CN101518541A - 甘草苷芹糖制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甘草苷芹糖在制备镇咳、平喘和祛痰药物和保健品中的应用。甘草苷芹糖单独或与其它活性组份或辅料配合制成。经过对甘草苷芹糖制剂的主要药效学的评价，证实甘草苷芹糖有较强的平喘、镇咳和祛痰药效，可以改善急、慢性咳嗽、痰多和喘息症状。本发明的甘草苷芹糖制剂可制成任何一种适于临床上使用的剂型，如胶囊剂、片剂、口服液体剂等。甘草苷芹糖来源于天然植物，原料来源丰富，制剂成本低，药物毒副作用小，疗效显著。本发明为临床治疗急、慢性咳嗽、痰多和喘息症状提供优选天然药物。

Description

甘草苷芹糖制剂的应用

技术领域

本发明属药物用途，涉及甘草苷芹糖制剂的用途，具体涉及甘草苷芹糖在制备治疗镇咳、祛痰和平喘药物中的应用。

背景技术

随着全球经济的发展，工业与民用污染源不断增加，加之环境治理不力等因素，呼吸系统疾病的发病率呈明显上升趋势，其引起的死亡率也逐年上升。不过，这也给生产呼吸系统疾病药物的企业创造了更广阔的市场空间。咳嗽、痰多和喘息是呼吸系统疾病的主要症状，应用镇咳、祛痰和平喘药是对症治疗的重要手段。合理应用镇咳药不仅可以减轻病人的痛苦，并可防止并发症的发生和原发疾病的进一步恶化。在中国药品市场中，镇咳、祛痰和平喘药每年的市场份额约为300亿元。因此，从中药中寻找和提取镇咳、祛痰和平喘药具有良好的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘草苷芹糖在制备治疗镇咳、平喘和祛痰药物中的应用。所述制备以甘草苷芹糖单独或与其它活性组份或辅料配合制成，制剂中以1000粒计，含甘草苷芹糖30克。初步的药理实验证实本发明的甘草苷芹糖可以改善急、慢性咳嗽、痰多和喘息症状。

本发明通过2种动物镇咳试验模型，枸橼酸引起的豚鼠咳嗽模型和辣椒素引起的小鼠咳嗽模型。证明了甘草苷芹糖抑制枸橼酸引起的豚鼠咳嗽反应和辣椒素引起的小鼠咳嗽反应，提示甘草苷芹糖具有很强的镇咳作用；通过2种动物祛痰试验模型，小鼠气道酚红排泄模型和蛙上腭和食道纤毛运动模型。证明了甘草苷芹糖促进小鼠气道酚红排泄，增强蛙上腭和食道纤毛运动，提示甘草苷芹糖具有很强的祛痰作用；通过3种离体豚鼠气管平滑肌试验方法，证明了甘草苷芹糖可直接松弛离体豚鼠气管平滑肌，呈量效关系松弛CCH引起离体豚鼠气管平滑肌收缩反应，抑制CCH收缩的趋势，提示甘草苷芹糖具有很强的平喘作用。

本发明所述甘草苷芹糖的英文名：liquiritin apioside，分子式：C₂₆H₃₀O₁₃，分子量：550，结构式：

本发明是以甘草苷芹糖为主要活性成分，单独或加入常规的赋形剂、调味剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适于临床上使用的剂型，如胶囊剂、片剂、口服液体剂等。

本发明的另一个目的是提供甘草苷芹糖在制备改善咳嗽、痰多和喘息症状的保健食品中的应用。甘草苷芹糖来源于天然植物，因此，可以将甘草苷芹糖制成保健食品，用于咳嗽、痰多和喘息症状的改善。

甘草苷芹糖(Liquiritin apioside)是从甘草总黄酮中分离纯化获得的一个天然药物，属于二氢黄酮类。至今为止尚未见有它制备成药品和治疗任何疾病或症状的报道。我们从甘草总黄酮中分离纯化，经四大图谱(红外、紫外、质谱、核磁共振)检测，证明它为甘草苷芹糖，分离纯化的程度达到了99％以上。通过对甘草苷芹糖主要药效学的评价，证实了甘草苷芹糖具有平喘、镇咳和祛痰药效，且证实其药效明显强于甘草黄酮，作用强度是甘草黄酮10倍以上。本发明提供的甘草苷芹糖来源于天然植物，原料来源丰富，制备成本低，药物毒副作用小，适于实用，为临床治疗急、慢性咳嗽、痰多和喘息症状提供优选天然药物。

