KR20090052322A - 물질의 검출 등에 유용한 핵산쇄와 그 방법 - Google Patents

물질의 검출 등에 유용한 핵산쇄와 그 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090052322A
KR20090052322A KR1020097002996A KR20097002996A KR20090052322A KR 20090052322 A KR20090052322 A KR 20090052322A KR 1020097002996 A KR1020097002996 A KR 1020097002996A KR 20097002996 A KR20097002996 A KR 20097002996A KR 20090052322 A KR20090052322 A KR 20090052322A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
acid chain
detection
chain
endonuclease
Prior art date
Application number
KR1020097002996A
Other languages
English (en)
Inventor
카즈히로 나카가와
Original Assignee
소니 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 소니 가부시끼가이샤 filed Critical 소니 가부시끼가이샤
Publication of KR20090052322A publication Critical patent/KR20090052322A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/119—Modifications characterised by incorporating abasic sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • C12Q2565/1015—Interaction between at least two labels labels being on the same oligonucleotide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

극미량(極微量) 물질을 검출할 때에, 해당(當該) 극미량 물질의 증폭을 행하지 않아도 고감도로 검출하는 것을 과제로 한다.
공명 여기 에너지(fluorescence Resonance Energy)의 도너로 될 수 있는 형광 물질 F와, 상기 공명 여기 에너지를 수취하는 것이 가능한 위치에 존재하는 쿠엔처 물질 Q와, 그 쿠엔처 물질 Q와 상기 형광 물질 F 사이에 위치하고 있으며, 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 효소 절단 부위 X를 가지는 핵산쇄 부분 N을 적어도 가지는 검출용 핵산쇄 P나 그 검출용 핵산쇄 P를 이용한 검출 기술을 제공한다.

Description

물질의 검출 등에 유용한 핵산쇄와 그 방법{NUCLEIC ACID STRAND USEFUL IN DETECTING SUBSTANCE AND METHOD THEREOF}
본 발명은, 물질의 검출 등에 유용한 핵산쇄(核酸鎖)와 그의 관련 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 형광 물질과 쿠엔처 물질 사이의 염기 배열 부분에 효소 절단 부위가 존재하는 핵산쇄와, 그 핵산쇄를 이용하는 방법에 관한 것이다.
물질로부터 발(發; emit)해지는 형광을 검출하는 것에 의해, 물질의 존재나 반응 등을 검출하는 기술이 알려져 있으며, 여러 가지 센서 기술 등에 널리 이용되고 있다.
예를 들면, 반응장에 존재하고 있는 물질의 존재를, 해당 물질과 특이적으로 상호 작용할 수 있는 프로브 물질을 상기 반응장에 도입하고, 그 프로브 물질에 미리 표지(標識; 라벨) 붙여진 형광이 그의 반응장으로부터 검출할 수 있는지 여부에 따라서 확인하는 기술이 알려져 있다. 예를 들면, 기판(칩) 표면에 고정된 핵산쇄를 향해서, 형광 표지 붙여진 핵산쇄를 도입하고, 양(兩)핵산쇄 사이의 하이브리다이제이션(hybridization)의 유무를 형광 검출에 의해 행하는 수법은 DNA 칩의 관용 기술이다.
또, 반응장에 존재하고 있는 단일가닥(一本鎖; single-stranded) 핵산끼리가 하이브리다이제이션했을 때에, 그의 상보 결합 부분에 특이적으로 결합해서 형광을 발하는 물질, 이른바 「인터컬레이터(intercalator)」도 알려져 있다. 이 인터컬레이터는, 핵산쇄에 형광 물질을 미리 표지 붙여두는 수고를 생략할 수 있는 등의 이점이 있다.
「FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)」는, 여기(勵起)된 형광 물질(Donor)로부터 방출된 공명 여기 에너지를 수취한 형광 물질(Acceptor)이 여기 상태로 되어 형광이 발해지는 현상 또는 원리를 말한다. 이 「FRET」가 일어나기(발생되기) 위해서는, 도너와 억셉터의 형광 스펙트럼이 중합(重合; overlap)하는 것, 양물질이 일정 정도의 범위나 적절한 위치 관계에 있는 것이 필요하다. 이 「FRET」를 이용해서, 도너로 되는 형광 물질이 라벨 붙여진 물질과 억셉터로 되는 형광 물질이 라벨 붙여진 물질과의 상호 작용의 유무를 검출하는 기술이 알려져 있다(예를 들면, 일본공개특허 제(特開)2004-065262호 공보, 일본공개특허 제2005-207823호 공보 참조).
다음에, 「생물 발광 공명 에너지 이동(BRET)」은, 단백질간 상호 작용을 직접적으로 검출할 수 있는 생물 물리학적인 방법이다. 이 「BRET」는, 원래 발광 해파리 Aequorea victoria나 바다 표고 Renilla reniformis 등의 해양 생물에 인정되는 프로세스이며, 도너 단백질과 억셉터 단백질이 접근했을 때에 발생하는, 도너 단백질의 여기 에너지 이동에 수반하는 억셉터 단백질의 에너지 방출을, 형광 검출할 수가 있다. 따라서, BRET는 단백질간의 상호 작용을 검출하는 유용한 기술로 될 수 있다.
반응장이나 시료 용액중에 존재하는 극미량(極微量) 물질을 검출하려고 하는 경우에, 일반적으로 행해지는 수법은, 상기 극미량 물질을 증폭시키는 것에 의해서 검출 감도를 향상시키는 것이다. 예를 들면, 검출 대상으로 되는 극미량의 핵산쇄를, PCR(polymerase chain reaction)법에 의해서 증폭하는 기술은 널리 행해지고 있다.
그러나, 극미량 물질의 증폭에는, 신중한 작업이 요구되고, 수고(手間; effort)도 요하며, 또 특별한 고가의 장치도 필요하게 되는 경우가 많다. 또, 작업에 신중을 기해도, 목적으로 하는 대상외의 물질이 증폭 과정에서 부차적으로 발생해 버릴 가능성이 있으며, 이 경우는 검출 노이즈의 원인으로 되어 버린다는 기술적 과제가 있었다. 이에 부가해서, 단백질이나 지방질(脂質) 등의 생체 물질은 핵산쇄에 비해서 증폭하는 것이 어렵다는 기술적 과제도 있다.
그래서, 본 발명은 극미량 물질을 검출할 때에, 해당 극미량 물질의 증폭을 행하지 않아도 고감도로 검출할 수 있는 기술을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
본 발명에서는, 우선 공명 여기 에너지(fluorescence Resonance Energy)의 도너로 될 수 있는 형광 물질과, 상기 공명 여기 에너지를 수취하는 것이 가능한 위치에 존재하는 쿠엔처 물질과, 그 쿠엔처 물질과 상기 형광 물질 사이에 위치하고 있으며, 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의해 절단되는 효소 절단 부위가 형성된 핵산쇄 부분을 적어도 가지는 검출용 핵산쇄를 제공한다.
또한, 「쿠엔처 물질」은, 형광을 저감 또는 소광(消光; quenching)하는 기능을 가지는 물질을 널리 의미하며 좁게 한정되지 않는다. 「핵산쇄」는, 푸린 또는 피리미딘 염기와 당(糖)이 글리코시드 결합한 뉴클레오시드의 인산 에스테르의 중합체(뉴클레오티드쇄)를 의미하고, 프로브 DNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 푸린 뉴클레오티드와 피리미딘 뉴클레오티드가 중합한 DNA(전체 길이(全長) 혹은 그의 단편(斷片; fragment)), 역전사(逆轉寫)에 의해 얻어지는 cDNA(c프로브 DNA), RNA 등을 널리 포함한다.
「엔도뉴클레아제」는, 핵산쇄의 내부를 절단하는 핵산 분해 효소의 총칭이며, 본 발명에서는 본 효소를 단독으로 이용하거나, 혹은 다른 협동적 작용을 발휘하는 효소와 병용하거나 한다. 「검출용 핵산쇄」는, 소정의 물질, 반응(화학적 결합, 상호 작용 등을 포함한다), 구조 등을 검출할 목적으로 이용되는 핵산쇄이며, 경우에 따라서는 프로브 핵산쇄라고 칭해지는 바와 같은 개념과 일치한다.
본 발명에 따른 검출용 핵산쇄를 구성하는 핵산쇄 부분에 존재하는 상기 효소 절단 부위로서는, 예를 들면 이중가닥(二本鎖; double strand; 두가닥) 특이적인 AP-엔도뉴클레아제에 의해서 절단될 수 있는 염기 결락(缺落) 부위(AP 부위)를 들 수 있다.
또한, 「AP 부위(Apurinic/Apyrimidinic site)」는, 핵산쇄에서 염기가 결락(탈락)하고 있는 부위를 의미하고, 「AP-엔도뉴클레아제(AP-endonuclease 또는 Apurinic/Apyrimidinic endonuclease)」는, 핵산쇄에서 AP 부위에 닉(nick, 새김눈(切目))을 넣는 AP 리아제 활성을 가지는 효소이다. 그 예를 몇 가지 들면, Endonuclease Ⅵ·Endonuclease Ⅳ(AP 부위의 5'측을 절단), Endonuclease Ⅲ(AP 부위의 3'측을 절단), Endonuclease S1, Endonuclease Ⅷ, Formamidopyrimidine-DNA-glycosylase(Fpg), OGG1 등이다. 본 발명에서, 특히 유용한 AP-엔도뉴클레아제는, 이중가닥을 특이적으로 인식하고, 또한 염기 결락 부위를 가지는 측의 한쪽의 핵산쇄를 해당 염기 결락 부위에서 절단하는 효소이다.
본 발명에 따른 핵산쇄의 염기수(핵산 분자수)는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 올리고 뉴클레오티드쇄로서, 같은(同) 핵산쇄의 용도에 대해서도 특별히 한정은 되지 않지만, 1예를 들면 표적 물질(검출 목적의 물질)을 검출하기 위한 프로브로서 이용할 수가 있다. 또한, 올리고 뉴클레오티드쇄라 함은, 수십 염기 정도, 예를 들면 15∼30염기 정도의 뉴클레오티드 폴리머를 의미한다. 핵산쇄 부분은, 예를 들면 소정의 단백질과 결합하는 응답 염기 배열 영역이 존재하는 것이더라도 좋으며, 그 단백질은, 핵산쇄와 결합하는 기능을 가지는 단백질로서, 그의 1예는, 전사 인자이다.
