CN101501191B - 硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了重组多形拟杆菌GAG裂解酶多肽。本发明也提供了编码这种多肽的核酸分子、含有多形拟杆菌裂解酶核酸分子的重组表达载体以及引入表达载体的宿主细胞。也提供了利用本发明的组合物的特征、诊断和治疗方法。

Description

硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途

相关申请的交叉引用

本申请是2005年11月3日提交的美国申请序号11/265,908的部分连续申请，并要求该美国申请的优先权。

发明背景

肝素和硫酸乙酰肝素代表以连接至己糖醛酸的D-葡糖胺的线性多糖为特征的一类粘多糖(Linhardt，R.J.(1991)Chem.Ind.2，45-50；Casu，B.(1985)Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.43，51-134)。肝素和硫酸乙酰肝素是在哺乳动物胞外基质中具有关键功能作用的碳水化合物复合物。这些多糖调节和调控重要的生化信号通路，所述信号通路作用于正常的生理过程，例如细胞和组织的形态发生、细胞-细胞相互作用以及生长和分化。这些多糖也在多种病理过程中具有关键作用，所述病理过程包括伤口愈合、肿瘤生长和转移、某些神经变性疾病和微生物引起的发病，在此仅举几个例子。

现在对肝素和硫酸乙酰肝素序列的理解大多依赖于对其生物合成的研究(Linhardt，R.J.，Wang，H.M.，Loganathan，D.，and Bae，J.H.(1992)Biol.Chem.267，2380-2387；Lindahl，U.，Feingold，D.，and Roden，L.(1986)Trends Biochem.Sci.11，221-225；Jacobson，I.，and Lindahl U.(1980)J.Biol.Chem.255，5094-5100；Lindahl，U.，and Kjellen，L.(1987)in The Biology of ExtracellularMatrix Proteoglycans(Wight，T.N.，and Mecham R.，eds)pp.59-104，AcademicPress，New York)。

硫酸乙酰肝素与肝素在化学上相关，其出现在细胞表面上以及差不多每种哺乳动物细胞类型的胞外基质(extracellular matrix，ECM)中。这些肝素样粘多糖(heparin-like glycosaminoglycan，HLGAG)作为称作蛋白聚糖的蛋白-多糖共轭物存在于这种胞外环境中。逐渐认识到HLGAG不仅仅具有结构功能，因为它们以功能性方式与许多胞外机制的蛋白质相互作用，所述蛋白质例如层粘连蛋白、纤连蛋白、整合蛋白和胶原蛋白。这样，HLGAG(作为蛋白聚糖的一部分)协助限定基质的生物学特性。这些HLGAG也与胞外基质中的一列细胞因子样生长因子和形态发生素，通过协助其与受体的生化相互作用以及保护它们不被蛋白水解降解而相互作用。例如，如Thornton，et al.，Science 222，623-625(1983)报道的肝素控制aFGF的生物学活性，这可能是如Schreiber，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，6138-6142(1985)报道的通过控制aFGF对其细胞表面受体的亲和力。根据Gospodarowicz and Cheng，J.Cell Physiol.128，475-484(1986)；Rosengart，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.152，432-440(1988)；和Lobb Biochem.27，2572-2578(1988)的报道，肝素保护aFGF和bFGF免于被热、酸和蛋白酶降解。根据Vlodavsky，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，2292-2296(1987)和Folkman，et al.，Am.J.Pathol.130，393-400(1988)和Emersonet.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(14)：4833-8(2004)的报道，bFGF储存在胞外基质中并可通过酶(例如乙酰肝素酶)的水解活性被动员为生物活性形式。

如Yayon，et al.，Cell 64，841-848(1991)和Papraeger，et al.，Science 252，1705-1708(1991)报道，FGF结合到硫酸乙酰肝素上是FGF结合到其位于细胞表面上的高亲和力受体的先决条件。如Kiefer，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，6985-6989(1990)描述的，已发现特异的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖调节bFGF对细胞表面的结合。

肝素裂解酶，例如肝素酶是能够特异性切割肝素和硫酸乙酰肝素中的主要糖苷键的一类酶。已经在肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)中鉴定了3种肝素酶，所述肝素黄杆菌作为使用GAG的有机体也生产外切葡糖醛酸糖苷酶(exoglycuronidases)、糖苷酶、硫酸酯酶(sulfoesterases)和氨苯磺胺酶(sulfamidases)以及其他另外作用于裂解酶产生的低聚糖产物的其他酶类(Yang，et al.J.Biol.Chem.260，1849-1857(1987)；Galliher，et al.Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.15，252-257(1982)。这些裂解酶被称为肝素酶I(肝素酶，EC 4.2.2.7)、肝素酶II(肝素酶，没有EC号)和肝素酶III(肝素酶EC 4.2.2.8)。这三种纯化的肝素酶在其切割肝素和硫酸乙酰肝素的能力上不同：肝素酶I主要切割肝素，肝素酶III特异切割硫酸乙酰肝素，而肝素酶II同时作用于肝素和硫酸乙酰肝素。几个拟杆菌属(Bacteroides)的种类(Saylers，et al.Appl.Environ.Microbiol.33，319-322(1977)；Nakamura，et al.J.Clin.Microbiol.26，1070-1071(1988))也产生肝素裂解酶。Bohmer，et al.J.Biol.Chem.265，13609-13617(1990)从一种未鉴定的土壤细菌中，根据明显同源性也纯化了肝素裂解酶。

发明概述

本发明部分地根据来自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的粘多糖(glucosaminoglycan，GAG)裂解酶后文中称为“多形拟杆菌GAG裂解酶”的发现和重组表达，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I、多形拟杆菌GAG裂解酶II、多形拟杆菌GAG裂解酶III和多形拟杆菌GAG裂解酶IV，其特别可用于肝素和/或硫酸乙酰肝素的结构特异性切割，并且在某些情况下用于硫酸软骨素和硫酸皮肤素的结构特异性切割。因此，本发明包括多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段以及多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段的组合的方法、组合物和试剂盒，用于例如对粘多糖(GAG)(例如肝素样粘多糖(heparin-likeglycoaminoglycans，HLGAG)，例如肝素或硫酸乙酰肝素)的表征或修饰，或者例如对非肝素/硫酸乙酰肝素GAG(例如硫酸软骨素和硫酸皮肤素)的表征或修饰。例如，所述方法、组合物和试剂盒可用于分析和监视GAG(例如HLGAG)的异源群体。在其他方面，所述方法、组合物和试剂盒可用于修饰GAG(例如HLGAG)的结构和/或活性。

因此，一方面，本发明的特征在于多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段；基本上与SEQ IDNOs：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列相同的氨基酸；或者由核酸分子编码的氨基酸，该核酸分子在严格杂交条件下与包括SEQ IDNOs：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39中的氨基酸序列的核酸分子杂交，其中所述核酸编码全长多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其功能片段。

在另一方面，本发明的特征在于包括一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段的组合物，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一个实施方案中，所述组合物进一步包括一种或多种HLGAG降解酶，例如除GAG裂解酶多肽以外的一种或多种肝素酶，和/或一种或多种除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的GAG裂解酶多肽。例如，所述组合物进一步包括一种或多种不饱和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶(glycuronidase)；多形拟杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)；β-葡糖醛酸糖苷梅(glucuronidase))；硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-O-硫酸酯酶、6-O-硫酸酯酶、3-O-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-O-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；N-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶(heparan-N-sulfatase))；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I(flavobacterium heparinum heparinase I)、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素噬胞菌(Cytophaga heparina)或肝素土地杆菌(Pedobacter heparinum)的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶(heparinase)、噬菌体K5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。这样的组合物可用于，例如切割HLGAG(例如肝素和/或硫酸乙酰肝素)，例如表征HLGAG(例如肝素和/或硫酸乙酰肝素)的制备。

在另一方面，本发明的特征在于特异切割HLGAG(例如肝素或硫酸乙酰肝素)的方法，其包括将HLGAG与一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一个实施方案中，所述HLGAG被切割成二-、三-、四-、五-、六-、八-和/或十糖，以及例如所述方法进一步包括确定所述HLGAG的二-、三-、四-、五-、六-、八-和/或十糖的序列。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述HLGAG与一种或多种HLGAG降解酶(例如除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽以外的肝素酶多肽或GAG裂解酶多肽)接触。例如，所述HLGAG降解酶可以是一种或多种不饱和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形拟杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α-艾杜糖醛酸酶；β-葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-O-硫酸酯酶、6-O-硫酸酯酶、3-O-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-O-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；N-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内-N-乙酰氨基葡糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素噬胞菌或肝素土地杆菌的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶、噬菌体K5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。

在另一方面，本发明的特征在于用于分析HLGAG异源群体的方法，所述HLGAG例如肝素(例如UFH、LMWH和合成的肝素)和硫酸乙酰肝素，所述方法包括将所述群体与一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。因此，在一些方面，本发明涉及与分析和监视HLGAG异源群体相关的方法和产品，所述分析和监视使用一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段从而以鉴定HLGAG异源群体的结构特征(structural signature)和活性，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。

在一些实施方案中，所述方法包括测定一组或多组HLGAG产品的结构特征，所述HLGAG与一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述方法进一步包括选择一组作为所述测定的结果。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述测定的结果与预选值例如参考标准进行比较。所述预选值可以是，例如一种或多种与HLGAG的切割相关的二-、三-、四-、五-、六-、八-和/或十糖的存在与否或者给定值(例如摩尔％或曲线下的区域)，所述HLGAG的切割是用一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段进行的，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。