附图说明

图1是制剂处方组成筛选溶出度曲线。

图2是甘草苷芹糖吸湿性曲线。

图3是甘草苷芹糖胶囊制剂制备工艺流程图。

图4是甘草苷芹糖片对离体豚鼠气管平滑肌直接松弛作用。

图5是甘草苷芹糖片对CCH引起离体豚鼠气管平滑肌收缩的解痉作用。

图6是甘草苷芹糖片对CCH引起豚鼠离体气管平滑肌的抑制作用。

图7是甘草苷芹糖片对CCH引起豚鼠离体气管平滑肌的解痉作用。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一、甘草苷芹糖胶囊处方及制备工艺

1处方

2 处方依据及处方的筛选过程

2.1 处方依据

根据药效学试验制订甘草苷芹糖胶囊，规格：甘草苷芹糖含量30mg/粒。

淀粉本方中为玉米淀粉，色泽好，吸湿性弱，产量大，价格低；为白色细微粉末，不溶于水和乙醇，在空气中很稳定，与大多数药物不起作用，吸湿而不潮解，遇水膨胀，为最为广泛的稀释剂和崩解剂，本方中主要用作稀释剂崩解剂。

羟丙基纤维素(L-HPC)本品为白色或白色或结晶性粉末，在水中不溶但可吸水溶胀，由于L-HPC粉末有很大的比表面积和孔隙率，故有较大的吸湿速度和吸水量，增加了膨胀性。本品用量，一般可为1％-5％左右，本方中用量为2％。

微粉硅胶，本品为轻质的白色粉末，无臭无味，不溶于水及酸，化学性质稳定，与绝大多数药物不发生反应，良好的流动性，对药物有较大的吸附力，亲水性能强，有利于药物的吸收，本品用量一般仅为0.15％-3％，因为主药甘草苷芹糖流动性差，本方中用于改善颗粒的流动性，用量为1.5％。

硬脂酸镁为白色粉末，细腻轻松，有良好的附着性，颗粒混合后分布均匀而不易分离，仅少量即可显示出良好的润滑作用，一般用量为0.3％-1％，本方中用量为0.5％。

2.2 处方的筛选过程：

设计以下三个处方(1000粒)规格：30mg/粒表1-1

按照以上三个处方试制样品，并进行以上处方筛选试验。

(1)、进行溶出度试验

①、测定方法

按中国药典2000年版第二部甘草苷芹糖胶囊溶出度测定法(附录XC第二法)操作，以0.1mol/L醋酸盐缓冲液(取无水醋酸钠82g加水7500ml，用冰醋酸pH值至5.0，加水使成10000ml)为溶剂，转速为每分钟50转，依法操作，按时取溶液经0.8μm微孔滤膜滤过，取续滤液在482nm处测定吸收度，计算溶出百分率。

②、溶出度测定结果

分别取供试品，按测定方法测定溶出度，取样时间5，10，15，20，25，30，45，60min，结果见表1-1

1-2 三个处方溶出度测定结果

根据上表对应的溶出度结果见表1-3及图1。

表1-3 溶出度测定结果(n＝6 X±S)

结果表明：处方3在20分钟溶出度可达到86.8％，30分钟溶出度几乎达到最大。处方1、处方2在20分钟吸光度仅有60分钟的60％，30分钟时溶出度为85％。根据中国药典在30分钟时溶出度达到80％，它们都符合药典要求。

由此可见，处方3中低取代羟丙基纤维素(L-HPC)的用量仅为2％，溶出速率明显快于处方1、处方2，可见本方3中加入L-HPC之后，有助于胶囊的崩解而加快了主药甘草苷芹糖溶出。

