酸酯T81-5(S)通过与K2CO3(3当量)一起在MeOH中搅拌1h而水解。(后处理)：加入水并在减压下蒸发MeOH，然后以Et2O萃取水相。合并的有机相在MgSO4上干燥并浓缩以提供定量产率的醇。)使用LC-MS以手性HPLC柱分析粗制醇以确定％ee。
以用于外消旋醇的相同程序以Amano PS再处理醇T81-5(R)，只是允许反应进行直到由LC-MS确定20％的转化(2h后开始取小份，通常8.5h后达到此水平)。然后如对T81-5(S)所述地处理混合物以提供醇T81-6(R)(14.1g)和乙酸酯T81-5(S).(J.Chem.Soc，Perkin Trans.1 2000，367.)。该醇可以代替在以下步骤8-6中的T81-6(S)异构体并转化为包含8R-立构中心的T81。
步骤8-5.3-(2-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙-1-醇[T81-6(S)]。在-30℃向乙酸酯T81-5(S)(3.0g，13.4mmol，1.0当量)的DCM(65mL)溶液加入1M BBr3的DCM(33.8mL，34mmol，2.5当量)溶液。在0℃搅拌混合物3h并由TLC[(30％AcOEt，70％己烷)，Rf＝0.30(UV，CMA)]监控。在0℃缓慢加入甲醇(135mL，4倍于BBr3的体积)，接着加入水。搅拌混合物O/N。以DCM(3x150mL)萃取水相。在MgSO4上干燥有机相，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(乙酸乙酯/己烷，8/2，Rf＝0.3)纯化残余物以提供2.25g的T81-6(S)(98％)。
步骤8-6.3-[2-(2-羟基-丙氧基)-苯基]-2-甲基-丙-1-醇[T81-7(1R，8S)]。向苯酚T81-6(S)(1.4g，8.42mmol，1.0当量)的DMF(16mL)溶液加入碳酸钾(1.6g，8.42mmol，1当量)和(R)-碳酸甲酯(T81-A，0.73mL，8.42mmol，1.0当量)。在85℃搅拌所得的混合物72h并以TLC[(乙酸乙酯/己烷：2/8)；Rf＝0.30，UV，CMA]监控反应。将混合物冷却至室温，加入盐水。以乙酸乙酯萃取水相，以盐水萃取合并的有机相。有机相在MgSO4上干燥并在减压下浓缩。由快速色谱法(乙酸乙酯/己烷，2/8，Rf＝0.30)纯化残余物以提供T81-7(1R，8S)(1.45g，76％)。该反应中使用(S)-碳酸甲酯反应，经过如下对相应(1R)-异构体所述的相同转化，得到包含(1S)-立构中心的T81(1S，8S)。
步骤8-7.甲苯-4-磺酸3-[2-(2-羟基-丙氧基)-苯基]-2-甲基-丙基酯[T81-8(1R，8S)]。在0℃向醇T81-7(1R，8S)(2.0g，8.9mmol，1.0当量)的吡啶∶二氯甲烷(1∶5，25mL)的溶液逐滴加入Ts-Cl(1.90g，9.8mmol，1.1当量)的10mL二氯甲烷溶液，并在0℃度搅拌所得的混合物O/N，以TLC[(乙酸乙酯∶己烷，3∶7)Rf＝0.50(UV)]监控反应。加入水并以CH2Cl2萃取水相。以0.1N HCl溶液洗涤合并的有机相3次，然后在MgSO4上干燥并在减压下浓缩。以快速色谱法(乙酸乙酯/己烷，3/7，Rf＝0.5)纯化残余物以提供T81-8(1R，8S)(2.29g，70％)。还以～10％产率分离小量的二-甲苯磺酸化的化合物。
步骤8-8.1-[2-(3-叠氮-2-甲基-丙基)-苯氧基]-丙-2-醇[T81-9(1R，8S)]。向甲苯磺酸酯T81-8(1R，8S)(2.2g，5.85mmol，1.0当量)的DMF(25mL)溶液加入NaN3(185g，0.03mol，5当量)，在50℃搅拌所得的混合物24h或直到完成。由TLC[(乙酸乙酯∶己烷，3∶7)，Rf＝0.35(UV，CMA)]监控反应。加入水并以Et2O萃取水相。以盐水洗涤合并的有机相，然后在MgSO4上干燥并在减压下浓缩。以快速色谱法(乙酸乙酯/己烷，3/7)纯化残余物以提供T81-9((1R，8S)(12g，80％)。
步骤8-9.1-[2-(3-氨基-2-甲基-丙基)-苯氧基]-丙-2-醇[T81-10(1R，8S)]。向T81-9((1R，8S)(1.20g，4.8mmol，1.0当量)的乙酸乙酯(25mL)溶液小心地加入10％Pd/C (0.12g)。向溶液持续吹入氢，在室温搅拌所得的混合物O/N。由TLC[(乙酸乙酯/己烷；3/7)，Rf＝基线，UV，CMA]监控反应。将溶液过滤通过
Figure A20078003349401391
(World Minerals Inc.，SantaBarbara，CA)垫并以乙酸乙酯漂洗。在减压下蒸发合并的滤液和漂洗液以提供粗制胺T81-10((1R，8S)(1.12g，98％)。
步骤8-10.{3-[2-(2-羟基-丙氧基)-苯基]-2-甲基-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯[Boc-T81(1R，8S)]。向T81-10(1R，8S)(1.12g，5.01mmol，1.0当量)的THF∶水(1∶1，20mL)溶液加入K2CO3(1.43g，10.0mmol，2.0当量)和Boc2O(3.30g，15.0mmol，3当量)。在室温搅拌混合物O/N。由TLC[(乙酸乙酯/己烷，4/6).Rf＝0.50(UV，水合茚三酮)]监控反应。加入柠檬酸盐缓冲液并以Et2O(3x)萃取混合物。顺序地以柠檬酸盐缓冲液、水和盐水洗涤合并的有机相。在MgSO4上干燥有机相并过滤。在减压下浓缩滤液。以快速色谱法(乙酸乙酯/己烷，4/6)纯化残余物以提供Boc-T81(1R，8S)(1.0g，75％)。
1H NMR(CDCl3)：δ0.9(d，3H)，1.25(d，3H)，1.42(s，9H)，1.90(m，1H)，2.30(m，1H)，2.80-3.05(m，4H)，3.82(m，1H)，4.01(m，1H)，4.25(m，1H)，6.85(m，2H)，7.15(m，2H)；
LC-MS(Grad_A4)：tR＝8.52min；实测质量：323；
13C NMR(CDCl3)：δ19.01 29.10，35.10，36.20，38.10，46.20，62.20，70.00，80.10，115.20，120.15，128.10，130.00，132.10，158.50.
注意T81(1R，8S)和T81(1R，8R)用于制备具有(1S)-立构中心的式I化合物。类似地，T81(1S，8S)和T81(1S，8R)用于合成具有(1R)-立构中心的式I化合物。
实施例9(图8)
液相合成本发明化合物的一般程序
A.)片段1合成
步骤9-1.在装备有Dean-Stark仪器的圆底烧瓶中，将氨基酸G-1(0.2mol，1.0当量)悬浮在甲苯(每0.2mol用1L，该程序中溶剂/洗液的量根据更小或更大规模而依比例确定)中。加入对甲苯磺酸(pTSA，1.2当量)和苄基醇(5.0当量)，并回流搅拌混合物16-18h。冷却混合物至室温并形成白色沉淀。以MTBE(500mL)稀释沉淀，过滤并以MTBE(3x500mL)研碎。在高度真空下干燥固体16-18h以提供中间产物甲苯磺酸盐。
将甲苯磺酸盐吸收入1M Na2CO3(200mL)水溶液。以EtOAc(4x150mL)萃取该碱性水相并以盐水(1x100mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤，在减压下浓缩并真空干燥以提供游离的氨基酯G-2。
如本领域技术人员将理解的，对于修改脱保护方案的程序，也可以使用苄基酯的替代酯。
步骤9-2.向新鲜游离碱化的G-2(10当量)的DCM(90-100mL)溶液加入三乙胺(TEA，1.1当量)、吡啶(3.4当量)和Bts-Cl(2.0当量)。在室温搅拌反应O/N。以DCM(100mL)稀释反应混合物，顺序地以柠檬酸盐缓冲液(2x)、盐水(1x)洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法纯化所得的残余物以提供Bts保护的氨基酯G-3。
步骤9-3.将受保护的拴系物G-4(1.5当量)、三苯基膦(8.5g，32.4mmol，1.5当量)和G-3(1.0当量)溶解于无水THF(100mL)。将溶液在冰-水浴中冷却至0℃并逐滴加入偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD，1.45当量)。预形成的DIAD:PPh3加合物(实施例38)也可用于该步骤。加入后，在0℃搅拌混合物1h，然后缓慢升温至室温并在氮下搅拌16-18h。在减压下除去THF并以快速色谱法纯化粗制残余物以提供烃基化的氨基酸酯G-5。
注意当拴系物G-4包含键合至手性碳原子的羟基基团时，在该中心发生倒转。因此，拴系物中的(S)-立构中心产生在该手性碳原子处具有(R)-立构中心的式I化合物。类似地，具有(R)-立构中心的拴系物产生在该手性碳原子处具有(S)-立构中心的式I化合物。
步骤9-4.向G-5(1.0当量)的DMF(75mL)溶液加入固体碳酸钠(5.0当量)，接着加入2-巯基乙醇(5.0当量)。在室温搅拌混合物16-18h。反应由HPLC(Grad A4)监控。加入水(150mL)且以EtOAc(3x75mL)萃取水相。以盐水(1x100mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法纯化粗制残余物以提供去苯并噻唑-2-磺酰化的(debetsylated)氨基酸酯G-6。反应后由LC-MS确定确保苯并噻唑：巯基乙醇加合物无剩余是重要的，因为该副产物已显示会抑制随后的氢解反应。
步骤9-5.该步骤针对大约15mmol的规模描述。在氮氛下向圆底烧瓶装入10％Pd/C(50％湿，10％重量)和95％EtOH(70mL)，接着装入G-6(15mmol，1.0当量)的EtOH 95％(70mL)溶液。使用气体分散管在氢吹入下搅拌混合物4小时。2h后混合物中形成沉淀。加入EtOAc或THF(100mL)以获得搅拌的悬浮液。以氮清洗混合物10min以除去多余氢，过滤通过
Figure A20078003349401411
(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)垫并以EtOAc和MeOH洗涤直到TLC指示不再洗脱出材料。在减压下蒸发溶剂并在高度真空下干燥所得的固体以提供氨基酸G-7。
B.)片段2合成