다음에, 본 발명은 (1) 공명 여기 에너지(fluorescence Resonance Energy)의 도너로 될 수 있는 형광 물질과, 상기 공명 여기 에너지를 수취하는 것이 가능한 위치에 존재하는 쿠엔처 물질과, 그 쿠엔처 물질과 상기 형광 물질 사이에 위치하고 있으며, 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 효소 절단 부위를 가지는 핵산쇄 부분을 적어도 가지는 검출용 핵산쇄가 관계되는 상보쇄 형성 반응을 진행시키는 수순(手順), (2) 상기 상보쇄 형성 반응에 의해서 얻어진 이중가닥에 특이적인 엔도뉴클레아제를 작용시키는 것에 의해서 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 프로브 핵산쇄를 절단해서 단편화하고, 또한 단일가닥으로 해리시키는 것에 의해서, 상기 형광 물질의 형광을 증폭하는 수순, 이상 (1), (2)의 수순을 적어도 행하는 핵산쇄 이용 방법을 제공한다.
또한, 「상보쇄 형성 반응」은, 핵산(뉴클레오티드쇄) 사이의 이른바 하이브리다이제이션으로서, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA 사이의 상보 결합 등을 널리 포함한다.
본 발명에 따른 방법은, 쿠엔처 물질의 작용에 의해 형광 저감 또는 소광 상태에 있는 검출용 핵산쇄가, 스스로 상보적인 핵산쇄와 이중가닥을 형성한 것이 상정(想定)될 때, 이중가닥 특이적인 엔도뉴클레아제의 작용에 의해, 검출용 핵산쇄를 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 절단함과 동시에, 단일가닥으로 해리시킨다.
이 단일가닥 해리의 단계에서는, 검출용 핵산쇄는, 형광 물질측의 핵산쇄와 쿠엔처 물질측의 핵산쇄로 단편화되어 유리(遊離)되기 때문에, 형광 물질은 쿠엔처 물질과 거리를 두고 존재하게 되므로, (쿠엔처 물질의 영향이 없어져서) 형광이 증폭하게 된다.
본 방법은, 예를 들면 엔도뉴클레아제 절단 전의 상기 검출용 핵산쇄가 상기 상보쇄 형성 반응을 진행할 수 있는 상한 온도 이하이며, 또한 엔도뉴클레아제 절단 후의 검출용 핵산쇄 단편이 상보쇄 형성 반응을 유지 또는 진행할 수 없게 되는 온도 이상의 온도 조건하에서 행할 수가 있다.
이 형광 증폭의 유무, 혹은 증폭량(증폭의 정도)을 측정하는 것에 의해서, 본 발명에서는, 검출용 핵산쇄가 이중가닥(상보쇄)을 형성한 것, 즉 상기 프로브 핵산쇄와 상보적인 표적 핵산쇄가 존재하는 것, 나아가서는 핵산 이외의 생체 물질이 존재하는 것, 생체 물질에 화학적 변화나 구조 변화가 일어나고 있는 것, 약제(藥劑) 후보 물질이 존재하는 것, 등을 알 수가 있다.
본 발명에 핵산쇄를 이용하는 것에 의해서, 극미량 물질을 검출할 때에, 해당 극미량 물질의 증폭을 행하지 않아도 고감도로 검출할 수가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄의 개념 및 실시형태예를 설명하기 위한 도면,
도 2는 같은 검출용 핵산쇄중, 형광 물질(F)과 쿠엔처 물질(Q)의 양쪽을 핵산쇄의 도중(途中) 부위에 결합한 실시형태예를 도시하는 도면,
도 3은 같은 검출용 핵산쇄중, 형광 물질(F)을 말단 부위, 한쪽의 쿠엔처 물질(Q)을 도중 부위에 결합한 다른 실시형태예를 도시하는 도면,
도 4는 같은 검출용 핵산쇄중, 형광 물질(F)을 도중 부위, 한쪽의 쿠엔처 물질(Q)을 말단 부위에 결합한 또 다른(別) 실시형태예를 도시하는 도면,
도 5는 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)의 기능과 그의 대표적인 사용예를 도시하는 도면,
도 6은 AP-엔도뉴클레아제 E에 의해서 AP 부위 X에 대해서 새김눈이 형성되는 모습을 모식적으로 도시하는 도면,
도 7은 적정 온도 조건(t)하에서, AP-엔도뉴클레아제(E)에 의해서 절단된 검출용 핵산쇄 단편(P1, P2)이 핵산쇄(T)로부터 해리하고, 단일가닥으로서 반응장(R)에 유리되어 있는 상태를 모식적으로 도시하는 도면,
도 8은 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P에 의한 「사이클 반응」의 기본적인 플로를 도시하는 도면,
도 9는 반응장(R)의 온도 조건의 변화에 따라서, (절단되어 있지 않은) 검출용 핵산쇄(P)와, (AP-엔도뉴클레아제 E에 의해서 절단된) 검출용 핵산쇄 단편(P1, P2)의 이중가닥 형성 또는 해리의 모습을 도시하는 참고도,
도 10은 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)를 이용하는 제1 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도,
도 11은 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)를 이용하는 제2 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도,
도 12는 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)를 이용하는 제3 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도,
도 13은 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)를 이용하는 제4 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도,
도 14는 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)를 이용하는 제5 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도,
도 15는 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)를 이용하는 제6 응용 방법예의 개 념을 도시하는 모식도,
도 16은 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄(P)를 이용하는 제7 응용 방법예의 개념을 도시하는 도면으로서, 구조 변화 전의 물질(예를 들면, 단백질 Dx)을 검출하고 있는 경우의 모식도,
도 17은 같은 제7 응용 방법예의 개념을 도시하는 도면으로서, 구조 변화 후의 물질(예를 들면, 단백질 Dy)을 검출하고 있는 경우의 모식도,
도 18은 같은 제8 응용예의 개념을 도시하는 도면으로서, 검출용 핵산쇄 P를 DNA 칩의 프로브로서 이용한 예를 도시하는 모식도,
도 19는 실험예 1: 100f㏖의 표적 핵산쇄와 8p㏖의 (AP 부위를 가지는) 검출용 핵산쇄를 AP-엔도뉴클레아제와 반응시키고, 검출 핵산쇄의 절단을 검출한 결과를 도시하는 도면(아가로스 전기 영동의 결과를 나타내는 사진),
도 20은 실험예 2: 형광 시그널의 증폭을 경시적(經時的)으로 검출했을 때의 결과를 도시하는 도면(종축: 형광 강도, 횡축: 시간(분)),
도 21은 실험예 2: 각 표적 핵산쇄의 농도와 초기 반응 속도를 「Lineweaver Burk Plot」을 이용해서 플롯했을 때의 도면(그래프),
도 22는 실험예 3: 형광 색소(FITC)의 형광의 증가를 경시적으로 측정한 결과이며, 단위 시간당의 형광의 증가율을, 각 시각에서 플롯한 도면(도면 대용 그래프),
도 23은 실험예 3: Hela 세포의 세포수(횡축)를 바꾸어, BMAL1-CLOCK 복합체의 검출을 행한 결과를 도시하는 도면(도면 대용 그래프),
도 24는 실험예 4: Hela 세포를 50Horse Serum을 포함한 배양액(DMEM 배지(培地; culture medium))에서 2시간 자극하고, 자극 스타트시(시작시)로부터 15시간, 17.5시간, 20시간, 22.5시간 후에 세포를 회수하고, BMAL1-CLOCK 단백질 복합체를 검출한 결과를 도시하는 도면(도면 대용 그래프),
도 25는 실험예 4: Per1의 mRNA량을 정량(定量)한 결과를 도시하는 도면(도면 대용 그래프),
도 26은 실험예 4: Per2의 mRNA량을 정량한 결과를 도시하는 도면(도면 대용 그래프).
이하, 본 발명의 실시형태예에 대해서, 첨부 도면을 참조로 하면서 설명한다. 또한, 본 발명의 개념은, 이하에 설명하는 실시형태예에 의거해서 좁게 해석되는 일은 없다.
우선, 도 1∼도 4는 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄의 개념 및 실시형태예를 설명하기 위한 도면이다.
도 1∼도 4중에 도시되어 있는 부호 P는, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄의 1실시형태예를 나타내고 있다. 이 검출용 핵산쇄 P는, 공명 여기 에너지(fluorescence Resonance Energy)의 도너로 될 수 있는 형광 물질 F와, 상기 공명 여기 에너지를 수취하는 것이 가능한 위치에 존재하는 쿠엔처 물질 Q와, 그 쿠엔처 물질과 상기 형광 물질 사이에 위치하는 핵산쇄 부분 N과, 그 핵산쇄 부분 N에 존재하는 효소 절단 부위(예를 들면, AP 부위: 도면중, 부호 X로 나타낸다)를 적어도 가지고 있다.
예를 들면, 소정의 분자 길이로 이루어지는 핵산쇄의 3' 말단 또는 5' 말단에 형광 물질 F를 결합하고(표지 붙이고), 그 형광 물질 F와는 반대측(逆側; 대향하는 측)의 말단부에 쿠엔처 물질 Q를 결합한(표지 붙인) 경우에서는, 상기 핵산쇄의 전부가 형광 물질 F와 쿠엔처 물질 Q 사이에 위치하고 있으므로, 그 전체 핵산쇄 부분이 본 발명에서 말하는 핵산쇄 부분 N에 상당하는 것으로 된다(도 1 참조).
또, 소정의 분자 길이로 이루어지는 핵산쇄의 말단 이외의 위치에, 형광 물질 F와 쿠엔처 물질 Q의 양쪽 또는 어느것인가 한쪽을 결합한 구성에서는, 양물질 F, Q 사이에 존재하고 있는 핵산쇄 영역이 본 발명에서 말하는 핵산쇄 부분 N으로 된다(도 2∼도 4 참조).
구체적으로는, 도 2는 형광 물질 F와 쿠엔처 물질 Q의 양쪽을 핵산쇄의 도중 부위에 결합한 실시형태예, 도 3은 형광 물질 F를 말단 부위, 한쪽의 쿠엔처 물질 Q를 도중 부위에 결합한 다른 실시형태예, 도 4는 형광 물질 F를 도중 부위, 한쪽의 쿠엔처 물질 Q를 말단 부위에 결합한 또 다른 실시형태예를 각각 도시하고 있다.