(2)、休止角试验：

按处方1、2、3制成颗粒，经口径7cm的长颈漏斗流下，并呈圆锥形状，测其休止角，结果见表1-4

表1-4

可见处方2、3的休止角小于处方1，说明处方2、3的流动性好于处方1。

结论：微粉硅胶能显著改善颗粒的流动性能。

综上所述，处方3的溶出度、流动性好于处方1、2，所以选定处方3。

3 生产工艺

3.1 制备方法

制法：称取处方量的甘草苷芹糖、淀粉、和L-HPC混合，过60目的筛三次，混合均匀；加入10％的淀粉浆适量制软材，用16目制粒，600C干燥，用16目整粒后，加入微粉硅胶、硬脂酸镁混合均匀，用0号胶囊制成1000粒。

3.2 工艺条件的筛选

按处方进行试制1000粒样品。

3.2.1 堆密度试验

将试制的颗粒装入100ml量筒中，以一定的高度落下两次，(每次保持条件一致，松紧适宜，称其重量计算其堆密度，结果见表2-1

表2-1 堆密度试验数据(n＝3)

因此，根据以上数据可知，颗粒平均堆密度是0.46g/ml，每粒装量要求为30m，所以选择5号胶囊。

3.2.2 吸湿性试验

考察环境湿度对胶囊填充过程中影响程度，为此测定了颗粒的吸湿性。

称取颗粒12份，每份约2g，精密称定，将其置于不同相对湿度环境下放置7天，测其重量变化，结果见表2-2及图2吸湿曲线。

表2-2 吸湿性测定数据表(n＝2)

相对湿度在40-90％条件下颗粒重量基本没有变化，吸湿性没有明显增加。因此，可确定该品种的相对湿度要求不严格，在一般的生产环境下可以生产。不会因为水分对药物性质及稳定性造成影响。

4 工艺流程参见图3。

二、甘草苷芹糖缓释放片处方及制备工艺

1 制剂处方组成

1.1 每1000片含下列物质

甘草苷芹糖                          30g

硬脂酸                              40g

HMPC                                200g

聚乙烯吡咯烷酮(K30)                 80g

30％丙烯酸树脂IV号                  适量

1.2 包衣液处方

(Y-1-7000)                          60g(类白色)

乙醇                                1000ml

2.制备工艺

2.1 粘合剂的配制

精密称取丙烯酸树脂IV号适量，用95％乙醇配制成浓度为30％的溶液，备用。

2.2 片芯的制备

取处方量主药甘草苷芹糖与辅料硬脂酸、HMPC、聚乙烯吡咯烷酮充分混匀后过60目筛，加入30％丙烯酸树脂IV号适量，制成干湿适中的软材，24目筛制粒，50℃烘干30分钟，24目筛整粒，测定颗粒含量合格后，压片即得。

2.3 包衣

2.3.1 包衣的依据

甘草苷芹糖缓释片为薄膜衣片，同时考虑到美观等因素，本品制成薄膜衣片。

2.3.2 包衣液的配制

称取(Y-1-7000)适量，缓缓加入70％的乙醇溶液中，配制成6％的包衣液，在磁力搅拌器上不停地搅拌，直至完全溶解，即得。

2.3.3 取素片置包衣锅内，锅转速每分钟30～40转，锅内温度为40～50℃，不间断喷包衣液至素片上，直至均匀包上一层薄膜衣，干燥即得。

2.4 临界相对湿度的测定

在一定温度下，取按处方和工艺制得的颗粒适量，分别放置在不同的饱和盐溶液中，放置5天后，取出称重，以不同的饱和盐溶液的相对湿度作横坐标，颗粒在不同的饱和盐溶液中增重百分率作纵坐标，作曲线图，并作曲线的切线，所得两切线的交点为临界相对湿度，且从图得出临界相对湿度为74％。测定结果见下表3-1。

表3-1 临界相对湿度的测定

 

相对湿度	9％	32.5％	66％	75％	92.5％
						饱和盐溶液	H3PO4	CaCl2	NaNO2	NaCl	KNO3
颗粒重量(g)	0.0245	0.0939	0.2187	0.2868	0.9182
						增重百分率(％)	0.2350	0.9067	2.168	2.848	9.102

