CN101506363B - 用于检测物质的核酸链及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以高灵敏度来检测极微量物质而不扩增该极微量物质。本发明提供了检测用核酸链P以及使用检测用核酸链P的检测技术。其中，该检测用核酸链P至少具有荧光物质F、淬灭物质Q和核酸链区N，该荧光物质F可以用作共振激发能量(荧光共振能量)的供体，该淬灭物质Q位于能使它接受共振激发能量的位置，该核酸链区N位于淬灭物质Q和荧光物质F之间并且具有由核酸内切酶裂解的酶裂解位点。

Description

用于检测物质的核酸链及其方法
技术领域
本发明涉及用于检测物质等的核酸链和涉及该核酸链的技术。更详细地讲，本发明涉及在荧光物质和淬灭物质之间的核酸序列区中具有酶裂解位点的核酸链，和使用该核酸链的方法。 
背景技术
通过探测物质发出的荧光来检测该物质存在或者它们的反应等的技术是已知的，并且它们被广泛应用于多种传感器技术等。 
例如，通过将能够特异性地与物质相互作用的探针物质引入到反应区，并且确定已经预先被荧光标记的探针物质的荧光在反应区中是否能够被检测到，从而来确认该物质存在反应区中的技术是已知的。例如，对于固定在基板(substrate)(芯片)的表面的核酸链，引入荧光标记的核酸链，通过荧光检测来检测两个核酸链之间的杂交是否存在，这个技术是DNA芯片通常使用的技术。 
另外，当存在于反应区的单链核酸互相杂交时，通过特异性地结合到互补结合位点而发出荧光的所谓的“嵌入剂”也是已知的。这样的嵌入剂具有可以省略预先给核酸链标记荧光物质的程序的优势，等等。 
“FRET(荧光能量共振转移)”表示接受从激发的荧光物质(供体)释放的共振激发能量的荧光物质(受体)被激发而发出荧光的 现象或者原理。为了产生这种“FRET”，供体和受体的荧光光谱必须是彼此重叠的，并且两种物质都必须位于固定的范围左右或者为合适的位置关系。使用这种“FRET”来检测标记有荧光物质用作供体的物质和标记有荧光物质用作受体的物质之间的相互作用是否存在的技术是已知的(见，例如JP-A-2004-065262和JP-A-2005-207823)。 
接下来，“生物发光能量共振转移(BRET)”是能够直接检测蛋白质-蛋白质相互作用的生物物理方法。这种“BRET”最初是在如Aequorea victoria水母和Renilla reniformis海肾的海洋生物中观察到的过程，可以通过荧光检测来检测到，当供体蛋白和受体蛋白彼此靠近时，产生了伴随从供体蛋白的激发能量转移的受体蛋白的能量释放。因此，BRET可以是用于检测蛋白质之间的相互作用的技术。 
当试图检测出反应区或者样品溶液中存在的极微量物质时，通常使用的技术是通过增加该极微量的物质来提高检测的敏感性。例如，通过PCR(聚合酶链式反应)方法来扩增待检测的极微量核酸链的技术已经被广泛操作。 
但是，这样的极微量物质的扩增必须小心的操作，还会进行大量的工作，并且它还经常需要特别昂贵的装置。另外，即使小心翼翼地完成工作，可能在扩增的过程中间接产生除了靶(target)物质以外的物质。此时，出现了产生检测噪音的技术问题。另外，还存在一个技术问题就是，扩增如蛋白质或者脂肪的生物物质比扩增核酸链更困难。 
由此，本发明的主要目标是提供能够以高灵敏度并且不需要扩增极微量物质来检测该极微量物质的技术。 
发明内容
本发明首先提供了用于检测的至少具有荧光物质、淬灭物质和核酸链区的核酸链，该荧光物质可以用作共振激发能量(荧光共振能量)的供体，该淬灭物质位于能够使其接受共振激发能量的位置，该核酸链区位于淬灭物质和荧光物质之间，并且具有在其中形成的由核酸内切酶裂解的酶裂解位点。 
“淬灭物质”是广义上具有降低或者淬灭荧光的功能的物质，并且没有严格限制。“核酸链”表示核苷磷酸酯的聚合物(核苷链)，其中嘌呤或者嘧啶碱基通过配糖键连接到糖，并且广泛包含包括探针DNA的低聚核苷酸、多聚核苷酸、其中嘌呤核苷和嘧啶核苷被聚合(全长或其片断)的DNA、通过反转录获得的cDNA(cDNA探针)、RNA等等。 
“核酸内切酶”是能够在内部键裂解核酸的核酸酶的总称。在本发明中，这种酶单独使用或者与其他表现出合作作用的酶联合使用。“检测用核酸链”是用于检测特定的物质、反应(包括化学键接、相互作用等)、结构等等的核酸链。它与在某些情况下被称为探针核酸链的概念一致。 
因为酶裂解位点存在于构成本发明的检测用核酸链的核酸链区中，例如可以被双链特异性AP-核酸内切酶裂解的脱碱基位点(AP位点)可以作为例子。 
“AP位点(脱嘌呤/脱嘧啶位点)”表示核酸链中碱基被删除(缺失)的位点，“AP核酸内切酶(脱嘌呤/脱嘧啶内切酶)”是具有AP裂解酶活性以在AP位点向核酸链引入切口的酶。它们的一些实例如下：核酸内切酶VI、核酸内切酶IV(在AP位点的5’边裂解)、核酸内切酶III(在AP位点的3’边裂解)、核酸内切酶S1、核酸内 切酶VIII、甲酰氨基嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)、OGG1等等。在本发明中，一种特别有用的AP核酸内切酶是特异性识别双链并且在脱碱基位点裂解具有脱碱基位点的核酸链的酶。 
本发明的核酸链的碱基数目(核酸分子的数目)没有特别的限制，但是该核酸链为，例如低聚核苷酸链。同样，该核酸链的使用没有特别的限制，但是，举一个实例，核酸片断可以被用作探针检测靶物质(待检测的物质)。顺便提及的是，低聚核苷酸链表示由几十个核苷构成的核苷聚合物，例如大约15到30个核苷。在核酸链区中，可以存在结合到特定蛋白质的响应元件区，而该蛋白质是具有结合到核酸链的功能的蛋白质。这样的蛋白质的实例包括转录因子。 