步骤9-6.对于氨基酸苄基酯的盐(G-8，1当量，描述为对15mmol规模)，将固体吸收入1M Na2CO3水溶液(50mL)。以EtOAc(4x50mL)萃取该碱性水相并以盐水(1x600mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤，在减压下浓缩并在高度真空下干燥4-6h以提供游离氨基酯G-9。
步骤9-7.将G-9(商业上可获得的或如步骤9-1或9-6中所述的合成，15.5mmol，1.0当量)和受保护的氨基酸(G-10，1.05当量)溶解于无水THF/CH2Cl2(1∶1)(80mL)。然后加入6-Cl-HOBt(1.0当量)和DIPEA(5.0当量)。在冰-水浴中冷却混合物至0℃并加入EDCI(1.1当量)。在0℃搅拌混合物1h，允许升温至室温并搅拌16-18h。在减压下蒸发溶剂，将残余物溶解于EtOAc(100mL)。顺序地以柠檬酸盐缓冲液(1M，pH 3.5)(2x50mL)、水(1x50mL)、饱和NaHCO3水溶液(2x50mL)和盐水(1x50mL)洗涤有机相。在MgSO4上干燥有机相，过滤，在减压下浓缩并在高度真空下干燥16-18h以提供粗制二肽。
将粗制二肽(1.0当量)溶解于3.3M的HCl/EtOAc溶液(由在0℃吹入气态HCl至EtOAc而制备，10当量)并在室温搅拌混合物1h，形成白色沉淀。过滤沉淀并顺序地以EtOAc(1x50mL)和MTBE(1x50mL)洗涤，然后在高度真空下干燥16-18h以提供盐酸盐G-11。
C.)大环合成
步骤9-8.在0℃向酸片段G-7(1.0当量)和二肽盐酸盐G-11(1.05当量)的无水THF/DCM(1∶1)(10mL，对1.50mmol描述)溶液加入DIPEA(5.0当量)，接着加入HATU(1.05当量)。在0℃搅拌混合物1h，允许升温至室温并在氮下搅拌16-18h。在减压下除去溶剂并将残余物溶解于EtOAc(50mL)。顺序地以柠檬酸盐缓冲液(1M，pH 3.5)(2x25mL)、饱和NaHCO3水溶液(2x25mL)和盐水(1x25mL)洗涤有机相。在MgSO4上干燥有机相，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法纯化粗制残余物以提供期望的受保护的烃基化三肽G-12。
步骤9-9.在氮氛下向圆底烧瓶装入10％Pd/C(50％湿，10％重量)和95％EtOH 95％(5mL，对1.30mmol描述)，接着装入G-12(1.0当量)的95％EtOH(8mL)溶液。在氢吹入下搅拌混合物4h。2-3h后反应混合物变得很稠。加入THF以便至少部分地溶解悬浮液。以氮清洗混合物5min以除去多余的氢，过滤通过(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)垫并以THF洗涤直到不再洗脱出材料。在减压下蒸发溶剂并在高度真空下干燥所得的固体以提供酸G-13。
步骤9-10.将Boc保护的G-13(10当量，对1.30mmol描述)溶解于TFA/TES/DCM(33/3/64)(9.8当量，大约3mL)。在室温搅拌混合物30min并在减压下蒸发。将残余物与THF共蒸发两次，然后在高度真空下干燥16-18h以提供大环前体G-14。
步骤9-11.向G-14(1.0当量，对1.30mmol描述)的无水THF溶液(足以形成25mM溶液，尽管10mM浓度的溶液也是可接受的)加入DIPEA(5.0当量)和DEPBT(1.1当量)。在室温搅拌混合物16-18h。在减压下蒸发THF并将残余物吸收入1M Na2CO3(水溶液)∶EtOAc(1∶1)(50mL)。以盐水(2x25mL)洗涤分离的碱性水相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下蒸发。以快速色谱法或反相HPLC纯化粗制残余物以提供大环G-15。
下表13列出了已根据该标准步骤合成的本发明其它代表性化合物的该最终大环化步骤的产率。
表13.步骤9-11的代表性产率
  化合物   大环化产率a   浓度
  513   73％   25mM
  554   75％   25mM
  555   78％   25mM
  557   76％   25mM
  558   72％   25mM
  559   83％   10mM
  560   73％   10mM
  561   55％   10mM
  562   87％   10mM
a硅胶纯化后确定产率，根据脱Boc保护之前的线性前体。
实施例10
合成化合物552的标准程序(图9)
步骤10-1.H-(D)Tyr-OMe的氯化。在5℃向H-(D)Tyr-OMe(游离碱，10-1，0.11mol，21.7g)的冰乙酸(550mL)溶液逐滴加入SO2Cl2(12.1mL，0.15mmol，1.35当量)。搅拌1h后加入Et2O并沉淀产物。将其过滤并以Et2O洗涤以提供20.8g(85.4％)10-2。
LC-MS(UV，CLND，ELSD)：98.2/98.4/99.4；tR＝3.39min，(M+H)+229。步骤10-2.双Bts保护。向10-2盐酸盐的DCM(50mL)溶液加入吡啶(5.8mL，68mmol，6.8当量)和Et3N(3.0mL，22mmol，2.2当量)，接着加入固体Bts-Cl(9.3g，40mmol，4当量)。然后在室温搅拌混合物16h。将其以DCM(100mL)稀释，顺序地以柠檬酸盐缓冲液(2x50mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2x50mL)和盐水(一次)洗涤，然后在MgSO4上并浓缩。以快速色谱法(梯度，EtOAc∶己烷30∶70至50∶50)纯化产物以提供灰白色固体的10-3(5.3g，85％)。或者是，可以1.0M盐酸/EtOAc研碎而以定量产率分离产物。
1H NMR(CDCl3)：与结构一致
LC-MS(UV，CLND，ELSD)：94.2/95.2/100；tR＝8.88min，(M+H)+624
步骤10-3.Fukuyama-Mitsunobu法。在0℃在N2下向10-3(3.2g，5.1mmo1)、Boc-T38(R)(2.2g，7.2mmol，1.4当量)、PPh3(1.9g，7.2mmol，1.4当量)的THF(25mL)溶液逐滴加入DIAD(1.5mL，7.2mmol，1.4当量)。加入后，在室温搅拌混合物16h然后在减压下浓缩。快速色谱法(梯度，EtOAc∶己烷，30∶70至45∶55)纯化残余物以提供黄色油状的10-4，其静置固化(5.7g，＞100％)。该材料可直接用于下一步骤。或者是，起初，PPh3和DIAD可减少至1.1当量，然后如果需要，各另加入0.3-0.4当量以驱动反应至完成。
LC-MS(UV，CLND，ELSD)：91/80/100；tR＝14.53min，(M+H)+229
步骤10-4.苯并噻唑-2-磺酰化(Debetsylation)。向10-4(5.2g)的DMF(50mL)溶液加入碳酸钠(3.3g，31mmol，5当量)和2-巯基乙醇(2.2mL，31mmol，5当量)。然后在N2下搅拌混合物16h，然后蒸发DMF并以水(200mL)稀释混合物，且调节pH至8。以EtOAc(3x100mL)萃取水层。以盐水洗涤合并的有机层，然后以MgSO4干燥并在减压下浓缩。以快速色谱法(EtOAc∶己烷，梯度，40∶60至70∶30)纯化产物以提供为黄色油的10-5，4.98g。LC/MS指示该材料含有显着量的苯并噻唑：巯基乙醇加合物(UV显示84％)。对更高反应浓度，还可以THF/水(1∶2)作为溶剂，以LiOH作为碱进行反应。
步骤10-5.酯水解。向粗制10-5(4.98g，污染有苯并噻唑巯基乙醇加合物)在THF∶水的1∶1混合物(共40mL)的溶液加入2.6g LiOH·H2O(62mmol)。在室温搅拌混合物16h，然后在减压下除去THF。向混合物加入200mL水并调节pH至6。形成白色沉淀，将其滤出并以冷水(2x40mL)洗涤，然后以冷MTBE(2x40mL)洗涤并以iPrOH∶庚烷(1∶2)研碎。获得灰白色固体的10-6(1.94g，对最后3步骤为75％)。还可在95％EtOH中重结晶产物，使用庚烷以引起固体形成。
LC-MS(UV，CLND，ELSD)：65/98/100(保留16％苯并噻唑加合物，tR＝5.05min)：tR＝6.48min，(M+H)+507。
步骤10-6.片段偶合。向10-6(1.94g，3.8mmol，1.0当量)和10-7(如步骤10-9中所述的合成，1.24g，4.6mmol，1.2当量)在DMF(20mL)中的混合物加入HATU(175g，4.6mmol，1.2当量)和DIPEA(4.0ml，23mmol，5当量)。在N2下在室温搅拌混合物16h，然后在减压下蒸发溶剂。将残余物吸收入水(20mL)，调节pH至8-9并以EtOAc(2x20mL)和DCM(2x20mL)萃取产物。将THF加入至合并的有机层以溶解悬着的固体，在MgSO4上干燥混合物并在减压下浓缩。以快速色谱法(梯度，EtOAc∶己烷，40∶60至60∶40)纯化产物以提供为微黄色油的10-8(1.5g，52％)。重复反应提供产率高至73.6％的粗品。
LC-MS(UV，CLND，ELSD)：90.7/100/98.7；tR＝11.33min；(M+H)+761。
步骤10-7.脱保护。向10-8(1.5g，2.0mmol)加入TFA(70mL)、DCM(30mL)和Et3SiH(3mL)的混合物。在室温搅拌混合物2h，然后在减压下浓缩。以DCM蒸发两次，然后真空干燥。在步骤X-8中大环化之前，将粗制残余物10-9与THF(2x)共沸。
步骤10-8.大环化。向上述粗制10-9的THF(100mL)溶液加入DEPBT(1.2g，4.0mmol，2当量)和DIPEA(4.2mL，24mmol，6当量)并在N2下在室温搅拌混合物16-86h。除去THF并以快速色谱法(100％EtOAc)纯化产物以提供为白色泡沫的化合物552(0.80g，对两步骤68.3％)。以通过硅胶垫代替快速色谱法来修改上述程序，获得类似产率(70.9％)和纯度(89.3/91.1/100，UV，CLND，ELSD)。
LC-MS(UV，CLND，ELSD)：92.9/100/98.6；tR＝5.84min；(M+H)+586。
步骤10-9.盐酸盐形成。将化合物552溶解于乙腈(60mg.mL)，加入1.5当量0.5M盐酸(水溶液)以立即形成固体沉淀。过滤收集固体并以乙腈洗涤。所得的化合物552的盐酸盐可从95％EtOH重结晶一次或多次，使用庚烷以引起固体形成。