本品颗粒的临界相对湿度为74％(>50％)，说明本品颗粒在密封条件下不吸湿。

3.处方依据

3.1 剂量的确定

甘草苷芹糖缓释片其规格为30mg/片，本品临床上常规用量为每日30～90mg，在确定本品的剂量时，并考虑到方便病人服用，便于剂量调节，故确定为每片含甘草苷芹糖30mg。

3.2 处方筛选

3.2.1 辅料的干扰性试验

选择在333nm波长处无吸收干扰的辅料如HMPC、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、淀粉、甘露醇、硬脂酸、丙烯酸树脂等，按处方配比取一片量辅料，加入容器中照含量测定项下方法，测定定量溶液的吸收度，实验结果表明在333nm波长处辅料无吸收。

3.2.2 处方筛选过程

甘草苷芹糖可溶于水，为了使药物缓慢释放，有效血药浓度能维持较长时间，以达到较好的治疗目的，因此，我们制成甘草苷芹糖缓释片，为骨架型。目前国内常用的缓释材料有：聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素、硬脂酸、羟丙甲纤维素、丙烯酸树脂等。以每片含甘草苷芹糖30mg，采用上述控释材料中的一种或数种以及不同规格、不同用量组方，进行体外释放度试验，从十多个缓释处方中发现1、2号处方缓释效果较好，但2号处方体外释放度最好，且颗粒的可压性、流动性和处方的重现性均佳，故确定处方2为本缓释片处方。

处方筛选过程如下表：表3-2

 

处方号	处方组成(1000片量)	判断标准	结果
				1	甘草苷芹糖   30g硬脂酸       100gHMPC         150g丙烯酸树脂II 20g20％(K90)    适量	硬度：9kg休止角：26°外观：尚可释放度2小时：41.9％6小时74.5％12小时：98.5％	释放度略快，此处方不可行。
2	甘草苷芹糖   30g硬脂酸       40gHMPC         200g(K30)        80g丙烯酸树脂5 适量	硬度：：10kg休止角：25°外观：好释放度2小时：39.7％6小时66.2％12小时：87.1％	释放度好，可压性、流动性、外观等也好，本处方可行。
				3	甘草苷芹糖   30g丙烯酸树脂II 20g糊精         20g(K90)        20g硬脂酸       50g乙基纤维素   适量	硬度：：10kg休止角：27°外观：好释放度2小时：74.3％6小时93.5％12小时：未测	释放度太快。此处方不可行。

3.2.3 试制的三批样品检测结果

根据确定的处方和制备工艺，试制了三批样品，检测结果如下：

表3-3

 

批号	含量％	释放度％
			080904	98.79	2小时：40.56小时：63.912小时：85.3
080906	99.51	2小时：38.46小时：64.712小时：83.3
			080908	99.63	2小时：38.96小时：62.612小时：82.6

从三批试制样品检测结果表明：该品确定的处方和制备工艺可行。

3.2.4 以pH6.8的磷酸盐缓冲液作为本品的释放介质，方法采用转篮法(中国药典2000年版二部附录XC第一法)，转速为每分钟100转，取样点为1小时、3小时和10小时，据此我们重新测定了三批样品及进口片的释放度，结果如下：

表3-4

 

批号	释放度％
		080904	1小时：31.4   3小时：54.4   10小时：85.8
080906	1小时：32.1   3小时：54.4   10小时：85.9
		080908	1小时：32.1   3小时：54.1   10小时：84.1

从三批试制样品检测结果表明：该品确定的处方和制备工艺可行。

同时对试制的样品(080906)进行了影响因素试验(光照试验、高温试验、高湿试验)，方法与结果如下：

(1)光照试验

在室温条件下，本品去除外包装将样品平摊在平皿里，在4500lux光强度下放置5、10天后取样检测。结果见表4-1。

(2)高温试验

本品去除上市包装分别于60℃的烘箱中放置5、10天后取样检测。结果见表4-2。

(3)高湿试验

本品去除上市包装分别放入恒湿器皿中，于25℃、相对湿度92.5％敞口放置考核5、10天后取样检测。结果见表4-3。

表4-1 光照试验结果

*指片芯色泽，薄膜衣均无变化(下同)

