WO2008020589A1 - Brin d'acide nucléique utile pour détecter une substance et procédé de détection correspondant - Google Patents

Brin d'acide nucléique utile pour détecter une substance et procédé de détection correspondant Download PDF

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Kazuhiro Nakagawa
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Sony Corporation
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Definitions

  • Nucleic acid strands useful for detecting substances and methods are provided.
  • the present invention relates to a nucleic acid chain useful for detecting a substance and the related technology. More specifically
  • the present invention also relates to a nucleic acid chain in which an enzyme cleavage site is present in the base sequence portion between the fluorescent substance and the quencher substance, and a method using the nucleic acid chain.
  • a technique for detecting the presence or reaction of a substance by detecting fluorescence emitted from the substance is known and widely used in various sensor techniques.
  • a probe substance capable of specifically interacting with the substance present in the reaction field is introduced into the reaction field, and fluorescence previously labeled on the probe substance is converted into the reaction field.
  • a technique for confirming whether or not it can be detected from the field is known.
  • a method of introducing a fluorescently labeled nucleic acid chain toward a nucleic acid chain immobilized on the surface of a substrate (chip) and detecting the presence or absence of hybridization between the two nucleic acid chains by fluorescence detection is the method of a DNA chip. It is a conventional technique.
  • intercalator when single-stranded nucleic acids existing in a reaction field are hybridized, a substance that specifically binds to its complementary binding portion and emits fluorescence, a so-called "intercalator”. Is also known. This intercalator has the advantage that it saves the trouble of pre-labeling the fluorescent substance on the nucleic acid chain.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • bioluminescence resonance energy transfer is a biophysical method capable of directly detecting protein-protein interactions.
  • This “BRET” is a process found in marine organisms such as the jellyfish Aequore a victoria Renilla reniformis. It is possible to detect the energy release of the acceptor protein with fluorescence. Therefore, BRET can be a useful technique for detecting protein-protein interactions.
  • a generally performed technique is to improve the detection sensitivity by amplifying the trace substance.
  • a technique for amplifying a very small amount of nucleic acid chain to be detected by a PCR (polymerase chain reaction) method is widely used!
  • the main object of the present invention is to provide a technique that can detect a trace amount substance with high sensitivity without performing amplification of the trace quantity substance.
  • a fluorescent substance that can be a donor of resonance excitation energy, a quencher substance that exists at a position where the resonance excitation energy can be received, and the quencher substance
  • a nucleic acid chain for detection having at least a nucleic acid chain portion located between the fluorescent substances and having an enzyme cleavage site cleaved by an endonuclease.
  • nucleic acid chain means a polymer (nucleotide chain) of a phosphate ester of a nucleoside in which a purine or pyrimidine base and a sugar are glycosidically linked, and includes an oligonucleotide, polynucleotide, purine nucleotide and pyrimidine nucleoside containing probe DNA. It includes a wide range of DNAs (including full-length or fragments thereof), cDNA obtained by reverse transcription (c-probe DNA), and RNA.
  • Endonuclease is a general term for nucleolytic enzymes that cleave the inside of a nucleic acid chain.
  • the present enzyme is used alone or in combination with an enzyme that exerts another cooperative action.
  • a “detection nucleic acid chain” is a nucleic acid chain used for the purpose of detecting a predetermined substance, reaction (including chemical bonds, interactions, etc.), structure, etc., and is sometimes called a probe nucleic acid chain. This is consistent with the concept.
  • Examples of the enzyme cleavage site present in the nucleic acid chain part constituting the nucleic acid chain for detection according to the present invention include, for example, a base missing site (AP site that can be cleaved by a double-strand-specific AP-endonuclease. ) Power to raise S.
  • a base missing site AP site that can be cleaved by a double-strand-specific AP-endonuclease.
  • the “AP site (Apurinic / Apyrimidinic site)” means a site where a base is missing (dropped) in a nucleic acid chain! /
  • AP-endonuclease is an enzyme having an AP lyase activity that inserts a nick (nick) in the nucleic acid chain.
  • Endonucleas e VI-Endonuclease IV (cutting the 5 'side of the AP site), Endonuclease ⁇ (cutting the 3' side of the heel site 13 ⁇ 4, Endonuclease SI, Endonuclease VIII, Pormamidopynmidine-DNA-glycosyl ase (Fpg), OGG1, etc.
  • Particularly useful AP-endonuclease in the present invention is to specifically recognize a double strand and one nucleic acid strand having a base deletion site to the base. It is an enzyme that cleaves at the missing site.
  • the number of bases (number of nucleic acid molecules) of the nucleic acid chain according to the present invention is not particularly limited.
  • it is an oligonucleotide chain
  • the use of the nucleic acid chain is not particularly limited.
  • it can be used as a probe for detecting a target substance (substance for detection).
  • the oligonucleotide chain means a nucleotide polymer of about several tens of bases, for example, about 15 to 30 bases.
  • the nucleic acid chain portion may be, for example, a protein having a response base sequence region that binds to a predetermined protein.
  • the protein is a protein having a function of binding to a nucleic acid chain, and an example thereof is a transcription factor. .
  • the present invention provides (1) a fluorescent substance that can be a donor of resonance excitation energy, and a position where the resonance excitation energy can be received.
  • a fluorescent substance that can be a donor of resonance excitation energy, and a position where the resonance excitation energy can be received.
  • the present invention provides a method for using a nucleic acid chain that at least carries out the procedure for amplifying the fluorescence of the fluorescent substance by dissociating it into a single strand, and the procedures (1) and (2).
  • the "complementary strand formation reaction” is a so-called hybridization between nucleic acids (nucleotide strands), and widely includes DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA complementary binding, and the like.
  • the detection nucleic acid strand in a fluorescence-reduced or quenched state is formed into a double strand with a complementary nucleic acid strand by the action of a quencher substance.
  • the detection nucleic acid strand is cleaved at the endonuclease cleavage site and dissociated into single strands by the action of a double strand-specific endonuclease.
  • the nucleic acid strand for detection is fragmented and released into a nucleic acid chain on the fluorescent substance side and a nucleic acid chain on the single substance side, so that the fluorescent substance is at a distance from the quencher substance.
  • the fluorescence will be amplified (without the influence of the Taentia substance).
  • the detection nucleic acid strand before endonuclease cleavage is not more than an upper limit temperature at which the complementary strand formation reaction can proceed, and the detection nucleic acid strand fragment after endonuclease cleavage is complementary strand formation.
  • the reaction can be carried out under a temperature condition higher than the temperature at which the reaction cannot be maintained or proceeded.
  • the detection nucleic acid strand formed a double strand (complementary strand), ie, the probe nucleic acid
  • the target nucleic acid strand that is complementary to the strand exists, that there is a biological substance other than the nucleic acid, that there is a chemical or structural change in the biological substance, and that there is a drug candidate substance. , Etc. Power to know.
  • the trace amount is detected. It can be detected with high sensitivity without amplification of the substance.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the concept of a nucleic acid strand for detection according to the present invention and an example embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing an embodiment in which both a fluorescent substance (F) and a quencher substance (Q) are bound to a midway portion of the nucleic acid chain among the nucleic acid chains for detection.
  • Fig. 3 is a view showing another embodiment example in which the fluorescent substance (F) is bound to the terminal portion and one quencher substance (Q) is bound to the intermediate portion of the detection nucleic acid chain.
  • Fig. 4 is a view showing still another embodiment in which the fluorescent substance (F) is bound to the middle part and one quencher substance (Q) is bound to the terminal part of the nucleic acid chain for detection. .
  • FIG. 5 is a diagram showing the function of the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention and a typical use example thereof.
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing how a cut is formed in AP site X by AP-endonuclease E.
  • FIG. 7 shows that the nucleic acid strand fragments (P, P) for detection cleaved by AP-endonuclease (E) dissociate from the nucleic acid strand (T) under the appropriate temperature condition (t).
  • reaction chain (R) as a chain
  • FIG. 8 is a diagram showing a basic flow of “cycle reaction” by the nucleic acid strand for detection P according to the present invention.
  • Fig. 9 shows detection nucleic acid chains (P) that have not been cleaved and nucleic acids for detection (that have been cleaved by AP-endonuclease E) due to changes in the temperature conditions of the reaction field (R). It is a reference figure which shows the mode of the double strand formation or dissociation of a chain
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the concept of a first applied method example using the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the concept of a second applied method example using the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing a concept of a third applied method example using the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing the concept of a fourth applied method example using the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention.
  • FIG. 14 is a schematic diagram showing the concept of a fifth applied method example using the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention.
  • FIG. 15 is a schematic diagram showing the concept of a sixth applied method example using the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention.
  • FIG. 16 is a diagram showing the concept of the seventh applied method example using the detection nucleic acid strand (P) according to the present invention, in which a substance (for example, protein Dx) before structural change is detected.
  • a substance for example, protein Dx
  • FIG. 17 is a diagram showing the concept of the seventh applied method example, and is a schematic diagram in the case of detecting a substance after structural change (for example, protein Dy).
  • FIG. 18 is a diagram showing the concept of the eighth application example, and is a schematic diagram showing an example in which the detection nucleic acid chain P is used as a DNA chip probe.
  • Fig. 19 shows the result of experiment 1: reaction of lOOfmol target nucleic acid strand and 8 pmol of detection nucleic acid strand (having AP site) with AP-endonuclease to detect cleavage of detection nucleic acid strand It is a figure (photograph which shows the result of agarose electrophoresis) which shows.
  • Fig. 20 is a diagram (Experimental Example 2: Fluorescence signal amplification detected over time) (Experimental axis: Fluorescence intensity, Horizontal axis: Time (minutes)).
  • FIG. 21 is a graph (graph) obtained by plotting Experimental Example 2: Concentration of each target nucleic acid strand and initial reaction rate using “Line weaver Burk Plotj”.
  • Fig. 22 shows the results of measurement of the increase in fluorescence of Experimental Example 3: Fluorescent Dye (FITC) over time, and plots the increase rate of fluorescence per unit time at each time (drawing cost)
  • FITC Fluorescent Dye
  • FIG. 23 is a diagram (drawing substitute graph) showing the result of detecting BMAL1-CLOCK complex by shaking the number of Hela cells (horizontal axis) in Experimental Example 3: Hela cells.
  • FIG. 24 shows experimental example 4: Hela cells were stimulated with a culture solution (DMEM medium) containing 50 Horse Serum for 2 hours, and the force at the start of stimulation was 15 hours, 17.5 hours, 20 hours, 22
  • Figure 5 shows the results of recovering cells after 5 hours and detecting the BMAL1-CLOCK protein complex (drawing substitute)
  • FIG. 25 is a diagram (drawing substitute graph) showing the result of quantifying the amount of mRNA of Experimental Example 4: Perl.
  • FIG. 26 is a diagram (diagram substitute for drawing) showing the results of quantifying the amount of mRNA of Experimental Example 4: Per2;
  • Figs. 1 to 4 are diagrams for explaining the concept of a nucleic acid chain for detection according to the present invention and an embodiment.
  • the detection nucleic acid chain P includes a fluorescent substance F that can be a donor of resonance excitation energy, a quencher substance Q that exists at a position where the resonance excitation energy can be received, and the quencher substance.
  • fluorescent substance F is bound (labeled) to the T-end or ⁇ -end of a nucleic acid chain having a predetermined molecular length, and a single substance Q is bound to the end opposite to the fluorescent substance F.
  • the entire nucleic acid chain is located between the fluorescent substance F and the quencher substance Q, so that the entire nucleic acid chain part corresponds to the nucleic acid chain part N in the present invention. (See Figure 1).
  • the nucleic acid strand region is the nucleic acid strand portion N referred to in the present invention (see FIGS. 2 to 4).