步骤10-10.二肽氢解
Figure A20078003349401451
将二肽10-10(由标准方法从Cbz-Val-OH和H-Nva-OtBu形成，2.4g，6.0mmol)和10％Pd/C(50％湿，0.5g)在95％EtOH(150mL)中的混合物在Parr仪器中在30psi氢下摇动。6h后，TLC指示反应结束。过滤混合物通过充分填充的(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)塞并以乙醇洗涤，然后在减压下浓缩合并的滤液和洗涤液以提供10-7，其纯度足够用于上述步骤10-6。
1H NMR：与结构一致
LC-MS：tR＝5.86min；(M+H)+272。
实施例11
合成代表性化合物556的标准程序(图10)
A.)AA 1 -拴系物片段合成
步骤11-1.在装备有Dean-Stark仪器的圆底烧瓶中，在甲苯(1L)中悬浮H-(D)Phe(3F)-OH(11-1，35.6g，194mmol，1.0当量)。加入对甲苯磺酸(44.3g，233mmol，1.2当量)、苄基醇(101mL，970mmol，5.0当量)，回流搅拌混合物16-18小时。冷却混合物至室温，形成白色沉淀。以MTBE(500mL)稀释沉淀，过滤并以MTBE(3x500mL)研碎。在高度真空下干燥固体16-18h以提供为白色固体的甲苯磺酸盐(85.1g，98.6％)。
将甲苯磺酸盐(85.1g)吸收入1M Na2CO3水溶液(210mL)。以EtOAc(4x150mL)萃取碱性水相，然后以盐水(1x100mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤，在减压下浓缩并在高度真空下干燥以提供为澄清油的游离氨基酯11-2(49.5g，95％)。
步骤11-2.向新鲜游离碱化的11-2(49.5g，181mmol，1.0当量)的DCM(90mL)溶液加入三乙胺(27.8mL，616mmol，1.1当量)、吡啶(49.8mL，616mmol，3.4当量)和Bts-Cl(84.7g，363mmol，2.0当量)。在室温搅拌反应O/N，此期间溶液变为橙色。以DCM(100mL)稀释反应混合物，顺序地以柠檬酸盐缓冲液(2x)和盐水(1x)洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法[梯度，己烷∶EtOAc(8∶2)至己烷∶EtOAc(7∶3)]纯化残余的油以提供为微黄色固体的Bts保护的氨基酯11-3(63.4g，74.4％)。
TLC[己烷∶EtOAc(1∶1)]：Rf＝0.30(UV，CMA)。
步骤11-3.将Boc-T38(R)拴系物(11-4，10.0g，32.4mmol，1.5当量)、三苯基膦(8.5g，32.4mmol，1.5当量)和Bts-(D)Phe(3F)-OBn(11-3，10.2g，21.6mmol，1.0当量)溶解于无水THF(108mL)。在冰-水浴中冷却溶液至0℃并逐滴加入偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD，6.2mL，31.3mmol，1.45当量)。加入后，在0℃搅拌混合物1h，然后缓慢升温至室温并在氮下搅拌16-18h。在减压下除去THF并以快速色谱法[梯度，己烷/EtOAc(9∶1)至己烷/EtOAc(75∶25)]纯化粗制残余物以提供为淡黄色固体的烃基化氨基酸酯11-5(15.1g，91％)。
TLC[己烷∶EtOAc(1∶1)]：Rf＝0.67(UV，CMA)。
步骤11-4.向烃基化氨基酸11-5(14.0g，18.4mmol，1.0当量)的DMF(74mL)的溶液加入碳酸钠(9.8g，92.0mmol，5.0当量)，接着加入2-巯基乙醇(6.5mL，92.0mmol，5.0当量)。在室温搅拌混合物16-18h。反应由HPLC[(Grad_A4)：9.69min(产物)，15.37min(起始材料)]监控。加入水(150mL)并以EtOAc(3x75mL)萃取水相。以盐水(1x100mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以干燥填充的硅胶色谱[己烷∶EtOAc(8∶2)]纯化粗制残余物以提供为黄色油的去苯并噻唑-2-磺酰化的氨基酸酯11-6(7.95g，76％)。反应后由LC-MS确定确保苯并噻唑：巯基乙醇加合物无剩余是很重要的。已知该副产物抑制随后的氢解反应。
步骤11-5.在氮氛下向圆底烧瓶装入10％Pd/C(50％湿，785mg，10％重量)和95％EtOH(70mL)，接着装入氨基酸酯11-6(7.85g，13.9mmol，1.0当量)的95％EtOH(70mL)溶液。使用气体分散管在氢吹入下搅拌混合物4h。2h后形成沉淀。加入EtOAc(100mL)以获得搅拌的悬浮液。以氮清洗反应混合物10min以除去多余的氢，过滤通过
Figure A20078003349401471
(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)垫并以EtOAc和MeOH洗涤直到不再洗脱出材料。在减压下蒸发溶剂并在高度真空下干燥所得的固体以提供为白色固体的氨基酸11-7(6.2g，94％)。
TLC[己烷/EtOAc(1∶1)]：Rf＝基线(UV，CMA)；
LC-MS(Grad_A4)：7.04min。
B.)AA 2 -AA 3 -二肽合成
步骤11-6.将市售的H-Leu-OBn甲苯磺酸盐(11-8，6.1g)吸收入1MNa2CO3水溶液(50mL)。以EtOAc(4x50mL)萃取碱性水相并以盐水(1x580mL)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤，在减压下浓缩并真空下干燥4-6h以提供为淡黄色油的游离氨基酯11-9(3.44g，100％)。
步骤11-7.将新鲜游离碱化的H-Leu-OBn(11-9，3.44g，15.5mmol，1.0当量)和Boc-(D)Val-OH(11-10，3.54g，16.3mmol，1.05当量)溶解于无水THF∶CH2Cl2(1∶1，81mL)。加入6-Cl-HOBt(2.63g，15.5mmol，1.0当量)和DIPEA(14.2mL，81.5mmol，5.0当量)。在冰-水浴中冷却混合物至0℃并加入EDC(3.28g，17.1mmol，1.1当量)。在0℃搅拌混合物1小时，允许升温至室温并搅拌16-18h。在真空下蒸发溶剂并将残余物溶解于EtOAc(100mL)。顺序地以柠檬酸盐缓冲液(1M，pH 3.5)(2x50mL)、水(1x50mL)、饱和NaHCO3水溶液(2x50mL)和盐水(1x50mL)洗涤有机相。有机相在MgSO4上干燥，过滤，在减压下浓缩并在高度真空下干燥16-18h以提供为淡黄色固体的粗制二肽(6.6g，＞100％粗制)。
TLC[己烷/EtOAc(1∶1)]：Rf＝0.40(UV，CMA)。
将粗制二肽(6.6g，15.7mmol，1.0当量)溶解于3.3M的HCl/EtOAc溶液(由在0℃吹入气态HCl至EtOAc而制备，43.6mL，157mmol，10当量)。在室温搅拌混合物1h，形成白色沉淀。过滤沉淀并以EtOAc(1x50mL)和MTBE(1x50mL)洗涤，然后真空下干燥16-18h以提供为白色固体的盐酸盐11-11(4.38g，对2步骤79％)。
TLC[己烷：EtOAc(1∶1)]：Rf＝基线(UV，水合茚三酮)；
LC-MS(Grad_A4)：6.59min。
C.)大环合成
步骤11-8.在0℃向11-7(750mg，1.58mmol，1.0当量)和11-11(591g，1.66mmol，1.05当量)的无水THF.DCM(1∶1，10.5mL)溶液加入DIPEA(1.4mL，7.9mmol，5.0当量)，接着加入HATU(631mg，1.66mmol，1.05当量)。在0℃搅拌混合物1h，允许升温至室温并在氮下搅拌16-18h。在减压下除去溶剂，并将残余物溶解于EtOAc(50mL)。以柠檬酸盐缓冲液(1M，pH 3.5，2x25mL)、饱和NaHCO3水溶液(2x25mL)和盐水(1x25mL)洗涤有机相。在MgSO4上干燥有机相，过滤，然后在减压下浓缩。以快速色谱法[梯度，己烷∶EtOAc(75∶25)至己烷∶EtOAc(6∶4)]纯化粗制残余物以提供期望的受保护的烃基化三肽11-12(988mg，81％)，为淡黄色胶质固体。
TLC[己烷/EtOAc(1∶1)]：Rf＝0.43(UV，CMA)。
步骤11-9.在氮氛下向圆底烧瓶装入Pd/C 10％(50％湿，208mg，10％重量)和95％EtOH(5mL)，接着装入苄基酯X-12(1.04g，1.34mmol，1.0当量)的95％EtOH(8.4mL)溶液。在氢吹入下搅拌混合物4h。2-3h后反应混合物变得很浓，加入THF以溶解悬浮液。以氮清洗混合物5min以除去多余的氢，过滤通过
Figure A20078003349401481
(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)垫并以THF洗涤直到不再洗脱出材料。在减压下蒸发溶剂并在高度真空下干燥所得的固体以提供为白色固体的酸11-13(911mg，100％)。
TLC：[己烷/EtOAc(1∶1)]：Rf＝基线(UV，CMA)。
步骤11-10.将Boc保护的烃基化三肽11-13(911mg，1.33mmol，1.0当量)溶解于TFA/TES/DCM(33/3/64，3.0mL，12.9mmol，9.8当量)。在室温搅拌混合物30min并在减压下蒸发。将油状残余物与THF共蒸发两次，然后在高度真空下干燥16-18h以提供为淡黄色胶质固体的大环前体11-14(1.27g，＞100％)。
TLC：[EtOAc∶MeOH(9∶1)]：Rf＝基线(UV，水合茚三酮)。
步骤11-11.向大环前体11-14[1.27g，1.33mmol(基于氢解后获得的量)，1.0当量)的无水THF(53.6mL，对25mM溶液)溶液加入DIPEA(1.17mL，6.79mmol，5.0当量)和DEPBT(440mg，1.47mmol，1.1当量)。在室温搅拌混合物16-18h。在减压下蒸发THF并将残余物吸收入1MNa2CO3∶EtOAc(1∶1，50mL)。以盐水(2x25mL)洗涤分离的碱性水相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下蒸发。以快速色谱法[梯度，100％EtOAc至EtOAc∶MeOH(98∶2)]纯化粗制残余物以提供为淡黄色固体的大环556(617mg，81％)。