表4-2.高温试验结果

表4-3.高湿度试验结果

4.各辅料在处方中的作用

4.1 A：具有疏水性，阻止药物的释放。

4.2 羟丙甲纤维素：为亲水性高分子纤维素材料，遇水形成凝胶，降低水向片内渗透的速率，延缓药物的释放，具有缓释作用。国内外已广泛用于缓控释制剂。

4.3 聚乙烯吡咯烷酮：为亲水性高分子材料，遇水形成凝胶，降低水向片内渗透的速率，延缓药物的释放，具有缓释作用。国内外已广泛用于缓控释制剂

4.4 丙烯酸类树脂：商品名为“Eudragit”，因其取代基不同分成各种型号，国外已广泛用来作为控缓释制剂的材料，也用作肠溶衣材料，本处方选择其作为粘合剂，利用其成膜性包裹药物，阻止药物在胃内释放速率。

4.5 B：为润滑剂。

4.6 Opadry：薄膜衣材料，主要成份为羟丙甲纤维素。

5.原辅料来源及质量标准

5.1 甘草苷芹糖：本实验室提取纯化，含量纯度为99％以上。

5.2 A：符合中国药典1995年版，上海延安油脂化工厂生产。

5.3 羟丙甲纤维素：符合美国药典(USP XXIII)，由上海Colorcon公司提供。

5.4 聚乙烯吡咯烷酮：符合美国药典，沈阳东北制药总厂生产。

5.5 丙烯酸树脂IV：符合中国药典1995年版，由连云港制碘厂生产。

5.6 B：符合中国药典1995年版，由上海葡萄糖厂生产。

5.7 Opadry：符合英国药典，由上海Colorcon公司提供。

三、药效学研究

参照国家食品药品监督管理局《新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学)》，设计了本实验方案。选用2种镇咳药实验动物模型、2种祛痰药实验动物模型和3种平喘试验方法，对甘草苷芹糖胶囊或片剂进行了平喘、镇咳和祛痰方面的研究。试验材料、方法和结果如下：

1.材料：

药品与试剂

(1)枸橼酸：上海化学试剂一厂，批号20070201，用蒸馏水配制成15％的浓度备用；

(2)磷酸可待因片：青海制药厂，批号20060615；蒸馏水配制成0.5mg/ml混悬液；

(3)Capsaicin(辣椒素)：Sigma Chemical Company，lot：123H78341，新鲜配制：称取Capsaicin 3mg，用10％乙醇1ml溶解，加10％吐温801ml，研磨后加水至100ml。

(4)地西泮注射液：江苏济川制药有限公司，批号：20060309；

(5)酚红试剂：上海化学试剂三厂；批号：20070615；精密称取酚红试剂2g，加生理盐水至80ml。由于酚红在生理盐水不能完全溶解，因此置超声波洗涤器内超声溶解30min，使酚红颗粒均匀，配制成0.25％酚红悬液。

(6)氢氧化钠：浙江萧山化学试剂厂，批号：20060726；

(7)carbamylcholine：Sigma Chemical Company，lot：0834

(8)异丙肾上腺素：上海信宜制药业有限公司，批号：20070212

(9)甘草苷芹糖胶囊或片剂：自制，批号：20080206；将甘草苷芹糖10粒胶囊或片剂的原料药加蒸馏水至100ml。整体试验剂量以mg/kg表示，离体试验以mol浓度。

动物：

(1)Hartley品系豚鼠，体重350-500g，雌雄不拘。(2)ICR品系小鼠，体重18～22g，雌雄各半。购于浙江大学实验动物中心，合格证号：220010014。所有的操作和实验流程均遵守《实验动物管理条例》。动物在实验前均自由进食和进水。(3)青蛙，体重25～45g，雌雄不拘。购于市场。

2、方法：

2.1、枸橼酸引起的豚鼠咳嗽试验

2.1.1 分组：共分5组，每组8～9只豚鼠，雌雄不拘。具体分组情况如下：

A.生理盐水对照组，以等量生理盐水灌胃给药

B.甘草苷芹糖 3mg/kg

C.甘草苷芹糖 10mg/kg

D.甘草苷芹糖 30mg/kg

E.可待因     10mg/kg

2.1.2 筛选豚鼠：用超声波雾化器气雾15％枸橼酸2min后，10min内咳嗽次数在10次以上的豚鼠作为实验豚鼠，弃去10次以下的豚鼠。24h后给豚鼠灌胃给药(ig)，进行药物镇咳试验。