  • Fig. 2 shows an embodiment in which both the fluorescent substance F and the quencher substance Q are bound to an intermediate site of the nucleic acid chain
  • Fig. 3 shows the fluorescent substance F as a terminal site and one quencher
  • FIG. 4 shows another embodiment in which the substance Q is bonded to the intermediate site
  • FIG. Still another embodiment example in which the single substance Q is bound to the terminal site is shown respectively.
  • FIG. 5 is a diagram showing the function of the detection nucleic acid strand P according to the present invention and a typical use example thereof.
  • the example shown in FIG. 5 shows an example in which the detection nucleic acid strand P is used to detect the presence and amount of a nucleic acid strand T having a base sequence complementary to the nucleic acid strand portion N.
  • the detection nucleic acid chain P shown in FIG. 1 is described as a representative example (the detection nucleic acid chain P in FIGS. 2 to 4 may also be! /).
  • the nucleic acid strand P for detection is reduced or quenched by the action of the quencher substance Q before the predetermined enzyme treatment (described later) is performed. .
  • T the nucleic acid strand portion N and the nucleic acid strand T form a double strand (complementary strand) (complementary strand formation procedure).
  • the symbol W in FIG. 5 indicates a double-stranded (complementary strand) portion generated by the above-described complementary strand formation procedure! (Hereinafter the same).
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing how a cut is formed in AP site X by AP-endonuclease E.
  • the double-stranded (complementary-stranded) portion W (see Fig. 5) and the double-stranded W and double-stranded W (see Fig. 6) shortened by AP-endonuclease E are: Because the chain length is different, t (mel
  • the buffer solution temperature condition in the reaction field R is not more than the temperature t at which the nucleic acid strand P for detection before cleavage by AP-endonuclease E can proceed or maintain the complementary strand formation reaction.
  • nucleic acid for detection after cleavage with AP-endonuclease E More than temperature t at which strand fragments P and P (see Fig. 6) cannot maintain or proceed with complementary strand formation reaction
  • FIG. 7 shows that the nucleic acid strand fragments P and P for detection cleaved by AP-endonuclease E (see FIG. 6) were dissociated from the nucleic acid strand T under the above-mentioned appropriate temperature condition t to form a single strand.
  • Reaction field R
  • FIG. 9 shows that the nucleic acid chain P for detection (not cleaved) and the nucleic acid chain fragment Pl for detection (cleaved by AP-endonuclease E) by changing the temperature conditions of the reaction field R
  • FIG. 3 is a reference diagram showing the state of P2 duplex formation or dissociation.
  • FIG. 9 will be specifically explained. Under the condition of temperature t below the temperature, the nucleic acid strand for detection P
  • the nucleic acid strand for detection P forms the complementary strand.
  • the reaction can proceed and the formed complementary strand can be maintained.
  • the detection nucleic acid chain fragments P and P shortened by AP-endase E are extracted from the nucleic acid chain.
  • the detection nucleic acid strand P is also dissociated into single strands, and AP-
  • Nucleic acid strand fragments P and P for detection shortened by denuclease E are also released from nucleic acid strand T.
  • the present invention introduces an excessive amount of the detection nucleic acid chain P relative to the reaction field R relative to the nucleic acid chain T, thereby obtaining "the nucleic acid chain T and the detection nucleic acid chain P.
  • Complementary strand formation between see Fig. 5) " ⁇ " Shortening of detection nucleic acid strand P with AP-endonuclease E (see Fig. 6) " ⁇ ” Shortened detection nucleic acid strand fragments P and P Dissociation from nucleic acid strand T and accompanying fluorescence amplification (Fig.
  • FIG. 8 is a diagram showing a basic flow of this cycle reaction.
  • the presence of the nucleic acid strand ⁇ ⁇ is shown from a very small amount (quenched by the Taentia substance Q). Since a strong fluorescent signal derived from the fluorescent substance F (which has been lost) can be obtained from the reaction field R, nucleic acid strands can be detected with high sensitivity.
  • the setting of the temperature condition of the reaction field R is important that the complementary strand formation between the nucleic acid strand ⁇ and the detection nucleic acid strand ⁇ can proceed. Therefore, the condition of temperature t exceeding t as shown in Fig. 9 is not preferable.
  • the temperature conditions suitable for the present invention are, as described above, the temperature at which the detection nucleic acid strand P before cleavage by AP-endonuclease E can proceed or maintain the complementary strand formation reaction. and the detection nucleic acid strand fragments P and P (see FIG. 6) after cleavage with AP-endonuclease E cannot maintain or proceed with the complementary strand formation reaction.
  • the temperature becomes higher than the temperature t (ie, temperature ⁇ t ⁇ t) (see Fig. 9 again).
  • the detection nucleic acid chain fragments P and P have different chain lengths.
  • both the nucleic acid strand fragments for detection P and P are solved from the nucleic acid strand ⁇ b 1 2
  • a feature of the present invention common to all of the application methods exemplified below is that a very small amount of substance is produced by the above "cycle reaction” involving an excessive amount of the detection nucleic acid strand P introduced into the reaction field. This means that it is possible to detect a small amount of reaction, interaction, and change in material structure with high sensitivity. Since this is a duplicate, I will omit the detailed explanation for each case.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a concept of a first applied method example using the detection nucleic acid strand P according to the present invention.
  • This first applied method example is useful for verifying whether or not the target base sequence region exists in the base sequence of the nucleic acid strand Y. For example, heredity It can be confirmed whether or not a specific response nucleotide sequence for a specific transcription factor is present in the promoter region located upstream of the child.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the concept of a second applied method example using the nucleic acid strand for detection P according to the present invention.
  • a substance for example, a protein
  • a detection target exists on the surface S of a solid phase (for example, a substrate, a bead, or a carrier).
  • a solid phase for example, a substrate, a bead, or a carrier.
  • the substance M If the substance M is present in the sample solution, the nucleic acid strand Z forming the complementary strand and the detection nucleic acid strand P are bound to the substance M, so that the complementary strand
  • AP-endonuclease E acts to cut the complementary strand (AP portion X of the nucleic acid strand portion N constituting it) into a single strand. For this reason, even if the content of the substance M is extremely small, a strong fluorescence signal can be obtained from the fluorescent substance F constituting the detection nucleic acid chain P. Thereby, the substance M can be detected with high sensitivity.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing the concept of a third applied method example using the nucleic acid strand for detection P according to the present invention. According to this third applied method example, it is possible to detect the reaction and interaction of substance L with substance K immobilized on surface S of a solid phase (eg, substrate, beads, etc.).
  • a solid phase eg, substrate, beads, etc.
  • a sample solution containing a substance L for verifying the presence or absence of a reaction or interaction with the substance K with respect to the reaction field R on which the surface S on which the substance K is previously immobilized is exposed. Then, the reaction field R is washed with a solution.
  • Substance L contains nucleic acid chain Z with a predetermined base sequence.
  • the nucleic acid strand portion N is complementary to the base sequence of the nucleic acid strand Z.
  • the detection nucleic acid strand P is introduced, and then double-strand-specific AP-endonuclease E is introduced into the reaction field R.
  • AP-endonuclease E specific to double strand acts on the complementary strand, and a cut is made in the complementary strand (AP site X of the nucleic acid strand portion N constituting it). It becomes a main chain. For this reason, even if the amount of reaction or interaction between substance K and substance L is very small, the fluorescence signal can be obtained from the fluorescent substance F that forms the nucleic acid chain P for detection.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing the concept of a fourth applied method example using the detection nucleic acid strand P according to the present invention.
  • a low molecular weight compound that can be a drug candidate for example, a compound that can bind to a receptor and become an agonist or antagonist can be detected or screened with high sensitivity.
  • a sample solution containing a candidate substance V that can bind to or interact with the substance U is introduced toward the substance U existing on the solid phase surface S such as a substrate, and then Wash the reaction field R with a solution.
  • Substance V is labeled in advance with nucleic acid strand Z having a predetermined base sequence.
  • nucleic acid chain portion N complementary to the base sequence of the nucleic acid chain Z is present.
  • the detection nucleic acid strand P to be introduced is introduced, and then double-strand-specific AP-endonuclease E is introduced into the reaction field R.
  • the candidate substance V binds to each other, the candidate substance V is labeled in the reaction field R! /, And the nucleic acid chain Z and the detection nucleic acid chain P (the nucleic acid chain part N) are To form complementary strands
  • a double-strand-specific AP-endonuclease E acts on the complementary strand, and the complementary strand (AP site X of the nucleic acid strand portion N constituting it) is cut to become a single strand. Therefore, even if the binding amount between substance U and candidate substance V is very small, nucleic acid strand P for detection is constituted. A strong fluorescent signal from fluorescent substance F is obtained.
  • FIG. 14 is a schematic diagram showing the concept of a fifth applied method example using the nucleic acid strand for detection P according to the present invention.
  • environmental hormones endocrine disrupting substances
  • transcription factor J DNA binding protein
  • DNA binding protein changes its structure when hormone H binds to it, so that it binds to the response base sequence region existing in the upstream region of the gene, and It has a function of promoting transcription.
  • endocrine disruptors called environmental hormones are substances that behave in the same way as hormone H in the body.
  • a transcription factor (an intranuclear receptor) J is previously present (for example, immobilized) on a solid phase surface S such as a substrate or a bead, and a nucleic acid corresponding to the response base sequence region.
  • Nucleic acid strand P for detection having nucleic acid strand portion N complementary to the base sequence of strand Z and nucleic acid strand Z
  • a hormone-like substance h is introduced into the reaction field R of such a substance environment in order to verify whether it can become an endocrine disruptor.
  • the hormone-like substance h has a function similar to that of hormone H, the structure of transcription factor J is changed by the action of hormone-like substance h.
  • the reaction field R where the transcription factor J that has undergone this structural change is present, a nucleic acid chain Z corresponding to the above-mentioned response base sequence region and a nucleic acid chain portion N that forms a double strand with the nucleic acid chain Z
  • a nucleic acid strand P for detection is further introduced, and a double strand-specific AP-endonuclease E is introduced into the reaction field R.
  • a different AP-endonuclease E acts to break the complementary strand (AP site X of the nucleic acid strand portion N constituting it) into a single strand.
  • FIG. 15 is a schematic diagram showing the concept of a sixth applied method example using the detection nucleic acid strand P according to the present invention. According to this sixth applied method example, for example, detection of a post-translational modification reaction of a protein can be performed.
  • a protein may be modified after translation via an enzymatic reaction or the like.
  • phosphorylation is a typical example.
  • a protein D to be detected is previously present (for example, immobilized) on the solid phase surface S such as a substrate, and the protein D is not modified (for example, phosphorylated).
  • Antibody B that specifically binds to antibody B and antibody B that specifically binds to the modified (eg, phosphorylated) portion should also be present.
  • antibody B and antibody B have a nucleic acid chain consisting of a unique base sequence in advance.
  • the detection nucleic acid strand Pa has a nucleic acid strand portion Na complementary to the nucleic acid strand Za, and the nucleic acid strand portion Nb complementary to the nucleic acid strand Zb.
  • the detection nucleic acid strand Pb is introduced together.
  • the detection nucleic acid chain Pa is labeled with a fluorescent substance F that can emit fluorescence of a predetermined wavelength
  • the detection nucleic acid chain Pb is a fluorescent substance that can emit fluorescence with a wavelength different from that of the fluorescent substance F. Try to label F.
  • the detection nucleic acid chain Pa binds to all the proteins D present in the reaction field R via the complementary chain, so that the fluorescent substance F constituting the detection nucleic acid chain Pa
  • the fluorescent substance F constituting the detection nucleic acid chain Pa
  • the modified nucleic acid D is bound to the detection nucleic acid strand Pb via a complementary strand.