对于本文描述的任何方法，可分析多形拟杆菌GAG裂解酶多肽(或者多种多肽)完全或部分消化的样品以一种或多种下列方式测定结构特征：多种质谱(例如基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization mass spectroscopy，MALDI-MS))，核磁共振(nuclear magneticresonance，NMR)光谱(例如1D NMR或2D NMR)，凝胶电泳，毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)，反相柱色谱(reverse-phase column chromatography，例如HPLC，例如具有用季铵盐动态涂敷的固定相的HPLC)，离子配对HPLC(例如强阴离子交换HPLC(strong anion exchange HPLC，SAX-HPLC))。本文描述的方法进一步包括用一种或多种HLGAG降解酶消化所述样品，所述HLGAG降解酶例如除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽以外的肝素酶或肝素裂解酶多肽。例如，所述HLGAG降解酶可以是一种或多种不饱和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形拟杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α-艾杜糖醛酸酶；β-葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-O-硫酸酯酶、6-O-硫酸酯酶、3-O-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-O-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；N-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素噬胞菌或肝素土地杆菌的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶、噬菌体K5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。

在另一方面，本发明的特征在于HLGAG制品(例如肝素或硫酸乙酰肝素制品)，所述HLGAG制品通过将HLGAG制品和一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触而制备，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一个实施方案中，所述HLGAG制品(例如肝素或硫酸乙酰肝素制品)例如与参考标准相比，例如与市售肝素或硫酸乙酰肝素相比，或者与在多形拟杆菌GAG裂解酶多肽接触前的肝素或硫酸乙酰肝素制品相比，具有一种或多种降低的抗Xa活性和抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或增加抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其他的实施方案中，当维持或增强抗Xa活性时，降低抗IIa活性。在另外的实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。这样的制品可用于例如需要降低的抗Xa活性和/或抗IIa活性的应用中，例如将肝素或硫酸乙酰肝素用做另一个试剂例如治疗性试剂、预防性或诊断性试剂的载体剂。因此，在一些实施方案中，所述HLGAG制品还包括除该HLGAG以外的第二试剂，例如该制品还包括一种或多种治疗性、预防性或诊断性试剂。在另一个实施方案中，所述HLGAG制品(例如所述肝素或者硫酸乙酰肝素制品)具有一种或多种增加的抗Xa活性和抗IIa活性，例如与参考标准相比，例如与市售肝素或硫酸乙酰肝素相比，或者在与多形拟杆菌GAG裂解酶多肽接触前与肝素或硫酸乙酰肝素制品相比。这样的制品可用于例如需要增加的的抗Xa活性和/或抗IIa活性的应用中，例如凝血剂和/或抗血栓形成的试剂。

在另一个方面中，该发明的特征在于中和一种或多种HLGAG(例如肝素或硫酸乙酰肝素)活性的方法。该方法包括将HLGAG与一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段。当所述HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素时，待中和的活性是一种或多种抗Xa活性和抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或增加抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其他的实施方案中，当维持或增强抗Xa活性时，降低抗IIa活性。在其他的实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在其他的实施方案中，维持抗Xa活性和抗IIa活性。所述HLGAG可例如离体(ex vivo)或在体内接触。因此，在一些实施方案中，该方法包括以中和受试者中抗Xa活性和/或抗IIa活性的有效量，施用一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段至受试者，例如已经施用了HLGAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的受试者，例如已经施用了肝素或硫酸乙酰肝素以抑制凝血和/或血栓的受试者。

在另一方面，本发明的特征在于在受试者内抑制血管生成的方法。该方法包括向受试者施用有效量的一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段，例如本文描述的多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽、多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽、多形拟杆菌GAG裂解酶III多肽、多形拟杆菌GAG裂解酶IV多肽或其功能性片段，从而以抑制血管生成。在一个实施方案中，所述受试者患有与不需要的血管生成相关的疾病或病症。这样的病症包括，但不局限于关节炎(例如风湿性关节炎)、多种眼病(例如糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、炎症性病症(inflammatory disorders)、眼瘤(ocular tumors，例如视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))、水晶液后囊纤维化(retrolental fibroplasias)、葡萄膜炎(uveitis)，以及与脉络膜血管新生和虹膜血管新生相关的病症)和癌症(例如肿瘤生长和转移)。

在另一方面，本发明的特征在于抑制受试者内不需要的细胞增殖和/或分化的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，从而抑制细胞增殖和/或分化。在一个实施方案中，所述受试者患有癌症。

在另一方面，本发明的特征在于包括一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段和药用可接受载体的药用组合物。在一个实施方案中，所述一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段具有中和一种或多种HLGAG的活性的有效量。优选地，所述HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素，并且所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段有效中和一种或多种抗Xa活性和抗IIa活性的量存在。在一些实施方案中，当维持或增加抗IIa活性时，降低抗Xa活性。优选，HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素，并且多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段是以有效中和一种或多种抗Xa活性和抗IIa活性的量存在。在一些实施方案中，当维持抗IIa活性活性时，抗Xa活性降低。在另外一些实施方案中，当维持或增强抗Xa活性时，降低抗IIa活性。在另外一些实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在另一个实施方案中，所述所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段以有效抑制血管生成的量存在。

在另一方面，本发明的特征在于包含一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段的组合物的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒还包括一种或多种HLGAG降解酶，例如一种或多种肝素酶多肽和/或除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽以外的一种或多种GAG裂解酶多肽。例如，该试剂盒包含以下中的一种或多种：不饱和葡萄糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形拟杆菌Δ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡萄糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α-艾杜糖醛酸酶；β-葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-O-硫酸酯酶、6-O-硫酸酯酶、3-O-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-O-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；N-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素噬胞菌或肝素土地杆菌的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶、噬菌体K5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。在一个实施方案中，所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，以及一种或多种其他HLGAG降解酶在同一个组合物中。在另一个实施方案中，所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，以及一种或多种其他HLGAG降解酶在不同的组合物中。在另一个实施方案中，所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段与药学上有效的载体一起在药用组合物中。所述试剂盒还包括HLGAG，例如肝素和/或硫酸乙酰肝素。在一个实施方案中，当该试剂盒包括多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段的药用组合物时，该HLGAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素也在药学组合物中，并且例如该试剂盒还包括用于中和HLGAG的一种或多种活性的指导性材料。

在另一方面，本发明的特征在于编码多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段的核酸分子。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子编码具有SEQ IDNOs：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的氨基酸序列的多肽。在其他的实施方案方案中，本发明提供了具有SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、22、28、33、36或38所示的核苷酸序列的分离的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供与SEQ ID NOs：1、5、28或36所示的核苷酸序列基本上相同的核酸分子(例如天然存在的等位基因变体)，以及在严格杂交条件下与包含SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子，其中所述核酸编码全长多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其功能片段。

在相关方面，本发明还提供包含本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子的核酸构建体。在某些实施方案中，本发明的核酸分子有效连接至天然或异源调控序列。也包括包含本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子的载体和宿主细胞，例如适宜生产多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子和多肽的载体和宿主细胞。

在另一方面，本发明的特征在于抗体及其抗原结合片段，其与多形拟杆菌GAG裂解酶多肽相互作用，或者更优选地与多形拟杆菌GAG裂解酶多肽特异结合。

在另一方面，本发明提供筛选调节多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或核酸表达或活性的化合物的方法。

以下详细的说明书和权利要求清晰显示了本发明的其他特性和优点。

附图说明

图1A描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的DNA序列(SEQ ID NO：1)。起始甲硫氨酸密码子(ATG)加了下划线，而第二个内部甲硫氨酸密码子加了双下划线。图1B描绘了其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，并以粗体显示多形拟杆菌GAG裂解酶I的2个变体——称为M17变体(SEQ ID NO：4)和Q26变体(SEQ ID NO：23)的N-末端氨基酸残基。

图2描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶I(SEQ ID NO.2)与来自肝素黄杆菌的肝素酶I(SEQ ID NO：24)和共有序列(SEQ ID NO：26)的BLAST比对。

图3A描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的M17变体的DNA序列(SEQID NO：3)和以阴影显示的甲硫氨酸17(M17)的ATG密码子。图3B描绘了其预测的氨基酸序列(SEQ DD NO：4)。

图4A描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的Q26变体的DNA序列(SEQID NO：22)。图4B描绘了其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。

图5A描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶II的DNA序列(SEQ ID NO：5)。图5A也描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶II的核苷酸序列的部分，其未出现在多形拟杆菌GAG裂解酶II的2种变体中，即，称为″Q23变体″(SEQ IDNO：7)其删除部分以下划线显示，和″K169变体″(SEQ ID NO：9)，其删除部分以阴影显示。图5B描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶II的预测氨基酸序列(SEQID NO：6)，并且显示Q23变体(SEQ ID NO：8)和K169变体(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的删除部分。

图6描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶II(SEQ ID NO：6)与来自肝素黄杆菌的肝素酶m(SEQ ID NO：25)和共有序列(SEQ ID NO：27)的BLAST比对。

图7是MALDI-MS质谱的图示。A版(panel A)描绘了未处理的ATIII五糖

的峰，也显示了其结构。B版描绘了用重组多形拟杆菌GAG裂解酶I消化

后产生的峰。消化后产生了五硫酸化三糖产物，也显示了其结构。

图8描绘了编码从多形拟杆菌克隆到的GAG裂解酶III基因序列的DNA序列(SEQ ID NO：28)。以粗体标注起始甲硫氨酸(ATG)和终止(TAA)密码子。对应于谷氨酸23(Q23)的密码子(CAG)加了下划线。

图9描绘了从多形拟杆菌克隆到的GAG裂解酶III的氨基酸序列(SEQ IDNO：29)。预测的输出信号序列加了下划线。为氨基末端变体的开端划定界限的谷氨酰胺23(Q23)涂有灰色阴影。

图10描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶III(SEQ ID NO：29)的氨基酸序列——从顶端开始的所列第三项——与相关的肝素/硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶的比对。以深灰色表示相同的残基，浅灰色表示相似的残基。BT表示多形拟杆菌，FH表示肝素黄杆菌。