2.1.3 给药剂量和容积：所有试验豚鼠均在枸橼酸引咳前30min给药1次。采用等容不等量灌胃给药(ig)。

2.1.4 实验步骤：将豚鼠放入20×10×10cm体积描记盒中，用高灵敏度压力换能器将豚鼠呼吸频率和容积信号输入微机Pclab生物信号采集系统，记录豚鼠咳嗽次数。豚鼠放入体积描记盒稳定1min后，用超声波雾化器气雾15％枸橼酸2min，计数自气雾开始10min内的咳嗽次数，每一次咳嗽均以听到豚鼠咳嗽声音和微机Pclab上见到的明显的咳嗽记录结合分析。

2.2、辣椒素诱导小鼠咳嗽试验

2.2.1 分组：ICR小鼠，体重25-30g，♀

各半。共分5组，每组动物数见表2，雌雄不拘。具体分组情况如下：

A.生理盐水对照组，以等量生理盐水灌胃给药

B.甘草苷芹糖 6mg/kg

C.甘草苷芹糖 20mg/kg

D.甘草苷芹糖 60mg/kg

E.可待因     20mg/kg

2.2.2 筛选小鼠：将小鼠放入特制的体积描记器中稳定1min后，用超声波雾化器气雾30μmol/L辣椒素溶液15sec，即刻描计3min内的咳嗽次数，3min内咳嗽次数在10次以上的小鼠作为实验小鼠，弃去10次以下的小鼠。24h后给小鼠灌胃给药(ig)，进行药物镇咳试验。

2.2.3 给药剂量和容积：所有试验小鼠均在枸橼酸引咳前30min给药1次。采用等容不等量ig。

2.2.4 实验步骤：辣椒素引咳前，每鼠ip地西泮0.5mg/只，以减少小鼠活动所引起的实验观察记录干扰。实验时将小鼠放入特制的体积描记器中稳定1min后，用超声波雾化器以1ml/min雾化30μmol/L辣椒素溶液15sec，用压力换能器将小鼠呼吸频率和容积信号传入微机Pclab生物信号采集处理系统，记录小鼠在3min内的咳嗽次数。每一次咳嗽均以听到小鼠咳嗽时张嘴表现和微机Pclab上见到的明显的咳嗽记录结合分析。

2.3、小鼠气道酚红分泌试验

2.3.1分组：共分6组，每组9～12只小鼠，雌雄各半。具体分组情况如下：

A.生理盐水对照组，以等量生理盐水灌胃给药

B.甘草苷芹糖 6mg/kg

C.甘草苷芹糖 20mg/kg

D.甘草苷芹糖 60mg/kg

E.甘草苷芹糖 120mg/kg

F.氨溴索     200mg/kg

2.3.2 给药剂量和容积：所有试验小鼠饥饿过夜，均在注射酚红前30min给药一次。采用等容不等量ig。

2.3.3 实验步骤：2.5％酚红置电磁搅拌器上边混合边注射，2.5％酚红0.2ml/10g体重ip，30min后脱臼处死动物，低温放置1h，待小鼠僵硬时解剖气管(避免分离气管时出血)，分离气管，取喉结下至肺门的主气管，每一气管放置一支5ml试管内，加生理盐水1.0ml，震荡洗涤30min后，加0.1ml 1mmol/L NaOH，混匀后150g离心10min，取上清液于酶标仪(BIO-TEK，ELX800，USA)520nm测定含量。标准曲线绘制：取12.5μg/ml酚红倍比稀释成5个浓度：0.78、1.56、3.13、6.25、12.5μg/ml浓度酚红液在酶标仪520nm测得的A值绘制标准曲线。