TLC[EtOAc/MeOH(9∶1)]：Rf＝0.45(UV，CMA)；
LC/MS(Grad_B4)：10.88min。
实施例12
合成咪唑啉基和二氢嘧啶碱基大环的标准程序
Figure A20078003349401491
该合成是基于文献中为引入该官能性的合成方法(St Laurent，D.R.等Bioorg.Med.Chem.1995，3，1145)。向伯胺大环12-1(0.030mmol)的15mL无水THF的溶液加入硫醚试剂12-A或12-B(0.30mmol，10当量，65mg)，接着加入Et3N(0.60mmol，20当量，0.083mL)。在氮下回流搅拌混合物16h，然后在减压下蒸发至干燥。两种情形下LC-MS分析都指示Boc-保护的(12-2)和Boc-脱保护的(12-3)大环产物的混合物。Boc-脱保护的产物由MS-触发的反相HPLC从混合物分离。或者是，可以EtOAc中的HCl处理混合物以在纯化前裂解Boc基团。对代表性大环519(12-3，m＝1)和521(12-3，m＝2)施用该一般程序。
实施例13
合成胍基(Guanidinyl)大环的标准程序
Figure A20078003349401501
向完全脱保护的大环13-1(7.0mg，12.9μmol，1.0当量)的无水THF(1.5mL)溶液加入Et3N(18μL，129μmol，10当量)，接着加入胍基化(guanidylation)试剂13-A(10.1mg，25.8μmol，2.0当量)。(Fechtinger，K.；Zapf，C；Sings，H.L.；Goodman，M.J.Org.Chem.1998，63，3804.)。在氮氛下在室温搅拌混合物O/N。在减压下蒸发溶剂并以快速色谱法[梯度，MeOH/DCM(1∶99)至(5∶95)]纯化粗制残余物以提供13-2。蒸发期望的级分后，在20mL小瓶中将TFA/Et3SiH/DCM(50/3/47，2mL)溶液加入至双Boc保护的大环产物13-2。在室温搅拌混合物2h，然后在减压下浓缩以提供期望的TFA盐形式的胍类似物13-3。以反相HPLC纯化粗制产物。
TLC[MeOH∶DCM(1∶9)]：Rf＝0.57(UV，CMA)。
实施例14
合成氰基胍基大环的标准程序
对代表性大环522例示一般程序。向大环14-1(0.01mmol)的EtOH(3mL)的溶液加入三乙胺(0.1mmol，10当量)和试剂14-A。在55℃搅拌混合物16h，然后在减压下浓缩。使用ISCO(Teledyne Isco，Inc.，Lincoln，NE，USA)纯化产物，然后直接进行下一步骤。将中间产物硫醚溶解于7N的NH3/MeOH，然后在压力瓶中在55℃搅拌16h。蒸发溶剂并使残余物经受制备型HPLC以提供氰基胍大环522。
实施例15
合成Boc-AA5的标准程序(图11)
步骤15-1.(Panda，G.；Rao，N.V.Synlett 2004，714.)。在室温向搅拌的Boc-L-Ser-OH(15-1，5.0g，24.5mmol，1.0当量)的160mL无水DMF悬浮液加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，4.25mL，24.5mmol，1.0当量)。向混合物加入HBTU(9.30g，24.5mmol，1.0当量)并在室温剧烈搅拌反应5-10min，然后在冰-水浴中冷却，加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(2.65g，27mmol，1.1当量)接着加入N，N-二异丙基乙胺(4.70mL，27mmol，1.1当量)。搅拌混合物1h，然后除去冰浴并在室温搅拌反应O/N。将反应混合物冷却至0℃并缓慢加入饱和NaHCO3水溶液(200mL)。以乙酸乙酯(4x200mL)萃取反应混合物。以盐水洗涤合并的有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(100％EtOAc)纯化粗制残余物以提供为无色固体的15-2(5.50g，90％)。
TLC(100％EtOAc)：Rf＝0.40(水合茚三酮)。
步骤15-2.在N2下向醇15-2(5.0g，20mmol，1当量)和三乙胺(5.60mL，40.3mmol，2当量)在100mL无水二氯甲烷中的混合物逐滴加入新蒸馏的甲磺酰氯(2.35mL，30mmol，1.5当量)持续5min。允许反应体系升温至室温并搅拌3h。顺序地以冷水、1M柠檬酸盐缓冲液、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤混合物。在硫酸镁上干燥有机层并在减压下浓缩以提供15-3(98％合并的产率)，其足以用于下一步骤。该化合物应在制备的同一天使用。
步骤15-3.在氩氛下向15-3(5.0g，15.3mmol，1当量)的60ml无水DMF溶液加入叠氮化钠(3.0g，46mmol，3当量)并在50℃搅拌混合物12h。(小心！处理这种量的NaN3应非常小心)。将反应混合物冷却至0℃并非常缓慢地加入水(100mL)。以乙酸乙酯(3x100mL)萃取反应混合物。以盐水(2x200mL)洗涤合并的有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(己烷∶EtOAc，1∶1)纯化油状残余物以提供为无色固体的Boc-AA5(3.35g，80％)。
TLC[己烷∶EtOAc(1∶1)]：Rf＝0.5(水合茚三酮)；
1H NMR(CDCl3，)：δ1.42(s，9H)，3.21(s，3H)，3.45-3.55(m，2H)，3.75(s，3H)，4.80(m，1H)，5.50(br s，1H)；
LC-MS：tR＝5.66min；[M+H]+：275。
实施例16
Boc保护大环的标准程序
在室温向537(1g，1.66mmol，1当量)的THF∶水(1∶1，10mL)溶液加入Boc2O(1.08g，4.97mmol，1当量)和K2CO3(0.352g，3.33mmol，2当量)。在室温搅拌混合物72h。以乙酸乙酯萃取溶液，然后以盐水洗涤有机层，在硫酸镁上干燥并在减压下浓缩至干燥。以快速柱色谱法(乙酸乙酯∶己烷，1∶1)纯化所得的残余物以提供受保护的大环Boc-537(75％产率)。
实施例17
从叠氮大环形成胺大环的标准程序
Figure A20078003349401531
537(Y＝CF3，R1＝H，R2＝H)                    17-2(Y＝CF3，R1＝H，R2＝H)
538(Y＝F，R1＝Me，R2＝H)                     17-13(Y＝F，R1＝Me，R2＝H)
545(Y＝F，R1＝Me，R2＝Me)                    17-20(Y＝F，R1＝Me，R2＝Me)
在室温向大环(537，由实施例9的一般程序合成，1.0g，1.65mmol，1当量)的THF(10mL)溶液加入三苯基膦(0.440g，1.65mmol，1当量)和1ml水。在40℃搅拌混合物以反应过夜。在减压下浓缩反应混合物至干燥并以乙酸乙酯萃取水相(3次)，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。以快速柱色谱法在硅胶(乙酸乙酯∶甲醇，9∶1)上纯化残余物以提供17-2(90％产率)。类似地，对化合物538(也由实施例9的一般程序合成，0.940g，1.65mmol，1当量)进行该程序提供17-13(90％产率)，对化合物545(也由实施例9的一般程序合成，0.960g，1.65mmol，1当量)进行该程序提供17-20(90％产率)。
这种氨基大环也可使用实施例9以适当保护的Dap衍生物组装或图7所示的固相程序来合成。
实施例18
合成包含吗啉的大环的标准程序
Figure A20078003349401532
对代表性大环525例示该程序。在室温向大环17-2(50mg，86.5μmol，1当量)的乙腈/原甲酸三甲酯(TMOF，2mL/0.5mL)溶液加入戊二醛(35μl，86.5μmol，1当量)、NaBH3CN(8.10mg，0.13mmol，1当量)和1滴乙酸。在室温搅拌混合物O/N。将溶液冷却至0℃，缓慢加入1mL NaOH溶液(25％)。搅拌反应5min。以乙酸乙酯(3x)萃取水相，然后以盐水洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(100％EtOAc)纯化残余物以提供525(50％产率)。
使用实施例18的标准程序从17-13合成化合物534，50％产率。
实施例19
合成包含吡咯的大环的标准程序
Figure A20078003349401541
在室温向大环17-2(50mg，86.5μmol，1当量)的乙腈/TMOF(2mL/0.5mL)溶液加入1，4-丁二醛(7.5mg，86.5μmol，1当量)和1滴乙酸。在室温搅拌混合物O/N。冷却溶液至0℃，缓慢加入1mL 25％NaOH溶液。搅拌反应5min，然后以乙酸乙酯(3x)萃取水相。以盐水洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速柱色谱法(100％EtOAc)纯化所得的残余物以提供大环19-1(50％产率)。
使用实施例19的标准程序从17-13合成化合物540，对3个步骤序列的总产率为50％。
实施例20
合成包含吡咯烷的大环的标准程序
Figure A20078003349401542
在室温向大环19-1(50mg，86.5μmol，1当量)的95％乙醇(2mL)溶液加入PtO2(10mg，20％重)和1滴乙酸。使用气瓶在氢氛下在室温搅拌混合物O/N。将PtO2过滤通过
Figure A20078003349401543
(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)并以乙醇洗涤。在减压下除去所有溶剂。以HPLC纯化所得的残余物以提供20-1(98％产率)。
实施例21
合成包含5-甲基-三唑的大环的标准程序
Figure A20078003349401551