도 5는, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P의 기능과 그의 대표적인 사용예를 도시하는 도면이다. 또한, 이 도 5에 도시하는 예에서는, 같은 검출용 핵산쇄 P를 이용해서, 그 핵산쇄 부분 N과 상보적인 염기 배열을 가지는 핵산쇄 T의 존재나 그의 존재량을 검출하는 예가 나타내어져 있으며, 본 예에서는, 도 1에 도시하는 검출용 핵산쇄 P를 대표예로서 설명하고 있다(도 2∼도 4의 검출용 핵산쇄 P이더라도 좋다).
검출용 핵산쇄 P는, 소정의 효소 처리(후술)가 시행되기 전에서는, 형광 물질 F로부터 발해질 형광이 쿠엔처 물질 Q의 작용에 의해서 저감 또는 소광되어 있다. 이 상태에 있는 검출용 핵산쇄 P가 존재하는 반응장 R에 샘플 용액을 도입했을 때에, 그 샘플 용액중에 검출용 핵산쇄 P의 핵산쇄 부분 N과 상보적인 염기 배열을 가지는 핵산쇄 T가 존재하면, 상기 핵산쇄 부분 N과 핵산쇄 T는 이중가닥(상보쇄)을 형성한다(상보쇄 형성 수순). 또한, 도 5중의 부호 W는, 상기 상보쇄 형성 수순에 의해서 생성한 이중가닥(상보쇄) 부분을 나타내고 있다(이하, 마찬가지).
다음에, 상기 상보쇄 형성 수순을 행한 후, 혹은 이 수순과 동시에, 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 반응장 R에 도입하면(도 6 참조), 그 AP-엔도뉴클레아제 E가 상보쇄 W를 형성하고 있는 (검출용 핵산쇄 P의) 핵산쇄 부분 N에 존재하고 있는 AP 부위 X를 인식하고, 그 AP 부위 X부분에 대해서 새김눈(Nick)을 넣고, 검출용 핵산쇄 P를 형광 물질 F측과 쿠엔처 물질 Q측으로 분단한다. 즉, 이중가닥(상보쇄) 부분 W는, 형광 물질 F측의 이중가닥 W1과 쿠엔처 물질 Q측의 이중가닥 W2로 단쇄화(短鎖化)된다. 또한, 도 6은 AP-엔도뉴클레아제 E에 의해서 AP 부위 X에 대해서 새김눈이 형성되는 모습을 모식적으로 도시하는 도면이다.
여기서, 이중가닥(상보쇄) 부분 W(도 5 참조)와, AP-엔도뉴클레아제 E에 의해서 단쇄화된 이중가닥 W1 및 이중가닥 W2(도 6 참조)에서는, 쇄 길이(鎖長)가 다 르기 때문에, tm(멜트 온도)이 상위(相違)하다. 즉, tm은, W>W1, W>W2로 된다.
그래서, 반응장 R의 버퍼 용액 온도 조건을, AP-엔도뉴클레아제 E에 의한 절단 전의 검출용 핵산쇄 P가 상기 상보쇄 형성 반응을 진행 또는 유지할 수 있는 온도 ta 이하이고, 또한 상기 AP-엔도뉴클레아제 E에 의한 절단 후의 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2(도 6 참조)가 상보쇄 형성 반응을 유지 또는 진행할 수 없게 되는 온도 tb 이상의 적정 온도(t) 조건, 즉 온도 tb≤t≤ta로 한다.
도 7은 상기 적정 온도 조건 t하에서, AP-엔도뉴클레아제 E에 의해서 절단된 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2(도 6 참조)가 핵산쇄 T로부터 해리하고, 단일가닥으로서 반응장 R에 유리되어 있는 상태를 모식적으로 도시하고 있다.
또, 도 9는 반응장 R의 온도 조건의 변화에 의해서, (절단되어 있지 않은) 검출용 핵산쇄 P와, (AP-엔도뉴클레아제 E에 의해서 절단된) 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2의 이중가닥 형성 또는 해리의 모습을 도시하는 참고도이다.
도 9에 대해서 구체적으로 설명하면, 온도 tb 미만의 온도 t1 조건에서는, 검출용 핵산쇄 P와 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2 모두가 이중가닥 형성을 진행시키는 것이 가능하며, 또 이중가닥을 유지할 수도 있다.
다음에, 적정 온도 t2 (tb≤t2≤ta)의 조건하에서는, 검출용 핵산쇄 P가 상기 상보쇄 형성 반응을 진행가능하며, 형성된 상보쇄는 유지할 수가 있다. 한편, AP- 엔도뉴클레아제 E에 의해서 단쇄화된 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2는, 핵산쇄 T로부터 해리해서 각각 단일가닥으로 되어 있으며, 이 단일가닥 해리에 의해서, 형광 물질 F는 쿠엔처 물질 Q와 거리를 두고 존재하게 되기 때문에, (쿠엔처 물질 Q의 영향이 없어져) 형광이 증폭하게 된다(도 9 참조).
또, 온도 t3의 조건하에서는, 검출용 핵산쇄 P도 단일가닥으로 해리하고 있으며, AP-엔도뉴클레아제 E에 의해서 단쇄화된 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2도, 핵산쇄 T로부터 해리해서 각각 단일가닥으로 되어 있다(도 9 참조).
여기서, 본 발명은, 반응장 R에 대해서, 핵산쇄 T에 비해 과잉량의 검출용 핵산쇄 P를 도입하는 것에 의해서, 「핵산쇄 T와 검출용 핵산쇄 P 사이의 상보쇄 형성(도 5 참조)」「AP-엔도뉴클레아제 E에 의한 검출용 핵산쇄 P의 단쇄화(도 6 참조)」→「단쇄화된 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2의 핵산쇄 T로부터의 해리와 그것에 수반하는 형광 증폭(도 7 참조)」라는 일련의 반응이, 반응장 R에 존재하는 검출용 핵산쇄 P에 의해서 몇번이나 반복됨으로써(이하, 편의상 「사이클 반응」이라고 한다), 반응장 R에 존재하는 극미량의 핵산쇄 T로부터도 증폭된 강한 형광 시그널을 얻을 수 있다는 이점이 있다. 또한, 도 8은 이 사이클 반응의 기본적인 플로를 도시하는 도면이다.
즉, 반응장 R에 존재하는 핵산쇄 T의 양을 일부러 증폭하지 않아도, 극미량인 채의 상태로부터, 같은 핵산쇄 T의 존재를 나타내게 되는(쿠엔처 물질 Q에 의해서 소광되지 않게 된) 형광 물질 F 유래(由來)의 강한 형광 시그널을 반응장 R로부 터 얻을 수 있게 되므로, 핵산쇄 T를 고감도로 검출할 수가 있다.
따라서, 본 발명에서, 반응장 R의 온도 조건의 설정은, 핵산쇄 T와 검출용 핵산쇄 P 사이의 상보쇄 형성을 진행시킬 수 있는 것이 중요하므로, 도 9에 도시하는 바와 같은 ta를 초과하는 온도 t3의 조건은, 바람직하지 않다.
따라서, 본 발명에서 매우 적합한 온도 조건은, 이미 기술(旣述)한 바와 같이, AP-엔도뉴클레아제 E에 의한 절단 전의 검출용 핵산쇄 P가 상기 상보쇄 형성 반응을 진행 또는 유지할 수 있는 온도 ta 이하이며, 또한 상기 AP-엔도뉴클레아제 E에 의한 절단 후의 검출용 핵산쇄 단편 P1, P2(도 6 참조)가 상보쇄 형성 반응을 유지 또는 진행할 수 없게 되는 온도 tb 이상의 온도(즉, 온도 tb≤t≤ta)이다(도 9 재참조).
또한, 검출용 핵산쇄 단편 P1과 P2(도 6 참조)의 쇄 길이가 다른 것에 의해서, 이들 tm이 다른 경우가 상정되지만, 그 경우는 보다 높은 쪽의 tm을, 설정 온도 조건의 하한 온도 tb로서 취급하는 것에 의해서, 검출용 핵산쇄 단편 P1과 P2 양쪽을 핵산쇄 T로부터 해리시킬 수가 있다. 이것에 의해, 상기 반복 반응을 행하는 것이 가능하게 된다.
이하, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용한 응용 방법예에 대해서, 몇 가지 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 응용 방법예는, 어디까지나 예시로서, 이들에 의해, 본 발명이 좁게 한정되는 일은 없다.
이하에 예시하는 응용 방법예의 어느것에나 공통되는 본 발명의 특징은, 반응장에 도입된 과잉량의 검출용 핵산쇄 P가 관계되는 상기 「사이클 반응」에 의해서, 극미량의 물질, 양적으로 적은 반응이나 상호 작용, 물질 구조의 변화를 고감도로 검출할 수 있다는 점이다. 이 점에 대해서는, 중복되므로 그 때마다의 자세한 설명에 대해서는 생략(割愛)한다.
<제1 응용 방법예>
도 10은, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제1 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도이다. 이 제1 응용 방법예에서는, 핵산쇄 Y의 염기 배열중에, 목적으로 하는 염기 배열 영역이 존재하는지 여부를 검증하는 경우 등에 유용하다. 1예를 들면, 유전자 상류에 위치하는 프로모터 영역중에, 특정의 전사 인자에 대한 특이적인 응답 염기 배열 부분이 존재하는지 여부를 확인할 수가 있다.
<제2 응용 방법예>
도 11은, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제2 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도이다. 이 제2 응용 방법예에 의하면, 고상(固相)(예를 들면, 기판, 비즈, 담체(擔體) 등)의 표면 S에 검출 표적으로 되는 물질(예를 들면, 단백질)이 존재하고 있는지 여부를 검출할 수가 있다.
보다 구체적으로는, 표면 S가 향(臨)하는 반응장 R에 샘플 용액을 도입하고, 이것에 계속해서, 검출 목적인 물질 M과 특이적으로 결합하는 염기 배열을 가지는 핵산쇄 Z1을 도입한 후, 혹은 그것과 동시에, 상기 염기 배열과 상보적인 핵산쇄 부 분 N을 가지는 검출용 핵산쇄 P를 도입하고, 그 후 반응장 R을 용액 세정한다. 그리고, 또 검출 핵산쇄 P와 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 반응장 R에 도입한다.