接下来，本发明提供了使用核酸链的方法，其包括至少以下步骤(1)和(2)：(1)互补链形成反应步骤，该互补链形成反应涉及检测用的至少具有荧光物质、淬灭物质和核酸链区的核酸链，该荧光物质可以用作共振激发能量(荧光共振能量)的供体，该淬灭物质位于能够使其接受共振激发能量的位置，该核酸链区位于淬灭物质和荧光物质之间，并且具有由核酸内切酶裂解的酶裂解位点；(2)使对双链(通过互补链形成反应获得)具有特异性的核酸内切酶作用于其上，在内切酶裂解位点裂解探针核酸链，以实现分裂，并且将裂解的链解离成单链，从而扩增荧光物质的荧光。 
“互补链形成反应”是所谓的核酸(核苷链)之间的杂交，并且广义包括DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等等之间的互补结合。 
在本发明的方法中，当认为由于淬灭物质的作用而处于荧光被降低或者淬灭的状态中的检测用核酸链和与其互补的核酸链形成 双链后，通过双链特异性核酸内切酶的作用，使检测用核酸链从核酸内切酶裂解位点裂解并且解离成单链。 
在解离成单链的这个步骤中，检测用核酸链碎裂成位于荧光物质侧的核酸链和位于淬灭物质侧的核酸链，然后作为单链被释放。因此，荧光物质远离淬灭物质存在，这引起了荧光的扩增(因为淬灭物质的影响消失)。 
这个方法可以在例如以下的温度条件下进行：不高于在通过核酸内切酶裂解之前的、可以使检测用核酸链的互补链形成反应进行的上限温度，并且不低于在核酸内切酶的裂解之后的、使检测用核酸链的片断的互补链形成反应不能保持或者进行的温度。 
在本发明中，通过测量荧光扩增是否存在或者荧光扩增水平(荧光扩增的程度)，可以发现检测用核酸链的双链(互补链)的形成，也就是，与探针核酸链互补的靶核酸链的存在，以及除了核酸以外的其他生物物质，生物物质中发生的化学变化或者结构变化，候选药物物质的存在等等。 
通过使用本发明的核酸链，可以以高灵敏度而不扩增该极微量物质来检测极微量物质。 
附图说明
图1是说明根据本发明的检测用核酸链的原理和实施方式的示图。 
图2是显示检测用核酸链的一个实施方式的示图，其中荧光物质(F)和淬灭物质(Q)都结合于该核酸链的内部位点。 
图3是显示检测用核酸链的另外一个实施方式的示图，其中荧光物质(F)结合于该核酸链的末端位点，而另外一种物质，淬灭物质(Q)结合于该核酸链的内部位点。 
图4仍然是显示检测用的核酸链的另外一个实施方式的示图，其中荧光物质(F)结合于该核酸链的内部位点，而另外一种物质，淬灭物质(Q)结合于该核酸链的末端位点。 
图5是显示了本发明的检测用核酸链(P)的功能和其典型应用实例的示图。 
图6是显示通过AP核酸内切酶E在AP位点X形成切口的方式的示意图。 
图7是显示在合适的温度条件(t)下，通过AP核酸内切酶(E)的裂解获得的检测用核酸链的片断(P1和P2)从核酸链(T)解离并且在反应区(R)中以单链释放的状态的示意图。 
图8是显示本发明的检测用核酸链P引起的“循环反应”的基本流程的示图。 
图9是显示根据反应区(R)的温度条件的变化，检测用核酸链(P)(未裂解)和检测用核酸链片断(P1和P2)(通过用AP核酸内切酶E裂解获得)的双链形成和解离的方式的参考图。 
图10是显示使用本发明的检测用核酸链的方法的第一应用实例的原理的示意图。 
图11是显示使用本发明的检测用核酸链的方法的第二应用实例的原理的示意图。 
图12是显示使用本发明的检测用核酸链的方法的第三应用实例的原理的示意图。 
图13是显示使用本发明的检测用核酸链的方法的第四应用实例的原理的示意图。 
图14是显示使用本发明的检测用核酸链的方法的第五应用实例的原理的示意图。 
图15是显示使用本发明的检测用核酸链的方法的第六应用实例的原理的示意图。 
图16是显示在检测结构变化前的物质(例如，蛋白质Dx)的情况中，使用本发明的检测用核酸链的方法的第七应用实例的原理的示意图。 
图17是显示在检测结构变化后的物质(例如，蛋白质Dy)的情况下，使用本发明的检测用核酸链的方法的第七应用实例的原理的示意图。 
图18是显示使用本发明的检测用的核酸链的方法的第八应用实例的原理的示意图。 
图19是显示通过将AP核酸内切酶与100fmol的靶核酸链和8pmol的检测用核酸链(具有AP位点)进行反应，以及检测实例1的检测用核酸链的裂解获得的结果的示图(显示琼脂糖电泳结果的照片)。 
图20是显示通过检测实施例2中经过一定时间的荧光信号的扩增获得的结果的示图(纵轴：荧光强度；横轴：时间(分钟))。 
图21是实施例2中通过使用双倒数作图法(Lineweaver-BurkPlot)来绘制各靶核酸链的浓度和起始反应速度的示图(曲线图)。 
图22是显示在实施例3中通过测量荧光染料(FITC)的荧光随时间升高获得的结果和通过绘制在每个时间点上每单位时间的荧光升高率获得的结果的图(用曲线图代替绘图)。 
图23是显示在实施例3中通过改变Hela细胞(横轴)的数量来检测BMAL1-CLOCK复合体获得的结果的示图(用曲线图代替绘图)。 
图24是显示了实施例4中通过刺激含有50马血清的培养基(DMEM培养基)中的Hela细胞2小时，在初始刺激之后的15小时、17.5小时、20小时和22.5小时回收细胞并且检测BMAL1-CLOCK蛋白质复合物获得的结果的示图(用曲线图代替绘图)。 
图25是显示在实施例4中通过定量测定Per1 mRNA水平获得的结果的示图(用曲线图代替绘图)。 
图26是显示在实施例4中通过定量测定Per2 mRNA水平获得的结果的示图(用曲线图代替绘图)。 
具体实施方式
在下文中，参照附图来介绍本发明的实施方式。但是，本发明的原理不会基于下述实施方式而被狭窄地解释。 
首先，图1到4是说明本发明的检测用核酸链的原理和实施方式的图。 