对代表性大环526例示该程序，它以文献中对该官能团的程序为基础(Rostovstev，V.；Green，L.K.；Fokin，V.V.；Sharpless，K.B.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2002，41，2596和引用的文献)。在室温向大环537(100mg，0.165mmol，1当量)、CuI(3.4mg，0.0165mmol，0.1当量)和DIPEA(30μL，0.165mmol，1当量)的乙腈/甲醇(2mL/0.5mL)溶液。将反应体系冷却至-78℃并向溶液吹入过量的丙烯气体(超过10当量)，密封烧瓶。在室温搅拌混合物O/N。将反应体系冷却至0℃，缓慢释放丙烯，并通过(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)过滤出Cu，以乙腈洗涤。在减压下除去所有溶剂。以快速色谱法(乙酸乙酯∶甲醇，95∶05)纯化所得的残余物以提供526(76％产率)。
实施例22
合成包含4，5-二甲基-三唑的大环的标准程序
Figure A20078003349401553
对代表性大环528例示该程序。在室温向537(100mg，0.165mmol，1当量)的甲苯(1mL)溶液加入2-丁炔(3mL，过量)并密封烧瓶。在140℃搅拌混合物48h。将反应体系冷却至0℃，缓慢释放2-丁炔并在减压下除去所有溶剂。以快速色谱法(100％乙酸乙酯)纯化残余物以提供528(65％产率)。
实施例23
合成包含5-甲基-四唑的大环的标准程序
对代表性大环527例示该程序。在室温向537(100mg，0.165mmol，1当量)的DMSO(1mL)溶液加入ZnBr2(37mg，0.165mmol，1当量)、乙腈(5mL，过量)。在140℃搅拌混合物48h。冷却反应体系至室温，然后在减压下除去溶剂。在硅胶上以快速色谱法(100％乙酸乙酯)纯化所得的残余物以提供527(35％产率)。
实施例24
合成包含4-氨基甲基-三唑的大环的标准程序
对代表性大环523例示该程序。向537溶液(100mg，0.165mmol，1当量)加入Boc-丙炔胺(28mg，0.184mmol，1.1当量)、DIPEA(30μL，0.165mmol，1当量)和CuI(3.4mg，0.0165mmol，0.1当量)的乙腈/甲醇(2mL/0.5mL)溶液并在室温搅拌O/N。在减压下除去溶剂并以快速色谱法(乙酸乙酯∶甲醇，95∶05)纯化所得的残余物以提供24-1(80％产率)。
以2mL HCl/二噁烷(4N，0.79mmol，20当量)处理24-1并在室温搅拌混合物1h。在减压下浓缩反应混合物至干燥以提供523(98％产率)。
实施例25
合成包含单甲氨基的大环的标准程序
Figure A20078003349401571
步骤25-1.在室温向17-2(1.0g，1.73mmol，1当量)的DCM(10mL)溶液加入Bts-Cl(0.41g，1.73mmol，1当量)和三乙胺(0.175g，1.73mmol，1当量)。在室温搅拌混合物O/N。以0.1N盐酸洗涤反应混合物，在硫酸镁上干燥并在减压下浓缩至干燥。以快速色谱法(EtOAc∶己烷，1∶1)纯化所得的残余物以提供25-1(95％产率)。
步骤25-2.在室温向25-1(50mg，64.5μmol，1当量)的THF(10mL)溶液加入甲醇(26μL，0.645mmol，10当量)、预形成的三苯基膦-DIAD加合物(如实施例38中所述的合成，32mg，0.071mmol，1.1当量)。在室温搅拌混合物O/N。在减压下浓缩反应混合物至干燥。以快速色谱法(乙酸乙酯∶己烷，1∶1)纯化残余物以提供25-2(98％产率)。
步骤25-3.在室温将25-2(50mg)溶解于乙醇∶THF(1∶1，2mL)，以苯硫酚树脂(1g)处理并在定轨摇动器上搅动2h。滤去树脂并以乙醇∶THF洗涤数次。在减压下除去滤液和洗涤液，将粗制残余物经受HPLC纯化以提供25-3(50％产率)。
使用实施例25的标准程序从17-20合成化合物546，对3个步骤序列～44％总产率。
使用实施例25的标准程序从17-13合成化合物548，对3个步骤序列40％总产率。
包含单甲氨基的大环也可使用构件Boc-AA4以如图7所示的固相方法或如实施例9中所述的液相程序合成。
实施例26
合成包含嘧啶的大环的标准程序
Figure A20078003349401581
对代表性大环524例示该程序。在室温向17-2(0.10g，0.173mmol，1当量)的DMF(1.7mL)溶液加入2-溴代嘧啶(0.136g，0.865mmol，5当量)和K2CO3(60mg，0.432mmol，2.5当量)。在70℃搅拌混合物O/N，然后冷却至室温。以10mL乙酸乙酯稀释反应混合物，以0.1N盐酸和盐水洗涤，然后在硫酸镁上干燥并在减压下浓缩至干燥。以快速色谱法(乙酸乙酯∶己烷，1∶1)纯化所得的残余物以提供524(96％产率)。
使用实施例26的标准程序从17-13合成化合物535，产率96％。
使用实施例26的标准程序从X-13合成化合物550，产率80％。
实施例27
合成包含二甲基氨基的大环的标准程序(图12A)
步骤27-1.在室温向27-1(从包含游离仲胺和受保护的伯胺的相应大环合成，类似于步骤11-2中所述的以Bts-Cl处理，接着在标准条件下脱Boc保护，3.3g，3.63mmol，1当量)的TFA(50mL，0.653mol，180当量)溶液加入聚苯乙烯(PS)磺酰胺树脂(Argonaut Technologies，现在是Biotage AB的一部分，Uppsala，Sweden，1.1mmol/g，，16.8g，18.2mmol，5当量)。在70℃搅拌混合物2h。滤去树脂并以TFA和DCM洗涤数次。在减压下除去滤液和洗涤液。以快速色谱法(100％乙酸乙酯)纯化所得的残余物以提供27-2(70％产率)。
步骤27-2.在室温向27-2(12g，1.55mmol，1当量)的乙腈/TMOF(6mL/2mL)溶液加入甲醛(0.426ml，15.5mmol，10当量)、NaBH3CN(97mg，15.5mmol，10当量)和1滴乙酸。在室温搅拌反应2h。将溶液冷却至0℃，然后缓慢加入1mL 25％NaOH溶液，搅拌反应5min。以乙酸乙酯(3x)萃取水相，以盐水洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(乙酸乙酯∶甲醇，95∶5)纯化所得的残余物以提供27-3(75％产率)。
步骤27-3.在室温向27-3(1.33g，1.66mmol，1当量)的DMF(10mL)溶液加入巯基丙酸(0.9g，8.30mmol，5当量)和K2CO3(1.15g，8.30mmol，5当量)。在室温搅拌混合物12h。以乙酸乙酯和水稀释反应混合物，然后以乙酸乙酯萃取。以盐水洗涤合并的有机层，在硫酸镁上干燥并在减压下浓缩至干燥。以快速色谱法(乙酸乙酯∶甲醇，9∶1)纯化所得的残余物以提供27-4(80％产率)。
实施例28
合成包含二甲基氨基的大环的其它标准程序(图12B)
步骤28-1.在室温向538(0.200g，0.352mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液加入三氟乙酸酐(TFAA，122μL，0.882mmol，2.5当量)和三乙胺(TEA，250μL，1.76mmol，5当量)。在0℃搅拌反应1h。然后以10mL二氯甲烷稀释混合物并以0.1N盐酸和盐水洗涤，在硫酸镁上干燥并在减压下浓缩至干燥。以快速色谱法(乙酸乙酯∶己烷，1∶1)纯化残余物以提供28-1(35％产率)。
步骤28-2.在室温向28-1(66mg，0.0994mmol，1当量)的乙酸乙酯(5mL)溶液加入Pd/C(15mg，20％重量)和1滴乙酸。使用气瓶在氢氛下在室温搅拌混合物O/N。将Pd/C过滤通过(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)并以乙酸乙酯洗涤。在减压下除去滤液和洗涤液以提供28-2。
步骤28-3.在室温将粗制28-2溶解于乙腈/TMOF(6mL/2mL)并加入甲醛(22μL，0.0995mmol，3当量)、NaBH3CN(6.15mg，0.0298mmol，2当量)和1滴乙酸。在室温搅拌混合物2h。将溶液冷却至0℃并缓慢加入1mL 25％NaOH溶液，搅拌混合物5min。以乙酸乙酯(3x)萃取水相，以盐水洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。在室温将残余物直接溶解于甲醇(5mL)，加入K2CO3(15mg)并在室温搅拌混合物1h。将溶液冷却至0℃并缓慢加入1mL 0.1N盐酸溶液，搅拌混合物5min。以乙酸乙酯(3x)萃取水相，以盐水洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制残余物经受HPLC纯化以提供549(＜5mg)。
实施例29
包含AA1的本发明化合物的标准脱保护程序
Figure A20078003349401601
在室温向29-1(36mg，1当量)的TFA(10mL，180当量)溶液加入聚苯乙烯(PS)磺酰胺树脂(Argonaut Technologies，现在是Biotage AB的一部分，Uppsala，Sweden，1.1mmol/g，0.5g，5当量)。在70℃搅拌混合物2h。滤去树脂并以TFA和DCM洗涤数次。在减压下除去滤液和洗涤液。以快速色谱法(100％乙酸乙酯)纯化所得的残余物以提供509(50％)。
实施例30
合成支链磺酰胺的标准程序
Figure A20078003349401602
对合成化合物576例示该程序。向Bts保护的大环30-1(50mg，67.6μmol，1.0当量)的无水DCM(4mL)溶液加入Et3N(188μL，1.35mmol，20当量)接着加入DMAP(1.6mg，13.5μmol，0.2当量)。在冰-水浴中冷却混合物至0℃并加入MsCl(105μL，1.35mmol，20当量)。在0℃搅拌混合物1h，升温至室温并在氮氛下搅拌O/N。在减压下蒸发溶剂并在THF∶95％EtOH(1∶1)的溶液中使用结合苯硫酚的聚合物(1g新制备树脂)从30-2除去Bts保护基团，持续2h。在减压下过滤和蒸发溶剂提供粗制576，其由反相HPLC纯化。
TLC[MeOH∶DCM(5∶95)]：Rf＝0.24(UV，CMA)。
实施例31
合成支链甲酰胺的标准程序