가령, 상기 샘플 용액중에 상기 물질 M이 존재하고 있던 경우는, 상보쇄를 형성한 핵산쇄 Z1과 검출용 핵산쇄 P가 물질 M과 결합한 상태로 되므로, 그 상보쇄에 대해서 AP-엔도뉴클레아제 E가 작용하고, 그 상보쇄(를 구성하는 핵산쇄 부분 N의 AP 부위 X)에 새김눈을 넣어 단일가닥화한다. 이 때문에, 해당 물질 M의 함유량이 극미량이더라도, 검출용 핵산쇄 P를 구성하고 있던 형광 물질 F로부터의 강한 형광 시그널을 얻을 수 있다. 이것에 의해, 상기 물질 M의 고감도 검출을 행할 수가 있다.
<제3 응용 방법예>
도 12는 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제3 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도이다. 이 제3 응용 방법예에 의하면, 고상(예를 들면, 기판, 비즈 등)의 표면 S에 고정되어 있는 물질 K에 대한 물질 L의 반응이나 상호 작용을 검출할 수가 있다.
보다 구체적으로는, 물질 K가 미리 고정된 표면 S가 향하는 반응장 R에 대해서, 상기 물질 K와의 반응이나 상호 작용의 유무를 검증하는 물질 L을 함유하는 샘플 용액을 도입하고, 그 후 반응장 R을 용액 세정한다. 또한, 물질 L에는 소정 염기 배열의 핵산쇄 Z2를 미리 표지 붙여 두도록 한다.
용액 세정에 계속해서, 상기 핵산쇄 Z2의 염기 배열과 상보적인 핵산쇄 부분 N을 가지는 검출용 핵산쇄 P를 도입하고, 계속해서 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 반응장 R에 도입한다.
가령, 물질 K와 물질 L이 반응해서 결합하는 경우 또는 상호 작용하는 경우는, 반응장 R에서 물질 L에 표지 붙여져 있는 핵산쇄 Z2와 검출용 핵산쇄 P(의 핵산쇄 부분 N)이 상보쇄를 형성하므로, 그 상보쇄에 대해서 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E가 작용하고, 그 상보쇄(를 구성하는 핵산쇄 부분 N의 AP 부위 X)에 새김눈을 넣어 단일가닥화한다. 이 때문에, 물질 K와 물질 L의 반응이나 상호 작용의 양이 아주 조금이더라도, 검출용 핵산쇄 P를 구성하고 있던 형광 물질 F로부터의 강한 형광 시그널을 얻을 수 있다.
이것에 의해, 물질 K와 물질 L의 반응(예를 들면, 항원 항체 반응)이나 상호 작용(예를 들면, 단백질간의 상호 작용, 지방질과 결합 분자의 반응 등)의 고감도 검출을 행할 수가 있다.
<제4 응용 방법예>
도 13은 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제4 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도이다. 이 제4 응용 방법예에 의하면, 약제 후보로 될 수 있는 바와 같은 저분자 화합물, 예를 들면 리셉터(receptor)에 결합해서, 아고니스트나 안타고니스트로 될 수 있는 화합물을 고감도로 검출 또는 스크리닝할 수가 있다.
보다 구체적으로는, 기판 등의 고상 표면 S에 존재하는 물질 U를 향해서, 상기 물질 U와 결합 또는 상호 작용할 수 있는 후보 물질 V를 함유하는 샘플 용액을 도입하고, 그 후 반응장 R을 용액 세정한다. 또한, 물질 V에는 소정 염기 배열의 핵산쇄 Z2를 미리 표지시켜 두도록 한다.
이 용액 세정에 계속해서, 상기 핵산쇄 Z2의 염기 배열과 상보적인 핵산쇄 부분 N을 가지는 검출용 핵산쇄 P를 도입하고, 계속해서 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 반응장 R에 도입한다.
가령, 물질 U와 후보 물질 V가 결합하는 경우는, 반응장 R에서 후보 물질 V에 표지 붙여져 있는 핵산쇄 Z2와 검출용 핵산쇄 P(의 핵산쇄 부분 N)이 상보쇄를 형성하므로, 그 상보쇄에 대해서 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E가 작용하고, 그 상보쇄(를 구성하는 핵산쇄 부분 N의 AP 부위 X)에 새김눈을 넣고 단일가닥화한다. 이 때문에, 물질 U와 후보 물질 V의 결합량이 극히 조금이더라도, 검출용 핵산쇄 P를 구성하고 있던 형광 물질 F로부터의 강한 형광 시그널을 얻을 수 있다.
이것에 의해, 물질 U와 후보 물질 V의 결합의 고감도 검출을 행할 수가 있다. 이 검출 기술을 이용해서, 약제 후보 물질의 스크리닝을 실시할 수가 있다.
<제5 응용 방법예>
도 14는 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제5 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도이다. 이 제5 응용 방법예에 의하면, 예를 들면 환경 호르몬(내분비 교란 물질)의 검출이나 스크리닝을 행할 수가 있다.
우선, 어떤 종류의 전사 인자 J(DNA 결합성 단백질)는, 호르몬 H가 결합하면 구조가 변화하고, 이것에 의해 유전자 상류역(上流域)에 존재하는 응답 염기 배열 영역에 결합해서, 유전자의 전사를 촉진한다는 기능을 가지고 있다. 일반적으로, 환경 호르몬이라고 칭해지는 내분비 교란 물질은, 생체내의 호르몬 H와 마찬가지 거동(振舞)을 하는 물질이다.
본 발명에서는, 기판이나 비즈 등의 고상 표면 S에 대해서 미리 전사 인자(핵내 리셉터) J를 존재(예를 들면, 고정)시켜 둠과 동시에, 상기 응답 염기 배열 영역에 상당하는 핵산쇄 Z3과 핵산쇄 Z3의 염기 배열과 상보적인 핵산쇄 부분 N을 가지는 검출용 핵산쇄 P를 적어도 존재시켜 두도록 한다. 이와 같은 물질 환경의 반응장 R에 대해서, 내분비 교란 물질로 되는지 여부를 검증하기 위한 호르몬모양(hormone-like) 물질 h를 도입한다.
구체적으로 설명하면, 가령 해당 호르몬모양 물질 h가, 정말로 호르몬 H와 마찬가지 기능을 가진다면, 호르몬모양 물질 h의 작용에 의해서 전사 인자 J의 구조가 변화한다. 이 구조 변화를 받은 전사 인자 J가 존재하는 반응장 R에 대해서, 상기 응답 염기 배열 영역에 상당하는 핵산쇄 Z3과 그 핵산쇄 Z3과 이중가닥을 형성하는 핵산쇄 부분 N을 구비하는 검출용 핵산쇄 P를 동시에 도입한다. 이것에 계속해서, 반응장 R의 용액 세정을 행하는 것에 의해서, 반응장 R중에 유리 상태로 존재하고 있는 잉여 핵산쇄 Z3을 반응장 R로부터 제거하고, 계속해서 또 검출용 핵산쇄 P를 도입함과 동시에, 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 반응장 R에 도 입한다.
가령, 전사 인자 J에 핵산쇄 Z3을 거쳐서 결합한 검출용 핵산쇄 P가 반응장 R에 존재하면, 그 핵산쇄 Z3과 검출용 핵산쇄 P(의 핵산쇄 부분 N)의 상보쇄에 대해서 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E가 작용하고, 그 상보쇄(를 구성하는 핵산쇄 부분 N의 AP 부위 X)에 새김눈을 넣고 단일가닥화한다.
이 때문에, 샘플 용액중의 호르몬모양 물질 h의 양이 극미량이더라도, 검출용 핵산쇄 P를 구성하고 있던 형광 물질 F로부터의 강한 형광 시그널을 얻을 수 있다. 이것에 의해, 호르몬모양 물질 h의 고감도 검출을 행할 수가 있다. 이 검출 기술을 이용해서, 내분비 교란 물질의 스크리닝도 실시할 수가 있다.
<제6 응용 방법예>
도 15는, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제6 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도이다. 이 제6 응용 방법예에 의하면, 예를 들면 단백질의 번역(飜譯) 후 수식(修飾) 반응의 검출 등을 행할 수가 있다.
우선, 단백질은 번역 후에, 효소 반응 등을 거쳐서 수식을 받는 경우가 있다. 예를 들면, 인산화는 그의 대표적인 것이다. 본 발명에서는, 기판 등의 고상 표면 S에 대해서, 미리 검출을 목적으로 하는 단백질 D를 존재(예를 들면, 고정)시켜 둠과 동시에, 해당 단백질 D의 수식(예를 들면, 인산화)되어 있지 않은 부분에 특이적으로 결합하는 항체 B1과 수식(예를 들면, 인산화)된 부분에 특이적으로 결합하는 항체 B2도 존재시켜 두도록 한다. 또한, 항체 B1과 항체 B2에는, 미리 각각에 특유의 염기 배열로 이루어지는 핵산쇄 Za, 핵산쇄 Zb를 각각 표지 붙여 두도록 한다(도 15 참조).
이와 같은 물질 환경의 반응장 R에 대해서, 핵산쇄 Za와 상보적인 핵산쇄 부분 Na를 가지는 검출용 핵산쇄 Pa와, 핵산쇄 Zb와 상보적인 핵산쇄 부분 Nb를 가지는 검출용 핵산쇄 Pb를 함께 도입한다. 또한, 검출용 핵산쇄 Pa에는, 소정 파장의 형광을 발할 수 있는 형광 물질 F1을 표지 붙여 두고, 검출용 핵산쇄 Pb에는, 상기 형광 물질 F1과는 다른 파장의 형광을 발할 수 있는 형광 물질 F2를 표지 붙여 두도록 한다.
그리고, 반응장 R의 용액 세정에 계속해서, 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 반응장 R에 도입하고, 이중가닥을 형성하고 있는 검출용 핵산쇄 Pa의 핵산쇄 부분 Na와 이중가닥을 형성하고 있는 검출용 핵산쇄 Pb의 핵산쇄 부분 Nb에 새김눈을 넣고 단쇄화하며, 이것에 의해 단일가닥으로 해리시켜, 형광 증폭을 행한다.
반응장 R에 존재하는 모든 단백질 D에는, 원리적으로, 검출용 핵산쇄 Pa가 상보쇄를 거쳐서 결합하므로, 그 검출용 핵산쇄 Pa를 구성하고 있던 형광 물질 F1 유래의 (증폭된) 형광 시그널을 측정하는 것에 의해서, 반응장 R에 존재하는 모든 단백질 D의 분자수를 예측할 수가 있다.