图1到4中的符号P表示本发明的检测用核酸链的一种实施方式。这个检测用核酸链P至少具有荧光物质F(其用作共振激发能量(荧光激发能量)的供体)，淬灭物质Q(其位于能使其接受共振激发能量的位置)，核酸链区N(其位于淬灭物质和荧光物质之间)和存在于核酸链区N中的裂解位点(例如AP位点：在图中，它用符号X表示)。 
例如，在荧光物质F结合(用于标记)于具有特定分子长度的核酸链的3’端或者5’端，并且淬灭物质Q(用于标记)结合到与荧光物质结合的末端相对的末端的情况下，核酸链的整个区域位于荧光物质F和淬灭物质Q之间，因此核酸链的整个区域对应于本发明的核酸区N(见图1)。 
另外，在荧光物质F和淬灭物质Q两者或者其中一个结合于具有特定分子长度的核酸链的末端以外的位置的结构中，位于物质F和Q之间的核酸链区对应于本发明的核酸区N(见图2到4)。 
更详细地讲，图2显示了荧光物质F和淬灭物质Q都结合于核酸链的内部位点的实施方式；图3显示了荧光物质F结合于核酸链的末端位点，而另外一种物质，淬灭物质Q结合于核酸链的内部位点的另外一个实施方式；而图4显示了荧光物质F结合于核酸链的内部位点，而另外一种物质，淬灭物质Q结合于核酸链的末端位点的另外一个实施方式。 
图5为显示本发明的检测用核酸链的功能和其典型应用实例的示图。在图5所显示的实例中，显示了通过使用检测用核酸链P，检测了具有与核酸链区N互补的核苷酸序列的核酸链T的存在或者其丰度的实例。在这个实例中，图1中所示检测用核酸链P作为代表性实例进行说明(也可以使用在图2到图4中的任何一个所示的检测用核酸链P)。 
在检测用核酸链P中，在将它进行特定的酶处理之前(这会在后面谈到)，通过淬灭物质Q的作用，荧光物质F发出的荧光降低或者淬灭。当样品溶液引入到反应区R(检测用核酸链P以这种状态存在于其中)中时，如果具有与检测用核酸链P的核酸链区N互补的核苷酸序列的核酸链T存在于样品溶液中，核酸链区N和核酸链T形成双链(互补链)(互补链形成步骤)。顺便提及的是，图5的符号W表示经过互补链形成步骤形成的双链(互补链)区(这在下文中同样适用)。 
在互补链形成步骤之后或同时，在双链特异性AP核酸内切酶E引入到反应区R时(见图6)，AP核酸内切酶E识别形成互补链W的(检测用核酸链P的)核酸链区N中存在的AP位点X，并且在AP位点X引入切口，并且将检测用核酸链P裂解成荧光物质F侧的片断和淬灭物质Q侧的片断。也就是说，双链(互补链)区W被裂解成为短链，荧光物质F侧的双链W1和淬灭物质Q侧的双链W2。顺便提及的是，图6是显示通过AP核酸内切酶E在AP位点X形成切口的方式的示意图。 
在这里，双链(互补链)区W(见图5)和用AP核酸内切酶E裂解成为短链获得的双链W1和W2(见图6)具有不同的链长度，因此它们具有不同的tm(熔解温度)。也就是，各自的tm温度之间的关系如下：W＞W1，且W＞W2。 
因此，反应区R中的缓冲溶液的温度条件设定为合适的温度(t)条件，该温度(t)不高于在通过AP核酸内切酶E的裂解前使检测用核酸链P的互补链形成反应可以进行或者保持的温度ta，并且不低于在由AP核酸内切酶E的裂解之后使检测用核酸链的片断P1和P2(见图6)的互补链形成反应不能保持或者不能进行的温度tb，也就是，t被设置为：tb≤t≤ta。 
图7示意性地显示了通过AP核酸内切酶E的裂解获得的检测用核酸链的片断P1和P2(见图6)从核酸链T解离并且在适当的温度条件t下作为单链在反应区R中释放的状态。 
另外，图9是显示根据反应区R的温度条件的变化，检测用核酸链P(未裂解的)和检测用核酸链的片断P1和P2(通过核酸内切酶E的裂解获得)的双链形成或者解离的方式的参考图。 
更详细地说明图9，在比温度tb低的温度t1下，所有检测用核酸链P和检测用核酸链片断P1和P2的双链形成都可以进行并且还可以保持形成的双链。 
在合适的温度条件t2下(tb≤t2≤ta)，检测用核酸链P的互补链形成反应可以进行并且可以保持形成的互补链。在另外一个方面，通过AP核酸内切酶E裂解成短链而获得的检测用核酸链的片断P1和P2分别从核酸链T解离成为单链。通过这种成为单链的解离，荧光物质F远离淬灭物质Q而存在，这引起荧光的扩增(因为丧失了淬灭物质Q的影响)(见图9)。 
另外，在温度条件t3下，检测用核酸链P也解离成单链，通过AP核酸内切酶E裂解成短链而获得的检测用核酸链的片断P1和P2也分别从核酸链T解离成为单链(见图9)。 
在这里，本发明具有的一个优势为，通过将相对于核酸链T过量的检测用核酸链P引入到反应区R中，通过用反应区R中存在的检测用核酸链P来将包括“形成核酸链T与检测用核酸链P之间的互补链(见图5)”→“用AP核酸内切酶E将检测用核酸链P裂解成短链(见图6)”→“解离通过裂解核酸链T成短链获得的检测用核酸链片断P1和P2，以及与解离同时的荧光扩增(见图7)”的一系列反应重复多次(在下文中，为方便称为“循环反应”)，即使从 反应区R中存在的极微量的核酸链T也可以获得扩增的强荧光信号。顺带提及的是，图8是这种循环反应的基础流程的示图。 
也就是说，可以从存在极微量的核酸链T的反应区R获得来自显示核酸链T存在的荧光物质F(其停止了被淬灭物质Q淬灭)的强荧光信号，不需要再麻烦地扩增反应区R中存在的核酸链T的量，因此，可以以高灵敏度来检测核酸链T。 
因此，在本发明中，设定反应区R的温度条件从而可以使核酸链T和检测用核酸链P之间的互补链形成是重要的，因此，不优选图9中所示超过ta的温度条件t3。 
如上所述，因此，本发明的优选温度条件是不高于在通过AP核酸内切酶E裂解之前使检测用核酸链P的互补链形成可以进行或者保持的温度ta，并且不低于在通过AP核酸内切酶E裂解之后使检测用核酸链的片断P1和P2(见图6)的互补链形成反应不能保持或者进行的温度tb的温度(也就是tb≤t≤ta)(又见图9)。 