图11描绘了从多形拟杆菌分离的GAG裂解酶III(BT GAG裂解酶)、从肝素黄杆菌分离的肝素酶II(FH肝素酶II)和从肝素黄杆菌分离的肝素酶III(FH肝素酶III)的酶活性。该酶活性表示为所述3种测试的酶底物的特异性。4种测试的“肝素样”底物是猪小肠肝素、2种不同的硫酸乙酰肝素(称为“HI”和HO”，每个在硫酸化作用程度上变化)和低分子量药用肝素即依诺肝素(enoxaparin)。所示酶活性描绘了根据在232nm处吸收值评估的，在彻底消化中，针对这些底物的总的切割活性。

图12描绘了从多形拟杆菌分离的GAG裂解酶III(BT GAG裂解酶)和从肝素黄杆菌分离的肝素酶II(FH Hep II)的切割活性。该切割活性表示测试酶的底物特异性。实际的切割产物通过毛细管电泳分级，并通过在232nm处的吸收值(Y轴)监视。实线描绘了BT GAG裂解酶，而虚线描绘了FH Hep II。

图13描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶IV的DNA序列(SEQ IDNO：36)。起始甲硫氨酸密码子(ATG)和终止密码子为粗体，而对应于天冬氨酸20的第二密码子(GAC)加了下划线。

图14描绘了具有加了下划线的信号序列的其预测的氨基酸序列(SEQ IDNO：37)。另外，称为D20变体(SFQ ID NO：38)的多形拟杆菌GAG裂解酶IV变体的N-端氨基酸残基以阴影表示。

图15描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶IV(SEQ ID NO：36)的氨基酸序列——从顶端开始的所列第三项——与相关的肝素/硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶的比对。以深灰色表示相同的残基，浅灰色表示相似的残基。BT表示多形拟杆菌，FH表示肝素黄杆菌。

图16描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶IV对3种不同底物的底物特异性，所述底物即是未分级的肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(HS)的2种称为“HO-HS”和“HI-HS”的级分。

详细描述

综述

本公开描述了来自多形拟杆菌的活性多形拟杆菌GAG裂解酶的重组表达，其对于GAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素粘多糖及其衍生物的修饰和表征特别有用。

例如，本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶是现有化学-酶促方法的补充工具，所述方法用于以结构特异的方式切割GAG，例如肝素和硫酸乙酰肝素多糖(以及在一些情况下的其它GAG，例如硫酸软骨素和硫酸皮肤素)。GAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素的结构特异切割可用于，例如确定异源GAG制品中的GAG结构。另外，切割可用于，例如从GAG中生产较低分子量的多糖。因此，多形拟杆菌GAG裂解酶可用于产生，例如肝素和硫酸乙酰肝素衍生的寡糖。这样的肝素和硫酸乙酰肝素衍射的寡糖具有诊断、预防和治疗潜能。

另外，本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶也在例如与血管生成相关的疾病中具有预防和治疗潜能。

所述多形拟杆菌GAG裂解酶进一步在体外、离体和/或体内可用于中和肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗凝血和/或抗血栓形成活性。

所述多形拟杆菌GAG裂解酶I序列(图1，SEQ ID NO：1)包括潜在的非翻译区在长度上大约有1251个核苷酸，包含大约1179个核苷酸的预测的甲硫氨酸起始的编码序列，其中包括终止密码子(在图1中指定为SEQ ID NO：1编码的核苷酸)。该假定的编码序列编码392个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)。其中氨基末端开始于残基17(M17)的甲硫氨酸的变体可用于生产重组蛋白质。

氨基末端开始于残基17的甲硫氨酸(M17)的变体也可用于产生重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的M17变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图3B(SEQ ID NO：4)和3A(SEQ ID NO：3)中。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA和生物素也可用于获得该酶。

氨基末端开始于残基Q26的谷氨酰胺的另一个变体也可用于生产重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的Q26变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图4B(SEQ ID NO：23)和4A(SEQ ID NO：22)中。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA和生物素也可用于获得该酶。

多形拟杆菌GAG裂解酶I与从肝素黄杆菌得到的肝素酶I，至少在一级氨基酸序列水平上共享结构特征(图2)。

多形拟杆菌GAG裂解酶II基因序列(图5，SEQ ID NO：5)包括终止密码子(在图5A中指定为SEQ ID NO：5编码的核苷酸)在内有大约2001个核苷酸长。该编码序列编码666个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：5B)。

氨基末端开始于残基23(Q23)处的谷氨酰胺的变体也可用于生产重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的Q23变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图5B(SEQ ID NO：8)和5A(SEQ ID NO：7)中。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA和生物素也可用于获得该酶。

缺失开始于残基169(K169)处的赖氨酸而结束于残基186处的谷氨酸的另一个变体也可用于生产重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶II的K169变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图5B(SEQ ID NO：10)和5A(SEQID NO：9)中。多形拟杆菌GAG裂解酶II蛋白质与从肝素黄杆菌得到的肝素酶III，至少在它们各自的一级氨基酸序列水平共享许多结构特征。

多形拟杆菌GAG裂解酶III序列(图8，SEQ ID NO：28)大约2690个核苷酸长(包括非翻译序列)并包含大约2622个核苷酸的预测的甲硫氨酸起始的编码序列，其中包括终止密码子。起始和终止密码子以粗体显示在图8中。该编码序列编码873个氨基酸的蛋白质(在图9中的SEQ ID NO.29)。

氨基末端开始于谷氨酰胺残基23(Q23)的变体也可用于生产重组蛋白质。该变体的核苷酸序列描绘于SEQ ID NO：33中，而该变体的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：34中。谷氨酰胺23残基在图9中加了下划线，而在图10中显示为灰色阴影。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白，以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA和生物素也可用于获得该酶。

多形拟杆菌GAG裂解酶III与从肝素黄杆菌得到的肝素酶II共同包含一些结构特征和底物特异性。多形拟杆菌GAG裂解酶III蛋白质具有对肝素和硫酸乙酰肝素两者的底物特异性。另外，其能够切割硫酸软骨素和硫酸皮肤素。

多形拟杆菌GAG裂解酶IV序列(图13，SEQ ID NO：36)大约2109个核苷酸长。起始和终止密码子在图15中粗体表示。该编码序列编码702个氨基酸的蛋白质(图14中的SEQ ID NO：37)。

氨基末端开始于氨基酸残基20(D20)处的天冬氨酸的变体也可用于生产重组蛋白质。该变体的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：38中，而该变体的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：39中。天冬氨酸20残基的密码子在图13中加了下划线，而天冬氨酸20在图14中显示为灰色阴影。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA和生物素也可用于获得该酶。

多形拟杆菌GAG裂解酶IV蛋白质包含与从多形拟杆菌得到的其它GAG裂解酶或从肝素黄杆菌得到的肝素酶相似的有限序列。另外，多形拟杆菌GAG裂解酶IV蛋白质具有与从多形拟杆菌得到的其它GAG裂解酶或从肝素黄杆菌得到的肝素酶不同的底物特异性。例如，其切割在科学文献中报道的、通常在大部分天然肝素和/或硫酸乙酰肝素通常不出现的二或四糖。

由于本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶多糖可以调节肝素和/或硫酸乙酰肝素介导的活性，因此，它们可用于多种预防性和治疗性应用，以及开发用于肝素和/或硫酸乙酰肝素介导的或和相关疾病的新的预防和治疗试剂。

如本文中所用的，“GAG裂解酶活性”、“GAG裂解酶的生物活性”或“GAG裂解酶的功能活性”指多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质、多肽或核酸分子在生理环境中发挥出的活性。例如GAG裂解酶活性可以是由多形拟杆菌GAG裂解酶对例如GAG裂解酶底物例如肝素或硫酸乙酰肝素中的糖苷键发挥出的活性。可在体内或体外测定GAG裂解酶的活性。

预测本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶分子具有与从肝素黄杆菌得到的多种肝素酶相似的生物活性。例如，本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖键，例如以与在切割位点产生具有C4和C5位置之间的不饱和键的糖醛酸(例如Δ4，5)相同的方式；(3)调节，例如增加或降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性；以及(4)降低或消除血管生成。

在一些方面，多形拟杆菌GAG裂解酶I具有与从肝素黄杆菌得到的肝素酶I相似，但不相同的生物活性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶I具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割与硫酸化糖醛酸有关的一种或多种糖苷键，例如2-O糖醛酸；切割与硫酸化的氨基己糖有关的一种或多种糖苷键，例如6-O-硫酸酯和/或N-磺胺；(3)例如与参考标准比较时，降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在一些实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。

在一些方面中，多形拟杆菌GAG裂解酶III具有与从肝素黄杆菌得到的肝素酶II相似，但不相同的生物活性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶III具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割硫酸化氨基己糖例如N-硫酸化的和/或6-O硫酸化的或未硫酸化的但乙酰化的氨基己糖(例如HNAc)和硫酸化的糖醛酸例如2-O硫酸化的糖醛酸或者未硫酸化的糖醛酸之间的一种或多种糖苷键；(3)例如与参考标准比较时，降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当可能维持抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其它的实施方案中，同时降低抗Xa活性和抗IIa活性。

因此，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子可作为新型治疗性试剂用于控制肝素相关的疾病。这样的疾病的实例包括肝素诱导的抗凝血和/或血管生成。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子，可用于例如在手术中或手术后降低或消除(例如中和)肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种抗凝血特性。在其它的实施方案方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III，可用于对血液去肝素化，例如在生物反应器中，例如在心肺和/或肾透析中使用的生物反应器。