또, 반응장 R에 존재하는 모든 단백질 D중 수식(예를 들면, 인산화)되어 있는 단백질 D에는, 검출용 핵산쇄 Pb가 상보쇄를 거쳐서 결합하므로, 그 검출용 핵 산쇄 Pb를 구성하고 있던 형광 물질 F2 유래의 (증폭된) 형광 시그널을 측정하는 것에 의해서, 수식된 단백질 D의 분자수를 예측할 수가 있다.
이와 같은 수법에 의해서, 반응장 R에 존재하는 모든 단백질 D의 분자수와, 수식된 단백질 D의 분자수로부터, 해당 단백질 D의 수식되어 있는 비율을 예측할 수가 있다.
<제7 응용 방법예>
도 16, 도 17은, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제7 응용 방법예의 개념을 도시하는 모식도이다. 도 16은, 구조 변화 전의 물질(예를 들면, 단백질)을 검출하고 있는 경우의 모식도, 도 17은, 구조 변화 후의 물질(예를 들면, 단백질)을 검출하고 있는 경우의 모식도이다. 이 제7 응용 방법예에 의하면, 물질의 구조 변화의 검출이나 같은 구조 변화의 수적 비율 등을 검출할 수가 있다.
예를 들면, 단백질은, 다른 인자가 작용함으로써, 그의 고차 구조가 변화해서, 특유의 기능을 발휘하는 경우가 있다. 따라서, 이와 같은 물질의 구조 변화를 검출하는 것에 의해서, 해당 물질의 기능이나 활성을 알 수가 있다. 이하, 도 16, 도 17에 의거해서, 구체적으로 설명한다.
도 16에 도시하는 부호 Dx는, 구조 변화 전의 단백질을 나타내고 있으며, 한편 도 17에 도시하는 부호 Dy는, 구조 변화 후의 단백질을 나타내고 있다. 우선, 도 16을 참조하면, 표면 S에 고정 등(等)된 단백질 Dx가 존재하는 반응장 R에, 단백질 Dx의 구조 부위 d1에 특이적으로 결합하는 항체 B1(핵산쇄 Za가 표지 붙여져 있다)과, 같은 단백질 Dx의 구조 부위 d2에 특이적으로 결합하는 항체 B2(핵산쇄 Zb가 표지 붙여져 있다)와, 형광 파장이 다른 2종류의 검출용 핵산쇄 Pa, Pb를 도입한다.
검출용 핵산쇄 Pa를 구성하는 핵산쇄 부분 Na는, 항체 B1에 표지 붙여져 있는 핵산쇄 Za와 상보적이므로, 이중가닥을 형성하고, 한편 검출용 핵산쇄 Pb를 구성하는 핵산쇄 부분 Nb는, 항체 B2에 표지되어 있는 핵산쇄 Zb에 상보적이므로 이중가닥을 형성한다(도 16 참조).
이와 같은 반응장 R에 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 도입하면, 핵산쇄 부분 Na, Nb에 새김눈이 넣어지고, 각각 단일가닥으로 해리한다. 그 결과, 형광 물질 F1, F2로부터 각각의 파장의 형광 시그널이 발해진다. 이것에 의해, 표면 S에 존재하는 단백질 Dx는, 구조 변화가 일어나고 있지 않는 것임을 알 수 있다.
한편, 도 17을 참조하면, 표면 S에 고정 등된 단백질 Dy(구조 변화가 생긴 단백질)가 존재하는 반응장 R에, 단백질 Dx(도 16 참조)의 구조 부위 d1에 특이적으로 결합하는 항체 B1(핵산쇄 Za가 표지 붙여져 있다)과, 단백질 Dy의 구조 부위 d2(이 경우, 단백질 Dx의 구조 부위 d2와 동일)에 특이적으로 결합하는 항체 B2(핵산쇄 Zb가 표지 붙여져 있다)와, 형광 파장이 다른 2종류의 검출용 핵산쇄 Pa, Pb를 도입한다.
항체 B1, B2중, 구조 변화가 생긴 것에 의해서 구조 부위 d1이 소실된 단백질 Dy에 결합하는 것은, 항체 B2뿐이다. 따라서, 검출용 핵산쇄 Pb를 구성하는 핵산쇄 부분 Nb만이, 그 항체 B2에 표지 붙여져 있는 핵산쇄 Zb와 상보 결합하여 이중가닥을 형성한다.
이 상황의 반응장 R에, 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제 E를 도입하면, 핵산쇄 부분 Nb에만 새김눈이 넣어져, 단일가닥으로 해리하며, 그 결과, 형광 물질 F2로부터의 형광 시그널만이 발해지게 된다(도 17 참조).
이것에 의해, 표면 S에 존재하는 단백질 Dy는, 구조 변화를 일으키는 수식을 받은 것이며, 구조 변화가 생기고 있지 않은 단백질 Dx가 아니라는 것을 알 수 있다. 또한, 본 방법에 의하면, 형광 시그널을 해석하는 것에 의해서, 단백질 Dx와 Dy의 양쪽을 동시에 검출할 수도 있다. 1예를 들면, β아밀로이드 구조 변화의 미량 검출, 나아가서는 알츠하이머병의 진단에 응용할 수 있다.
<제8 응용예>
도 18은, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하는 제7 응용예의 개념을 도시하는 모식도이다. 이 제7 응용예는, 상기 검출용 핵산쇄 P를 DNA칩의 프로브로서 이용하는 예이다. 또한, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P는, DNA칩 이외의 다른 센서 기술에도 응용가능하다.
도 18에서는, 부호 C로 나타내는 기판 표면에 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P(P11, P12, P13, P14)가 고정된 상태가 도시되어 있다. 그리고, 이 도 18의 (a)∼(c)에서는, 기판 표면 C 위에서의 경시적인 반응의 진행 상황을 모식적으로 도시하고 있다.
기판 표면 C 위에서는, 타켓으로 되는 핵산쇄 T가 반응장 R에 도입되면, 이 핵산쇄 T가, 시간의 경과와 함께, 기판 표면 C 위에 고정되어 있는 검출용 핵산쇄 P11, P12, P13, P14의 각각의 핵산쇄 부분 N과의 사이에서 상보쇄를 차례로 형성해 간다. 그리고, 이중가닥 특이적인 AP-엔도뉴클레아제(도 18에서는 도시하지 않음)에 의한 핵산쇄 부분 N의 분단(단쇄화)이 행해지면, 단쇄화된 검출용 핵산쇄 단편의 핵산쇄 T로부터의 해리가 일어나고, 그것에 수반하는 형광 증폭을 가져오게 된다는 일련의 반응(사이클 반응)이 연쇄적으로 일어난다.
이 도 18에 도시하는 반응예로부터도 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 DNA칩의 프로브로서 이용하면, 타켓으로 되는 한 분자의 핵산쇄 T가 복수의 프로브(도 18의 예에서는 P11, P12, P13, P14)에 의해 이용되기 때문에, 고감도의 검출이 가능하게 된다. 또, DNA칩에의 하이브리다이제이션과 프로브 절단을, 형광 색소 증폭에 의해 시간 경과를 좇아(경시적으로) 관찰하면, 반응 속도로부터 타켓의 농도를 측정하는 것이 가능하게 된다.
종래의 DNA칩에서는, 타켓 핵산쇄 T를 형광 색소로 표지 붙일 필요가 있었지만, 그 수고를 생략할 수가 있다. 또, 종래의 DNA칩에서는 하이브리다이제이션한 타켓 핵산쇄 T가 프로브에 고정된 상태로 되기 때문에, 하이브리다이제이션의 반응 장 부근에서의 타켓 핵산쇄 T의 외관상의 농도가 저하하고, 하이브리다이제이션의 효율이 저하한다는 문제가 있었지만, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄 P를 이용하면, 타켓 핵산쇄 T를 고정된 상태로 하지 않기 때문에, 하이브리다이제이션 반응장 부근의 타켓 핵산쇄 T의 외관 농도가 저하하지 않고, 하이브리다이제이션의 효율도 개선되는 것을 기대할 수 있다.
실시예
본 발명에 따른 검출용 핵산쇄의 기능 및 같은 검출용 핵산쇄를 이용한 검출 기술의 유효성을 확인하기 위해서, 이하의 실험예 1∼4를 행했다.
(실험예 1)
우선, 극미량인 표적 핵산쇄(배열 번호 1)가 반응장에 존재할 때에, 그 반응장에 도입된 과잉량의 검출용 핵산쇄(핵산쇄 부분: 배열 번호 2, 그의 구성은 도 1 등을 재참조)가 관계되는 사이클 반응(도 8 재참조)이 일어나고, AP-엔도뉴클레아제(배열 번호 3)의 작용에 의해서 다량의 검출용 핵산쇄 단편이 생기는 것을 검증했다. 또한, 배열 번호 2중의 기호 「n」은, 염기가 결락되어 있는 AP 부위를 의미한다.
또한, 본 실험에서 사용한 AP-엔도뉴클레아제는, human AP-endonuclease(APE 1)이고, 검출용 핵산쇄에 사용한 형광 물질은 형광 색소 FAM(5' 말단에 결합)이며, 쿠엔처 물질은, TAMRA(3' 말단에 결합)이다.
100f㏖의 표적 핵산쇄와 8p㏖의 (AP 부위를 가지는) 검출용 핵산쇄가 존재하는 반응장에 AP-엔도뉴클레아제를 첨가해서 반응시켰다. AP-엔도뉴클레아제 존재 하에서, 적정 온도내인 37℃, 42℃, 47℃에서 반응을 행하고, 그들 반응액을 AP-엔도뉴클레아제를 첨가하고 있지 않은 반응액과 합해서, 아가로스 전기 영동을 행하고 검출용 핵산쇄의 사이즈에 따른 분리를 행하고, 결합하고 있는 형광 색소에 의해 검출했다.
아가로스 전기 영동에 의한 핵산쇄의 사이즈에 따른 분리에서는, 사이즈가 작은 핵산쇄가 빨리 영동된다(밴드가 아래쪽으로 이동한다). AP-엔도뉴클레아제를 첨가한 반응액(레인 2-4)에서는, 첨가하고 있지 않은 반응액(레인 1, 5)에 비해서, 밴드가 아래쪽으로 이동하고 있다(도 19 참조). 이것에 의해 본 시험에서 사용한 검출용 핵산쇄가 AP-엔도뉴클레아제에 의해서 절단되어 있는(cleaved) 것이 명확하다.