顺便提及的是，假定片断P1和P2的tm温度彼此是不同的，因为检测用核酸链的片断P1和P2(见图6)的链长度是彼此不同的，在这种情况下，通过采用较高的tm为设定的温度条件的下限温度tb，检测用核酸链的两个片断P1和P2都可以从核酸链T解离。以这种方式，上面所提到的重复反应可以进行。 
在下面会介绍几个使用本发明的检测用核酸链的方法的应用实例。以下所介绍的方法的应用实例只是为了说明的目的，本发明不会限制于这些实例。 
对于以下所说明的方法的所有应用实例所共有的一个本发明的特征在于，可以通过上面所提到的涉及引入到反应区中的过量的 检测用核酸链P的“循环反应”，以高灵敏度检测到极微量物质、极微量反应或者相互作用，或者物质中结构的改变。省略了基于这点的逐条的详细介绍以避免重复。 
<方法的第一应用实例> 
图10是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第一应用实例原理的示意图。该方法的第一应用实例对于证明靶核苷酸序列区是否存在于核酸链Y的核苷酸序列中等场合是有用的。引用这个实例，可以证明对特定的转录因子特异性的响应元件区是否存在于位于基因上游的启动子区中。 
<方法的第二应用实例> 
图11是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第二应用实例原理的示意图。根据本方法的第二应用实例，可以检测待检测物质(如蛋白质)是否存在于固相(如基板、小珠或者支持物)的表面S上。 
更详细地讲，样品溶液被引入到表面S所面对的反应区R中，随后，引入具有特异性结合到待检测物质M的核苷酸序列的核酸链Z1，在此之后或者与之同时，引入具有以上述核苷酸序列互补的核酸链区N的检测用核酸链P，然后用溶液清洗反应区R。然后，检测用核酸链P和双链特异性AP核酸内切酶E进一步引入到反应区R中。 
如果物质M存在于样品溶液中，核酸链Z1和已经形成互补链的检测用核酸链P结合到物质M。因此，AP核酸内切酶E作用于互补链上并且在互补链中引入切口(构成互补链的核酸链区N中的AP位点X)并且将互补链解离成单链。因此，即使物质M的含量 是极微量的，也可以获得从构成检测用核酸链P的荧光物质F的强荧光信号。以这种方式，可以以高灵敏度来检测物质M。 
<方法的第三应用实例> 
图12是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第三应用实例原理的示意图。根据该方法的第三应用实例，可以检测固定在固相(如基板或者小珠)的表面S上的物质L与物质K的反应或者相互作用。 
更详细地讲，物质K已经预先固定在表面S上，将含有用于证实与物质K的反应或者相互作用是否存在的物质L的样品溶液引入到表面S面对的反应区R中，然后，用溶液清洗反应区R。物质L已经预先标记了具有特定核苷酸序列的核酸链Z2。 
在用溶液清洗之后，引入具有与核酸链Z2的核苷酸序列互补的核酸链区N的检测用核酸链P，然后，将双链特异性AP核酸内切酶E引入到反应区R中。 
如果物质K和物质L之间相互反应和结合或者相互作用，已经标记核酸链Z2的物质L和检测用核酸链P(的核酸链区N)在反应区R中形成互补链。因此，双链特异性AP核酸内切酶E作用于互补链并且在互补链(构成互补链的核酸链区N中的AP位点)引入切口，并且将互补链解离成单链。因此，即使物质K和物质L之间的反应或者相互作用水平是极小的，也可以获得从构成检测用核酸链P的荧光物质F的强荧光信号。 
以这种方式，可以以高灵敏度检测物质K和物质L之间的反应(如抗原-抗体反应)或者相互作用(如蛋白质-蛋白质相互作用或者脂质和结合分子之间的反应)。 
<方法的第四应用实例> 
图13是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第四应用实例原理的示意图。根据该方法的第四应用实例，可以通过结合到受体以高灵敏度检测或者筛选低分子化合物，该低分子化合物可以是候选药物，例如可以是激动剂或者拮抗剂的化合物。 
更详细地讲，对于存在于如基板的固相的表面S上的物质U，引入含有可以结合于或者与物质U互相作用的候选物质V的样品溶液，然后，用溶液清洗反应区R。物质V已经预先标记了具有特异性核苷酸序列的核酸链Z2。 
在用溶液清洗了之后，引入具有与核酸链Z2的核苷酸序列互补的核酸链区N的检测用核酸链P，然后将双链特异性AP核酸内切酶E引入到反应区R中。 
如果物质U和候选物质V互相结合，核酸链Z2(已用其预先标记了候选物质V)和检测用核酸链P(的核酸链区N)反应区中形成互补链。因此，双链特异性AP核酸内切酶E作用于互补链，并且在互补链(构成互补链的核酸链区N中的AP位点)引入切口，并且将其解离为单链。因此，即使物质U和候选物质V之间的结合的量是极微小的，也可以从构成检测用核酸链P的荧光物质F获得强的荧光信号。 
以这种方式，可以以高灵敏度检测物质U和候选物质V之间的结合。通过使用这种检测技术，可以筛选候选药物物质。 
<方法的第五应用实例> 
图14是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第五应用实例原理的示意图。根据该方法的第五应用实例，例如可以检测或者筛选环境激素(内分泌干扰物)。 
首先，某种类型的转录因子J(DNA结合蛋白)具有以下的功能。当激素H结合到其上时，转录因子J改变它的结构，由此它结合到位于基因上游的响应元件区并且促进该基因的转录。通常，称为环境激素的内分泌干扰物是表现类似于体内的激素H的物质。 
在本发明中，预先使转录因子(核受体)J存在于(例如，固定)如基板或者小珠的固相的表面S上，而且使至少核酸链Z3(相当于响应元件区)和检测用核酸链P(具有与核酸链Z3的核苷酸序列互补的核酸链区N)预先存在。在含有这样的物质的反应区R中，引入要证实其是否起到内分泌干扰物的作用的类激素物质h。 