在一些方面，多形拟杆菌GAG裂解酶II具有与从肝素黄杆菌得到的肝素酶III相似，但不相同的生物活性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶II具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割硫酸化的和未硫酸化的一种或多种糖苷键；(3)例如与参考标准比较时，增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当降低抗IIa活性时，维持或可能增加抗Xa活性。在其它实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。

在一些方面，多形拟杆菌GAG裂解酶IV具有与其他从多形拟杆菌得到的GAG裂解酶和从肝素黄杆菌得到的肝素酶不同的生物活性，例如底物特异性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶IV具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割低至中等硫酸化密度的一种或多种糖苷键，特别是与2-O-硫酸化的糖醛酸和邻近的乙酰化有关的键葡糖胺(在多数天然肝素和/或硫酸乙酰肝素制品中不经常发现)；(3)例如与参考标准比较时，增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或降低抗IIa活性时，增加抗Xa活性。在其它实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。

因此，这样的多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶II和多形拟杆菌GAG裂解酶IV分子可用于制备用于治疗凝血和/或血栓形成的肝素和/或硫酸乙酰肝素制品。这样的疾病的实例包括溶解或抑制血栓的形成，治疗和预防以下所产生的病症：心脏和中央神经系统血管梗塞、动脉硬化、血栓形成、心肌梗塞、心律不整(arrythmias)、心房震颤(atrial fibrillation)、心绞痛、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、充血性心力衰竭、弥散性血管内凝血、经皮冠状动脉干预(percutaneous coronary intervention，PCI)、冠状动脉旁路移植手术(coronary artery bypass graft surgery，CABG)、再灌注的冠状旁路的再闭塞或再狭窄(reocclusion or resenosis of reperfused coronary arteries)、风湿热、中风、暂时性缺血性发作、血栓性中风、栓塞性中风(embolic stroke)、深静脉血栓形成(deep venous thrombosis)、肺栓塞(pulmonary embolism)、偏头痛、过敏症、哮喘、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory stree syndrome，ARDS)、囊肿性纤维化、眼部的新血管生成、骨质疏松症、牛皮癣、关节炎(风湿性或成骨性)、阿尔茨海默症、骨折、大手术/外伤、烧伤、外科过程、移植(例如骨髓移植)、臀部替换(hip replacement)、膝盖替换(knee replacement)、败血病、败血病性休克、怀孕、遗传性疾病例如血友病。

在其他实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶II和/或多形拟杆菌GAG裂解酶IV分子，可用于治疗或预防细胞增殖性或分化性疾病，例如通过阻止或抑制表现出不需要的增殖和/或分化或者另外与不需要的增殖和/或分化相关的细胞的血管生成。细胞增殖性或分化性疾病的实例包括：糖尿病；关节炎，例如风湿性关节炎；眼病，例如眼部新血管生成，糖尿病视网膜病变，新生血管性青光眼，晶体后纤维增生症(retrolentalfibroplasia)，色素膜炎(uveitis)，与脉络膜新生血管(choroidal neovascularization)有关的眼病，与虹膜新血管生成相关的眼病；癌，例如肿瘤、肉瘤、转移疾病或造血瘤疾病，例如白血病。

在其他实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶III分子，可用于制备硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素制品。

多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质，其片段，以及其SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：37中序列的衍生物和其它变体都称为“本发明的多肽或蛋白质”或“多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或蛋白质”。编码这些多肽或蛋白质的核酸分子都称为“本发明的核酸”或“多形拟杆菌GAG裂解酶核酸”。“多形拟杆菌GAG裂解酶分子”指多形拟杆菌GAG裂解酶核酸、多肽和抗体。

如本文中所用的，术语“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如mRNA)和DNA或RNA的类似物。可从核苷酸类似物合成DNA或RNA类似物。DNA分子可以是单链的或者双链的，但优选是双链DNA。

术语“分离的核酸分子”或“纯化的核酸分子”包括与核酸的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。例如，对于基因组DNA，术语“分离的”包括从该基因组DNA与之天然相关的染色体上分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸在该核酸来源的有机体的基因组DNA内，没有天然位于其侧翼的序列(例如，位于该核酸5’和/或3’端的序列)。例如，在多个实施方案中，所述分离的核酸分子包含小于5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的5′和/或3′核苷酸序列，在该核酸来源的细胞基因组DNA中，所述核苷酸序列天然位于该核酸分子的侧翼。而且，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可基本上没有通过重组技术生产时的其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，基本上没有化学前体或化合物。

如本文所用的，术语“在严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤条件。严格杂交条件是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在大约45℃下的杂交，其后在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤2次。杂交条件是本领域技术人员已知的，并可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。水相和非水相方法(aqueous and nonaqueous methods)描述在该参考文献中，并可使用其中任一种。杂交条件的其它实例如下：1)低严格性，在6×SSC中，在大约45℃下杂交，其后在55℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；2)中等严格性，在6×SSC中，在大约45℃下杂交，其后在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及优选的3)高严格性，在6×SSC中，在大约45℃下杂交，其后在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。特别优选的严格条件(以及如果实施者不确定应该使用使用什么样的条件来测定分子是否在本发明的杂交限制内，应使用的条件)是在65℃、0.5M磷酸钠、7％SDS，其后在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。

优选，本发明的分离的核酸分子，其在严格条件下杂交与SEQ ID NO：1、5、28或36的序列杂交，对应于天然存在的核酸分子。

如本文中所用的，“天然的存在的”核酸分子指具有在天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如天然存在的核酸分子可编码天然蛋白质。

如本文所用的，术语“基因”和“重组基因”指包括至少一个编码多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的可读框的核酸分子。该基因任选地还包括非编码序列，例如调控序列和内含子。

“分离的”或“纯化的”多肽或蛋白质基本上没有来自该蛋白质来源的细胞或组织的细胞材料或其它污染蛋白质，或者基本上没有化学合成时的化学前体或其它化合物。“基本上没有”表示多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的制品至少是10％纯的。在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的制品中少于大约30％、20％、10％并且更优选地是5％(干物质重量比)的非多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质(在本文中也引述为“污染蛋白质”)，或者化学前体或非多形拟杆菌GAG裂解酶化学品。当多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其生物活性部分重组生产时，其也优选基本上没有培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于大约20％、更优选地少于10％，并且最优选地少于5％。本发明也包括干重至少为0.01、0.1、1.0和10毫克的分离的或纯化的制品。

“非必需”氨基酸残基是可从多形拟杆菌GAG裂解酶的野生型序列中改变而不破坏或实质上改变GAG裂解酶活性的残基。优选地，所述改变不实质上改变GAG裂解酶的活性，例如该活性至少是野生型的20％、40％、60％、70％或80％。“必需”氨基酸残基是当从多形拟杆菌GAG裂解酶的野生型序列中改变时，导致GAG裂解酶活性破坏从而具有少于20％野生型活性的残基。例如，预测多形拟杆菌GAG裂解酶的保守氨基酸残基特别经不起改变。

“保守氨基酸取代”是其中该氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组胺酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组胺酸)。因此，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质中预测的的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。可选地，在另一个实施方案中，可在多形拟杆菌GAG裂解酶编码序列的全长或部分中通过例如饱和诱变引入突变，并以GAG裂解酶生物活性筛选所得突变体以鉴定保留活性的突变体。SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：36诱变后，重组表达所编码的蛋白质并确定该蛋白质的活性。

如本文所用的，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的“生物活性部分”包括多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的片段，其参与相互作用例如分子间相互作用。分子间相互作用可以是结合相互作用或酶促相互作用(例如该相互作用可以是瞬时的，并且形成或破坏共价键)。分子间相互作用可在GAG裂解酶多形拟杆菌分子和非多形拟杆菌GAG裂解酶分子例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段之间。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的生物活性部分包括含有与多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质基本上同源或由其衍生的氨基酸序列的肽，例如SEQIDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，其包括少于全长多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的氨基酸，并且表现出至少一种GAG裂解酶蛋白质活性。通常，生物活性部分包括具有至少一种GAG裂解酶蛋白质活性的结构域或基序，例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段的解聚作用(例如，以位点特异性方式)，肝素、硫酸乙酰肝素及其片段对糖苷键的切割，降低或消除抗凝血活性，例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段的抗凝血活性。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的生物活性部分可以是例如长度为10、25、50、100、200、300、400、500或更过多个氨基酸的多肽。

如下进行序列间的同源性或序列同一性(这两个术语在本文中可交换使用)的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个氨基酸序列的百分比同一性，比对所述序列获得最佳比较目的(例如缺口(gap)引入至第一和第二氨基酸和核酸序列的一个或两个中用于最佳比对，而针对比较目的，忽视非同源序列)。两个序列间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数，其中考虑到缺口的数量，以及对于两个序列的最佳比对而需要引入的每一个缺口的长度。为了确定分子是否在本文的序列同一性或同一性限制范围内，通过Needleman andWunsch((1970)J.MoI.Biol.48：444-453)的数学算法确定百分比同一性，通过在GCG软件套装(来自http://www.gcg.com)的GAP程序完成，并使用下述参数：缺口罚分为12的Blossum 62得分矩阵、缺口延伸罚分为4，并且移码缺口罚分是5。

在优选的实施方案中，出于比较目的而比对的参考序列的长度是该参考序列的长度的至少30％，优选至少40％、更优选至少50％、60％，以及更优选地至少70％、80％、90％、100％。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中某一位置被第二序列上相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在此位置上是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”是等价的)。

为了分析有关多形拟杆菌GAG裂解酶分子的生物序列，除了上述的Needleman和Wunsch算法外使用以下对比程序。两个氨基酸或核苷酸序列间的百分比同一性可使用E.Meyers and W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)的算法来测定，使用PAM120加权残基表、缺口长度罚分是12、并且缺口罚分是4，其已经被并入ALIGN程序(2.0版)。