  • the number of molecules of the modified protein D can be predicted.
  • FIG. 16 and 17 are schematic diagrams showing the concept of a seventh applied method example using the detection nucleic acid strand P according to the present invention.
  • FIG. 16 is a schematic diagram when a substance (for example, protein) before structural change is detected
  • FIG. 17 is a schematic diagram when a substance (for example, protein) after structural change is detected. According to this seventh applied method example, it is possible to detect the structural change of a substance and the numerical ratio of the structural change.
  • a protein may exhibit a specific function by the action of other factors to change its higher-order structure. Therefore, the function and activity of the substance can be known by detecting such a structural change of the substance.
  • a specific description will be given based on FIGS. 16 and 17.
  • the symbol Dx shown in FIG. 16 indicates the protein before the structural change, while the symbol Dy shown in FIG. 17 indicates the protein after the structural change.
  • an antibody B nucleic acid chain Za is labeled
  • antibody B that specifically binds to the structural site dl of protein Dx to reaction field R where protein Dx immobilized on surface S is present.
  • antibody B that specifically binds to the structural site d2 of the protein Dx (labeled with nucleic acid chain Zb), fluorescence wavelength
  • the nucleic acid strand portion Na constituting the detection nucleic acid strand Pa is complementary to the nucleic acid strand Za labeled with the antibody B, and thus forms a double strand, constituting one detection nucleic acid strand Pb.
  • Nucleic acid strand part Nb is complementary to the nucleic acid strand Zb labeled with antibody B, forming a double strand
  • the reaction site R where the protein Dy immobilized on the surface S (a protein having a structural change) is present is characteristic of the structural site dl of the protein Dx (see FIG. 16).
  • Acid chain Zb is labeled) and two types of nucleic acid chains Pa and Pb for detection with different fluorescence wavelengths are introduced.
  • the protein Dy present on the surface S has undergone a modification that causes a structural change, and is not a protein Dx that has not undergone a structural change.
  • both proteins Dx and Dy can be detected simultaneously by analyzing the fluorescence signal. For example, it can be applied to the detection of trace amounts of / 3 amyloid structural change, and thus diagnosis of Alzheimer's disease.
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing the concept of a seventh application example using the detection nucleic acid strand P according to the present invention.
  • the seventh application example is an example in which the nucleic acid strand for detection P is used as a probe for a DNA chip.
  • the nucleic acid strand P for detection according to the present invention can also be applied to other sensor technologies other than DNA chips.
  • Complementary strands are successively formed between the nucleic acid strand portions N of P 1 and P 2.
  • nucleic acid strand N When the nucleic acid strand N is fragmented (shortened) by a double strand-specific AP-endonuclease (not shown in FIG. 18), the nucleic acid strand T of the detection nucleic acid strand fragment that has been shortened A series of reactions (cycle reactions) occur in which the dissociation of force occurs and the accompanying fluorescence amplification occurs.
  • nucleic acid strand for detection P when used as a probe for a DNA chip, a single nucleic acid strand T as a target is composed of a plurality of probes ( In the example shown in Fig. 18, it is used by P 1, P 2, P 2, and P), so highly sensitive detection is possible.
  • the concentration of the target can be measured from the reaction rate.
  • the force required to label the target nucleic acid strand T with a fluorescent dye can be saved. Furthermore, in the conventional DNA chip, the hybridized target nucleic acid strand T is fixed to the probe, so that the apparent concentration of the target nucleic acid strand T near the hybridization reaction field decreases, and the efficiency of the hybridization is reduced.
  • the detection nucleic acid strand P according to the present invention is used, the target nucleic acid strand T is not fixed, and the target nucleic acid strand T in the vicinity of the hybridization reaction field is apparent. It can be expected that the concentration does not decrease and the efficiency of the hybridization is improved.
  • nucleic acid chain portion SEQ ID NO: 2
  • FIG. Etc a cycle reaction involving re-reference
  • SEQ ID NO: 3 a large amount of nucleic acid chain fragments for detection were generated by the action of AP-endonuclease
  • the AP-endonuclease used in this experiment is human AP-endonuclease (APE 1), and the fluorescent substance used for the nucleic acid strand for detection is the fluorescent dye FAM (bound to the 5 'end).
  • FAM fluorescent dye
  • TAMRA attachmented to the 3 'end.
  • AP-endonuclease was added to the reaction field where lOOfmol target nucleic acid strand and 8 pmol of detection nucleic acid strand (having an AP site) existed for reaction.
  • the reaction is performed at 37, 42, and 47 ° C within the appropriate temperature, and these reaction solutions are added with AP-endase!
  • Electrophoresis was performed, separation was performed according to the size of the nucleic acid strand for detection, and detection was performed using a bound fluorescent dye.
  • the degree V can be expressed by a linear equation. Therefore, it was shown that the target nucleic acid strand can be quantified in the same concentration range (see FIG. 21).
  • This experimental example shows that an example of the application method according to the present invention was actually implemented and succeeded. Specifically, this experimental example detected the BMAL1-CLOCK complex, which is a biological clock gene product (clock protein) having transcription factor activity from human oral mucosal epithelial cells. It is an experimental example which shows that the detection of was successful.
  • BMAL1-CLOCK complex which is a biological clock gene product (clock protein) having transcription factor activity from human oral mucosal epithelial cells. It is an experimental example which shows that the detection of was successful.
  • the “nucleic acid strand for detection” used in this experimental example has the following base sequence structure in which a fluorescent dye (FITC) is bound to the 5 ′ end and a quencher substance (BHQ) is bound to the 3 ′ end.
  • the oligo DNA provided is the sixth base from the 5 'end (missing guanine: AP site) (see Table 1).
  • the nucleic acid strand that forms a double strand with this nucleic acid strand for detection is shown in Table 2.
  • the anti-BMALl antibody (Santa Cruz Biotechnology) was used as the antibody.
  • antibody magnetic beads were prepared by the following procedure. The above-described antibody was immobilized using magnetic beads (micromer-M [PE G-COOH], micromod PartiKeltechnologie ⁇ Boko PolyLink-Protein coupling Kit for COOOH Microparticles (Polyscience)).
  • the antibody magnetic beads were set to 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM C1, 2.5 2.27926e + 2891ycerol, lOmM EDTA, 0 • 05P-40, 0.05 mg / mL salmon sperm DNA, 0.2 each.
  • the suspension was suspended in a ⁇ M detection nucleic acid probe (double-stranded DNA comprising probe nucleic acids 1 and 2) and incubated at 37 ° C. lhr.
  • the antibody magnetic beads were washed three times with 500 L of PBS-T to wash away nonspecifically bound molecules and probe nucleic acids.
  • the so-called clock protein is a transcription factor and the most important circadian rhythm in biological rhythm. It is an autonomous oscillator that moves the music.
  • a transcription factor, clock protein induces the expression of other clock proteins, and the induced clock protein also functions as a transcription factor and represses transcription of other (original) clock proteins.
  • This negative feed loop is currently considered to function as a vibrator for a strong deer rhythm.
  • the clock protein that is a transcription factor is a core of the biological clock, it is considered that measuring this clock protein is most suitable for measuring the biological rhythm of an organism.
  • the human sleep-wake cycle is constrained by social life that is not limited to the autonomous control of the body clock, so there is a gap between the rhythm of the sleep-wake cycle and the autonomous rhythm of the body clock. It may cause poor physical condition as typified by jet lag and also the above-mentioned poor health condition.
  • the amount of enzymes that metabolize drugs in the body has a strong dian rhythm, and the amount of molecules targeted by drugs often has a strong dian rhythm. It is known that there is a rhythm, and the idea of chronotherapy with a prescribed medication time is spreading.
  • the present invention a predetermined experiment was performed to demonstrate that the expression variation of the BMALl-CLOCK protein complex can be observed from Hela cells.
  • the promoter region has an E-box sequence to which the BMAL 1-CLOCK protein complex binds, and the fluctuation pattern of the mRNA, Perl, Per 2, which is activated by the BMALl-CLOCK protein complex, is observed. Comparison with expression change of BMALl-CLOCK protein complex.
  • BMALl-CLOCK protein complex was detected in the same manner as oral mucosal epithelial cells (Fig. 24). (See drawing substitute graph).
  • the primer sequences used in RT-PCR are shown in “Table 3” below.
  • FIG. 25 is a diagram (drawing substitute graph) showing the results of quantifying the amount of Perl mRNA
  • FIG. 26 is a diagram (drawing substitute graph) showing the results of quantifying the amount of Per2 mRNA.
  • the mRNA levels of Perl and Per2 were calculated as values relative to the amount of GAPDH (glyceraldehy de-3-phosphate dehydrogenase) as an endogenous control.
  • the fluctuation pattern of the amount of BMAL1-CLOCK protein complex is similar to the fluctuation pattern of Perl and Per2 mRNA whose transcription is activated by the BMAL1-CLOCK protein complex ( Figures 24 and 25). And comparison with FIG. 26), it was shown that the BMAL1-CLOCK protein complex quantity S reflects the transcriptional activity of the BMAL1-CL0CK protein complex. From these results, it was demonstrated that by applying the present invention, it is possible to detect clock proteins and to observe in detail the “expression fluctuation” of the BMAL1-CLOCK protein complex. .
  • Some transcription factors have transcription activity only after binding to steroid hormones. There are many nuclear receptors. By applying the present invention, it is also possible to search and quantify these nuclear receptor ligands (steroid hormones, etc.). It is also possible to search, quantify, and evaluate drugs that act as agonists and antagonists for nuclear receptors. If SREBP activated by cholesterol is measured, metabolic syndrome and Alzheimer's can be prevented, and nutritional status can be determined by measuring transcription factors that serve as nuclear receptors for vitamin N honoremon. Ability to know physiological conditions including Using purified nuclear receptors, it is possible to quantify vitamins and hormones as ligands and to measure affinity with nuclear receptors, and screen for antagonists and antagonists that target nuclear receptors. It is also possible to apply the present invention to evaluation.