更详细地讲，如果类激素物质h确实具有类似于激素H的功能，转录因子J的结构被类激素物质h的作用改变。在存在有经历了这种结构改变的转录因子J的反应区R中，同时引入相当于响应元件区的核酸链Z3和与核酸链Z3形成双链的具有核酸链区N的检测用核酸链P。随后，用溶液清洗反应区R，从而将反应区R中存在的过量的游离形式的核酸链Z3从反应区R去除。然后，向反应区R中进一步引入检测用核酸链P和双链特异性AP核酸内切酶E。 
如果在反应区R中存在通过核酸链Z3结合到转录因子J的检测用核酸链P，双链特异性AP核酸内切酶E作用于核酸链Z3和检测用核酸链P(的核酸链区N)的互补链，并且在互补链(构成互补链的核酸链区N的AP位点X)上引入切口，并且将其解离成单链。 
因此，即使样品溶液中的类激素物质h的量是极微量的，也可以从构成检测用核酸链P的荧光物质F获得强的荧光信号。以这种方式，可以以高灵敏度检测类激素物质h。通过使用这种技术，还可以筛选内分泌干扰物。 
<方法的第六应用实例> 
图15是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第六应用实例原理的示意图。根据该方法的第六应用实例，例如，可以检测蛋白质翻译之后的修饰反应等等。 
首先，有时蛋白质可以在翻译之后通过酶反应等修饰。例如，磷酸化作用是一个典型的例子。在本发明中，已经预先使被检测的蛋白质D存在于(例如，固定)如基板的固相的表面S上，也预先使特异性结合到蛋白质D的未修饰(例如，未磷酸化)部分的抗体B1和特异性的结合到蛋白质D的修饰(例如，磷酸化)部分的抗体B2存在。抗体B1和B2已经预先分别标记了核酸链Za和核酸链Zb，每个核酸链都由特定的核苷酸序列构成(见图15)。 
在含有这样的物质的反应区R中，同时引入具有与核酸链Za互补的核酸链区Na的检测用核酸链Pa和具有与核酸链Zb互补的核酸链区Nb的检测用核酸链Pb。顺便提及的是，检测用核酸链Pa已经标记了能够发射预定波长荧光的荧光物质F1，而检测用核酸链Pb标记了能够发射与荧光物质F1不同波长的荧光的荧光物质F2。 
在用溶液清洗反应区R之后，在反应区R中引入双链特异性AP核酸内切酶E从而对形成双链的检测用核酸链Pa的核酸链区Na和形成双链的检测用核酸链Pb的核酸链区Nb都引入切口，从而将它们裂解成短链。这些短链解离成单链从而实现荧光的扩增。 
理论上，检测用核酸链Pa通过其互补链结合至存在于反应区R中的所有蛋白质D。因此，通过测量来自构成检测用核酸链Pa的荧光物质F1的(扩增)荧光信号，可以预测反应区R中的所有蛋白质D分子的数量。 
另外，检测用核酸链Pb通过其互补链结合于反应区中所有的蛋白质D分子中的经修饰(例如，磷酸化)的蛋白质D。因此，通过测量构成检测用核酸链Pb的荧光物质F2的(扩增)荧光信号，可以预测修饰的蛋白质D分子的数量。 
通过这样的技术，基于反应区R中总蛋白质D分子数量和修饰的蛋白质D分子的数量，可以预测修饰了的蛋白质D的比例。 
<方法的第七应用实例> 
图16和17是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第七应用实例原理的示意图。图16是检测结构改变之前的物质(例如，蛋白质)的情况的示意图；而图17是检测结构改变之后的物质(例如，蛋白质)的情况的示意图。通过该方法的第七应用实例，可以检测物质的结构改变、结构改变的数量比例等等。 
例如，蛋白质可以通过其它因素的作用改变它的构象从而表现出不同的功能。因此，通过检测物质中的这种结构改变，可以了解该物质的功能或者活性。在下文中，会参考图16和17来进行详细的介绍。 
图16中的符号Dx表示结构改变前的蛋白质，图17中的符号Dy表示结构改变后的蛋白质。首先，通过参考图16，特异性地结合到蛋白质Dx的结构部分d1的抗体B1(以核酸链Za标记)和特异性地结合到蛋白质Dx的结构部分d2的抗体B2(以核酸链Zb标 记)，以及具有不同的荧光波长的两种类型的检测用核酸链Pa和Pb被引入到反应区R中，反应区R中存在着固定到表面S等的蛋白质Dx。 
构成检测用核酸链Pa的核酸链区Na与标记抗体B1的核酸链Za互补，因此形成双链。在另外一个方面，构成检测用核酸链Pb的核酸链区Nb与标记抗体B2的核酸链Zb互补，因此形成双链(见图16)。 
当双链特异性AP核酸内切酶E被引入到这样的反应区R中时，核酸链区Na和Nb分别产生切口并且解离成单链。因此，荧光物质F1和F2发射出各自波长的荧光信号。由此，发现存在于表面S上的蛋白质Dx的结构改变未发生。 
在另外一个方面，通过图17，特异性地结合到蛋白质Dx(见图16)的结构部分d1的抗体B1(以核酸链Za标记)和特异性地结合到蛋白质Dy的结构部分d2(在这种情况中，该部分与蛋白质Dx的结构部分d2是相同的)的抗体B2(以核酸链Zb标记)，以及具有不同荧光波长的两种类型的检测用核酸链Pa和Pb引入到反应区R中，在反应区R中存在着固定在表面S等上的蛋白质Dy(已经发生结构改变的蛋白质)。 
抗体B1和B2之间，只有抗体B2结合到由于结构改变已经缺失了结构部分d1的蛋白质Dy。因此，只有构成检测用核酸链Pb的核酸链区Nb互补地结合到连接到抗体B2的用于标记的核酸链Zb并且形成双链。 
当向这样的反应区R中引入双链特异性AP核酸内切酶E时，只有核酸链区Nb产生切口并且解离成单链。因此，只从荧光物质F2发射出了荧光信号(见图17)。 
由此，发现存在于表面S上的蛋白质Dy被修饰从而产生结构改变，并且与未发生结构改变的蛋白质Dx不同。以这种方法，通过分析荧光信号，还可能同时检测蛋白质Dx和Dy。举个例子，该方法不仅可以应用于β-淀粉样蛋白的极微量结构改变的检测，还可以用于阿尔茨海默病的诊断。 