2.4、蛙上腭和食道粘膜纤毛运动试验

2.4.1 分组：

A.生理盐水对照组，以等量生理盐水加入

B.甘草苷芹糖1×10^-9～1×10^-6mol/L4个浓度

C.阳性对照药乙酰胆碱组1×10^-10～1×10^-7mol/L4个浓度

2.4.2 实验步骤：将毁脑和脊髓后的蛙固定于板上，分离口腔上腭至食道末端的粘膜，取2.5×1.5cm粘膜平贴于板上，加以固定，定时以任氏液湿润粘膜表面。每只试验的蛙食道粘膜均先用活性炭(半粒芝麻大小)测定一次2cm长度的运动时间，作为粘膜标本的筛选，剔除运动时间<80sec、>150sec的标本。筛选合格的粘膜标本以含受试药物的任氏液湿润，用同样大小的活性炭粒再测定一次运动2cm长度的运动时间作为用药后所需要的运动时间。

2.5、豚鼠离体气管平滑肌收缩和松弛试验：

2.5.1 分组：Hartley豚鼠，

♀兼用，体重361±20g

A.生理盐水对照组，以等量生理盐水加入

B.甘草苷芹糖1×10^-7～1×10^-4mol/L5个浓度

C.阳性对照药麻黄碱组1×10^-7～1×10^-4mol/L5个浓度

5.5.2 实验步骤：击昏豚鼠，动脉放血致死，立即分离并取出气管，置含氧的Krebs液中，制备成气管标本。然后将标本置37℃ Krebs液水浴槽内，通氧气，气管平滑肌静息张力为1g。张力变化通过张力换能器输入PCLab生物信号采集处理系统。标本稳定1h后开始实验。

5.2.1 对气管平滑肌直接松弛作用：气管平滑肌标本在浴槽内稳定1h后，分别以10^-9～10^-3mol/L累积剂量加药法加入甘草苷芹糖和麻黄碱药物后，然后再加入10^-6mol/L异丙肾上腺素，使其达最大松弛。计算时以10^-6mol/L异丙肾上腺素的松弛反应为100％。

5.2.2 对carbamylcholine(CCH)引起气管平滑肌收缩的解痉作用：气管平滑肌标本在浴槽内稳定1h后，先在浴槽内加入10^-6mol/L CCH，待气管平滑肌收缩反应达最大值并稳定后，再分别以10^-6～10^-3.5mol/L累积剂量加药法加入受试药物，最后加入10^-6mol/L异丙肾上腺素。计算时以10^-6mol/L异丙肾上腺素的松弛反应幅度为100％。

5.2.3 对CCH引起气管平滑肌收缩的抑制作用：先加入Krebs液(对照)或10^-6～10^-3mol/L受试药物，5min后累积剂量加药法加入10^-6～10^-4mol/L CCH，观察收缩反应幅度。以预先用Krebs液处理的CCH收缩幅度为100％，计算出受试药物对CCH收缩反应的抑制作用。

6、统计方法：用微机和Sigma Stat统计软件(Sigmastat 1.01 for Windows 95，1992，Jandel corporation，USA)具体方法见结果中的表注。ID₅₀(95％可信限)、ED₅₀(95％可信限)和EC₂₅(95％可信限)用上海科学技术出版社POMS2.0版软件计算。

3、结果

3.1、甘草苷芹糖对枸橼酸引起的豚鼠咳嗽反应的抑制作用

结果显示，甘草苷芹糖能减少豚鼠的咳嗽次数，见表5。抑制咳嗽50％的剂量(ID)₅₀(95％可信限)＝13.68(8.53～21.94)mg/kg。

表5.甘草苷芹糖对枸橼酸引起豚鼠咳嗽反应的抑制作用(x±SD)

统计方法：T-test，与生理盐水组比较^**P<0.01

3.2、甘草苷芹糖对辣椒素引起小鼠咳嗽反应的抑制作用

结果显示，甘草苷芹糖能减少辣椒素引起小鼠咳嗽次数，见表6。ID₅₀(95％可信限)＝18.33(12.17～27.63)ml/kg。

表6.甘草苷芹糖对辣椒素引起小鼠咳嗽反应的抑制作用(x±SD)

统计方法：T-TEST或Mann-Whitney Rank Sum Test，与生理盐水组比较^*P<0.01，^**P<0.01，^***P<0.001

3.3、甘草苷芹糖对小鼠气道酚红排泄的促进作用

结果显示，甘草苷芹糖能促进小鼠气道酚红排泄，见表7。ED₅₀(95％可信限)＝22.41(18.48～27.18)mg/kg。

表7.甘草苷芹糖片对小鼠气道酚红排泄的促进作用(x±SD)