  • the present invention can be used as a technique for detecting a very small amount of substance present in a reaction field with high sensitivity. For example,

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Description

明 細 書
物質の検出等に有用な核酸鎖とその方法
技術分野
[0001] 本発明は、物質の検出等に有用な核酸鎖とその関連技術に関する。より詳細には
、蛍光物質とクェンチヤ一物質の間の塩基配列部分に酵素切断部位が存在する核 酸鎖、並びに該核酸鎖を用いる方法に関する。
背景技術
[0002] 物質から発せられる蛍光を検出することにより、物質の存在や反応等を検出する技 術が知られており、種々のセンサー技術などに広く利用されている。
[0003] 例えば、反応場に存在している物質の存在を、当該物質と特異的に相互作用し得 るプローブ物質を前記反応場に導入し、該プローブ物質に予め標識された蛍光が該 反応場から検出できるか否かによって確認する技術が知られている。例えば、基板（ チップ)表面に固定された核酸鎖に向けて、蛍光標識された核酸鎖を導入して、両 核酸鎖間のハイブリダィゼーシヨンの有無を蛍光検出により行う手法は DNAチップ の慣用技術である。
[0004] また、反応場に存在している一本鎖核酸同士がハイブリダィゼーシヨンしたときに、 その相補結合部分に特異的に結合して蛍光を発する物質、いわゆる「インターカレ 一ター」も知られている。このインターカレーターは、核酸鎖に蛍光物質を予め標識し ておく手間が省けるなどの利点がある。
[0005] 「FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)」は、励起された蛍光物質（Do nor)から放出された共鳴励起エネルギーを受け取った蛍光物質 (Acc印 tor)が励起 状態となって蛍光が発せられる現象又は原理を言う。この「FRET」が起こるためには 、ドナーとァクセプターの蛍光スペクトルが重なり合うこと、両物質が一定程度の範囲 や適切な位置関係にあることが必要である。この「FRET」を利用して、ドナーとなる 蛍光物質がラベルされた物質とァクセプターとなる蛍光物質がラベルされた物質との 相互作用の有無を検出する技術が知られている（例えば、特開 2004— 065262号 公報、特開 2005— 207823号公報参照）。 [0006] 次に、「生物発光共鳴エネルギー移動（BRET)」は、タンパク質間相互作用を直接 的に検出できる生物物理学的な方法である。この「BRET」は、もともとクラゲ Aequore a victoriaゃゥミシィタケ Renilla reniformisなどの海洋生物に認められるプロセスであり 、ドナータンパク質とァクセプタータンパク質が接近したきに発生する、ドナータンパク 質の励起エネルギー移動に伴うァクセプタータンパク質のエネルギー放出を、蛍光 検出すること力 Sできる。したがって、 BRETは、タンパク質間の相互作用を検出する有 用な技術となり得る。
[0007] 反応場や試料溶液中に存在する極微量物質を検出しょうとする場合に、一般的に 行われる手法は、前記極微量物質を増幅させることによって検出感度を向上させるこ とである。例えば、検出対象となる極微量の核酸鎖を、 PCR (polymerase chain reacti on)法によって増幅する技術は広く行われて!/、る。
[0008] しかし、極微量物質の増幅には、慎重な作業が要求され、手間もかかり、また、特別 の高価な装置も必要となる場合が多い。さらに、作業に慎重を期しても、 目的対象外 の物質が増幅過程で副次的に発生してしまう可能性があり、この場合は検出ノイズの 原因となってしまうという技術的課題があった。加えて、タンパク質や脂質などの生体 物質は核酸鎖に比べて増幅することが難しレヽとレ、う技術的課題もある。
[0009] そこで、本発明は、極微量物質を検出する際に、当該極微量物質の増幅を行わな くても高感度に検出することができる技術を提供することを主な目的とする。
発明の開示
[0010] 本発明では、まず、共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy)のドナ 一となり得る蛍光物質と、前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に 存在するクェンチヤ一物質と、該クェンチヤ一物質と前記蛍光物質の間に位置して おり、エンドヌクレアーゼにより切断される酵素切断部位が形成された核酸鎖部分と、 を少なくとも有する検出用核酸鎖を提供する。
[0011] なお、「タエンチヤー物質」は、蛍光を低減又は消光する機能を有する物質を広く意 味し狭く限定されない。「核酸鎖」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合 したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブ DN Aを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオ チォドが重合した DNA (全長あるいはその断片）、逆転写により得られる cDNA (cプ ローブ DNA)、 RNA等を広く含む。
[0012] 「エンドヌクレアーゼ」は、核酸鎖の内部を切断する核酸分解酵素の総称であり、本 発明では本酵素を単独で用いたり、あるいは他の協働的作用を発揮する酵素と併用 したりする。「検出用核酸鎖」は、所定の物質、反応 (化学的結合、相互作用等を含 む）、構造等を検出する目的で用いられる核酸鎖であり、場合によってはプローブ核 酸鎖と称されるような概念と一致する。
[0013] 本発明に係る検出用核酸鎖を構成する核酸鎖部分に存在する前記酵素切断部位 としては、例えば、二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼによって切断され得る塩 基欠落部位 (AP部位）を挙げること力 Sできる。
[0014] なお、「AP部位 (Apurinic/Apyrimidinic site)」は、核酸鎖にお!/、て塩基が欠落（脱 落）して!/、る部位を意味し、「AP-エンドヌクレアーゼ（AP-endonuclease又は Apurinic /Apyrimidinic endonuclease)」は、核酸鎖にお!/、て AP部位にニック（nick、切れ目 )を 入れる APリアーゼ活性を有する酵素である。その例を幾つか挙げると、 Endonucleas e VI - Endonuclease IV (AP部位の 5' 側を切断）、 Endonuclease ΠΙ(ΑΡ部位の 3' 側 を切 1¾リ、 Endonuclease SI, Endonuclease VIII、 Pormamidopynmidine-DNA-glycosyl ase (Fpg)、 OGG1などである。本発明において、特に有用な AP-エンドヌクレアーゼ は、二本鎖を特異的に認識し、かつ、塩基欠落部位を有する側の一方の核酸鎖を当 該塩基欠落部位にお!/、て切断する酵素である。
[0015] 本発明に係る核酸鎖の塩基数 (核酸分子数）は、特に限定されないが、例えば、ォ リゴヌクレオチド鎖であって、同核酸鎖の用途についても特に限定はされないが、一 例を挙げれば、標的物質 (検出目的の物質）を検出するためのプローブとして用いる こと力 Sできる。なお、オリゴヌクレオチド鎖とは、数十塩基程度、例えば、 15〜30塩基 程度のヌクレオチドポリマーを意味する。核酸鎖部分は、例えば、所定のタンパク質と 結合する応答塩基配列領域が存在するものでもよぐ該タンパク質は、核酸鎖に結 合する機能を有するタンパク質であって、その一例は、転写因子である。
[0016] 次に、本発明は、（1)共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy)のドナ 一となり得る蛍光物質と、前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に 存在するクェンチヤ一物質と、該クェンチヤ一物質と前記蛍光物質の間に位置して おり、エンドヌクレアーゼにより切断される酵素切断部位を有する核酸鎖部分を少な くとも有する検出用核酸鎖が係わる相補鎖形成反応を進行させる手順、 (2)前記相 補鎖形成反応によって得られた二本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼを作用させるこ とによってエンドヌクレアーゼ切断部位でプローブ核酸鎖を切断して断片化し、かつ 、一本鎖へ解離させることによって、前記蛍光物質の蛍光を増幅する手順、以上（1) 、 (2)の手順を少なくとも行う核酸鎖利用方法を提供する。
[0017] なお、「相補鎖形成反応」は、核酸 (ヌクレオチド鎖）間のいわゆるハイブリダィゼー シヨンであって、 DNA—DNA、 DNA— RNA、 RNA—RNA間の相補結合などを広 く含む。
[0018] 本発明に係る方法は、クェンチヤ一物質の作用により蛍光低減又は消光状態にあ る検出用核酸鎖が、 自らと相補的な核酸鎖と二本鎖を形成したことが想定されるとき に、二本鎖特異的なエンドヌクレアーゼの作用により、検出用核酸鎖をエンドヌクレア ーゼ切断部位にて切断するとともに、一本鎖へと解離させる。
[0019] この一本鎖解離の段階では、検出用核酸鎖は、蛍光物質側の核酸鎖とクェンチヤ 一物質側の核酸鎖に断片化されて遊離することから、蛍光物質はクェンチヤ一物質 と距離を置いて存在するようになるので、（タエンチヤー物質の影響が無くなって）蛍 光が増幅するようになる。
[0020] 本方法は、例えば、エンドヌクレアーゼ切断前の前記検出用核酸鎖が前記相補鎖 形成反応を進行できる上限温度以下であり、かつ、エンドヌクレアーゼ切断後の検出 用核酸鎖断片が相補鎖形成反応を維持又は進行できなくなる温度以上の温度条件 下で行うことができる。
[0021] この蛍光増幅の有無、あるいは増幅量 (増幅の程度）を測定することによって、本発 明では、検出用核酸鎖が二本鎖 (相補鎖）を形成したこと、即ち、前記プローブ核酸 鎖に相補的な標的核酸鎖が存在すること、さらには、核酸以外の生体物質が存在す ること、生体物質に化学的変化や構造変化が起こっていること、薬剤候補物質が存 在すること、などを知ること力 Sできる。
[0022] 本発明に核酸鎖を用いることによって、極微量物質を検出する際に、当該極微量 物質の増幅を行わなくても高感度に検出することができる。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、本発明に係る検出用核酸鎖の概念及び実施形態例を説明するための 図である。
[図 2]図 2は、同検出用核酸鎖のうち、蛍光物質 (F)とクェンチヤ一物質（Q)の両方を 核酸鎖の途中部位に結合した実施形態例を示す図である。
[図 3]図 3は、同検出用核酸鎖のうち、蛍光物質 (F)を末端部位、一方のクェンチヤ 一物質 (Q)を途中部位に結合した他の実施形態例を示す図である。
[図 4]図 4は、同検出用核酸鎖のうち、蛍光物質 (F)を途中部位、一方のクェンチヤ 一物質 (Q)を末端部位に結合したさらに別の実施形態例を示す図である。
[図 5]図 5は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)の機能とその代表的な使用例を示す 図である。
[図 6]図 6は、 AP-エンドヌクレアーゼ Eによって AP部位 Xに対して切れ目が形成され る様子を模式的に示す図である。
[図 7]図 7は、適正温度条件 (t)下で、 AP-エンドヌクレアーゼ（E)によって切断され た検出用核酸鎖断片 (P 、 P )が核酸鎖 (T)から解離し、一本鎖として反応場 (R)に
1 2
遊離している状態を模式的に示す図である。
[図 8]図 8は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pによる「サイクル反応」の基本的なフロー を示す図である。
[図 9]図 9は、反応場 (R)の温度条件の変化によって、（切断されていない）検出用核 酸鎖 (P)と、（AP-エンドヌクレアーゼ Eによって切断された)検出用核酸鎖断片（P 、 P )の二本鎖形成又は解離の様子を示す参考図である。