本文所述的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”以执行针对公共数据库的搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关的序列。可使用Altschul，et al.(1990)J.MoI.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行这样的搜索。BLAST核苷酸搜索可使用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)进行，以获得与本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行，以获得与本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白分子同源的氨基酸序列性。为了获得用于比较目的的缺口比对，如Altschul et al，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402的描述使用缺口的BLAST。当使用BLAST和缺口的BLAST程序时，使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

本发明的具体的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽具有与SEQ ID Nos：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列。在氨基酸序列中，本文使用术语“充分相同”或“基本上相同”指包含足够的或最小数量的氨基酸残基的第一氨基酸，所述氨基酸残基i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或者ii)是第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基的保守替换，从而该第一和第二氨基酸序列具有共同的结构折叠和/或共同的功能性活性。例如，含有具有至少大约60％或65％同一性，可能是75％同一性，更可能是85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的共同结构性结构域的氨基酸序列被称作充分或基本上相同。在核苷酸序列中，本文使用术语“充分相同”或“基本上相同”指包含足够的或最小数量的核苷酸的第一核酸，所述核苷酸与第二核酸序列中比对的核苷酸相同，从而该第一和第二核苷酸序列具有相同的功能活性或编码共同的结构性多肽折叠或共同的功能多肽活性。

本文所教导的方法有时根据肝素样粘多糖(HLGAG)来描述，但本文所教导的特性可扩展到其它多糖。如本文所用的，术语“HLGAG”和“糖氨聚糖”(GAG)可交换地用于指具有肝素样结构和特性的分子家族，其通常在本文中称为“肝素”。这些分子包括，但不局限于低分子量肝素(low molecular weightheparin，LMWH)、未分级肝素、生物技术制备的肝素、化学修饰的肝素、合成肝素如五糖(例如ARIXTRATM)、肝素模拟物和硫酸乙酰肝素。术语“生物技术肝素”包括从经过化学修饰的多糖的天然来源制备的肝素，并描述于Razi etal.，Bioche.J.1995JuI 15；309(Pt 2)：465-72中。化学修饰的肝素描述于Yates etal.，Carbohydrate Res(1996)Nov 20；294：15-27中，并且是本领域技术人员已知的。合成的肝素是本领域技术人员熟知的并描述于Petitou，M.et al.，BioorgMed Chem Lett.(1999)Apr 19；9(8)：1161-6和Vlodavsky et al.，Int.J.Cancer，1999，83：424-431中。合成肝素的实例是磺达肝癸钠(Fondaparinux)。磺达肝癸钠(ARIXTRATM)是对应于AT-III结合位点的5个单位的合成的粘多糖。硫酸乙酰肝素指包含与肝素相似的二糖重复单位的粘多糖(Glycoaminoglycan)，但其具有更多的N-乙酰基团和更少的N-和O-硫酸基团。肝素模拟物是具有至少一种肝素的生物活性(即，抗凝血、抑制癌症、治疗肺病等)的单糖(例如硫糖铝)、寡糖和多糖。优选，这些分子是高度硫酸化的。肝素模拟物可以是天然存在的、合成的或化学修饰的(Barchi，JJ.，Curr.Pharm.Des.，2000，Mar，6(4)：485-501)。术语“HLGAG”也包括上述HLGAG分子的功能性变体。这些功能性变体具有相似的结构，但包括对该结构的轻微修饰，从而使得该分子保留其大部分生物活性或者具有提高的生物活性。

如本文所用的“LMWH”指具有平均分子量小于8000Da的硫酸化粘多糖(GAG)的制品，LMWH制品的大约至少60％的寡糖链具有小于8000Da的分子量。几种LMWH可购买获得，但也可例如使用HLGAG降解酶从肝素中制备LMWH。HLGAG降解酶包括，但不局限于肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、肝素酶IV、乙酰肝素酶、D-葡醛酸糖苷酶和L-艾杜糖醛酸酶。这3种来自肝素黄杆菌的肝素酶是已经用于产生LMWH(5,000-8,000Da)和超低分子量肝素(-3,000Da)的酶工具。另外，可使用例如本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽制备LMWH。市售的LMWH包括，但不局限于依诺肝素(enoxaparin)(商标名称为Lovenox；Aventis Pharmaceuticals)、达肝素(dalteparin)(Fragmin，Pharmacia and Upjohn)、舍托肝素(certoparin)(Sandobarin，Novartis)，阿地肝素(ardeparin)(Normiflo，Wyeth Lederle)、那屈肝素(nadroparin)(Fraxiparine，Sanofi-Winthrop)，帕肝素(pamaparin)(Fluxum，Wassermann)、瑞肝素(reviparin)(Clivarin，Knoll AG)和亭扎肝素(tinzaparin)(Innohep，Leo Laboratories，Logiparin，Novo Nordisk)。LMWH的一些优选形式包括依诺肝素(Lovenox)和达肝素(Fragmin)。如本文所用的术语″戊聚糖钠(Arixtra)″指包括甲基O-2-脱氧-6-O-硫代-2-(磺胺基)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-O-2-二氧-3，6-二-硫代-2-(磺胺基)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-O-2-O-硫代-α-L-艾杜吡喃葡糖基(idopyranuronosyl)-(1→4)-2-二氧-6-O-硫代-2-(磺胺基)-α-D-吡喃葡糖苷、其十钠盐和衍生物的的合成的五糖的组合物，如本文所用的，“合成的肝素”或“合成的HLGAG”指HLGAG示合成的化合物，并且不是由肝素的片段衍生的。制备肝素的方法提供于，例如Petitou et al.(1999)Nature 398：417中，其内容通过引用并入本文。

如本所用的，“错误表达或异常表达”指在RNA或蛋白质水平上基因表达的非野生型形式。其包括：非野生型水平的表达，即过量表达或低表达；在该基因表达的时间或阶段方面，不同于野生型的表达形式，例如在预定的发育时期或阶段增加或降低的表达(与野生型相比)；在预定的细胞类型或组织类型中在改变的表达(与野生型相比)方面，不同于野生型的表达形式；，在所表达的多肽的剪接长度、翻译的氨基酸序列、翻译后修饰或生物活性方面，不同于野生型的表达形式；在该基因表达的环境刺激或细胞外刺激的作用方面，不同于野生型的表达形式，例如在该刺激的强度增加或降低的情况下增加或降低的形式(与野生型相比)。

如本文所用的，“受试者”指哺乳动物生命体。在优选的实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是试验动物或适于作为疾病模型的动物。这些受试者的非限定性实例包括小鼠(mice)、大鼠(rates)和兔(rabbits)。受试者也可以是非人动物，例如马(hourse)、牛(cow)、山羊(goat)和其它家畜(domestic animal)。

以下更详细地描述本发明的多个方面。

分离的核酸分子

一方面，本发明提供了分离的或纯化的的核酸分子，其编码本文描述的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽，例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其片段，例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的生物活性部分。也包括适用于作为杂交探针的核酸片段，其用于，例如鉴定编码本发明的多肽的核酸分子、多形拟杆菌GAG裂解酶mRNA和适用于作为探针的片段例如用于扩增和突变核酸分子的PCR引物。

在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列或任何这些核苷酸序列的一部分。在一个实施方案中，该核酸分子包括编码多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的序列(即，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：28或SEQ IDNO：36的“编码区”)，以及5’非翻译序列。可选地，该核酸分子不包括正常伴随该目标序列(subject sequence)的侧翼序列。在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：28或SEQID NO：36所示的核苷酸序列或任何这些核苷酸序列的一部分互补物(complement)的核酸分子。在其它实施方案中，本发明的核酸分子与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列充分互补，从而其可与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：28或SEQ IDNO：37所示的核苷酸序列杂交，而形成稳定的双链体。

在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括与SEQ ID NO：1、SEQID NO：5、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列的全长或任何这些序列的一部分优选相同长度的部分具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

本发明的核酸分子可仅包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：36的核酸序列的一部分。核酸包括那些包括编码序列的部分或全部并延长至5’或3’非编码区域之一(或两者)的核苷酸序列。其它的实施方案包括片段，其包括编码本文所述氨基酸片段的核苷酸序列的片段，特别是其在长度上具有至少100个氨基酸的片段。片段也包括对应于上述具体氨基酸序列或其片段的核酸序列。核酸片段不应直译为包括那些在本发明前已公开的片段。

可通过分离SEQ ID NO：1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核苷酸序列的一部分——所述核苷酸序列的一部分编码具有GAG裂解酶生物活性(例如在本文中描述的GAG裂解酶蛋白质的生物活性)的多肽、通过表达多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的编码部分(例如通过体外重组表达)以及通过评估多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的编码部分的活性，来制备编码“多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的生物活性部分”的核酸片段。编码多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的生物活性部分的核酸片段包括长度上大于300或更多个核苷酸的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，核酸分子其在长度上包括大约100、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或更多个核苷酸，在严格杂交条件下与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核酸分子的核苷酸序列杂交。

本发明包括不同于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、22、28、33、36或38所示的核苷酸序列的核酸分子。这些差异源于遗传密码的兼并性(并产生编码与本文所公开的核苷酸序列编码的蛋白质相同多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的核酸)。在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有至少1个，但少于5、10、20、50或100个SEQ IDNO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸残基不同的氨基酸序列。如果对这种比较需要进行比对，则应当针对最大同源性比对该序列。认为来自缺失或插入或错配的“成环”序列是不同的。

对于具有具体表达系统的优选或非优选的密码子，可选择发明人的核酸。例如，该核酸可以是这样一种核酸，即，在该核酸中，至少一个密码子，优选地至少10％％或20％％的密码子被改变，使得该序列对于在大肠杆菌、酵母、人、昆虫或CHO细胞中表达是最佳的。