对合成化合物577例示该程序。向Bts保护的大环31-1(从包含游离仲胺和受保护的伯胺的相应大环合成，类似于步骤11-2中所述的以Bts-Cl处理，接着在标准条件下脱Boc保护，40mg，54.0μmol，1.0当量)的无水DCM(3.5mL)溶液加入Et3N(150μL，1.08mmol，20当量)接着加入DMAP(1.3mg，10.8μmol，0.2当量)。在冰-水浴中将混合物冷却至0℃，然后加入TMS异氰酸酯(143μL，1.08mmol，20当量)。在0℃搅拌混合物1h，升温至室温并在氮氛下搅拌O/N。由HPLC-MS监控反应。在减压下蒸发溶剂并以快速色谱法[梯度，DCM至MeOH∶DCM(1∶9)]纯化粗制残余物。蒸发合并的包含产物的级分后，在THF∶95％EtOH(1∶1)的溶液中使用结合苯硫酚的聚合物(1g新制备树脂)从31-2除去Bts保护基团，持续2h。在减压下过滤和蒸发溶剂提供粗制577，其由反相HPLC纯化。
实施例32
合成支链烃基胺的标准程序
Figure A20078003349401621
对合成代表性化合物581例示该程序。向32-1(60mg，81.1μmol，1.0当量)的TMOF∶MeCN(1∶1，5mL)溶液加入丙酮(148μL，2.02mmol，25当量)接着加入NaBH3CN(126mg，2.02mmol，25当量)和冰乙酸(11.6μL，202.8umol，2.5当量)。在氮氛下在室温搅拌混合物O/N。然后加入氢氧化钠溶液(1M)直到pH 10-12，并以DCM(3x)萃取所得的水相。以盐水洗涤合并的有机相一次，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下蒸发以提供粗制32-2，其由反相HPLC纯化。如对实施例31所述的除去Bts基团。该程序中使用其它脂肪族醛和酮代替丙酮产生其它类似的烃基化胺产物。
实施例33
合成包含脒基的大环的标准程序
Figure A20078003349401622
33-1(n＝1)                                        33-3(n＝1，R＝Bts)
33-2(n＝2)                                        33-4(n＝2，R＝Bts)
                                                  506(n＝1，R＝H)
                                                  518(n＝2，R＝H)
对合成代表性化合物506例示该程序，并也适用于从33-2开始合成代表性化合物518。在0℃将腈33-1(根据图7所示程序以合适氨基酸构件从固相合成获得，218mg粗制)溶解于1.25M的HCl/EtOH(25mL)溶液，并将气态HCl吹入溶液30min。然后在室温搅拌混合物2h。在减压下蒸发溶液，然后在高度真空下干燥。将粗制残余物溶解于2M的氨/乙醇溶液(25m1)并在室温搅拌混合物O/N。在减压下蒸发溶液并以反相HPLC纯化以提供33-3(17.4mg)。如对实施例3 1所述的除去Bts基团。
实施例34
合成拴系物Boc-T94(R)的标准程序(图14)
步骤34-1.3-(2-(R)羟基乙基-1-氧基)-2-溴代吡啶[T94-2(R)]。在氮氛下在室温将2-溴代-3-吡啶酚T94-1(2.0g，12mmol，1当量)溶解于DMF(无水，50mL)。加入碳酸钾(1.6g，12mmol，1当量)和(R)-碳酸甲酯(1mL，12mmol，1当量)并剧烈搅拌混合物15min。然后使用油浴将反应体系加热至85℃达72h。向混合物加入100mL水，并以乙酸乙酯(5x100mL)萃取水层。以盐水(200mL)洗涤合并的有机层并在MgSO4上干燥。在减压下浓缩有机层。将所得的残余物经受快速色谱法(100％乙酸乙酯)以获得淡黄色油状的T94-2(R)(2.12g，76％)。
TLC(100％乙酸乙酯)：Rf：0.55(UV，CMA)
步骤34-2.3-(2-(R)羟基乙基-1-氧基)-2-(1-叔丁氧基羰基氨基-丙-2-炔-3-基)吡啶[T94-3(R)]。将T94-2(R)(1g，4.3mmol，1当量)和Boc-丙炔胺衍生物(1.1g，6.46mmol，1.5当量)溶解于Et3N(经CaH2蒸馏)：DMF(1∶3，15mL)且通过向溶液吹入氩气将反应混合物脱气。加入反式-二氯代-双(三苯基膦)钯(II)(91mg，3mol％，0.13mmol)和新重结晶的碘化铜(I)(28.5mg，0.15mmol，3.5mol％)，将混合物升温至50℃并搅拌O/N。在减压下(油泵真空)除去溶剂并以快速色谱法(100％乙酸乙酯)纯化所得的残余物以获得淡褐色固体的T94-3(R)(1.12g，85％)。
TLC(100％乙酸乙酯)：Rf：0.33(UV，CMA)
步骤34-3.3-(2-(R)羟基乙基-1-氧基)-2-(1-叔丁氧基羰基氨基丙-3-基)吡啶[Boc-T94(R)]。将炔化合物T94-3(R)(5.0g，16mmol)溶解于EtOH(80mL)，然后加入PtO2(4mol％，150mg)并在氢氛下(使用充满氢的气瓶)搅拌混合物O/N。这阶段后，将反应混合物过滤通过(WorldMinerals Inc.，Santa Barbara，CA)垫，以THF洗涤，然后在减压下浓缩合并的滤液和洗涤液以提供相对纯(以1H NMR)但仍有色的Boc-T94(R)样品，定量产率。使该材料经受快速色谱法(100％乙酸乙酯)可实现进一步纯化。产物Boc-T94(R)与起始材料具有相同Rf，因此1H NMR是区分它们的最好方式。
TLC(100％乙酸乙酯)：Rf：0.33(UV，CMA)
1H NMR(CDCl3)：δ1.30(d，3H)，1.4(s，9H)，1.90(m，2H)，2.80(m，2H)，3.15(m，2H)，3.80-3.90(m，2H)，4.150(m，1H)，5,01(m，1H)，7.10(m，2H)，8.01(sb，1H).
13C NMR(CDCl3)：δ19.69，28.62，29.77，40.25，66.07，73,62，76.90，77.32，79.18，118.21，122.19，128.80，132.49，140.74，151.63，153.08，156.41.
注意T94(R)用于制备具有(S)-立构中心的式I化合物。类似地，T94(S)用于合成具有(R)-立构中心的式I化合物。
实施例35
合成拴系物Boc-T95(R)的标准程序(图15)
该顺序是基于文献中报道的反应方法。(Lin，N.Bioorg.Med.Chem.Lett 1998，8，249-254；Swindell，C.Heterocycles 1986，24，3373-3377；Shimano，Masanao，Tetrahedron Lett 1998，39，4363-4366；Snieckus，V.J.Org.Chem.1985，50，5436-5438.)
步骤35-1.将3-羟基吡啶(T95-1，14.0g，0.147mmol)的THF/DMF(315mL/315mL)溶液冷却至0℃，然后分批加入叔丁醇钾(24.7g，221mmol)。搅拌混合物5min，然后逐滴加入MOM-Cl(13.0mL，162mmol)持续10min。加入氯化铵饱和水溶液并在减压下除去THF。然后以Et2O(3x)萃取水相。在MgSO4上干燥合并的有机相，过滤并在减压下浓缩。所获得的粗制T95-2(橙色油)用于下一步骤。
步骤35-2.将T95-2(6.0g，43mmol)和TMEDA(7.8mL，52mmol)的THF(175mL)溶液冷却至-78℃并用机械搅拌器搅动。逐滴加入nBuLi(己烷中1.56M，31.4mL，49mmol)。形成粘的橙色稠浆并随时间溶解。搅拌溶液1h然后加入I2(14.2g，56mmol)，在-78℃再搅拌溶液1h然后升温至室温O/N。加入水至反应体系并在减压下除去THF。以Et2O(3x)萃取水相。合并有机相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(梯度，8/2EtOAc/己烷至6/4EtOAc/己烷)纯化所得的残余物以提供7.0g(68％)微黄色固体的T95-3。
步骤35-3.在室温向T95-3(6.5g，24.6mmol)的DCM(49mL)溶液加入TFA(49mL)。在室温搅拌混合物2h。在减压下除去溶剂并在相同条件下以相同试剂再处理1小时。通过对处理过的小份反应液的1HNMR光谱监控反应。加入碳酸氢钠饱和水溶液并以EtOAc(3x)萃取水相。在MgSO4上干燥合并的有机相，过滤并在减压下浓缩以提供5.1g(94％)为微黄色固体的T95-4，其原样用于下一步骤。
步骤35-4.向3-羟基-4-碘代吡啶(5.09g，23.0mmol)的DMF(95mL)溶液加入(R)-碳酸丙烯酯(T95-A，2.35g，23.0mmol))和碳酸钾(3.18g，23.0mmol)。在85℃搅拌溶液72h。加入水并以EtOAc(3x)萃取水相。以盐水(1x)和水(1x)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(100％EtOAc)纯化所得的残余物以提供1.4g(24％)T95-4(R)。
步骤35-5.以氩气对碘化物T95-4(R)(1.27g，4.56mmol)和Boc-丙炔胺(1.06g，6.83mmol)的CH3CN/TEA(13.2mL/5.4mL)溶液脱气5min，然后加入Pd(Cl)2(PPh3)2(95mg)和CuI(25mg)。在50℃加热溶液O/N。在减压下除去溶剂并以快速色谱法(100％EtOAc)纯化所得的残余物以提供1.23g(89％)的T95-5(R)。
步骤35-6.向T95-5(R)(935mg，3.05mmol)的95％EtOH(20mL)溶液加入PtO2(28mg，0.122mmol)。以氢饱和该溶液(将H2气体吹入反应混合物2h)，然后在氢氛下搅拌O/N。将混合物过滤通过
Figure A20078003349401651
(WorldMinerals Inc.，Santa Barbara，CA)，以EtOAc、然后以MeOH洗涤数次。在减压下浓缩滤液，如此获得的残余物适合用于构建本发明大环化合物而无需任何进一步纯化(见实施例37)。
LC-MS(Grad B4)：tR＝4.83min
注意T95(R)用于制备具有(S)-立构中心的式I化合物，如实施例37中进一步描述的。类似地，T95(S)用于合成具有(R)-立构中心的式I化合物。
实施例36
合成拴系物Boc-T96(R)的标准程序(图16)
该顺序是基于文献中报道的反应方法。(Meana，A.Synlett 2003，1678-1682；Canibano，V.Synthesis 2001，2175-2179.)