2
[図 10]図 10は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)を利用する第 1応用方法例の概念 を示す模式図である。
[図 11]図 11は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)を利用する第 2応用方法例の概念 を示す模式図である。
[図 12]図 12は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)を利用する第 3応用方法例の概念 を示す模式図である。 園 13]図 13は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)を利用する第 4応用方法例の概念 を示す模式図である。
園 14]図 14は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)を利用する第 5応用方法例の概念 を示す模式図である。
園 15]図 15は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)を利用する第 6応用方法例の概念 を示す模式図である。
園 16]図 16は、本発明に係る検出用核酸鎖 (P)を利用する第 7応用方法例の概念 を示す図であって、構造変化前の物質 (例えば、タンパク質 Dx)を検出している場合 の模式図である。
[図 17]図 17は、同第 7応用方法例の概念を示す図であって、構造変化後の物質 (例 えば、タンパク質 Dy)を検出している場合の模式図である。
[図 18]図 18は、同第 8応用例の概念を示す図であって、検出用核酸鎖 Pを DNAチッ プのプローブとして用いた例を示す模式図である。
[図 19]図 19は、実験例 1： lOOfmolの標的核酸鎖と 8pmolの（AP部位を有する）検 出用核酸鎖を AP—エンドヌクレアーゼと反応させ、検出核酸鎖の切断を検出した結 果を示す図（ァガロース電気泳動の結果を示す写真）である。
園 20]図 20は、実験例 2 :蛍光シグナルの増幅を経時的に検出したときの結果を示 す図 (縦軸：蛍光強度、横軸：時間 (分) )である。
[図 21]図 21は、実験例 2 :各標的核酸鎖の濃度と初期反応速度を「Lineweaver Burk Plotjを用いてプロットしたときの図（グラフ）である。
[図 22]図 22は、実験例 3 :蛍光色素（FITC)の蛍光の増加を経時的に測定した結果 であり、単位時間当たりの蛍光の増加率を、各時刻においてプロットした図（図面代
[図 23]図 23は、実験例 3 : Hela細胞の細胞数 (横軸）を振って、 BMAL1-CLOCK複合 体の検出を行った結果を示す図 (図面代用グラフ)である。
[図 24]図 24は、実験例 4： Hela細胞を 50Horse Serumを含んだ培養液 (DMEM培地)で 2時間刺激し、刺激スタート時力、ら 15時間、 17. 5時間、 20時間、 22. 5時間後に細 胞を回収し、 BMAL1-CLOCKタンパク質複合体を検出した結果を示す図（図面代用 [図 25]図 25は、実験例 4 : Perlの mRNA量を定量した結果を示す図（図面代用ダラ フ）である。
[図 26]図 26は、実験例 4 : Per2の mRNA量を定量した結果を示す図（図面代用ダラ フ）である。
発明を実施するための最良の形態
[0024] 以下、本発明の実施形態例ついて、添付図面を参照にしながら説明する。なお、 本発明の概念は、以下に説明する実施形態例に基づいて狭く解釈されることはない
[0025] まず、図 1から図 4は、本発明に係る検出用核酸鎖の概念及び実施形態例を説明 するための図である。
[0026] 図 1から図 4中に示されている符号 Pは、本発明に係る検出用核酸鎖の一実施形態 例を示している。この検出用核酸鎖 Pは、共鳴励起エネルギー（fluorescence Resona nce Energy)のドナーとなり得る蛍光物質 Fと、前記共鳴励起エネルギーを受け取るこ とが可能な位置に存在するクェンチヤ一物質 Qと、該クェンチヤ一物質と前記蛍光物 質の間に位置する核酸鎖部分 Nと、該核酸鎖部分 Nに存在する酵素切断部位 (例え ば、 AP部位：図面中、符号 Xで示す。）と、を少なくとも有している。
[0027] 例えば、所定の分子長からなる核酸鎖の; T 末端又は^ 末端に蛍光物質 Fを結 合 (標識)し、該蛍光物質 Fとは逆側の末端部にクユンチヤ一物質 Qを結合 (標識)し た場合では、前記核酸鎖の全部が蛍光物質 Fとクェンチヤ一物質 Qの間に位置して いるので、その全核酸鎖部分が本発明で言うところの核酸鎖部分 Nに相当するものと なる（図 1参照)。
[0028] また、所定の分子長からなる核酸鎖の末端以外の位置に、蛍光物質 Fとクェンチヤ 一物質 Qの両方又はいずれか一方を結合した構成では、両物質 F Qの間に存在し ている核酸鎖領域が本発明で言う核酸鎖部分 Nとなる（図 2〜図 4参照）。
[0029] 具体的には、図 2は、蛍光物質 Fとクェンチヤ一物質 Qの両方を核酸鎖の途中部位 に結合した実施形態例、図 3は、蛍光物質 Fを末端部位、一方のクェンチヤ一物質 Q を途中部位に結合した他の実施形態例、図 4は、蛍光物質 Fを途中部位、一方のク ェンチヤ一物質 Qを末端部位に結合したさらに別の実施形態例をそれぞれ示してい
[0030] 図 5は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pの機能とその代表的な使用例を示す図であ る。なお、この図 5に示す例では、同検出用核酸鎖 Pを用いて、その核酸鎖部分 Nに 相補的な塩基配列を有する核酸鎖 Tの存在やその存在量を検出する例が示されて おり、本例においては、図 1に示す検出用核酸鎖 Pを代表例として説明している（図 2 〜4の検出用核酸鎖 Pでもよ!/、）。
[0031] 検出用核酸鎖 Pは、所定の酵素処理 (後述）が施される前では、蛍光物質 Fから発 せられるはずの蛍光がクェンチヤ一物質 Qの作用によって低減又は消光されて!、る 。この状態にある検出用核酸鎖 Pが存在する反応場 Rにサンプル溶液を導入したとき に、該サンプル溶液中に検出用核酸鎖 Pの核酸鎖部分 Nに相補的な塩基配列を有 する核酸鎖 Tが存在すると、前記核酸鎖部分 Nと核酸鎖 Tは二本鎖 (相補鎖）を形成 する（相補鎖形成手順)。なお、図 5中の符号 Wは、前記相補鎖形成手順によって生 成した二本鎖 (相補鎖)部分を示して!/、る（以下、同様)。
[0032] 次に、上記相補鎖形成手順を行った後、あるいはこの手順と同時に、二本鎖特異 的な AP -エンドヌクレアーゼ Eを反応場 Rへ導入すると（図 6参照）、該 AP -エンドヌク レアーゼ Eが相補鎖 Wを形成して!/、る（検出用核酸鎖 Pの）核酸鎖部分 Nに存在して いる AP部位 Xを認識し、該 AP部位 X部分に対して切れ目（Nick)を入れ、検出用核 酸鎖 Pを蛍光物質 F側とクェンチヤ一物質 Q側に分断する。即ち、二本鎖 (相補鎖） 部分 Wは、蛍光物質 F側の二本鎖 Wとクェンチヤ一物質 Q側の二本鎖 Wに短鎖化
1 2 される。なお、図 6は、 AP -エンドヌクレアーゼ Eによって AP部位 Xに対して切れ目が 形成される様子を模式的に示す図である。
[0033] ここで、二本鎖（相補鎖）部分 W (図 5参照）と、 AP-エンドヌクレアーゼ Eによって短 鎖化された二本鎖 W及び二本鎖 W (図 6参照）とでは、鎖長が異なるため、 t (メル
1 2 m ト温度）が相違する。即ち、 t は、
m w>w 、
1 w>wとなる。
2
[0034] そこで、反応場 Rのバッファー溶液温度条件を、 AP-エンドヌクレアーゼ Eによる切 断前の検出用核酸鎖 Pが前記相補鎖形成反応を進行又は維持することができる温 度 t以下であって、かつ、前記 AP-エンドヌクレアーゼ Eによる切断後の検出用核酸 鎖断片 P 、P (図 6参照）が相補鎖形成反応を維持又は進行できなくなる温度 t以上
1 2 b の適正温度 (t)条件、即ち、温度 ≤t≤tとする。
b a
[0035] 図 7は、前記適正温度条件 t下で、 AP-エンドヌクレアーゼ Eによって切断された検 出用核酸鎖断片 P 、P (図 6参照）が核酸鎖 Tから解離し、一本鎖として反応場 Rに
1 2
遊離して!/、る状態を模式的に示して!/、る。
[0036] また、図 9は、反応場 Rの温度条件の変化によって、（切断されていない)検出用核 酸鎖 Pと、（AP-エンドヌクレアーゼ Eによって切断された）検出用核酸鎖断片 Pl、 P2 の二本鎖形成又は解離の様子を示す参考図である。
[0037] 図 9について具体的に説明すると、温度 未満の温度 t条件では、検出用核酸鎖 P
b 1
と検出用核酸鎖断片 P 、Pのすべてが二本鎖形成を進行させることが可能であり、
1 2
また、二本鎖を維持することもできる。
[0038] 次に、適正温度 t (t≤t≤t )の条件下では、検出用核酸鎖 Pが前記相補鎖形成
2 b 2 a
反応を進行可能であって、形成された相補鎖は維持することができる。一方、 AP-ェ ンドヌクレアーゼ Eによって短鎖化された検出用核酸鎖断片 P 、 Pは、核酸鎖丁から
1 2
解離してそれぞれ一本鎖になっており、この一本鎖解離によって、蛍光物質 Fはタエ ンチヤー物質 Qと距離を置いて存在するようになるため、（タエンチヤー物質 Qの影響 が無くなって)蛍光が増幅するようになる（図 9参照）。
[0039] さらに、温度 の条件下では、検出用核酸鎖 Pも一本鎖に解離しており、 AP-ェン
3
ドヌクレアーゼ Eによって短鎖化された検出用核酸鎖断片 P 、 Pも、核酸鎖 Tから解
1 2
離してそれぞれ一本鎖になって!/、る（図 9参照）。
[0040] ここで、本発明は、反応場 Rに対して、核酸鎖 Tに比して過剰量の検出用核酸鎖 P を導入することによって、「核酸鎖 Tと検出用核酸鎖 Pとの間の相補鎖形成（図 5参照 )」→「AP-エンドヌクレアーゼ Eによる検出用核酸鎖 Pの短鎖化（図 6参照）」→「短鎖 化された検出用核酸鎖断片 P 、Pの核酸鎖 Tからの解離とそれに伴う蛍光増幅（図
1 2
7参照）」、という一連の反応が、反応場 Rに存在する検出用核酸鎖 Pによって何度も 繰り返されることで（以下、便宜上「サイクル反応」という。）、反応場 Rに存在する極微 量の核酸鎖 Tからも増幅された強レ、蛍光シグナルを得ることができると!/、う利点がある 。なお、図 8は、このサイクル反応の基本的なフローを示す図である。 [0041] 即ち、反応場 Rに存在する核酸鎖 Tの量をわざわざ増幅しなくても、極微量のまま の状態から、同核酸鎖 Τの存在を示すことになる（タエンチヤー物質 Qによって消光さ れなくなった)蛍光物質 F由来の強い蛍光シグナルを反応場 Rから得られることになる ので、核酸鎖 Τを高感度で検出することができる。
[0042] したがって、本発明にお!/、て、反応場 Rの温度条件の設定は、核酸鎖 Τと検出用核 酸鎖 Ρとの間の相補鎖形成が進行させることができることが重要であるので、図 9に示 すような tを超える温度 tの条件は、好ましくない。
a 3
[0043] したがって、本発明において好適な温度条件は、既述したとおり、 AP-エンドヌクレ ァーゼ Eによる切断前の検出用核酸鎖 Pが前記相補鎖形成反応を進行又は維持す ること力 Sできる温度 t以下であって、かつ、前記 AP-エンドヌクレアーゼ Eによる切断 後の検出用核酸鎖断片 P 、 P (図 6参照）が相補鎖形成反応を維持又は進行できな
1 2
くなる温度 t以上の温度（即ち、温度 ≤t≤t )である（図 9再参照）。
b b a
[0044] なお、検出用核酸鎖断片 Pと P (図 6参照）の鎖長が異なることによって、これらの
1 2
が異なる場合が想定されるが、その場合は、より高い方の t を、設定温度条件の下 m m
限温度 tとして扱うことによって、検出用核酸鎖断片 Pと Pの両方を核酸鎖 τから解 b 1 2
離させること力 sできる。これにより、上記繰り返し反応を行うことが可能となる。
[0045] 以下、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用した応用方法例について、幾つか説明 する。なお、以下に説明する応用方法例は、あくまで例示であって、これらにより、本 発明が狭く限定されることはない。