核酸变体可以是天然存在的，例如等位基因变体(相同的基因座)和同系物(不同的基因座)，或者可以是非天然存在的。非天然存在的变体可通过诱变技术产生，其中包括那些应用于多核苷酸、细胞或生命体的技术。所述变体可包含核苷酸取代、缺失、倒置和插入。变体可发生在编码和非编码区域之一或两者上。所述变体既可产生保守的氨基酸取代也可产生非保守的氨基酸置换(如在所编码的产物中比较的)。

在优选的实施方案中，该核酸不同于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核酸在于如下：至少一个，但不多于10、20、30或40个核苷酸；至少一个，但不多于1％、5％、10％或20％的目标核酸中的核苷酸。如果对于该分析，此是必须需，则应当针对最大同源性比对该序列。认为来自缺失或插入或错配的“成环”序列是不同的。

可使用本领域已知的方法鉴定同系物和等位基因变体。这些变体包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列或这些序列的片段具有50％、至少大约70-75％，通常至少大约70-75％，更典型地至少大约80-85％，并且最通常至少大约90-95％的同一性。由于这些核酸分子能够在严格条件下，与编码SEQ ID NO 2、SEQ ID NO：6、SEQ ID、NO：29或SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者所述序列的片段杂交，所以这些核酸分子易于鉴定。对应于本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶DNA的同系物和等位基因变体的核酸分子可通过定位于与多形拟杆菌GAG裂解酶基因相同的染色体或基因座进行分离。

优选的变体包括那些与本文所述的GAG裂解酶活性相关的变体。

多形拟杆菌GAG裂解酶的等位基因变体包括功能性和非功能性蛋白质两者。功能性等位基因变体是维持一种或多种GAG裂解酶活性的群体中的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的天然氨基酸序列变体。功能性等位基因变体通常仅包含SEQ ID NO：2、6、29或37的一个或多个氨基酸的保守取代，或者包含该蛋白质的非关键区域内非关键残基的取代、缺失或插入。功能性变体的实例包括本文所述的M17、Q26、Q23、K169和D20变体(即分别是SEQ ID NOs：4、23、8、10和39)，以及GAG裂解酶III的Q23变体(SEQ ID NO：34)。非功能性等位基因变体是不具有一个和多个本文所述的GAG裂解酶活性的群体中的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的5个天然氨基酸序列。非功能性等位基因变体通常包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：37的氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入，或未成熟的截短，或者包含该蛋白质的关键残基或者关键区域中的取代、插入、或缺失。

而且，本发明包括编码其它多形拟杆菌GAG裂解酶家族成员的核酸分子，并且，其因此其有不同于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：29或SEQID NO：37的多形拟杆菌GAG裂解酶序列。

分离的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽

另一个方面，本发明的特征在于分离的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质及其片段，例如其生物活性部分。可使用标准蛋白质纯化技术从细胞或组织来源分离多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。可通过重组DNA技术或化学合成来产生多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质及其片段。

本发明的多肽包括那些产生自多重基因的存在、选择性转录事件、选择性RNA剪接事件和选择性翻译和翻译后事件的那些多肽。多肽可在系统中表达，例如培养的细胞，其导致基本上与当该表达的多肽在天然细胞中表达时具有的相同的翻译后修饰；或者多肽在导致翻译后修饰的改变或省略的系统中表达，例如当在天然细胞中表达时存在的糖基化或切割。

在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶多肽具有一种或多种以下特征：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键；(3)调节，例如增加或降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性；以及(4)降低或消除血管生成。

在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶I，并且多形拟杆菌GAG裂解酶I具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割一种或多种硫酸化糖醛酸的糖苷键，例如2-O糖醛酸；切割一种或多种涉及硫酸化的氨基己糖的糖苷键，例如6-O-硫酸酯和/或N-磺胺；(3)降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如与参考标准比较时，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，维持当抗IIa活性时，抗Xa活性降低。在其它的实施方案中，同时降低抗Xa活性和抗IIa活性。

在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶II，并且多形拟杆菌GAG裂解酶II具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，如切割一种或多种硫酸化的和未硫酸化的糖醛酸的糖苷键；(3)增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如与参考标准比较时，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当降低抗IIa活性时，维持或增加抗Xa活性。在其它的实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。

在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶III，并且多形拟杆菌GAG裂解酶III具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割硫酸化的氨基己糖(例如N-硫酸化的和/或6-O硫酸化的)或未硫酸化的、但乙酰化的氨基己糖(例如HNAc)和硫酸化的糖醛酸例如2-O硫酸化的糖醛酸或者未硫酸化的糖醛酸之间的一种或多种糖苷键；(3)降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如与参考标准比较时，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其它的实施方案中，同时降低抗Xa活性和抗IIa活性。

在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶IV，并且多形拟杆菌GAG裂解酶IV具有一种或多种以下活性：(1)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割低至中等硫酸化密度的一种或多种糖苷键，特别是涉及2-O硫酸化的糖醛酸和邻近的乙酰化葡糖胺的键(在大多数天然存在的肝素和/或硫酸乙酰肝素制品中不经常发现)；(3)增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如与参考标准比较时，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或降低抗IIa活性时，增加抗Xa活性。在其它的实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。

在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其片段不同于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39中的相应序列。在一个实施方案中，其至少有一个氨基酸不同，但不同的氨基酸不多于15、10或5个。在另一个实施方案中，其与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的相应序列至少有一个氨基酸不同，但不同的氨基酸不多于其残基的20％、15％、10％或5％(如果此比较需要比对，应当针对最大同源性比对该序列。认为来自缺失或插入或错配的“成环”序列是不同的)。所述不同优选是在非必需残基或者保守取代处的不同或变化。

其他实施方案包括在氨基酸序列中含有一种或多种变化的蛋白质，例如在对活性不是必须的氨基酸残基中的变化。这样的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质在氨基酸序列上不同于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39，但保留了生物活性。

在一个实施方案中，该蛋白质包括与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高同源性的氨基酸序列。

其中该蛋白质的区域被删除的生物活性部分可通过重组技术制备，并评估其天然多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的一种或多种功能性活性。

在优选地实施方案中，该多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质具有SEQ IDNO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列。在其他的实施方案中，该多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39基本上相同。仍然在另一个实施方案中，该多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39基本上相同，并且保留了如在上文的部分中详细描述的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的蛋白质的功能性活性。

另一方面，本发明提供了多形拟杆菌GAG裂解酶嵌合或融合蛋白质。如本文所用的，多形拟杆菌GAG裂解酶“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”包括连接与非多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽。“非多形拟杆菌GAG裂解酶多肽”指具有具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列对应于基本上不与多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质同源的蛋白质，例如不同于多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质并且来自相同或不同的生命体的蛋白质。所述融合蛋白质的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽相当于多形拟杆菌GAG裂解酶氨基酸序列的全部或一部分，例如本文描述的片段。在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶融合蛋白质包括多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的至少一个(或两个)生物活性部分。所述非多形拟杆菌GAG裂解酶多肽可与所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的N末端或C末端融合。

该融合蛋白质包括对配体具有高亲和力的部分。例如，该融合蛋白质是GST-多形拟杆菌GAG裂解酶融合蛋白质，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶序列融合到GST序列的C末端。这样的融合蛋白质有助于重组多形拟杆菌GAG裂解酶的纯化。可选地，该融合蛋白质是在其N末端含有异源信号序列的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可通过使用异源信号序列来提高多形拟杆菌GAG裂解酶的表达和/或分泌。而且，本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶-融合蛋白质可用作免疫原以在受试者中生产抗多形拟杆菌GAG裂解酶抗体，从而纯化多形拟杆菌GAG裂解酶配体，并在筛选分析中鉴定抑制多形拟杆菌GAG裂解酶与多形拟杆菌GAG裂解酶底物相互作用的分子。

表达载体可购买获得的，并且已经编码融合部分(例如GST多肽)。可以将编码多形拟杆菌GAG裂解酶的核酸克隆入这样的表达载体，使得该融合部分框内连接至多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。

在另一方面，本发明的特征也在于多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的变体，例如其可作为拮抗剂(模拟物)发挥作用的突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的变体可通过诱变产生，例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的序列或平截的不连续点突变、插入或缺失。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的拮抗剂基本上保留多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的天然存在形式的相同的或其中部分的生物活性。

多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的变体可通过以拮抗剂活性筛选突变体例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的截断突变体的组合物文库来鉴定。多形拟杆菌GAG裂解酶I的突变体包括SEQ ID NO：4所示的M17突变体和SEQ IDNO：23所示的Q26突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶II的突变体包括SEQ IDNO：8所示的Q23突变体和SEQ ID NO：10所示的K169突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶III的突变体包括SEQ ID NO：34所示的Q23突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶III的突变体包括SEQ ID NO：39所示的D20突变体。

多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白编码序列的片段例如N末端、C末端或内部片段的文库可用于产生片段的多种群体，用于筛选和随后选择多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的变体。特别优选其中添加或删除半胱氨酸残基，或者添加或删除被糖基化的残基的变体。

用于筛选通过点突变或平截产生的组合物文库的基因产物，和用于筛选具有选择的特性的基因产物的cDNA文库的方法在本领域中是已知的。这些方法适于快速筛选通过多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的组合诱变产生的基因文库。递归式整体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)，是一种增强文库中功能性突变频率的新技术，其可用于与该筛选分析组合使用，来鉴定多形拟杆菌GAG裂解酶变体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USAS9：7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6：327-331)。

可开发基于细胞的分析试验以分析多种多形拟杆菌GAG裂解酶文库。例如，可将表达载体的文库转染到细胞系中，例如通常以底物依赖模式响应多形拟杆菌GAG裂解酶的细胞系。随后，将该转染的细胞与多形拟杆菌GAG裂解酶接触，可通过例如测量肝素或硫酸乙酰肝素的切割来检测该突变体的表达对多形拟杆菌GAG裂解酶底物的作用。其后从细胞中回收质粒DNA，所述细胞对抑制评分或可选地增强多形拟杆菌GAG裂解酶底物的信号，其后进一步表征这些个别的克隆。