이 실험예 1의 결과로부터 명확한 바와 같이, 표적 핵산쇄에 대해서 80배량의 검출용 핵산쇄가 완전히 절단된 것을 알 수 있었다. 즉, 「표적 핵산쇄와 검출용 핵산쇄 사이의 상보쇄 형성」→「AP-엔도뉴클레아제에 의한 검출용 핵산쇄의 단쇄화(단편화)」→「단쇄화된 검출용 핵산쇄 단편의 표적 핵산쇄로부터의 해리」라는 일련의 반응이, 반응장에 존재하는 다량의 검출용 핵산쇄에 의해서 몇 번이나 반복되는 사이클 반응이 일어난다는 것이 명확해졌다(도 8 재참조).
(실험예 2)
이 실험예 2에서는, 농도가 다른(차이나는) 표적 핵산쇄(배열 번호 1)에 대해서, 8p㏖의 (AP 부위를 가지는) 검출용 핵산쇄(형광 물질: FAM(5' 말단에 결합), 쿠엔처 물질: TAMRA(3' 말단에 결합), 핵산쇄 부분의 염기 배열: 배열 번호 2)를 도입하고, 또 AP-엔도뉴클레아제를 반응시켜서, 형광 시그널의 증폭을 경시적으로 검출했다. 도 20에 도시하는 도면은, 그 결과를 도시하는 그래프이다(종축: 형광 강도, 횡축: 시간(분)). 또한, 표적 핵산쇄의 농도는, 32a㏖, 160a㏖, 0.8f㏖, 4f㏖, 20f㏖이다. 도 20에 도시하는 결과로부터 명확한 바와 같이, 표적 핵산쇄 양에 의존한 반응 속도에서, 시간 경과에 수반하여 형광 시그널이 증대한다는 것이 실증되었다.
또, 각 표적 핵산쇄의 농도와 초기 반응 속도를 「Lineweaver Burk Plot」을 이용해서 플롯하면, 32a㏖부터 20f㏖까지의 범위에서 거의 직선으로 된다. 즉, 표적 핵산쇄를 AP-엔도뉴클레아제의 기질(基質)로 하면, 그의 주형(鑄型) 핵산쇄 초기 농도[T]0과 초기 반응 속도 V는 일차식으로 표현할 수가 있다. 따라서, 같은 농도 범위에서 표적 핵산쇄를 정량할 수 있다는 것이 나타내어졌다(도 21 참조).
(실험예 3)
본 실험예는, 본 발명에 따른 응용 방법예의 1예를 실제로 실시해서 성공한 것을 나타낸다. 구체적으로는, 본 실험예는, 사람 구강내 점막 상피 세포로부터 전사 인자 활성을 가지는 체내 시계 유전자 산물(시계 단백질)인 BMAL1-CLOCK 복합체의 검출, 나아가서는 주간(日內; diurnal) 변동 리듬의 검출에 성공한 것을 나타내는 실험예이다.
이하에, 사람 구강내 점막 상피 세포로부터의 시계 단백질 BMAL1-CLOCK 복합체를 검출한 수순예를 나타낸다.
우선, 본 실험예에서 사용한 「검출용 핵산쇄」는, 5' 말단측에 형광 색소(FITC), 3' 말단측에 쿠엔처 물질(BHQ)이 결합된 이하의 염기 배열 구성을 구비하는 올리고 DNA(5' 말단측으로부터 6번째의 염기(구아닌이 결락: AP 부위)이며(표 1 참조), 이 검출용 핵산쇄와 이중가닥을 형성하는 핵산쇄는, 「표 2」에 나타내는 염기 배열 구성을 구비하는 올리고 DNA이며, 항체는, anti-BMAL1 antibody(Santa Cruz Biotechnology사)를 사용했다.
[표 1]
Figure 112009009033491-PCT00001
[표 2]
Figure 112009009033491-PCT00002
다음에, 이하의 수순으로, 항체 자기(磁氣) 비즈를 제작했다. 자기 비즈(micromer-M[PEG-COOH], micromod Partikeltechnologie사)에 PolyLink-Protein Coupling Kit for COOH Microparticles(Polyscience사)을 이용해서, 상술한 항체를 고정했다.
(1) 사람으로부터 채취한 구강내 세포를, protease inhibitor cocktail(로슈사)를 포함한 20mM Tris-Cl(pH 7.5), 150mM NaCl, 1ucrose Monolaurate에 현탁(懸濁)하고, 볼텍스(vortex)에 의해 세포를 파쇄했다. (2) 16,000g 10min의 원심 분리를 행하고, 불용 성분을 침전시켰다. (3) (2)에서 얻어진 샘플의 상청(上淸)에 대해서 280㎚의 흡광도 측정을 행해서, 각 샘플의 총단백질량의 지표로 하고, 모든 샘플의 단백질량을 일치(equal)시켰다. (4) 전(前) 수순에서, 단백질량을 일치시킨 샘플을, 9배량의 protease inhibitor cocktail을 포함한, PBS(pH 7.5), 0.05 Tween 20(PBS-T)로 희석했다. (5) 각 2μL의 항체 자기 비즈(anti-BMAL1)를 첨가하고, 4℃에서 하루 주야(一晝夜)로 인큐베이트했다. (6) 항체 자기 비즈를 500μL의 PBS-T로 세정하고, 비특이적으로 결합한 분자의 세정을 행했다. (7) 다음에, 항체 자기 비즈를 10mM Tris-Cl(pH 7.5), 50mM KCl, 2.52.27926e+289lycerol, 10mM EDTA, 0.05P-40, 0.05㎎/mL salmon sperm DNA, 각 0.2μM 검출용 핵산 프로브(프로브 핵산 1, 2로 이루어지는 이중가닥 DNA)에 현탁하고, 37℃에서 1hr의 인큐베이션을 행했다. (8) 항체 자기 비즈를 500μL의 PBS-T로 3회 세정하고, 비특이적으로 결합한 분자 및 프로브 핵산의 세정을 행했다. (9) 항체 자기 비즈를 물에 현탁하고, 80℃의 조건에서, 인큐베이션하고, 특이적으로 결합한 검출용 핵산쇄의 추출을 행했다. (10) 전 수순에서 추출한 검출용 핵산쇄를 20mM Tris-Acetat, 10mM Mg-Acetat, 50mM KCl, 1mM DTT(pH 7.9)(어느것이나 최종 농도)에 현탁하고, 최종 농도 각 0.2μM의 검출용 핵산쇄(배열 번호 4)와 AP-엔도뉴클레아제를 첨가해서 37℃에서 인큐베이션하고, 형광 색소(FITC)의 형광의 증가를 경시적으로 측정했다. (11) 단위 시간당의 형광의 증가율을, 각 시각에 있어서 플롯했다(도 22의 도면 대용 그래프 참조). 또, 감도를 조사하기 위해서, Hela 세포의 세포수를 바꾸어, 상기와 마찬가지 방법으로 BMAL1-CLOCK 복합체의 검출을 행하여 성공했다. 또한, 그 결과를 그래프화해서 도시했다(도 23의 도면 대용 그래프 참조).
고찰.
이른바 시계 단백질은, 전사 인자이며, 생체 리듬중 가장 중요한 24시간주기(槪日) 리듬(서케이디언(circadian) 리듬)을 움직이는 자율적인 진동자이다. 전사 인자인 시계 단백질은, 다른 시계 단백질의 발현을 유도하고, 그리고 유도된 시계 단백질은, 전사 인자로서도 기능하며, 다른 (원래의) 시계 단백질의 전사를 억제하는 바와 같은 네가티브 필드 루프에 의해, 서케이디언 리듬의 진동자로서 기능하고 있다고 현재 생각되고 있다. 다시 말해, 전사 인자인 시계 단백질은, 체내 시계의 코어이므로, 이 시계 단백질을 측정하는 것이야 말로, 생물의 생체 리듬을 측정하는데 가장 적합하다고 생각된다.
요즈음(近年), 체내 시계에 관계되는 생체 분자의 기능, 유전자의 결함이나 다양성이, 암을 비롯해서, 당뇨병, 혈관계의 질환, 신경 변성 질환 등의 생활 습관병의 요인으로 된다는 것이 서서히 명확해지고(밝혀지고) 있다. 특히, 쌍극성(雙極性) 장해나 우울증(鬱病)과 같은 정신 질환에 관해서는, 체내 시계의 변조가 원인이라고 의심되고 있으며, 실제로 체내 시계를 리셋하는 효과가 있는 광조사(光照射)에 의해 치료 효과가 나타난다.
또, 인간의 수면 각성 사이클은, 체내 시계에 의한 자율적인 제어뿐만 아니라, 사회 생활에 의해 제약을 받기 때문에, 수면 각성 사이클에 의한 리듬과 체내 시계에 의한 자율 리듬 사이에 어긋남이 생기고, 이것이 시차병(時差惚; jet lag)으로 대표되는 바와 같은 컨디션(體調)의 불량, 나아가서는 상기와 같은 건강 상태의 불량의 원인으로 될 가능성이 있다. 또, 체내에서 약을 대사하는 효소량이 서 케이디언 리듬을 가지는 것, 또 약의 타켓으로 되는 분자의 양도 서케이디언 리듬을 가지는 것이 많기 때문에, 약에 대한 감수성에 대해서도 서케이디언 리듬이 존재한다는 것이 알려져 있으며, 투약 시간을 정해서 행하는 시간 의료라고 하는 생각도 확산되고 있다.
좀 더 가까운 곳에서는, 심신의 활동도나 운동 능력에도 서케이디언 리듬이 있다는 것이 알려져 있으며, 자신의 능력을 최대한으로 끌어낼 수 있는 리듬이나, 학습이나 트레이닝에 좋은 리듬, 살찌기 쉬운 식사 리듬 등이 생각되고 있다.
이상과 같이, 본 발명에 따른 검출용 핵산쇄나 방법을 응용하면, 전사 인자의 1예인 시계 단백질을 측정하는 것이 실제로 가능하게 된다. 이것은, 체내 시계에 의한 자율적인 생체 리듬, 또는 그의 수면 각성 사이클이나 외적 시각과의 어긋남을 아는 것은, 정신 질환이나 생활 습관병의 예방, 시차병 등의 컨디션 불량의 개선, 시간 의료, 자기(自己) 능력의 발휘, 학습이나 트레이닝, 다이어트 등에 매우 유익한 기술이 될 것이라고 예상된다. 또, 본 발명의 응용예로서, 다음의 실험예 4를 나타낸다.