<方法的第八应用实例> 
图18是显示使用本发明的检测用核酸链P的方法的第八应用实例原理的示意图。这个第八应用实例是将检测用核酸链P用作DNA芯片的探针的实例。本发明的检测用核酸链P也可以应用于除了DNA芯片以外的传感器技术。 
图18显示了本发明的检测用核酸链P(P11、P12、P13、P14)固定在由符号C表示的基板表面上的情况。图18(A)到18(C)示意性地显示了基板表面C上反应随着时间的进展。 
在基板表面C上，如下的一系列反应(循环反应)以链式发生。当靶核酸链T被引入到反应区R中时，核酸链T依次与固定在基板表面C上的每一个检测用核酸链P11、P12、P13和P14的核酸链区N形成互补链。随后，当通过双链特异性AP核酸内切酶E(图18中未显示)在核酸链区N产生切口(裂解成短链)时，裂解成短链的检测用核酸链的片断从核酸链T解离，并且伴随着解离，荧光被扩增。 
从图18中所示的反应实例可以看出，通过将本发明的检测用核酸链P用作DNA芯片的探针，靶核酸链T的一个分子用在多个探针中(图18所示的实例中的P11、P12、P13、P14)。因此，以高灵敏度地实现检测是可能的。另外，基于荧光染料的扩增，通过观察随着时间推移的对DNA芯片的杂交和探针的裂解，可以根据反应速度来测量靶浓度。 
在传统的DNA芯片中，给靶核酸链T标记荧光染料是必须的，但是在本发明中可以省略这一工作。另外，传统的DNA芯片因为杂交的靶核酸链T处于固定在探针上的状态，存在杂交反应区周围的靶核酸链T的表观浓度下降，杂交效率下降的问题。但是，当使用本发明的检测用核酸链P时，靶核酸链T不是固定的，因此杂交反应区周围的靶核酸链T的表观浓度不下降，预期杂交效率会被提高。 
实施例 
为了证明本发明的检测用核酸链的功能和使用该检测用核酸链的检测技术的有效性，进行了以下的实验实施例1到4。 
(实验实施例1) 
首先，证实了当极微量的靶核酸链(SEQ ID NO：1)存在于反应区中时，发生了引入到反应区中过量的检测用核酸链(核酸链区：SEQ ID NO：2，其结构参见图1等)所参与的循环反应(参见图8)，并且通过AP核酸内切酶的作用产生了大量的检测用核酸链片断(SEQ ID NO：3)。SEQ ID NO：2所代表的序列中的符号“n”表示AP位点，缺失碱基的位点。 
这个实验中使用的AP核酸内切酶是人AP核酸内切酶(APE-1)，检测用核酸链中使用的荧光物质是荧光染料FAM(结合到5’端)，而淬灭物质是TAMRA(结合到3’端)。 
将AP核酸内切酶加入到具有100fmol的靶核酸链和8pmol的检测用核酸链(具有AP位点)的反应区中，并且和它们进行反应。在AP核酸内切酶的存在下，反应在37℃、42℃和47℃下进行，这些温度正好在合适的温度范围内，将这样获得的反应混合物以及没有加入AP核酸内切酶的反应混合物进行琼脂糖电泳，并且根据检测用核酸链的大小进行分离，并且通过结合的荧光染料进行检测。 
在通过琼脂糖电泳根据核酸链的大小进行的分离中，较小的核酸链移动地更快(条带(band)向下移动)。在加入了AP核酸内切酶的反应混合物(2～4道(lane))中，与未加入AP核酸内切酶的反应混合物(1和5道)相比条带向下移动(见图19)。由此可见，显然本实验中使用的检测用核酸链被AP核酸内切酶裂解。 
由实验实施例1的结果显而易见的是，发现数量为靶核酸链80倍的检测用核酸链被完全裂解了。也就是，说明通过反应区中存在的大量检测用核酸链，发生了包括“形成靶核酸链与检测用核酸链之间的互补链”→“用AP核酸内切酶将检测用核酸链裂解成短链(碎裂)”→“从靶核酸链解离通过裂解成短链获得的检测用核酸链片断”的一系列反应多次重复的循环反应(参见图8)。 
(实验实施例2) 
在实验实施例2中，将8 pmol的检测用核酸链(具有AP位点)(荧光物质：FAM(结合到5’端)，淬灭物质：TAMRA(结合到3’端)，核酸链区的核苷酸序列：SEQ ID NO：2)引入到不同浓度的靶核酸链(SEQ ID NO：1)，此外AP核酸内切酶与该链进行反应，然后，检测到荧光信号随着时间扩增。图20中的图为显示结果的曲线图(纵轴：荧光强度，横轴：时间(分钟))。靶核酸链的浓度设定为32amol、160amol、0.8fmol、4fmol和20fmol。从图20 中的结果所示，证明了荧光强度以取决于靶核酸链的量的反应速度随着时间升高。 
另外，当使用双倒数作图法来绘制各靶核酸链的浓度和起始反应速度时，在32amol到20fmol范围内的关系基本是线性的。也就是，当靶核酸链用作AP核酸内切酶的底物(substrate)时，它的模板核酸链的初始浓度[T]0和初始反应速度V可以线性表达。因此，这显示了可以在以上所述的浓度范围内定量确定靶核酸链(见图21)。 
(实验实施例3) 
本实验实施例显示实际实施了本发明的方法的应用实例中的一个实例并且成功了。更详细地讲，本实验实施例是显示成功实现具有转录因子活性的生物钟基因(时钟蛋白)的产物的BMAL1-CLOCK复合物的检测，以及人口腔粘膜上皮细胞的日变化规律的检测的实验实施例。 
在下文中，介绍了人口腔粘膜上皮细胞的时钟蛋白BMAL1-CLOCK复合物的检测程序的实施例。 
首先，在本实验实施例中使用的“检测用核酸链”是具有以下所示的碱基序列结构的oligo-DNA，其中荧光染料(FITC)结合到5’端侧，淬灭物质(BHQ)结合到3’端侧(5’端的第6个碱基(鸟嘌呤)缺失：AP位点)(见表1)，与这个检测用核酸链形成双链的核酸链是具有表2中所示的碱基序列结构的oligo-DNA，关于抗体，使用了抗-BMAL1抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)。 