[0046] 以下に例示する応用方法例のいずれにも共通する本発明の特徴は、反応場に導 入された過剰量の検出用核酸鎖 Pが係わる上記「サイクル反応」によって、極微量の 物質、量的に少ない反応や相互作用、物質構造の変化を高感度に検出できるという 点である。この点については、重複するので都度の詳しい説明については割愛する
〇
[0047] <第 1応用方法例 >
図 10は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 1応用方法例の概念を示す 模式図である。この第 1応用方法例では、核酸鎖 Yの塩基配列中に、 目的の塩基配 列領域が存在するか否かを検証する場合などに有用である。一例を挙げれば、遺伝 子上流に位置するプロモーター領域中に、特定の転写因子に対する特異的な応答 塩基配列部分が存在するか否かを確認することができる。
[0048] <第 2応用方法例 >
図 11は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 2応用方法例の概念を示す 模式図である。この第 2応用方法例によれば、固相（例えば、基板、ビーズ、担体等） の表面 Sに検出標的となる物質 (例えば、タンパク質）が存在しているか否かを検出 すること力 Sでさる。
[0049] より具体的には、表面 Sが臨む反応場 Rヘサンプル溶液を導入し、これに続いて、 検出目的である物質 Mと特異的に結合する塩基配列を有する核酸鎖 Zを導入した 後、あるいはそれと同時に、前記塩基配列と相補的な核酸鎖部分 Nを有する検出用 核酸鎖 Pを導入し、その後、反応場 Rを溶液洗浄する。そして、さらに検出核酸鎖 Pと 二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eを反応場 Rへ導入する。
[0050] 仮に、前記サンプル溶液中に前記物質 Mが存在していた場合は、相補鎖を形成し た核酸鎖 Zと検出用核酸鎖 Pが物質 Mに結合した状態となるので、該相補鎖に対し て AP-エンドヌクレアーゼ Eが作用し、該相補鎖（を構成する核酸鎖部分 Nの AP部 位 X)に切れ目を入れて一本鎖化する。このため、当該物質 Mの含有量が極微量で あっても、検出用核酸鎖 Pを構成していた蛍光物質 Fからの強い蛍光シグナルが得ら れる。これにより、前記物質 Mの高感度検出を行うことができる。
[0051] <第 3応用方法例〉
図 12は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 3応用方法例の概念を示す 模式図である。この第 3応用方法例によれば、固相（例えば、基板、ビーズ等）の表面 Sに固定されている物質 Kに対する物質 Lの反応や相互作用を検出することができる
[0052] より具体的には、物質 Kが予め固定された表面 Sが臨む反応場 Rに対して、前記物 質 Kとの反応や相互作用の有無を検証する物質 Lを含有するサンプル溶液を導入し 、その後、反応場 Rを溶液洗浄する。なお、物質 Lには所定塩基配列の核酸鎖 Zを
2 予め標識しておくようにする。
[0053] 溶液洗浄に続いて、前記核酸鎖 Zの塩基配列と相補的な核酸鎖部分 Nを有する 検出用核酸鎖 Pを導入し、続いて、二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eを反応 場 Rへ導入する。
[0054] 仮に、物質 Kと物質 Lが反応して結合する場合又は相互作用する場合は、反応場 Rにお!/、て物質 Lに標識されて!/、る核酸鎖 Zと検出用核酸鎖 P (の核酸鎖部分 N)が
2
相補鎖を形成するので、該相補鎖に対して二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eが作用し、該相補鎖（を構成する核酸鎖部分 Nの AP部位 X)に切れ目を入れて一 本鎖化する。このため、物質 Kと物質 Lの反応や相互作用の量が極わずかであっても 、検出用核酸鎖 Pを構成してレ、た蛍光物質 Fからの強!/、蛍光シグナルが得られる。
[0055] これにより、物質 Kと物質 Lの反応（例えば、抗原抗体反応）や相互作用（例えば、 タンパク質間の相互作用、脂質と結合分子の反応等）の高感度検出を行うことができ
[0056] <第 4応用方法例〉
図 13は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 4応用方法例の概念を示す 模式図である。この第 4応用方法例によれば、薬剤候補となり得るような低分子化合 物、例えば、レセプターに結合して、ァゴニストやアンタゴニストとなり得る化合物を高 感度に検出又はスクリーニングすることができる。
[0057] より具体的には、基板等の固相表面 Sに存在する物質 Uに向けて、前記物質 Uと結 合又は相互作用し得る候補物質 Vを含有するサンプル溶液を導入し、その後、反応 場 Rを溶液洗浄する。なお、物質 Vには所定塩基配列の核酸鎖 Zを予め標識してお
2
くようにする。
[0058] この溶液洗浄に続いて、前記核酸鎖 Zの塩基配列と相補的な核酸鎖部分 Nを有
2
する検出用核酸鎖 Pを導入し、続いて、二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eを 反応場 Rへ導入する。
[0059] 仮に、物質 Uと候補物質 Vが結合する場合は、反応場 Rにおいて候補物質 Vに標 識されて!/、る核酸鎖 Zと検出用核酸鎖 P (の核酸鎖部分 N)が相補鎖を形成するの
2
で、該相補鎖に対して二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eが作用し、該相補鎖 (を構成する核酸鎖部分 Nの AP部位 X)に切れ目を入れて一本鎖化する。このため 、物質 Uと候補物質 Vの結合量が極わずかであっても、検出用核酸鎖 Pを構成してい た蛍光物質 Fからの強い蛍光シグナルが得られる。
[0060] これにより、物質 Uと候補物質 Vの結合の高感度検出を行うことができる。この検出 技術を利用して、薬剤候補物質のスクリーニングを実施することができる。
[0061] <第 5応用方法例〉
図 14は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 5応用方法例の概念を示す 模式図である。この第 5応用方法例によれば、例えば、環境ホルモン（内分泌撹乱物 質）の検出やスクリーニングを行うことができる。
[0062] まず、ある種の転写因子 J (DNA結合性タンパク質）は、ホルモン Hが結合すると構 造が変化し、これにより、遺伝子上流域に存在する応答塩基配列領域に結合して、 遺伝子の転写を促進するという機能を有している。一般に、環境ホルモンと称される 内分泌撹乱物質は、生体内のホルモン Hと同様の振る舞いをする物質である。
[0063] 本発明では、基板やビーズ等の固相表面 Sに対して予め転写因子（核内レセプタ 一) Jを存在 (例えば、固定)させておくとともに、前記応答塩基配列領域に相当する 核酸鎖 Zと核酸鎖 Zの塩基配列と相補的な核酸鎖部分 Nを有する検出用核酸鎖 P
3 3
を少なくとも存在させておくようにする。このような物質環境の反応場 Rに対して、内分 泌撹乱物質となるか否力、を検証するためのホルモン様物質 hを導入する。
[0064] 具体的に説明すると、仮に、当該ホルモン様物質 h力 本当にホルモン Hと同様の 機能を有するならば、ホルモン様物質 hの作用によって転写因子 Jの構造が変化する 。この構造変化を受けた転写因子 Jが存在する反応場 Rに対して、上記応答塩基配 列領域に相当する核酸鎖 Zと該核酸鎖 Zと二本鎖を形成する核酸鎖部分 Nを備え
3 3
る検出用核酸鎖 Pを同時に導入する。これに続いて、反応場 Rの溶液洗浄を行うこと によって、反応場 R中に遊離状態で存在している余剰の核酸鎖 Zを反応場 Rから除
3
去し、続いて、さらに検出用核酸鎖 Pを導入するとともに、二本鎖特異的な AP-エンド ヌクレアーゼ Eを反応場 Rへ導入する。
[0065] 仮に、転写因子 Jに核酸鎖 Zを介して結合した検出用核酸鎖 Pが反応場 Rに存在
3
すると、該核酸鎖 Zと検出用核酸鎖 P (の核酸鎖部分 N)の相補鎖に対して二本鎖特
3
異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eが作用し、該相補鎖（を構成する核酸鎖部分 Nの A P部位 X)に切れ目を入れて一本鎖化する。 [0066] このため、サンプル溶液中のホルモン様物質 hの量が極微量であっても、検出用核 酸鎖 Pを構成していた蛍光物質 Fからの強い蛍光シグナルが得られる。これにより、ホ ルモン様物質 hの高感度検出を行うことができる。この検出技術を利用して、内分泌 撹乱物質のスクリーニングも実施することができる。
[0067] <第 6応用方法例〉
図 15は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 6応用方法例の概念を示す 模式図である。この第 6応用方法例によれば、例えば、タンパク質の翻訳後修飾反応 の検出などを行うことができる。
[0068] まず、タンパク質は翻訳後に、酵素反応等を介して修飾を受ける場合がある。例え ば、リン酸化はその代表的なものである。本発明では、基板等の固相表面 Sに対して 、予め検出目的のタンパク質 Dを存在 (例えば、固定)させておくとともに、当該タンパ ク質 Dの修飾 (例えば、リン酸化）されていない部分に特異的に結合する抗体 Bと修 飾 (例えば、リン酸化）された部分に特異的に結合する抗体 Bも存在させておくように
2
する。なお、抗体 Bと抗体 Bには、予めそれぞれに特有の塩基配列からなる核酸鎖
1 2
Za、核酸鎖 Zbをそれぞれ標識しておくようにする（図 15参照）。
[0069] このような物質環境の反応場 Rに対して、核酸鎖 Zaに相補的な核酸鎖部分 Naを有 する検出用核酸鎖 Paと、核酸鎖 Zbに相補的な核酸鎖部分 Nbを有する検出用核酸 鎖 Pbと、を一緒に導入する。なお、検出用核酸鎖 Paには、所定波長の蛍光を発し得 る蛍光物質 Fを標識しておき、検出用核酸鎖 Pbには、前記蛍光物質 Fとは異なる 波長の蛍光を発し得る蛍光物質 Fを標識しておくようにする。
2
[0070] そして、反応場 Rの溶液洗浄に続いて、二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ E を反応場 Rへ導入し、二本鎖を形成して!/、る検出用核酸鎖 Paの核酸鎖部分 Naと二 本鎖を形成している検出用核酸鎖 Pbの核酸鎖部分 Nbに切れ目をいれて短鎖化し て、これにより一本鎖へ解離させ、蛍光増幅を行う。
[0071] 反応場 Rに存在するすべてのタンパク質 Dには、原理的に、検出用核酸鎖 Paが相 補鎖を介して結合するので、該検出用核酸鎖 Paを構成していた蛍光物質 F由来の (増幅された）蛍光シグナルを測定することによって、反応場 Rに存在するすべてのタ ンパク質 Dの分子数を予測することができる。 [0072] また、反応場 Rに存在するすべてのタンパク質 Dのうち修飾 (例えば、リン酸化）され ているタンパク質 Dには、検出用核酸鎖 Pbが相補鎖を介して結合するので、該検出 用核酸鎖 Pbを構成していた蛍光物質 F由来の（増幅された)蛍光シグナルを測定す
2
ることによって、修飾されたタンパク質 Dの分子数を予測することができる。
[0073] このような手法によって、反応場 Rに存在するすべてのタンパク質 Dの分子数と、修 飾されたタンパク質 Dの分子数から、当該タンパク質 Dの修飾されている割合を予測 すること力 Sでさる。
[0074] <第 7応用方法例〉
図 16、図 17は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 7応用方法例の概念を 示す模式図である。図 16は、構造変化前の物質 (例えば、タンパク質）を検出してい る場合の模式図、図 17は、構造変化後の物質 (例えば、タンパク質)を検出している 場合の模式図である。この第 7応用方法例によれば、物質の構造変化の検出や同構 造変化の数的割合などを検出することができる。
[0075] 例えば、タンパク質は、他の因子が作用することで、その高次構造が変化して、特 有の機能を発揮する場合がある。したがって、このような物質の構造変化を検出する ことによって、当該物質の機能や活性を知ることができる。以下、図 16、図 17に基づ いて、具体的に説明する。