(실험예 4)
현재, 배양 세포를 50Horse Serum을 포함한 배양액으로 자극함으로써, 시계 유전자의 발현이 각 세포에서 동조(同調)하고 각 시계 유전자의 mRNA량의 변동으로서, 리듬이 관찰된다는 것이 알려져 있다. 그렇지만, 지금까지 시계 단백질을 검출하는 것이 곤란했었기 때문에, BMAL1-CLOCK 단백질 복합체의 「발현 변동」에 대해서 자세하게 관찰된 적은 없었다.
그래서, 본 발명을 응용해서, Hela 세포로부터 BMAL1-CLOCK 단백질 복합체의 발현 변동의 관찰이 가능하다는 것을 실증하기 위한 소정의 실험을 행했다. 또, BMAL1-CLOCK 단백질 복합체가 결합하는 E-box 배열을 프로모터 영역에 가지고, 그의 전사가 BMAL1-CLOCK 단백질 복합체에 의해서 활성화되는 유전자, Per1, Per2의 mRNA의 변동 패턴을 관찰하고, BMAL1-CLOCK 단백질 복합체의 발현 변동과 비교했다.
구체적으로는, Hela 세포를 50Horse Serum을 포함한 배양액(DMEM 배지)에서 2시간 자극했다. 자극 스타트시부터 15시간, 17.5시간, 20시간, 22.5시간 후에 세포를 회수하고, 구강 점막 상피 세포와 마찬가지 수순으로, BMAL1-CLOCK 단백질 복합체를 검출했다(도 24의 도면 대용 그래프 참조).
또, 자극 스타트시부터 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 28시간 후에 각각 세포를 회수했다. 회수한 각 세포로부터 totalRNA를 추출하고(메이커명 Agilent Technologies: 제품 번호 5185-6000), 정법(定法)에 따라서 PT-PCR을 행하여, Per1, Per2의 mRNA량을 정량했다. 또한, RT-PCR에서 사용한 프라이머의 배열은, 다음의 「표 3」과 같다.
[표 3]
Figure 112009009033491-PCT00003
또한, 도 25는 Per1의 mRNA량을 정량한 결과를 도시하는 도면(도면 대용 그래프)이며, 도 26은 Per2의 mRNA량을 정량한 결과를 도시하는 도면(도면 대용 그래프)이다. 또한, Per1, Per2의 mRNA량은, 내재성(內在性) 컨트롤로서의 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 양에 대한 상대값으로서 계산했다.
고찰.
BMAL1-CLOCK 단백질 복합체량의 변동 패턴과, BMAL1-CLOCK 단백질 복합체에 의해서 전사가 활성화되는 Per1, Per2의 mRNA의 변동 패턴이 서로 닮아(似通) 있기 때문에(도 24와 도 25 및 도 26을 비교 참조), BMAL1-CLOCK 단백질 복합체량이, BMAL1-CLOCK 단백질 복합의 전사 활성을 반영하고 있다는 것이 나타내어졌다. 이 결과로부터, 본 발명을 응용하는 것에 의해서, 시계 단백질을 검출하는 것이 가능하고, 또한 BMAL1-CLOCK 단백질 복합체의 「발현 변동」에 대해서 자세하게 관찰하 는 것이 가능하다는 것이 실증되었다.
이상의 실험예는, 본 발명의 응용예의 일부를 나타내는 것이다. 전사 제어가 전사 인자의 양이나 번역후 수식의 정도, 다른 분자와의 복합체 형성에 의해 제어되고 있는 경우는, 실시예에 나타낸 바와 같이 세포 파쇄액을 사용할 수가 있다. 전사 제어가 상기 제어 기구에 의존하지 않고, 전사 인자의 핵내 이행에 의해서 제어되고 있는 경우는, 핵 추출액을 이용함으로써 전사 인자의 활성도를 측정할 수가 있다. 또, Notch나 SREBP와 같이 막 결합형 단백질로서 생성되고, 단백질 절단 효소에 의해 절단되어 핵내로 이행하는 바와 같은 전사 인자에 관해서는, 막 파편(膜畵分; membrane fraction)을 포함하지 않는 바와 같은 세포 추출액을 이용함으로써 전사 인자의 활성도를 측정할 수가 있다.
또한, 전사 인자중에는, 스테로이드 호르몬과 결합해야 비로소 전사 활성을 가지는 핵내 리셉터가 많이 존재한다. 본 발명을 응용해서, 이들 핵내 리셉터의 리간드(스테로이드 호르몬 등)를 검색, 정량하는 것도 가능하다. 또, 핵내 리셉터에 대한 아고니스트나 안타고니스트로서 작용하는 약제의 검색, 정량, 평가를 행하는 것도 가능하다. 콜레스테롤에 의해서 활성화되는 SREBP를 측정하면, 메타볼릭 신드롬이나 알츠하이머 등의 예방이 가능하게 되는 것도 생각되며, 비타민이나 호르몬의 핵내 수용체(受容體)로 되는 전사 인자를 측정함으로써, 영양 상태를 비롯한 생리 상태를 알 수가 있다. 정제한 핵내 수용체를 이용하면, 리간드로 되는 비타민이나 호르몬의 정량이나 핵내 수용체와의 친화성의 측정이 가능하며, 또 핵내 수용체를 타켓한 아고니스트나 안타고니스트의 스크리닝이나 평가에 본 발명을 응 용하는 것도 가능하다.
본 발명은, 반응장에 존재하는 극미량의 물질을 고감도로 형광 검출하는 기술로서 이용할 수가 있다. 예를 들면,
(1) 검출용 핵산쇄에 상보적인 표적 핵산쇄의 검출, (2) 핵산 이외의 생체 물질의 검출, (3) 생체 물질의 화학적 변화(화학적 수식)의 검출, (4) 단백질 또는 그 밖의 생체 물질의 구조 변화의 검출, (5) 약제 후보 물질의 검출 또는 스크리닝, (6) 환경 호르몬(내분비 교란 물질)의 검출, (7) 질병 진단, (8) DNA칩 등의 센서칩 분야에서 특히 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110>Sony Corporation <120> Nucleic acid chain for detecting material and the method by using the nucleic acid chain <130>0790375302 <160>3 <210>1 <211>17 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Target nucleotic acid chain <400>1 agcacggctt ctcctta 17 <210>2 <211>17 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Probe nucleotic acid chain n means Apurinic/Apyrimidinic site <400>2 taaggagaan ccgtgct <210>3 <211>318 <212>PRT <213>Homo sapiens <220> <223>human AP-endonuclease(APE1) <400>3 Met Pro Lys Arg Gly Lys Lys Gly Ala Val Ala Glu Asp Gly Asp 1 5 10 15 Glu Leu Arg Thr Glu Pro Glu Ala Lys Lys Ser Lys Thr Ala Ala 20 25 30 Lys Lys Asn Asp Lys Glu Ala Ala Gly Glu Gly Pro Ala Leu Tyr 35 40 45 Glu Asp Pro Pro Asp Gln Lys Thr Ser Pro Ser Gly Lys Pro Ala 50 55 60 Thr Leu Lys Ile Cys Ser Trp Asn Val Asp Gly Leu Arg Ala Trp 65 70 75 Ile Lys Lys Lys Gly Leu Asp Trp Val Lys Glu Glu Ala Pro Asp 80 85 90 Ile Leu Cys Leu Gln Glu Thr Lys Cys Ser Glu Asn Lys Leu Pro 95 100 105 Ala Glu Leu Gln Glu Leu Pro Gly Leu Ser His Gln Tyr Trp Ser 110 115 120 Ala Pro Ser Asp Lys Glu Gly Tyr Ser Gly Val Gly Leu Leu Ser 125 130 135 Arg Gln Cys Pro Leu Lys Val Ser Tyr Gly Ile Gly Asp Glu Glu 140 145 150 His Asp Gln Glu Gly Arg Val Ile Val Ala Glu Phe Asp Ser Phe 155 160 165 Val Leu Val Thr Ala Tyr Val Pro Asn Ala Gly Arg Gly Leu Val 170 175 180 Arg Leu Glu Tyr Arg Gln Arg Trp Asp Glu Ala Phe Arg Lys Phe 185 190 195 Leu Lys Gly Leu Ala Ser Arg Lys Pro Leu Val Leu Cys Gly Asp 200 205 210 Leu Asn Val Ala His Glu Glu Ile Asp Leu Arg Asn Pro Lys Gly 215 220 225 Asn Lys Lys Asn Ala Gly Phe Thr Pro Gln Glu Arg Gln Gly Phe 230 235 240 Gly Glu Leu Leu Gln Ala Val Pro Leu Ala Asp Ser Phe Arg His 245 250 255 Leu Tyr Pro Asn Thr Pro Tyr Ala Tyr Thr Phe Trp Thr Tyr Met 260 265 270 Met Asn Ala Arg Ser Lys Asn Val Gly Trp Arg Leu Asp Tyr Phe 275 280 285 Leu Leu Ser His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Cys Asp Ser Lys Ile 290 295 300 Arg Ser Lys Ala Leu Gly Ser Asp His Cys Pro Ile Thr Leu Tyr 305 310 315 Leu Ala Leu 318 <210>4 <211>15 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>n means Apurinic/Apyrimidinic site <400>4 acccagncca cgtgc 15 <210>5 <211>15 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223> <400>5 gcacgtggac tgggt 15 <210>5 <211>15 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223> <400>5 gcacgtggac tgggt 15 <210>6 <211>20 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>forward primer for RT-PCR <400>6 gcaccgtcaa ggctgagaac 20 <210>7 <211>20 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>reverse primer for RT-PCR <400>7 atggtggtga agacgccagt 20 <210>8 <211>20 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>forward primer for RT-PCR <400>8 acgcactggc ctgtgtcaag 20 <210>9 <211>19 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>reverse primer for RT-PCR <400>9 tagacgattc ggcccgtca 19 <210>10 <211>24 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>forward primer for RT-PCR <400>10 gcatccatat ttcactgtaa aaga 24 <210>11 <211>22 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>reverse primer for RT-PCR <400>11 agtaaaagaa tctgctccac tg 22

Claims (8)

  1. 공명 여기 에너지(fluorescence Resonance Energy)의 도너로 될 수 있는 형광 물질과,
    상기 공명 여기 에너지를 수취하는 것이 가능한 위치에 존재하는 쿠엔처 물질과,
    상기 쿠엔처 물질과 상기 형광 물질 사이에 위치하고 있으며, 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 효소 절단 부위가 형성된 핵산쇄(核酸鎖) 부분
    을 적어도 가지는 검출용 핵산쇄.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 효소 절단 부위는, 이중가닥(一本鎖; double strand) 특이적인 AP-엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 염기 결락(缺落) 부위(AP 부위)인 것을 특징으로 하는 검출용 핵산쇄.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 핵산쇄 부분은, 올리고 뉴클레오티드쇄인 것을 특징으로 하는 검출용 핵산쇄.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 핵산쇄 부분에는, 소정의 단백질과 결합하는 응답 염기 배열 영역이 존재하는 것을 특징으로 하는 검출용 핵산쇄.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단백질은, 전사(轉寫) 인자인 것을 특징으로 하는 검출용 핵산쇄.