[表1] 
    5’FITC-acccag(AP)ccacgtgc-BHQ 3’(SEQ ID NO：4)
[表2] 
    5’gcacgtggatgggt 3’(SEQ ID NO：5)
随后，根据以下步骤制备抗体磁珠。使用对羧基微球蛋白偶联试剂盒(PolyLink-Protein Coupling Kit)(Polyscience，Inc.)将以上所提到的抗体连接到磁珠(micromer-M[PEG-COOH]，micromodPartikeltechnologie Gmbh)。 
(1)来自人的口腔细胞悬浮在含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、150mM NaCl和1蔗糖十二烷酸酯(ucrose monolaurate)的20mM Tris-Cl(pH7.5)中，使用旋涡混合器来使细胞均质。(2)得到均质物以16,000g离心10分钟从而沉淀不溶的成分。(3)在280nm的吸光度测量(2)中获得的样品的上清液，并且使用每个样品中的总蛋白质量作为指标，使所有的样品中的蛋白质量相等。(4)用9倍体积的含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS-T(PBS(pH7.5)，0.05％Tween 20)来稀释在前一程序中所得的蛋白质量相等的每个样品。(5)在每个稀释后的溶液中加入2μL的抗体磁珠(抗-BMAL1)，并且于4℃培养一昼夜。(6)用500μL的PBS-T洗涤抗体磁珠从而洗掉未特异性结合的分子。(7)随后，抗体磁珠悬浮在10mM Tris-Cl(pH7.5)、50mM KCl、2.5 2.27926e+289 lycerol、10mM EDTA、0.05 P-40，0.05mg/mL鲑鱼精DNA和0.2μM的各检测用核酸探针(由探针核酸1和2构成的双链DNA)中，得到的悬浮液在37℃培养1小时。(8)用500μL的PBS-T洗涤抗体磁珠3次从而洗掉未特异性结合的分子和探针核酸。(9)抗体磁珠悬浮在水中，得到的悬浮液在80℃培养从而提取特异性结合的检测用核酸链。(10)通过前面程序提取的检测用核酸链悬浮在20mMTris-Acetat、10mM Mg-Acetat、50mM KCl、1mM DTT(pH7.9) (显示的是终浓度)中，并且在悬浮液中加入终浓度各为0.2μM的检测用核酸链(SEQ ID NO：4)和AP核酸内切酶，得到的混合物在37℃进行培养。然后，测量荧光染料(FITC)的荧光随着时间的增加。(11)绘制了相对于每个时间点的每个单位时间的荧光提高率(见图22中代替绘图的曲线图)。另外，为了检测灵敏度，根据上述的相同的方法，通过改变Hela细胞的数量成功进行了BMAL1-CLOCK复合物的检测。结果在曲线图中示出(见图23中代替绘图的曲线图)。 
讨论 
所谓的时钟蛋白(clock protein)是转录因子和改变生物节奏中最重要的昼夜节律的自主振荡器。目前认为作为转录因子的时钟蛋白质诱导另外一种时钟蛋白质的表达，而且这个被诱导的时钟蛋白质也是作为转录因子起作用，并且是作为昼夜节律振荡器，通过如抑制另外一个(原)时钟蛋白的转录的负场环(negative field loop)起作用。也就是，作为转录因子的时钟蛋白是生物钟的核心，因此认为测量这样的时钟蛋白最适合于测量生物的生物节奏。 
最近，逐渐揭示参与生物钟的生物分子的功能或者基因中的缺陷或者多样性是与生活方式相关疾病，如癌症、糖尿病、血管病和神经退化性疾病的病因因素。特别是，怀疑如双相障碍和抑郁症的精神障碍是由异常的生物钟造成的。事实上，具有重新设定生物钟效果的光照射显示出了治疗效果。 
另外，人类睡眠-苏醒的循环不仅是由生物钟自主控制的，还受到社会生活的限制。因此，在基于睡眠-苏醒循环的节奏和基于生物钟的自主节奏之间产生了滞后，这可能造成以时差为代表的生理状态不良，以及上面所介绍的不良健康状态。另外，体内代谢药物的酶量具有昼夜节律，而且在很多情况下药物的靶分子的量也具有昼 夜节律。因此，已知对药物的敏感性也具有昼夜节律，通过设定给药时间来进行的时间疗法的概念也被传播开来。 
举一个熟悉的实施例，总所周知，精神和身体的活力以及运动能力也具有昼夜节律，将一个人自己的能力最大化的节奏，有益于学习和训练的节奏，使体重轻松升高的饮食节奏等等都是要考虑的。 
如上所述，通过应用本发明的检测用核酸链或方法，确实可以测量作为转录因子的一个例子的时钟蛋白。由此，可预期，了解基于生物钟的自主生物节奏或者睡眠-苏醒循环以及其与外部时间的滞后将会成为用于预防精神障碍和生活方式相关疾病、改善如时差的生理不良状态、时间疗法、展现个人能力、学习、训练、饮食等等的非常有用的技术。此外，作为本发明的应用实例，将介绍以下的实验实施例4。 
(实验实施例4) 
目前，已知通过刺激含有50马血清的培养基中的培养细胞，时钟基因的表达在各个细胞之间同步化，并且观察到作为各个时钟基因的mRNA水平的变动的节奏。但是，因为迄今为止难于检测时钟蛋白，因此没有进行BMAL1-CLOCK蛋白质复合物的“表达变化”的详细观察。 
因此，通过应用本发明，进行了用于证实观察Hela细胞的BMAL1-CLOCK蛋白质复合物的表达变化是可能的特定实验。另外，观察了Per1和Per2基因的mRNA的变化方式，并且与BMAL1-CLOCK蛋白质复合物的表达变化进行了比较，Per1和Per2基因在启动子区中具有BMAL1-CLOCK蛋白质复合物所结合的 E-box序列并且其转录是通过BMAL1-CLOCK蛋白质复合物启动的。 