T-test或Mann-Whitney Rank Sum Test，与生理盐水组比较^*P<0.01，^**P<0.01，^***P<0.001

3.4.甘草苷芹糖对蛙上腭和食道粘膜纤毛运动的增强作用

甘草苷芹糖增强蛙上腭和食道纤毛运动，EC₂₅(95％可信限)＝1.01(0.8～1.3)×10^-9mol/L，见表8。

表8.甘草苷芹糖片对蛙上腭和食道粘膜纤毛运动的促进作用(x±SD)

T-test或Mann-Whitney Rank Sum Test，与任氏液对照比较^*P<0.01，^**P<0.01，^***P<0.001

3.5、甘草苷芹糖对离体豚鼠气管平滑肌直接松弛作用

以累积剂量加药法分别加入甘草苷芹糖10^-7～10^-4mol/L后，可见甘草苷芹糖呈量效关系松弛离体豚鼠气管平滑肌，见表9和图4。

表9 甘草苷芹糖对离体豚鼠气管平滑肌直接松弛作用(x±SD)

统计方法：Student-Newman-Keuls Method；与对照K-H液组比较^*P<0.05；

3.6、甘草苷芹糖对CCH引起离体豚鼠气管平滑肌收缩的解痉作用

以累积剂量加药法分别加入10^-9～10^-6mol/L药物后，可见甘草苷芹糖和麻黄碱均呈量效关系松弛CCH引起离体豚鼠气管平滑肌收缩反应，甘草苷芹糖与麻黄碱作用强度基本相同，见表9和图5。

3.7、甘草苷芹糖对CCH引起离体豚鼠气管平滑肌收缩的抑制作用

先加入甘草苷芹糖和麻黄碱10^-6、10^-5和10^-4mol/L，再以累积加药法加入CCH10^-8～10^-5.5mol/L。可见甘草苷芹糖和麻黄碱有抑制CCH收缩的趋势。见表10和图6、7。

表10、甘草苷芹糖片对CCH引起离体豚鼠气管平滑肌收缩的抑制作用(x±SD)

4 讨论与小结

在本实验中，采用了2种动物镇咳试验模型，枸橼酸引起的豚鼠咳嗽模型和辣椒素引起的小鼠咳嗽模型。甘草苷芹糖抑制枸橼酸引起的豚鼠咳嗽反应和辣椒素引起的小鼠咳嗽反应，提示甘草苷芹糖具有很强的镇咳作用。

在本实验中，采用了2种动物祛痰试验模型，小鼠气道酚红排泄模型和蛙上腭和食道纤毛运动模型。甘草苷芹糖促进小鼠气道酚红排泄，增强蛙上腭和食道纤毛运动，提示甘草苷芹糖具有很强的祛痰作用。

在本实验中，采用了3种离体豚鼠气管平滑肌试验方法，证明了甘草苷芹糖可直接松弛离体豚鼠气管平滑肌，呈量效关系松弛CCH引起离体豚鼠气管平滑肌收缩反应，抑制CCH收缩的趋势，提示甘草苷芹糖具有很强的平喘作用。

Claims (4)

1.一种甘草苷芹糖在制备镇咳、平喘和祛痰药物中的应用，所述甘草苷芹糖的分子式：C₂₆H₃₀O₁₃，分子量：550，其特征在于：所述制备以甘草苷芹糖单独或与其它活性组份或辅料配合制成，制剂规格为按每粒或片含甘草苷芹糖30mg。

2.一种甘草苷芹糖在制备改善咳嗽、痰多和喘息症状的保健食品中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种甘草苷芹糖镇咳、平喘和祛痰药物中的应用，其特征在于：所制备的制剂以甘草苷芹糖为活性成分，加入常规的赋形剂、调味剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂或增溶剂中的一种或多种药物辅料制成药物制剂。

4.根据权利要求3所述的一种甘草苷芹糖制剂，其特征在于：所述制剂剂型为胶囊剂、片剂或口服液体剂。

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