在另一个方面，本发明的特征在于制备天然存在的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的片段或类似物的方法。该方法包括：例如通过一个或多个残基的取代或删除，来改变多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的序列，例如改变本文描述的非保守区域的序列、或结构域或残基，并且测试该改变的多肽的所需活性，例如上文所述的活性。

重组表达载体、宿主细胞和遗传改造的细胞

在另一发明，本发明包括载体，优选表达载体，其包含编码本文所述多肽的核酸。如本文所用的，术语“载体”指能够运输其连接的另一个核酸的核酸分子，其包括质粒、粘粒或病毒载体。该载体能够自主复制或其能整合到宿主DNA中。病毒载体包括，例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(adeno-associated viruses)。

载体可以包括具有适于在宿主细胞中表达的核酸形式的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸。优选，该重组表达载体包括有效连接至待表达的核酸分子的一种或多种调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷化信号)。调控序列包括那些指导核酸序列组成性表达序列，以及组织特异性调控和/或诱导的序列。表达载体的设计依赖如待转染宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等这类因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞，从而生产蛋白质或多肽，其中包括由本文描述的核酸编码的融合蛋白质或多肽(例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质、多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的突变体形式、融合蛋白质等)。

设计本发明的重组表达载体用于在原核或真核细胞中表达多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。例如，本发明的多肽可在大肠杆菌、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。适宜的宿主细胞进一步在Goeddel，(1990)Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA中讨论。可选地，该重组表达载体可在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

在原核生物中的蛋白质表达最经常在大肠杆菌中使用载体进行，所述载体包含指导融合或非融合蛋白质表达的组成性或诱导性启动子。融合载体将一定数量的氨基酸添加到其所编码的蛋白质中，通常是加入到重组蛋白质的氨基末端。这样的融合载体通常具有三个目的：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加该重组蛋白质的可溶性；以及3)通过作为亲和纯化中的配体来协助该重组蛋白质的纯化。常常将蛋白质水解切割位点引入至该融合部分和该重组蛋白质的结合处，以能够在纯化该融合蛋白质后，从该融合部分分离该重组蛋白质。这些酶类以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白质或蛋白质A融合至靶重组蛋白质上。

纯化的融合蛋白质可用于多形拟杆菌GAG裂解酶活性分析中(例如下文更详细描述的直接分析或竞争性分析)，或者用来产生多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质特异性的抗体。在优选地实施方案中，在本发明的逆转录病毒表达载体中表达的融合蛋白质可用于感染其后被移植到受辐射处理的受体中的骨髓细胞。在经过足够的时间(例如6周)后，检查该受试者受体的病理学。

使重组蛋白在大肠杆菌中表达最大化是在以蛋白水解方式切割该重组蛋白质的能力受损的宿主细菌中表达该蛋白质(Gottesman，S.，(1990)GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California 119-128)。另一种策略是改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的个别密码子是在大肠杆菌中优先使用的密码子(Wada etal，(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明的核酸序列的此类改变可通过标准的DNA合成技术来进行。

所述多形拟杆菌GAG裂解酶表达载体可以是酵母表达载体、在昆虫细胞表达的载体例如杆状病毒表达载体，或适于在哺乳动物细胞中表达的载体。

当用于哺乳动物细胞中时，可通过病毒调控元件提供该表达载体的控制功能。例如，常用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40(Simian Virus 40)。

在另一个实施方案中，该启动子是可诱导的启动子，例如被甾类激素、多肽激素(例如，通过信号转导通路的方式)、或异源多肽(例如四环素-诱导系统、″Tet-On″和″Tet-Off′；参见例如Clontech Inc.，CA，Gossen and Bujard(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA 89：5547和Paillard(1989)Human Gene Therapy 9：983)调控的启动子。

仍然在另一个实施方案中，该重组哺乳动物表达载体能够指导该核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，组织特异性调控元件用于表达该核酸)。适宜的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异的性；Pinkert et al.(1987)Genes Dev.1：268-277)、淋巴特异性的启动子(Calame andEaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)、特别是T细胞受体启动子(Winoto andBaltimore(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji et al.(1983)Cell 33：729-740；Queen and Baltimore(1983)Cell 33：741-748)、神经元特异性的启动子(例如，神经纤维启动子；Queen and Baltimore(1983)Cell 33：741-748)、胰脏特异性的启动子(Edlund et al.(1985)Science 230：912-916)和乳腺特异性的启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。

也包括发育调控的启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel and Grass(1990)Science 249：374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes andTilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。

本发明还提供了包含以反义方向克隆入表达载体中的本发明的DNA分子的重组表达载体。可选择有效连接至在反义方向上所克隆的核酸的调控序列(例如，病毒启动子和/或增强子)，所述调控序列在多种细胞类型中指导反义RNA的组成型、组织特异型或细胞类型特异性表达。该反义表达载体可以是重组质粒、噬菌体或衰减的病毒的形式。

本发明另一方面提供了包括本文描述的核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子例如在重组表达载体中的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子或包含使其同源重组到宿主细胞基因组的特定位点上的序列的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可交换使用。这些术语不仅仅指特定的目标细胞(subject cell)，也指这种细胞的后代或潜在的后代。因为某些修饰源于突变或环境影响而发生在后代中，这样的后代事实上与亲代细胞不同，但仍然包括在本文所用术语的范围内。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质可在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

载体DNA可通过传统的转化或转染技术而引入宿主细胞中。如本文所用的，术语“转化”和“转染”意在指用于将外来核酸(例如DNA)引入宿主细胞中的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质体转染或电穿孔。

本发明的宿主细胞可用于生产(即表达)多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞生产多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基内培养本发明的宿主细胞(向其内引入编码多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的重组表达载体)，从而生产多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。在另一个实施方案中，该方法还包括从培养基或者宿主细胞中分离多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。

在另一方面，本发明的特征在于包括多形拟杆菌GAG裂解酶转基因或另外错误表达多形拟杆菌GAG裂解酶的细胞或细胞的纯化制品。该细胞制品由人类或非人类细胞组成的，例如啮齿类动物细胞例如小鼠或大鼠细胞、兔细胞或猪细胞。在优选地实施方案中，该细胞包括多形拟杆菌GAG裂解酶转基因，例如多形拟杆菌GAG裂解酶的异源形式，例如来自人的基因(在非人类细胞的情况下)。该多形拟杆菌GAG裂解酶转基因可被错误表达，例如过量表达或表达不足。在其他优选的实施方案中，该细胞包括错误表达内源多形拟杆菌GAG裂解酶的基因，例如其表达被破坏的基因，例如敲除。这些细胞可作为用于研究与突变的或错误表达的多形拟杆菌GAG裂解酶等位基因相关的疾病或用于药物筛选的模型。

在另一方面，本发明的特征在于人类细胞，例如用编码受试者多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的核酸转化的造血干细胞。

也提供了细胞，在该细胞中，多形拟杆菌GAG裂解酶受控于调控序列的细胞，所述调控序列通常不控制内源多形拟杆菌GAG裂解酶基因的表达。在细胞例如细胞系或微生物中的内源基因的表达特征可通过将外源DNA调控元件插入到细胞的基因组中而得以修饰，从而所插入的调控元件有效地连接至内源多形拟杆菌GAG裂解酶基因上。例如，“转录沉默”的内源多形拟杆菌GAG裂解酶基因(例如不正常表达或只以很低水平表达)，可通过插入控元件而被活化，所述调控元件能够启动在此细胞中正常表达的基因产物的表达。例如靶向同源重组的技术可用于插入例如在Chappel，US 5,272,071；WO 91/06667，published in May 16，1991中描述的异源DNA。

应用

如本文所述的，本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶分子对许多应用是有用的，包括但不局限于：1)根据化学组合物(二、三、四、五、六、八和/或十寡糖)表征GAG，例如肝素和硫酸乙酰肝素(以及在某种程度上的硫酸软骨髓和硫酸皮肤素)；2)表征GAG的药用剂型，例如肝素或硫酸乙酰肝素(以及在一定程度上的硫酸软骨髓和硫酸皮肤素)的剂型；3)将GAG，例如肝素和硫酸乙酰肝素(以及在某种程度上的硫酸软骨髓和硫酸皮肤素)分级为其化学组成以及限定长度的更小片段、序列和潜在的生物活性；4)体外中和肝素或硫酸乙酰肝素的抗凝血活性(抗Xa)；5)体外调节抗血栓形成活性(抗IIa)；6)鉴定样品中具体的GAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的存在和纯度；7)测定样品中中GAG的组合物；8)测定具体的肝素或硫酸乙酰肝素中的二、四、六、八和十糖单位的序列；9)用作附加的分析工具用于使用例如质谱、NMR谱、凝胶电泳、毛细管电泳、HPLC和离子配对HPLC的技术的化学分析；10)用于切割包括至少两个二糖单位具体的GAG，例如肝素或硫酸乙酰肝素；11)用于抑制血管生成，例如通过对需要此的受试者施用有效量的包含多形拟杆菌GAG裂解酶分子的组合物(例如药学组合物)；12)用于治疗癌症，其通过对受试者施用包含多形拟杆菌GAG裂解酶分子的组合物(例如药学组合物)；13)抑制细胞增殖，其通过对需要此的受试者施用有效量的包含多形拟杆菌GAG裂解酶分子的组合物(例如药学组合物)用来抑制细胞增殖；14)用来离体中和之前被施用至受试者用于抑制凝血的肝素或乙酰肝素的制品(如呀用制品)的扛过Xa活性；15)通过施用于需要这种中和的受试者，用于体内中和肝素或硫酸乙酰肝素的制品(例如药学制品)的抗Xa活性(例如之前被施用了肝素或硫酸乙酰肝素的药学制品的受试者)；16)用于离体中和肝素或硫酸乙酰肝素的制品(例如药学制品)的抗IIa活性，所述制品之前被施用于受试者用于抑制血栓形成；或17)通过施用于需要这种中和的受试者，用于体内中和肝素或硫酸乙酰肝素的制品(例如药学制品)的抗IIa活性(例如之前被施用了肝素或硫酸乙酰肝素的药学制品的受试者)。