更详细地讲，在含有50马血清的培养基(DEME培养基)中刺激Hela细胞2小时。在开始刺激之后15小时、17.5小时、20小时和22.5小时回收细胞，并且依据与对口腔粘膜上皮细胞相同的程序来检测BMAL1-CLOCK蛋白质复合物(见图24中代替绘图的曲线图)。 
另外，在开始刺激之后于12小时、16小时、20小时和28小时回收细胞。从分别回收的细胞，提取总RNA(生产商名字：AgilentTechnologies，型号编号：5185-6000)，根据常规方法进行PT-PCR，然后，然后定量测定Per1和Per2 mRNA水平。RT-PCR使用的引物序列如“表3”中所示。 
[表3] 
Figure G2007800304414D00271
图25是显示通过定量测定Per1 mRNA水平得到的结果的图(曲线图代替了绘图)，而图26是显示通过定量测定Per2 mRNA水平得到的结果的图(曲线图代替了绘图)。Per1和Per2 mRNA水平计算为内源性对照GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)水平的相对值。 
讨论 
因为BMAL1-CLOCK蛋白质复合物水平的变化方式类似于Per1和Per2 mRNA的变化方式，Per1和Per2的转录是受到BMAL1-CLOCK蛋白质复合物的启动(见并且将图24与图25和26进行比较)，显示BMAL1-CLOCK蛋白质复合物水平反映了BMAL1-CLOCK蛋白质复合物的转录活性。通过这些结果，证明了通过应用本发明，可以检测时钟蛋白质，并且可以实现BMAL1-CLOCK蛋白质复合物的“表达变化”的详细观察。 
以上所介绍的实验实施例是为了说明本发明的应用实例。在通过转录因子的水平、翻译后的修饰程度或者与其它分子形成复合物来实现转录调节的情况中，可以如实施例中所示的使用细胞均质物液体。在转录调节不依赖于以上所述的调节机制而通过转录因子的核内转运来实现的情况中，通过使用核提取液，可以测量转录因子的活性程度。另外，对于作为膜相关蛋白(如Notch或者SREBP)产生，并且被蛋白质裂解酶裂解且转移进入核的转录因子，可以通过使用不含有膜组分等的细胞提取液来测量转录因子的活性程度。 
在转录因子中，有许多直到它们结合于甾类激素才显示转录活性的核受体。通过应用本发明来搜寻或者定量这些核受体的配体(如甾类激素)也是可能的。另外，搜寻、定量或者评价用作这样的核受体的激动剂或者拮抗剂的药物物质也是可能的。还考虑如果可以测量被胆固醇激活的SREBP，可以预防代谢综合症、阿尔兹海默病等。另外，通过测量作为维生素或者激素的核受体的转录因子，可以了解如营养情况的生理状况。当使用纯化的核受体时，可以实现作为配体的维生素或者激素的定量化或者对于核受体亲和性的测量，而且本发明还可以用于靶向核受体的激动剂或者拮抗剂的筛选或者评价。 
工业实用性 
本发明可以用作以高灵敏度荧光检测反应区中存在的极微量物质的技术。例如，它特别用于(1)检测与检测用核酸链互补的靶核酸链；(2)检测除了核酸以外的生物物质；(3)检测生物物质中的化学变化(化学修饰)；(4)检测蛋白质或者其它生物物质的结构改变；(5)检测或者筛选药物候选物质；(6)检测环境激素(内分泌干扰物)；(7)诊断疾病；和(8)如DNA芯片的传感器芯片领域。 
Figure IYZ000005289442200011
Figure IYZ000005289442200021

Claims (6)

1.一种检测用核酸链，至少包括：
荧光物质，可以作为共振激发能量的供体；
淬灭物质，位于能够接受所述共振激发能量的位置；和
核酸链区，位于所述淬灭物质和所述荧光物质之间，并且其中形成有由核酸内切酶裂解的酶裂解位点，
其中，所述核酸链区与靶核酸链互补，
其中，所述检测用核酸链能够在所述酶裂解位点上被裂解，从而实现破碎，并且裂解的所述检测用核酸链还能够被解离成单链，从而扩增所述荧光物质的荧光，
其中，所述酶裂解位点是由双链特异性AP核酸内切酶裂解的脱碱基位点。
2.根据权利要求1所述的检测用核酸链，其特征在于，所述核酸链区是低聚核苷酸链。
3.根据权利要求1所述的检测用核酸链，其特征在于，在所述核酸链区中，存在结合到给定蛋白质的响应元件区。
4.根据权利要求3所述的检测用核酸链，其特征在于，所述蛋白质是转录因子。
5.一种使用检测用核酸链的方法，至少包括以下步骤：
进行有检测用核酸链参与的互补链形成反应，所述检测用核酸链至少具有荧光物质、淬灭物质和核酸链区，所述荧光物质可以用作共振激发能量的供体，所述淬灭物质位于能够接受所述共振激发能量的位置，所述核酸链区位于所述淬灭物质和所述荧光物质之间，并且具有由核酸内切酶裂解的酶裂解位点；和
通过使对所述互补链形成反应获得的双链具有特异性的核酸内切酶发挥作用，在所述酶裂解位点上裂解所述检测用核酸链，从而实现破碎，并且还将所述裂解链解离成单链，从而扩增所述荧光物质的荧光，
其中，所述核酸链区与靶核酸链互补，
其中，所述酶裂解位点是由双链特异性AP核酸内切酶裂解的脱碱基位点，
其中，所述方法是在以下的温度条件下进行：不高于在所述核酸内切酶的所述裂解之前可以进行所述检测用核酸链的所述互补链形成反应的上限温度，并且不低于在所述核酸内切酶的所述裂解之后不能保持或者不能进行所述检测用核酸链的所述片段的所述互补链形成反应的下限温度。
6.一种使用根据权利要求5所述方法的方法，其特征在于，在所述核酸内切酶作用之前和之后测量荧光强度，并且基于荧光扩增的存在与否或者荧光扩增水平来检测以下(1)到(5)中的任何一个：
(1)与所述检测用核酸链互补的靶核酸链；
(2)除了核酸以外的生物物质；
(3)生物物质中的化学变化；
(4)生物物质中的结构变化；和
(5)药物候选物质。
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