步骤36-1.在室温向4-羟基吡啶(T96-1，7.0g，74mmol)的CCl4(360mL)溶液加入NBS(26.2g，0.147mol)。在黑暗中搅拌溶液24h(覆盖铝箔)。在减压下浓缩混合物并依次以MeOH和丙酮研碎所得的残余物，以提供18.9g(1 00％)的T96-2。
步骤36-2.在-90℃向T96-2(8.0g，31.3mmol)的THF(307mL)的溶液缓慢加入n-BuLi (己烷中1.15M，71mL)溶液。搅拌混合物40min，然后加入水(10当量)并将混合物升温至室温。在减压下除去溶剂并以快速色谱法(丙酮∶MeOH，10∶1)纯化所得的残余物以提供3.22 g(60％)的T96-3。
步骤36-3.将T96-3(3.22g，18.4mmol)、PPh3(4.82g，18.4mmol)和(R)-甘油的单-PMB醚(T96-A，使用标准方法从相应二醇合成，1.8g，9.2mmol)溶解于THF(14mL)。冷却混合物至0℃，然后逐滴加入DIAD(3.5mL，17.9mmol)并保持温度在0℃。在0℃搅拌溶液1h，然后在室温O/N。在减压下浓缩混合物并以快速色谱法(50/50 EtOAc/己烷)纯化残余物以产生T96-4(R)(42％)。
步骤36-4.向T96-4(R)(1.25g，3.56mmol)的DIPEA(20mL)溶液加入Boc-丙炔胺并以氩气对混合物脱气10min。然后加入三苯基膦(121mg)、CuI(29mg)和Pd(Cl)2PPH3(160mg)。在70℃搅拌溶液O/N。在减压下浓缩反应混合物并以快速色谱法(梯度，40％至90％EtOAc/己烷)纯化所得的残余物以提供1.3g(80％)的T96-5(R)。
步骤36-5.将Pd/C(10％，50％湿，628mg)加入至T96-5(R)(900mg)和AcOH(1.5当量)的95％EtOH(20mL)溶液。以1300psi的H2饱和该溶液。将混合物过滤通过(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)并以EtOAc、然后以MeOH洗涤数次。在减压下浓缩合并的滤液和洗涤液，获得的粗制Boc-T96(R)用于合成本发明的大环化合物而不经任何进一步纯化。
1H NMR(CDCl3)：δ1.4(d，CH3)，1.5(s，Boc)，1.8(t，CH2)，2.6(t，CH2)，3.15(t，CH2)，4.0(m，2xCH)，4.3(m，1H)，4.98(1H，NH)，6.8(d，1H 芳族)，8.3(d，1H)，8.4(s，1H芳族).
注意T96(R)用于制备具有(S)-立构中心的式I化合物。类似地，T96(S)用于合成具有(R)-立构中心的式I化合物。
实施例37
合成化合物565的标准程序(图17)
步骤37-1.将Boc-T95(R)(901mg，2.90mmol)、三苯基膦(762mg，2.90mmol)和Bts-(D)Phe(3F)-OBn(976mg，2.07mmol)溶解于无水THF(10mL)。将溶液在冰-水浴中冷却至0℃并逐滴加入偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD，551μL)。完成加入后，在0℃搅拌混合物1h，然后缓慢升温至室温并在氮下再搅拌16-18h。在减压下除去THF并以快速色谱法(梯度，50/50 EtOAc/己烷至80/20 EtOAc/己烷)纯化获得的粗制残余物以提供858mg的37-1。该步骤的产率通常为80-90％。
步骤37-2.向烃基化氨基酸37-1(778mg，1.02mmol)的DMF(6mL)溶液加入碳酸钠(519mg，5当量)，接着加入2-巯基乙醇(346μL，5当量)。在室温搅拌混合物16-18小时。加入水并以EtOAc(3x)萃取水相。以盐水(1x)洗涤合并的有机相，在MgSO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(梯度6/3 EtOAc/己烷至100％EtOAc)纯化粗制残余物以提供552mg的37-2(96％)。
步骤37-3.将Pd/C(10％，50％湿，628mg)小心地加入至37-2(502mg，0.888mmol)和AcOH(2滴)的95％EtOH(6mL)溶液。以氢饱和该溶液(将H2气体吹入反应混合物2h)，然后在H2氛下搅拌O/N。将混合物过滤通过
Figure A20078003349401671
(World Minerals Inc.，Santa Barbara，CA)并以EtOAc、然后以MeOH洗涤数次。在减压下浓缩滤液，如此获得的粗制37-3(94％)用于下一步骤而不经任何进一步纯化。
步骤37-4.在0℃向氨基酸两性离子37-3(293mg，0.617mmol)和H-D-Val-Nva-OBn盐酸盐(422mg，1.23mmol)的无水THF(3.0mL)溶液加入DIPEA(1.1mL，6.17mmol)，接着加入HATU(469mg，1.23mmol)。在氮下搅拌混合物16-18h。在减压下除去溶剂并将所得的残余物溶解于EtOAc。顺序地以柠檬酸盐缓冲液(1M，pH 3.5，2x)、碳酸氢钠饱和水溶液(2x)和盐水(2x)洗涤有机相。在MgSO4上干燥有机相，过滤并在减压下浓缩。如此获得的残余物以快速色谱法(80/20 EtOAc/己烷)纯化以提供290mg的37-4(62％)。
步骤37-5.将Pd/C(10％，50％湿，28mg)加入至37-4(284mg，0.373mmol)的95％EtOH(4mL)溶液。以氢饱和该溶液(将H2气体吹入反应混合物2h)，然后在H2氛下搅拌O/N。将混合物过滤通过
Figure A20078003349401672
(WorldMinerals Inc.，Santa Barbara，CA)并以EtOAc、然后以MeOH洗涤数次。在减压下浓缩滤液，获得的256mg粗制37-5(100％)用于下一步骤而不经任何进一步纯化。
步骤37-6.将Boc保护的烃基化三肽37-5(256mg)溶解于TFA/TES/DCM(33/3/64，17mL)混合物。在室温搅拌反应1h，然后在减压下浓缩。所得的油状残余物与DCM(3x)、然后与THF(3x)共蒸发并在减压下干燥以提供大环前体37-6。
步骤37-7.向37-6(0.380mmol)的无水THF(33mL)溶液加入DIPEA(330μL，5当量)和DEPBT(136mg，1.2当量)。在室温搅拌混合物16-18h。在减压下蒸发THF，将残余物吸收入EtOAc并以盐水(2x)洗涤。在MgSO4上干燥有机溶液，过滤并在减压下浓缩。以快速色谱法(95/5DCM/MeOH)纯化获得的粗制残余物以提供大环565(65％)。
LC/MS(Grad_B4)：tR＝5.26min。
实施例38
合成PPh3-DIAD加合物
在0℃在氮下向充分搅拌的三苯基膦(1当量)的THF(0.4M)溶液逐滴加入偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD，1当量)。完成加入后，在0℃再搅拌混合物30min。过滤收集获得的白色固体(使用中等大小的多孔滤器)并以冷的无水THF洗涤直到洗涤液为无色。最后以无水Et2O洗涤白色沉淀一次。然后在真空下充分干燥加合物并在氮下储存。(在无水条件下储存该试剂很重要！)。该加合物可在Mitsunobu型反应中代替分别加入的各试剂使用。
实施例39
制备本发明化合物的代表性制剂
设计为增强药物溶解度的制剂通常导致口服生物利用度和临床效力都增加。最流行的方法是向惰性脂质媒介物中加入活性亲脂成分(Christopher J.H.Porter & al.Lipid and lipid-based formulation；optimizing the oral delivery of lipophilic drugs(脂质和基于脂质的制剂；优化亲脂药物的口服递送).Nat.Rev.Drug.Disc.2007，6，231-246；Aungst，B.J.Novel formulation strategies for improving oral bioavailability of drugswith poor membrane permeation or presystemic metabolism(改进膜渗透性差或体循环前代谢差的药物的口服生物利用度的新配制策略).J.Pharm.Sci 1993，82，979-987)，如油(Burcham，D.L.；Maurin，M.B.；Hausner，E.A.；Huang，S.M.Improved oral bioavailability of the hypocholesterolemicDMP 565 in dogs following oral dosing in oil and glycol solutions(以油和乙二醇溶液口服给药后降血胆固醇的DMP 565在犬的口服生物利用度改善).Biopharm.Drug Dispos.1997，75，737-742)、表面活性剂分散剂(Serajuddin，A.T.M.；Sheen，P.-C；Mufson，D.；Bernstein，D.F.；Augustine，M.A.Effect of vehicle amphiphilicity on the dissolution and bioavailabilityof a poorly water-soluble drug from solid dispersion(赋形剂的两亲性对水溶性差的药物从固态分散剂的溶出度和生物利用度的效应).J.Pharm.Sci.1988，77，414-417)、自乳化制剂(Charman，S.A.；Charman，W.N.；Rogge，M.C；Wilson，T.D.；Dutko，FJ.；Pouton，CW.Self-emulsifying drugdelivery systems：formulation and biopharmaceutical evaluation of aninvestigational lipophilic compound(自乳化药物递送系统：研究的亲脂化合物的配制和生物药物评价).Pharm.Res.1992，9，87-93；Craig，D.Q.M.；Lievens，H.S.R.；Pitt，K.G.；Storey，D.E.An investigation into thephysicochemical properties of self-emulsifying systems using low frequencydielectric spectroscopy，surface tension measurements and particle sizeanalysis(使用低频介电谱、表面张力测量和粒径分析研究自乳化系统的物理化学特征).Int.J.Pharm.1993，96，147-155；Shah，N.H.；Carvajal，M.T.；Patel，C.I；Infeld，M.H.；Malick，A.W.Self-emulsifying drug deliverysystems(SEDDS)with polyglycolysed glycerides for improving in vitrodissolution and oral absorption of lipophilic drugs(含有聚乙二醇化甘油酯以改善亲脂药物的体外溶出度和口服吸收的自乳化药物递送系统(SEDDS)).Int.J.Pharm.1994，106，15-23)和乳液剂(Palin，K.J.；Phillips，A.J.；Ning，A.The oral absorption of cefoxitin from oil and emulsionvehicles in rats(大鼠中头孢西丁从油和乳液赋形剂的口服吸收).Int.J.Pharm.1986，33，99-104；Kararli，T.T.；Needham，T.E.；Grifaen，M.；Schoenhard，G.；Ferro，L.J.；Alcorn，L.Oral delivery of a renin inhibitorcompound using emulsion foumulations(肾素抑制剂化合物使用乳液制剂的口服递送).Pharm.Res.1992，9，888-893)。
代表性制剂的药代动力学参数用本领域技术人员已知的确定的方法测定，如此前在方法3-I中提及的。本发明代表性化合物的代表性制剂的结果示于以下。
表14.化合物552的代表性制剂在大鼠中口服生物利用度
媒介物 水中5％HP-β-CD 水中5％HP-β-CD   Cremophor EL/Lysorbate 80/大豆油   油酸/Labrafil
  给药途径   IV   口服   口服   口服
  n(大鼠)   3   3   3   3
  剂量(mg/kg)   2   8   8   8
  给药体积(mL/kg)   4   16   1   1
  给药溶液浓度(mg/mL)   0.5   0.5   8   8
  t1/2(min)   45±13   -   -   -
  Cmax(ng/mL)   1719±299   369±97   229±162   143±77
  Tmax(min)   5   5/15   15/30   30/60
  清除率(mL/min/kg)   55±10   -   -   -
AUCinf(ng.min/mL)   36977±6980 15291±6811 23806±2141   21412±10039
  F(％)(单独结果)   - 6，15，9 18，15，16 7，21，15
  F(％)(平均)   -   10±5   16±1   14±7
CD＝环糊精
上述是本发明的说明，并不应解释为对其的限制。本发明由如下的权利要求所限定，并包括权利要求的等同物。

Claims (40)

1.一种下式I的化合物和其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：
Figure A2007800334940002C1
其中：
Y是
其中(L5)和(L6)分别表示结合式I的L5和L6的键；
Ar选自以下基团：
Figure A2007800334940002C3
R1选自低级烃基和环烃基；
R2选自低级烃基、取代的低级烃基、环烃基和取代的环烃基；
R3、R4、R5和R6独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R7选自氢、低级烃基、羟基和氨基；
R10a和R10b独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