[0076] 図 16に示す符号 Dxは、構造変化前のタンパク質を示しており、一方の図 17に示 す符号 Dyは、構造変化後のタンパク質を示している。まず、図 16を参照すると、表 面 Sに固定等されたタンパク質 Dxが存在する反応場 Rへ、タンパク質 Dxの構造部位 dlに特異的に結合する抗体 B (核酸鎖 Zaが標識されている）と、同タンパク質 Dxの 構造部位 d2に特異的に結合する抗体 B (核酸鎖 Zbが標識されている）と、蛍光波長
2
の異なる二種類の検出用核酸鎖 Pa, Pbを導入する。
[0077] 検出用核酸鎖 Paを構成する核酸鎖部分 Naは、抗体 Bに標識されている核酸鎖 Z aに相補的であるので二本鎖を形成し、一方の検出用核酸鎖 Pbを構成する核酸鎖 部分 Nbは、抗体 Bに標識されている核酸鎖 Zbに相補的であるので二本鎖を形成
2
する（図 16参照)。
[0078] このような反応場 Rへ二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eを導入すると、核酸 鎖部分 Na，Nbに切れ目が入り、それぞれ一本鎖へ解離する。その結果、蛍光物質 F 、 F力 それぞれの波長の蛍光シグナルが発せられる。これにより、表面 Sに存在す
1 2
るタンパク質 Dxは、構造変化を起きて!/、な!/、ものであることがわかる。
[0079] 一方、図 17を参照すると、表面 Sに固定等されたタンパク質 Dy (構造変化が生じた タンパク質）が存在する反応場 Rへ、タンパク質 Dx (図 16参照）の構造部位 dlに特 異的に結合する抗体 B (核酸鎖 Zaが標識されている）と、タンパク質 Dyの構造部位 d2 (この場合、タンパク質 Dxの構造部位 d2と同じ）に特異的に結合する抗体 B (核
2 酸鎖 Zbが標識されている）と、蛍光波長の異なる二種類の検出用核酸鎖 Pa, Pbを導 入する。
[0080] 抗体 B 、 Bのうち、構造変化が生じたことによって構造部位 dlが消失したタンパク
1 2
質 Dyに結合するのは、抗体 Bのみである。従って、検出用核酸鎖 Pbを構成する核
2
酸鎖部分 Nbだけが、該抗体 Bに標識されている核酸鎖 Zbと相補結合し二本鎖を形
2
成する。
[0081] この状況の反応場 Rに、二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼ Eを導入すると、 核酸鎖部分 Nbだけに切れ目が入って、一本鎖へ解離し、その結果、蛍光物質 Fか
2 らの蛍光シグナルだけが発せられることになる（図 17参照）。
[0082] これにより、表面 Sに存在するタンパク質 Dyは、構造変化を生じる修飾を受けたも のであり、構造変化が生じていないタンパク質 Dxではないことがわかる。なお、本方 法によれば、蛍光シグナルを解析することによって、タンパク質 Dxと Dyの両方を同 時に検出することもできる。一例を挙げると、 /3アミロイド構造変化の微量検出、ひい てはアルツハイマー病の診断に応用できる。
[0083] <第 8応用例〉
図 18は、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを利用する第 7応用例の概念を示す模式 図である。この第 7応用例は、前記検出用核酸鎖 Pを DNAチップのプローブとして利 用する例である。なお、本発明に係る検出用核酸鎖 Pは、 DNAチップ以外の他のセ ンサー技術にも応用可能である。
[0084] 図 18では、符号 Cで示す基板表面に本発明に係る検出用核酸鎖 P (P ，P ，P ，P
11 12 13
)が固定された状態が示されている。そして、この図 18の (A)〜（C)では、基板表 面 c上での経時的な反応の進行状況を模式的に示している。
[0085] 基板表面 C上では、ターゲットとなる核酸鎖 Tが反応場 Rへ導入されると、この核酸 鎖 T力 S、時間の経過とともに、基板表面 C上に固定されている検出用核酸鎖 P ，P ，
11 12
P ，P のそれぞれの核酸鎖部分 Nとの間で相補鎖を次々に形成していく。そして、
13 14
二本鎖特異的な AP—エンドヌクレアーゼ（図 18では図示せず。 )による核酸鎖部分 Nの分断 (短鎖化）が行われると、短鎖化された検出用核酸鎖断片の核酸鎖 T力、らの 解離が起こり、それに伴う蛍光増幅がもたらされるという一連の反応（サイクル反応） が連鎖的に起こる。
[0086] この図 18に示す反応例からもわかるように、本発明に係る検出用核酸鎖 Pを DNA チップのプローブとして利用すれば、ターゲットとなる一分子の核酸鎖 Tが複数のプ ローブ（図 18の例では P ，P ，P ，P )により利用されるため、高感度な検出が可能
11 12 13 14
となる。また、 DNAチップへのハイブリダィゼーシヨンとプローブ切断を、蛍光色素増 幅により時間経過を追って観察すれば、反応速度からターゲットの濃度を測定するこ とが可能となる。
[0087] 従来の DNAチップでは、ターゲット核酸鎖 Tを蛍光色素で標識する必要があった 力 その手間を省略することができる。さらに、従来の DNAチップではハイブリダィゼ ーシヨンしたターゲット核酸鎖 Tがプローブに固定された状態となるため、ハイブリダィ ゼーシヨンの反応場付近でのターゲット核酸鎖 Tの見かけ上の濃度が低下し、ハイブ リダィゼーシヨンの効率が低下するという問題があった力 S、本発明に係る検出用核酸 鎖 Pを利用すると、ターゲット核酸鎖 Tを固定された状態としないために、ハイブリダィ ゼーシヨン反応場付近のターゲット核酸鎖 Tの見かけ濃度が低下せず、ハイブリダィ ゼーシヨンの効率も改善することが期待できる。
実施例
[0088] 本発明に係る検出用核酸鎖の機能及び同検出用核酸鎖を用いた検出技術の有 効性を確認するため、以下の実験例 1〜4を行った。
[0089] (実験例 1)
まず、極微量な標的核酸鎖 (配列番号 1)が反応場に存在するときに、該反応場に 導入された過剰量の検出用核酸鎖 (核酸鎖部分:配列番号 2、その構成は図 1等を 再参照）が係わるサイクル反応（図 8再参照）が起きて、 AP-エンドヌクレアーゼ (配列 番号 3)の作用によって多量の検出用核酸鎖断片が生じることを検証した。なお、配 列番号 2中の記号「n」は、塩基が欠落して!/、る AP部位を意味する。
[0090] なお、本実験で使用した AP-エンドヌクレアーゼは、 human AP-endonuclease(APE 1)であり、検出用核酸鎖に使用した蛍光物質は蛍光色素 FAM (5' 末端に結合)で あり、クェンチヤ一物質は、 TAMRA(3' 末端に結合）である。
[0091] lOOfmolの標的核酸鎖と 8pmolの (AP部位を有する）検出用核酸鎖が存在する 反応場に AP -エンドヌクレアーゼを添加して反応させた。 AP—エンドヌクレアーゼ存 在下において、適正温度内の 37，42，47°Cで反応を行い、それら反応液を AP—ェ ンドヌクレアーゼを加えて!/、な!/、反応液と合わせて、ァガロース電気泳動を行レ、検出 用核酸鎖のサイズによる分離を行い、結合している蛍光色素により検出した。
[0092] ァガロース電気泳動による核酸鎖のサイズによる分離では、サイズの小さな核酸鎖 が早く泳動される (バンドが下方に移動する)。 AP—エンドヌクレアーゼを加えた反応 液 (レーン 2-4)では、加えていない反応液 (レーン 1,5)に比べて、バンドが下方に移動 している（図 19参照）。このことから、本実験で使用した検出用核酸鎖が AP—エンド ヌクレアーゼによって切断されている（cleaved)ことが明らかである。
[0093] この実験例 1の結果から明らかなように、標的核酸鎖に対して 80倍量の検出用核 酸鎖が完全に切断されたことがわかった。即ち、「標的核酸鎖と検出用核酸鎖との間 の相補鎖形成」→「AP-エンドヌクレアーゼによる検出用核酸鎖の短鎖化（断片化）」 →「短鎖化された検出用核酸鎖断片の標的核酸鎖からの解離」と!、う一連の反応が 、反応場に存在する多量の検出用核酸鎖によって何度も繰り返されるサイクル反応 が起こることが明らかになつた（図 8再参照）。
[0094] (実験例 2)
この実験例 2では、濃度違いの標的核酸鎖 (配列番号 1)に対して、 8pmolの (AP 部位を持つ)検出用核酸鎖 (蛍光物質: FAM (5' 末端に結合）、クェンチヤ一物質: TAMRA(3' 末端に結合）、核酸鎖部分の塩基配列：配列番号 2)を導入し、さらに AP-エンドヌクレアーゼを反応させ、蛍光シグナルの増幅を経時的に検出した。図 2 0に示す図は、その結果を示すグラフである（縦軸：蛍光強度、横軸：時間（分））。な お、標的核酸鎖の濃度は、 32amol、 160amol、 0. 8fmol、 4fmol、 20fmolである
。図 20に示す結果から明らかなように、標的核酸鎖量に依存した反応速度で、時間 経過に伴って蛍光シグナルの増大することが実証された。
[0095] 更に、各標的核酸鎖の濃度と初期反応速度を「LineWeaver Burk Plot」を用いてプ ロットすると、 32amolから 20fmoほでの範囲でほぼ直線となる。即ち、標的核酸鎖を AP-エンドヌクレア一ゼの基質とすると、その铸型核酸鎖初期濃度 [T]と初期反応速
0
度 Vは一次式で表すことができる。したがって、同濃度範囲において標的核酸鎖を 定量できることが示された (図 21参照)。
[0096] (実験例 3)
本実験例は、本発明に係わる応用方法例の一例を実際に実施して成功したことを 示す。具体的には、本実験例は、ヒト口腔内粘膜上皮細胞から転写因子活性を有す る体内時計遺伝子産物（時計タンパク質）である BMAL1-CLOCK複合体の検出、さ らには、 日内変動リズムの検出に成功したことを示す実験例である。
[0097] 以下に、ヒト口腔内粘膜上皮細胞からの時計タンパク質 BMAL1-CLOCK複合体を 検出した手順例を示す。
[0098] まず、本実験例で使用した「検出用核酸鎖」は、 5 末端側に蛍光色素（FITC)、 3 ' 末端側にクェンチヤ一物質 (BHQ)が結合された以下の塩基配列構成を備えるォ リゴ DNA(5' 末端側から 6番目の塩基（グァニンが欠落: AP部位）であり（表 1参照） 、この検出用核酸鎖と二本鎖を形成する核酸鎖は、「表 2」に示す塩基配列構成を備 えるオリゴ DNAであり、抗体は、 anti-BMALl antibody (Santa Cruz Biotechnology社 )を使用した。
[表 1]
5 ' F I TC-accc ag (AP) c c acg t gc-BHQ 3， （配列番号 4 )
[表 2]
5 ' gc acg t gga t ggg t 3 ' (配列番号 5 [0099] 次ぎに、以下の手順で、抗体磁気ビーズを作製した。磁気ビーズ (micromer-M[PE G-COOH], micromod PartiKeltechnologie†土バこ PolyLink—Protein coupling Kit for C OOH Microparticles(Polyscience社)を用いて、上述の抗体を固定した。
[0100] ( 1 )ヒト力、ら採取した口腔内細胞を、 protease inhibitor cocktail (ロシュ社)を含んだ 2 OmM Tris-Cl (pH7.5), 150mM NaCl, lucrose Monolaurate，に懸濁し、ボノレテックスに より細胞を破砕した。 （2) 16，000g lOminの遠心分離を行い、不溶成分を沈殿させた。