  6. 공명 여기 에너지(fluorescence Resonance Energy)의 도너로 될 수 있는 형광 물질과,
    상기 공명 여기 에너지를 수취하는 것이 가능한 위치에 존재하는 쿠엔처 물질과,
    상기 쿠엔처 물질과 상기 형광 물질 사이에 위치하고 있으며, 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 효소 절단 부위를 가지는 핵산쇄 부분을 적어도 가지는 검출용 핵산쇄가 관계되는 상보쇄(相補鎖) 형성 반응을 진행시키는 수순과,
    상기 상보쇄 형성 반응에 의해서 얻어진 이중가닥에 특이적인 상기 엔도뉴클레아제를 작용시키는 것에 의해서, 상기 효소 절단 부위에서 프로브 핵산쇄를 절단해서 단편화(斷片化)하고, 또한 단일가닥으로 해리시키는 것에 의해서, 상기 형광 물질의 형광을 증폭하는 수순
    을 적어도 행하는 핵산쇄 이용 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제 작용전의 형광 강도와 작용후의 형광 강도를 측정하고, 형광 증폭의 유무 또는 증폭량에 의거해서, 다음의 (1)∼(5)중 어느것인가를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (1) 상기 검출용 핵산쇄와 상보적인 표적 핵산쇄.
    (2) 핵산 이외의 생체 물질.
    (3) 생체 물질의 화학적 변화.
    (4) 생체 물질의 구조 변화.
    (5) 약제 후보 물질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제 절단전의 상기 검출용 핵산쇄가 상기 상보쇄 형성 반응을 진행할 수 있는 상한 온도 이하이며, 또한 상기 엔도뉴클레아제 절단후의 검출용 핵산쇄 단편이 상보쇄 형성 반응을 유지 또는 진행할 수 없게 되는 온도 이상의 온도 조건하에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020097002996A 2006-08-14 2007-08-14 물질의 검출 등에 유용한 핵산쇄와 그 방법 KR20090052322A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006221228 2006-08-14
JPJP-P-2006-00221228 2006-08-14
JPJP-P-2007-00203079 2007-08-03
JP2007203079A JP5088034B2 (ja) 2006-08-14 2007-08-03 物質の検出等に有用な核酸鎖とその方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20090052322A true KR20090052322A (ko) 2009-05-25

Family

ID=39082114

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097002996A KR20090052322A (ko) 2006-08-14 2007-08-14 물질의 검출 등에 유용한 핵산쇄와 그 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20100291553A1 (ko)
EP (1) EP2050817B1 (ko)
JP (1) JP5088034B2 (ko)
KR (1) KR20090052322A (ko)
CN (1) CN101506363B (ko)
WO (1) WO2008020589A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011087707A1 (en) * 2009-12-22 2011-07-21 Elitech Holding B.V. Hypertheromostable endonuclease iv substrate probe
JP5697129B2 (ja) * 2010-03-24 2015-04-08 国立大学法人埼玉大学 Ｆｒｅｔを利用した酵素活性測定基質及びその製造方法
CN102296116A (zh) * 2011-09-02 2011-12-28 北京大学 对dna目标序列进行信号放大和检测的方法
US10907193B2 (en) * 2012-05-21 2021-02-02 Acumen Detection, Llc Methods and systems for the detection of ricin and other ribosome inactivating proteins
TW201531569A (zh) * 2014-02-12 2015-08-16 Taiwan Sugar Corp 雙股核酸分子與ｓ１核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途
CN103882128A (zh) * 2014-03-13 2014-06-25 北京大学 常温下对目标dna序列进行信号放大和检测的方法
CN106715724A (zh) * 2014-09-30 2017-05-24 皇家飞利浦有限公司 用于检测第一和第二表位的空间接近性的方法
WO2018008435A1 (ja) * 2016-07-04 2018-01-11 株式会社ダナフォーム 核酸分析方法
JP7270254B2 (ja) 2017-06-16 2023-05-10 デューク ユニバーシティ 改善された標識検出、演算、検体感知、および調整可能な乱数生成のための共鳴体ネットワーク

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5403711A (en) * 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
DE68911648T2 (de) * 1988-03-24 1994-06-23 Univ Iowa Res Found Katalytische hybridisierungs-systeme zum nachweis von nukleinsäuresequenzen, die auf deren aktivität als kofaktoren in katalytischen reaktionen basieren in denen eine komplementäre, markierte nukleinsäureprobe gespalten wird.
JPH06153997A (ja) * 1992-11-27 1994-06-03 Canon Inc 検出信号増幅による標的核酸の検出方法
JPH0774619A (ja) * 1993-06-30 1995-03-17 Fujitsu Ltd 論理ゲート回路
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5955268A (en) * 1996-04-26 1999-09-21 Abbott Laboratories Method and reagent for detecting multiple nucleic acid sequences in a test sample
US5853990A (en) * 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
US5912168A (en) * 1996-08-30 1999-06-15 Genesis Research & Development Corporation Limited CD95 regulatory gene sequences
AU5492499A (en) * 1998-08-21 2000-03-14 University Of Virginia Patent Foundation Signal generating oligonucleotide-based biosensor
US6709817B1 (en) * 1999-09-07 2004-03-23 Baylor College Of Medicine Method of screening Rett syndrome by detecting a mutation in MECP2
JP2003528627A (ja) * 2000-03-27 2003-09-30 アプレラ コーポレイション 改善された侵襲アッセイ
US6210945B1 (en) * 2000-06-02 2001-04-03 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the RsaI restriction endonuclease in E. coli and purification of the recombinant RsaI restriction endonuclease
US6773885B1 (en) * 2000-09-29 2004-08-10 Integrated Dna Technologies, Inc. Compositions and methods for visual ribonuclease detection assays
US6846658B1 (en) * 2000-10-12 2005-01-25 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the Msel restriction endonuclease
EP1389638A1 (en) 2002-08-06 2004-02-18 Roche Diagnostics GmbH Improved fluorescent resonance energy transfer probes
EP1543154A4 (en) * 2002-08-21 2006-08-16 Epoch Biosciences Inc ENDONUCLEASE TEST IN ABASIC SITE
JP2005192418A (ja) * 2003-12-26 2005-07-21 Japan Science & Technology Agency 検出すべき特定配列の簡易検出方法
JP2005207823A (ja) 2004-01-21 2005-08-04 Olympus Corp 蛍光分光分析の方法
WO2006020933A2 (en) * 2004-08-13 2006-02-23 Stratagene California Dual labeled fluorescent probes

Also Published As

Publication number Publication date
JP2008067694A (ja) 2008-03-27
EP2050817A1 (en) 2009-04-22
CN101506363A (zh) 2009-08-12
US20100291553A1 (en) 2010-11-18
JP5088034B2 (ja) 2012-12-05
EP2050817A4 (en) 2010-05-26
WO2008020589A1 (fr) 2008-02-21
EP2050817B1 (en) 2013-05-01
CN101506363B (zh) 2012-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20090052322A (ko) 물질의 검출 등에 유용한 핵산쇄와 그 방법
Baleriola et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions
Wang et al. Rapid 40S scanning and its regulation by mRNA structure during eukaryotic translation initiation
US6232067B1 (en) Adapter directed expression analysis
CN109072205A (zh) 核酸的检测
CN103781919A (zh) 指示阿尔茨海默氏病的微rna生物标志物
US20100203516A1 (en) Detecting analytes using both an optical and an electrical measurement method
US20180080076A1 (en) Nucleic acid detection method, detection probe, detection probe set, and nucleic acid quantification method
Shi et al. Fluorescence lifetime imaging of nanoflares for mRNA detection in living cells
Zhuang et al. Combined microRNA and mRNA detection in mammalian retinas by in situ hybridization chain reaction
Xu et al. Sense and validate: Fluorophore/mass dual-encoded nanoprobes for fluorescence imaging and MS quantification of intracellular multiple microRNAs
KR20150139582A (ko) 나노파티클-지원 신호 증폭을 이용한 rna 마이크로칩 검출
Borum et al. Hybridizing clinical translatability with enzyme-free DNA signal amplifiers: recent advances in nucleic acid detection and imaging
Li et al. DNA-silver nanoclusters/polypyrrole nanoparticles: a label-free and enzyme-free platform for multiplexed transcription factors detection
Sun et al. In situ detection of exosomal RNAs for cancer diagnosis
JP2010524459A (ja) 未知の生体分子と一本鎖核酸の結合プロファイルを生成するための核酸チップ、核酸チップの製造方法、及び核酸チップを利用した未知の生体分子分析方法
US10481153B2 (en) Integrated compound discovery systems and methods
CN116479089A (zh) 一种纳米核酸探针及其制备方法和应用
CN101666805A (zh) 特异性蛋白检测芯片的制备方法
CN109439738A (zh) Abcb1、cyp3a5基因检测引物组、试剂盒及检测方法
Liu et al. Nucleic Acid Hybridization Enhanced Luminescence for Rapid and Sensitive RNA and DNA Based Diagnostics
JP2007228803A (ja) 転写機構を利用した知能型核酸配列センシングシステム
KR102197368B1 (ko) Risc를 이용한 폴리뉴클레오타이드의 검출방법
CN114555125A (zh) 多核苷酸连接的生物缀合物及其制备和使用方法
Zhang et al. Endogenous AND Logic DNA Nanomachine for Highly Specific Cancer Cell Imaging

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E601 Decision to refuse application