X1、X2、X6、X7、X8和X9独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
X3、X4和X5独立地选自氢、羟基、烃氧基、卤素、三氟甲基和低级烃基；
L1、L2、L3和L4独立地选自CH和N；前提是环中氮的总数必须是0、1、2或3；且
L5和L6独立地选自O、CR8aR8b和NR9；其中R8a和R8b独立地选自氢和低级烃基；且R9选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Ar选自以下基团：
Figure A2007800334940003C1
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R1选自甲基、乙基、异丙基和环丙基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R2选自(CH2)mCH3、(CH2)n1R11、CH2N3、(CH2)n2NR12R13、(CH2)n3C(＝NR14)NR15R16、(CH2)n4NR17C(＝NR18)NR19R20和(CH2)n5NHC(＝O)NR21R22，其中m是0、1、2或3；n1、n2、n3、n4和n5独立地为1、2、3或4；R11、R13、R16、R17、R20、R21和R22独立地选自氢和低级烃基；R12、R15和R19独立地选自氢、低级烃基、羧烃基、羧芳基和磺酰基；R14和R18独立地选自氢、低级烃基、羧烃基、羧芳基、磺酰基和氰基。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中R2选自以下基团：
Figure A2007800334940004C1
其中M选自CH2、O、NH和NCH3。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中L1、L2、L3和L4各为CH，L5为O，且L6为CH2。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R3、R4、R5和R6各为氢；或R3为甲基且R4、R5和R6各为氢；或R3为羟甲基且R4、R5和R6各为氢；或R3、R4和R6各为氢且R5为甲基；或R3和R5各为甲基且R4和R6各为氢。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中Y是：
Figure A2007800334940004C2
其中(L5)和(L6)分别表示结合L5和L6的键。
9.根据权利要求1所述的化合物，其具有下述结构：
Figure A2007800334940005C1
Figure A2007800334940006C1
Figure A2007800334940007C1
Figure A2007800334940008C1
Figure A2007800334940009C1
Figure A2007800334940010C1
Figure A2007800334940011C1
Figure A2007800334940012C1
Figure A2007800334940013C1
或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物。
10.一种具有如下结构的化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物：
其中R25选自氢、烃基、芳基、环烃基、杂环和杂芳基；R26选自氢、烃基、芳基、酰基、羧烃基、羧芳基、磺酰基和用于氨基酸的标准保护基团；R27选自氢和烃基；且R28选自以下基团
Figure A2007800334940014C2
其中M选自CH2、O、NH和NCH3。
11.一种具有如下结构的化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物：
Figure A2007800334940014C3
其中X10和X11独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
R40、R41、R42和R43独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R44选自氢、烃基、酰基、羧烃基、羧芳基、磺酰基和用于胺官能团的标准保护基团；
R45选自氢和烃基；
R46选自氢、烃基、酰基、磺酰基和用于羟基官能团的标准保护基团；
L11、L12、L13和L14独立地选自CH和N；前提是环中氮的总数必须是0、1、2或3；且
L15和L16独立地选自O、CR47R48和NR49；其中R47和R48独立地选自氢和低级烃基；且R49选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
12.根据权利要求11所述的化合物，其具有如下结构：
Figure A2007800334940015C1
或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物，
其中PG1选自氢和用于胺官能团的保护基团，并且PG2选自氢和用于羟基官能团的保护基团。
13.一种大环化合物，其包括：
(a)构件结构；和
(b)根据权利要求1所述的式I的化合物。
14.一种使用权利要求11所述的化合物合成式I化合物的方法。
15.一种药物组合物，其包括：
(a)根据权利要求1所述的式(I)的化合物；和
(b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
16.一种药物组合物，其包括：
(a)根据权利要求9所述的化合物；和
(b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
17.一种药物组合物，其包括：
(a)根据权利要求13所述的化合物；和
(b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
18.一种抑制胃肠能动性的方法，该方法包括向患有胃肠运动过度或高胃动素血症造成的一种或多种病症的受治疗者施用有效量的式I化合物和其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：
其中：
Y是
Figure A2007800334940016C2
其中(L5)和(L6)分别表示结合式I的L5和L6的键；
Ar选自以下基团：
Figure A2007800334940017C1
R1选自低级烃基和环烃基；
R2选自低级烃基、取代的低级烃基、环烃基和取代的环烃基；
R3、R4、R5和R6独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R7选自氢、低级烃基、羟基和氨基；
R10a和R10b独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
X1、X2、X6、X7、X8和X9独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
X3、X4和X5独立地选自氢、羟基、烃氧基、卤素、三氟甲基和低级烃基；
L1、L2、L3和L4独立地选自CH和N；前提是环中氮的总数必须是0、1、2或3；且
L5和L6独立地选自O、CR8aR8b和NR9；其中R8a和R8b独立地选自氢和低级烃基；且R9选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述化合物具有下述任何一种结构：
Figure A2007800334940018C1
Figure A2007800334940019C1
Figure A2007800334940020C1
Figure A2007800334940022C1
Figure A2007800334940024C1
Figure A2007800334940025C1
或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物口服施用。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物胃肠外施用。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述受治疗者是人类。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物与用于抑制胃肠能动性的其它药剂共施用。
25.根据权利要求18所述的方法，其中胃肠病症选自腹泻、癌症治疗相关的腹泻、癌症引起的腹泻、化疗引起的腹泻、放射性小肠炎、放射引起的腹泻、应激引起的腹泻、慢性腹泻、AIDS相关的腹泻、艰难梭菌相关的腹泻、旅行腹泻、移植物抗宿主病引起的腹泻、消化不良、肠易激综合征、化疗引起的恶心和呕吐(呕吐)和手术后恶心和呕吐以及功能性胃肠病症。
26.一种治疗受治疗者与异常胃吸收或肠吸收相关的病症的方法，该方法包括施用治疗有效量的式I化合物和其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：
Figure A2007800334940027C1
其中：
Y是
Figure A2007800334940027C2
其中(L5)和(L6)分别表示结合式I的L5和L6的键；
Ar选自以下基团：
Figure A2007800334940028C1
R1选自低级烃基和环烃基；
R2选自低级烃基、取代的低级烃基、环烃基和取代的环烃基；
R3、R4、R5和R6独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R7选自氢、低级烃基、羟基和氨基；
R10a和R10b独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
X1、X2、X6、X7、X8和X9独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
X3、X4和X5独立地选自氢、羟基、烃氧基、卤素、三氟甲基和低级烃基；
L1、L2、L3和L4独立地选自CH和N；前提是环中氮原子的总数必须是0、1、2或3；且
L5和L6独立地选自O、CR8aR8b和NR9；其中R8a和R8b独立地选自氢和低级烃基；且R9选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述化合物具有下述任何一种结构：
Figure A2007800334940029C1
Figure A2007800334940030C1
Figure A2007800334940031C1
Figure A2007800334940032C1
Figure A2007800334940033C1
Figure A2007800334940035C1
Figure A2007800334940036C1
Figure A2007800334940037C1
或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述病症是短肠综合征或乳糜泻。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述病症是恶病质。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述病症是癌症相关的恶病质、AIDS相关的恶病质或肾病相关的恶病质。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。
32.根据权利要求26所述的方法，其中所述受治疗者是人类。
33.根据权利要求26所述的方法，其中所述受治疗者接受调节胃吸收或肠吸收的其它化合物治疗。
34.一种治疗受治疗者与胃肠道炎症相关的病症的方法，该方法包括施用治疗有效量的式I化合物和其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：
Figure A2007800334940038C1
其中：
Y是
Figure A2007800334940038C2
其中(L5)和(L6)分别表示结合式I的L5和L6的键；
Ar选自以下基团：
R1选自低级烃基和环烃基；
R2选自低级烃基、取代的低级烃基、环烃基和取代的环烃基；
R3、R4、R5和R6独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
R7选自氢、低级烃基、羟基和氨基；
R10a和R10b独立地选自氢、低级烃基和取代的低级烃基；
X1、X2、X6、X7、X8和X9独立地选自氢、卤素、三氟甲基和低级烃基；
X3、X4和X5独立地选自氢、羟基、烃氧基、卤素、三氟甲基和低级烃基；
L1、L2、L3和L4独立地选自CH和N；前提是环中氮原子的总数必须是0、1、2或3；且
L5和L6独立地选自O、CR8aR8b和NR9；其中R8a和R8b独立地选自氢和低级烃基；且R9选自氢、低级烃基、甲酰基、酰基和磺酰基。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述化合物具有下述任何一种结构：
Figure A2007800334940040C1
Figure A2007800334940041C1
Figure A2007800334940042C1
Figure A2007800334940043C1
Figure A2007800334940044C1
Figure A2007800334940046C1
Figure A2007800334940048C1
或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或立体化学混合物。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述病症位于胃或肠中。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述病症是炎性肠病、溃疡性结肠炎、Crohn病或胰腺炎。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述受治疗者是人类。
40.根据权利要求34所述的方法，其中所述受治疗者接受调节炎症的其它化合物治疗。
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