(3) (2)で得られたサンプルの上清について 280nmの吸光度測定を行って、各サン プルの総タンパク質量の指標とし、全てのサンプルのタンパク質を揃えた。 （4)前手 順でタンパク質量を揃えたサンプルを、 9倍量の protease inhibitor cocktailを含んだ P BS(pH7.5), 0.05Tween20 (PBS-T)で希釈した。 （5)各 2 Lの抗体磁気ビーズ (anti-B MALI)を加えて、 4°Cで一昼夜インキュベートした。 （6)抗体磁気ビーズを 500 しの PBS-Tで洗浄し、非特異的に結合した分子の洗浄を行った。 （7)次に、抗体磁気ビ ーズを 10mM Tris-Cl(pH7.5), 50mM C1, 2.5 2.27926e+2891ycerol, lOmM EDTA, 0 • 05P-40, 0.05mg/mL salmon sperm DNA,各 0.2 μ M検出用核酸プローブ (プローブ 核酸 1 ,2からなる 2本鎖 DNA)に懸濁し、 37°C lhrのインキュベーションを行った。 （8) 抗体磁気ビーズを 500 Lの PBS-Tで 3回洗浄し、非特異的に結合した分子およびプ ローブ核酸の洗浄を行った。 （9)抗体磁気ビーズを水に懸濁し、 80°Cの条件で、ィ ンキュベーシヨンし、特異的に結合した検出用核酸鎖の抽出を行った。 （10)前手順 で抽出した検出用核酸鎖を 20mMTris-Acetat， l OmMMg-Acetat, 50mM Cl, 1 mMDTT(pH7.9) (いずれも最終濃度)に懸濁し、最終濃度各 0. 2 の検出用核酸 鎖（配列番号 4)と ΑΡエンドヌクレアーゼを加えて 37°Cでインキュベーションし、蛍光 色素（FITC)の蛍光の増加を経時的に測定した。 （1 1 )単位時間当たりの蛍光の増加 率を、各時刻においてプロットした（図 22の図面代用グラフ参照）。また、感度を調べ るため、 Hela細胞の細胞数を振って、上記と同様の方法で BMAL1-CLOCK複合体 の検出を行い成功した。なお、その結果をグラフ化して示した (図 23の図面代用ダラ フ参照)。
[0101] 考察。
[0102] いわゆる時計タンパク質は、転写因子であり、生体リズムのうち最も重要な概日リズ ム（サ一力ディアンリズム）を動かす自律的な振動子である。転写因子である時計タン パク質は、他の時計タンパク質の発現を誘導し、そして、誘導された時計タンパク質 は、転写因子としても機能し、他の（元の）時計タンパク質の転写を抑制するといつた ようなネガティブフィードループにより、サ一力ディアンリズムの振動子として機能して いると現在考えられている。つまり、転写因子である時計タンパク質は、体内時計のコ ァであるので、この時計タンパク質を測定することこそが、生物の生体リズムを測定す るに最も適していると考えられる。
[0103] 近年、体内時計に係わる生体分子の機能、遺伝子の欠陥や多様性が、癌をはじめ として、糖尿病、血管系の疾患、神経変性疾患などの生活習慣病の要因となることが 徐々に明ら力、となってきている。特に、双極性障害や鬱病のような精神疾患に関して は、体内時計の変調が原因であると疑われており、実際に体内時計をリセットする効 果のある光照射により治療効果が現れる。
[0104] また、人間の睡眠覚醒サイクルは、体内時計による自律的な制御だけでなぐ社会 生活により制約を受けるため、睡眠覚醒サイクルによるリズムと体内時計による自律リ ズムの間にズレが生じ、これが時差ぼけに代表されるような体調の不良、さらには上 記のような健康状態の不良の原因となる可能性がある。さらに、体内で薬を代謝する 酵素量がサ一力ディアンリズムを持つこと、また薬のターゲットとなる分子の量もサー 力ディアンリズム持つものが多いことから、薬に対する感受性についてもサ一力ディア ンリズムが存在することが知られており、投薬時間を定めて行う時間医療という考え方 も広がってきている。
[0105] もっと身近なところでは、心身の活動度や運動能力にもサ一力ディアンリズムがある ことが知られており、自分の能力を最大限に引き出せるリズムや、学習やトレーニング に良!/、リズム、太りやす!/、食事リズムなどが考えられて!/、る。
[0106] 以上のように、本発明に係る検出用核酸鎖や方法を応用すれば、転写因子の一例 である時計タンパク質を測定することが実際に可能となる。このことは、体内時計によ る自律的な生体リズム、または、その睡眠覚醒サイクルや外的時刻とのズレを知ること は、精神疾患や生活習慣病の予防、時差ぼけなどの体調不良の改善、時間医療、 自己能力の発揮、学習やトレーニング、ダイエットなどに非常に有益な技術となると予 想される。さらに、本発明の応用例として、次の実験例 4を示す。
[0107] (実験例 4)
現在、培養細胞を 50HorSe Serumを含んだ培養液で刺激することで、時計遺伝子 の発現が各細胞で同調し各時計遺伝子の mRNA量の変動として、リズムが観察され ること力 S知られている。し力もながら、これまで時計タンパク質を検出することが困難で あつたために、 BMALl-CLOCKタンパク質複合体の「発現変動」について詳しく観察 されたことは無かった。
[0108] そこで、本発明を応用して、 Hela細胞から BMALl-CLOCKタンパク質複合体の発 現変動の観察が可能であることを実証するための所定の実験を行った。更に、 BMAL 1-CLOCKタンパク質複合体が結合する E-box配列をプロモーター領域に持ち、その 転写が BMALl-CLOCKタンパク質複合体によって活性化される遺伝子、 Perl、 Per 2の mRNAの変動パターンを観察し、 BMALl-CLOCKタンパク質複合体の発現変 動と比較した。
[0109] 具体的には、 Hela細胞を 50Horse Serumを含んだ培養液 (DMEM培地)で 2時間刺 激した。刺激スタート時から 15時間、 17. 5時間、 20時間、 22. 5時間後に細胞を回 収し、口腔粘膜上皮細胞と同様の手順で、 BMALl-CLOCKタンパク質複合体を検 出した（図 24の図面代用グラフ参照）。
[0110] また、刺激スタート時から 12時間、 16時間、 20時間、 24時間、 28時間後にそれぞ れ細胞を回収した。回収した各細胞力、ら totalRNAを抽出し（メーカー名 Agilent Tech nologies :型番 5185-6000)、定法に従って PT-PCRを行って、 Perl、 Per2の mRNA 量を定量した。なお、 RT-PCRで使用したプライマーの配列は、次の「表 3」の通りで ある。
[表 3] GAPD1I forward 5' gcaccgtcaaggc tgagaac 3' 配列 ^ ' 6 r e \r e r s e 5' atggtggtgaagacgccagt 3' 配列 ¾ 7
Perl forward 5' acgcactggcctgtgtcaag 3' 配列 ^ 8 reverse 5' tagacgat tcggcccgtca 3' 配列 .9
Per2 forward 5' gcatccatat t tcactgtaaaaga 3'
r e \' e r s e 5' agtaaaagaatctgctccactg 3' 配列 ^')11
[0111] なお、図 25は、 Perlの mRNA量を定量した結果を示す図（図面代用グラフ）であり 、図 26は、 Per2の mRNA量を定量した結果を示す図（図面代用グラフ）である。な お、 Perl、 Per2の mRNA量は、内在性コントロールとしての GAPDH (glyceraldehy de-3-phosphate dehydrogenase)の量に対する相対値として計算した。
[0112] 考察。
[0113] BMAL1-CLOCKタンパク質複合体量の変動パターンと、 BMAL1-CLOCKタンパク 質複合体によって転写が活性化される Perl、 Per2の mRNAの変動パターンが似通 つていることから（図 24と図 25及び図 26を比較参照）、 BMAL1-CLOCKタンパク質 複合体量力 S、BMAL1-CL0CKタンパク質複合の転写活性を反映していることが示さ れた。この結果から、本発明を応用することによって、時計タンパク質を検出すること が可能であり、なおかつ、 BMAL1-CLOCKタンパク質複合体の「発現変動」について 詳しく観察することが可能であることが実証された。
[0114] 以上の実験例は、本発明の応用例の一部を示すものである。転写制御が転写因子 の量や翻訳後修飾の度合い、他の分子との複合体形成により制御されて!/、る場合は 、実施例に示したように細胞破砕液を使うことができる。転写制御が前記制御機構に 依存せず、転写因子の核内移行によって制御されている場合は、核抽出液を用いる ことで転写因子の活性度を測定することができる。また、 Notchや SREBPのように膜結 合型タンパク質として生成され、タンパク質切断酵素により切断され核内へ移行する ような転写因子に関しては、膜画分を含まないような細胞抽出液を用いることで転写 因子の活性度を測定することが出来る。
[0115] なお、転写因子の中には、ステロイドホルモンと結合してはじめて転写活性を有す る核内レセプターが多く存在する。本発明を応用して、これら核内レセプターのリガン ド (ステロイドホルモン等）を検索、定量することも可能である。また、核内レセプター に対するァゴニストやアンタゴニストとして働く薬剤の検索、定量、評価を行うことも可 能である。コレステロールによって活性化される SREBPを測定すれば、メタボリックシ ンドロームやアルツハイマーなどの予防が可能となることも考えられ、ビタミンゃホノレ モンの核内受容体となる転写因子を測定することで、栄養状態をはじめとする生理状 態を知ること力 Sできる。精製した核内受容体を用いれば、リガンドとなるビタミンやホル モンの定量や核内受容体との親和性の測定が可能であり、また、核内受容体をター ゲットしたァゴニストやアンタゴニストのスクリーニングや評価に本発明を応用すること も可能である。
産業上の利用可能性
本発明は、反応場に存在する極微量の物質を高感度に蛍光検出する技術として 利用することができる。例えば、
(1)検出用核酸鎖に相補的な標的核酸鎖の検出、（2)核酸以外の生体物質の検出 、 （3)生体物質の化学的変化（化学的修飾）の検出、（4)タンパク質その他の生体物 質の構造変化の検出、（5)薬剤候補物質の検出又はスクリーニング、 （6)環境ホル モン（内分泌撹乱物質の検出、（7)疾病診断、（8) DNAチップなどのセンサーチッ プ分野において特に有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy)のドナーとなり得る蛍光物 質と、
前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクェンチヤ一物 質と、
前記クェンチヤ一物質と前記蛍光物質の間に位置しており、エンドヌクレアーゼに より切断される酵素切断部位が形成された核酸鎖部分と、
を少なくとも有する検出用核酸鎖。
[2] 前記酵素切断部位は、二本鎖特異的な AP-エンドヌクレアーゼにより切断される塩 基欠落部位 (AP部位)であることを特徴とする請求項 1記載の検出用核酸鎖。
[3] 前記核酸鎖部分は、オリゴヌクレオチド鎖であることを特徴とする請求項 1記載の検 出用核酸鎖。
[4] 前記核酸鎖部分には、所定のタンパク質と結合する応答塩基配列領域が存在する ことを特徴とする請求項 1記載の検出用核酸鎖。
[5] 前記タンパク質は、転写因子であることを特徴とする請求項 4記載の検出用核酸鎖
[6] 共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy)のドナーとなり得る蛍光物 質と、
前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクェンチヤ一物 質と、
前記クェンチヤ一物質と前記蛍光物質の間に位置しており、エンドヌクレアーゼに より切断される酵素切断部位を有する核酸鎖部分を少なくとも有する検出用核酸鎖 が係わる相補鎖形成反応を進行させる手順と、
前記相補鎖形成反応によって得られた二本鎖に特異的な前記エンドヌクレアーゼ を作用させることによって、前記酵素切断部位でプローブ核酸鎖を切断して断片化し 、かつ、一本鎖へ解離させることによって、前記蛍光物質の蛍光を増幅する手順と、 を少なくとも行う核酸鎖利用方法。
[7] 請求項 6記載の方法を利用する方法であって、 前記エンドヌクレアーゼ作用前の蛍光強度と作用後の蛍光強度とを測定し、蛍光 増幅の有無又は増幅量に基づレ、て、次の（1)から (5)の!/、ずれかを検出することを 特徴とする方法。
(1)前記検出用核酸鎖に相補的な標的核酸鎖。
(2)核酸以外の生体物質。
(3)生体物質の化学的変化。
(4)生体物質の構造変化。
(5)薬剤候補物質。
前記エンドヌクレアーゼ切断前の前記検出用核酸鎖が前記相補鎖形成反応を進 行できる上限温度以下であり、かつ、前記エンドヌクレアーゼ切断後の検出用核酸鎖 断片が相補鎖形成反応を維持又は進行できなくなる温度以上の温度条件下で行う ことを特徴とする請求項 7記載の方法。
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