GAG的表征和测序

本文描述的方法可用于，例如分析聚糖，例如GAG(例如多糖的混合群体)，例如以通过将该多糖与多形拟杆菌GAG裂解酶分子接触来鉴定多糖(例如多糖的混合群体)的结构特征和/或活性。如本文所用的，结构特征指关于例如多糖的单或二糖构建组块(building blocks)的同一性和数量的信息；关于理化特性的信息，例如总电荷(也称为“净电荷”或“总电荷”)、电荷密度、分子大小、荷质比和艾杜糖醛酸和/或糖醛酸含量以及单和二糖构建组块间的关系，以及特别是与这些构建组块相关的活性位点。该结构特征可通过确定一个和多个初级产量来提供，其中包括：一种或多种组成性的糖或二糖的存在或量，如本文所用的“组成性的糖”指构成多糖的糖，组成性的糖包括单糖、二糖、三糖等，也包括通常天然发现的糖，以及非天然的糖和修饰的糖，例如由于生产、加工和/或纯化产生的糖；一种或多种组块成(block component)分的存在或量，其中“组块成分”由多于一种的糖或聚糖构成；以及一种或多种修饰的糖的存在或量，其中修饰的糖是存在与用于产生制品的起始材料中，但其在该制品的产生中被改变，例如由切割而修饰的糖。关于多糖的“序列”指共价连接的组成性糖的线形排列，并可通过本领域已知的方法确定，例如在本文中和在以下公开的方法：PCT公开号WO 00/65521、WO 02/23190和WO 04/055491；美国公开号20030191587和20040197933、Venkataraman(1999)；Shriver et al.(2000a)；Shriver et al.(2000b)和Reiser et al.(2001)；其全部教导通过引用并入本文。“活性位点的定位”指某一组成性多糖和给定活性之间的相关性。

在一个实施方案中，本发明提供了通过评估与本文所述结构特征类型(structural signature species)相关的一个和多个参数来评估多糖混合物的方法，例如HLGAG的异源群体。这些参数包括本文公开的结构特征的存在、大小分布和数量。该结构特征可以是以下中的一种和几种：

二糖1

二糖2

二糖3

四糖1

三糖1

ΔUA-GlcNac-GlcA-GlcNS(3S)或ΔIIA-IVs_glu

ΔUA-GlcNac-GlcA-GlcNS(3，6S)或ΔIIA-IVs_glu

在优选的实施方案中，通过选自下组的一种和多种方法确定结构特征：MALDI-MS、ESI-MS、CE、HPLC、FPLC、荧光测定法、ELISA、发色分析例如反向柱色谱(例如HPLC)、比色分析法、NMR和其它光谱技术。

使用一种或多种多形拟杆菌GAG裂解酶分子不完全或完全消化多糖组合物。可使用一种或多种HLGAG降解酶进一步消化该组合物。其它HLGAG降解酶的实例包括：肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、肝素酶IV、乙酰肝素酶、D-葡糖醛酸糖苷酶、L-艾杜糖醛酸酶及其功能性活性变体和片段。多种HLGAG降解酶及其变体和片段是已知的，并描述于美国专利号5,569,600、5,389,539、5,830,726、5,714376、5,919,693、5,681,733和6,869,789，以及美国专利公开号20030099628、20030303301和20010565375中，其内容通过引用并入本文。

本文所述的方法还包括：通过将一组多糖(例如多糖的异源群体)与一种或多种多形拟杆菌GAG裂解酶分子接触来提供或确定第一结构特征；通过将一组不同的多糖(例如多糖的异源群体)与一种或多种多形拟杆菌GAG裂解酶分子接触来提供或确定该多糖的第二结构特征；并且比较第一和第二结构测定结果以确定一组或多组是否具有与具体特性相关的结构测定。该方法还包括依据其结构测定选择或丢弃一组多糖。

在其它实施方案中，通过将多糖的一种或多种结构特征与比较参考标准进行比较来来分析一组多糖(例如多糖的异源群体)，所述结果结构特征是通过将该多糖与一种或多种多形拟杆菌GAG裂解酶分子接触而获得的。该参考标准是，例如出现在多糖的混合群体中的结构特征的预选的范围或水平和/或是否存在，例如多糖的市售群体，例如依诺肝素(Lovenox^TM)、达肝素(Fragmin^TM)、舍托肝素(Sandobarin^TM)、阿地肝素(Normiflo^TM)、那屈肝素(Fraxiparine^TM)、帕肝素(Fluxum^TM)、瑞肝素(Clivarin^TM)、亭扎肝素(Innohep^TM或Logiparin^TM)，或磺达肝癸钠(Arixtra^TM)，其已用一种或多种多形拟杆菌GAG裂解酶分子消化。

多形拟杆菌GAG裂解酶分子也可通过分析与一种或多种多形拟杆菌GAG裂解酶分子接触的组合物以及确定该混合物中的一种或多种成分的生物等效性(bioequivalence)和/或生物利用率，来确定用于药物的参考标准。如本文所用的，“生物等效性”表示“当在相似的条件下以相同的摩尔剂量施用时，药学等效物和药学替代物的活性成分或活性部分在药物作用位点有效的比率和程度缺少显著差异。”

分级HLGAG制品的产生

本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶分子可用于产生多糖(例如分级的肝素或硫酸乙酰肝素)，其具有例如需要的特性，例如需要的活性和/或降低的不需要的特性，例如不需要的副作用。如本文所用的，“需要的活性”指对给定的征候(given indications)有益的那些活性，例如特别是如本文定义的阳性患者反应。“不需要的活性”包括对给定的征候无益的那些活性，例如特别是如本文定义的阴性患者反应。给定的活性可以是对某一征候的需要的活性，和对另一征候的不需要的活性，例如抗IIa活性，其当对某些征候不需要时，对其它征候是需要的，特别是急性或外伤的情况下。因此，本发明涉及设计具有理想的产物特征(product profiles)的肝素、LMWH或合成的肝素的方法，所述产物特征包括但不局限于如下特征：如高活性，例如高抗Xa和/或抗IIa活性；降低的活性，例如降低的抗Xa和/或抗IIa活性；良好表征的、中和的、较低的副作用，包括降低的HTT、优秀的药代动力学和/或降低的PF4结合。

可设计分级的肝素，例如通过将包括混合的多糖群体的组合物与多形拟杆菌GAG裂解酶接触来设计，所述多糖为例如粘多糖(GAG)、HLGAG、UFH、FH、LMWH或合成的肝素(包括但不局限于具有依诺肝素(Lovenox^TM)、达肝素(Fragmin^TM)、舍托肝素(Sandobarin^TM)、阿地肝素(Normifio^TM)、那屈肝素(Fraxiparine^TM)、帕肝素(Fluxum^TM)、瑞肝素(Clivarin^TM)、亭扎肝素(Innohep^TM或Logiparin^TM)，或磺达肝癸钠(Arixtra^TM))。

在一些实施方案中，通过将肝素和多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子接触来制备抗Xa和/或抗IIa活性降低的分级的肝素制品。在一些实施方案中，当维持抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其他的实施方案中，同时降低抗Xa和/或抗IIa活性。可使用抗Xa和/或抗IIa活性降低的肝素，例如作为载体以递送试剂，例如诊断性、预防性或治疗性试剂。可将肝素分子连接至该试剂。活性试剂包括治疗性或预防性多肽、核酸、小分子、脂质/糖酯等。在一个实施方案中，该活性试剂是选自下组的治疗性多肽：胰岛素、胰岛素原、人生长激素、干扰素、α-1蛋白酶抑制因子、碱性磷酸酶、血管生成素、囊性纤维化跨膜转导调节因子、胞外超氧化物歧化酶、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、谷氨酰胺脱羧酶、人血清白蛋白、髓鞘碱性蛋白、可溶性CD4、乳铁蛋白(lactoferrin)、乳球蛋白、溶菌酶、乳清蛋白、促红细胞生成素、组织纤溶酶原激活剂、抗凝血酶III、催乳素、α-1抗胰蛋白酶。治疗性或预防性多肽可以是这些多肽的活性衍生物或片段。活性试剂也可以是，但不局限于以下中的一种和多种：甲状旁腺激素及其衍生物和片段、促红细胞生成素、倍他依泊汀、基因活化的促红细胞生成素、第二代EPO、新型红细胞生成刺激蛋白、赖脯胰岛素、胰岛素(牛)、胰岛素、精氨酸胰岛素、胰岛素类似物、降钙素、黑色素瘤疫苗(Theraccine)、贝卡普勒明(重组人血小板衍生生长因子BB)、曲弗明、人生长激素释放因子、BMP-7、PEG天冬酰胺酶、阿法链道酶、阿糖脑苷酶、半乳糖苷酶β、阿法链道酶、半乳糖苷酶α、链激酶、替特普酶(teneteplase)、瑞替普酶(reteplase)、阿替普酶(alteplase)、帕米普酶(pamiteplase)、RH因子VIII、RH FVIIa、因子IX(人)、因子IX(复合物)、HGH、人蛋氨生长素/促生长素、抗-CD33-加里刹霉素(calicheamicin)偶联物、依决洛单抗(Edrecolomab)、rituxumab、赛尼哌(daclizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、硫索单抗(sulesomab)、阿昔单抗(abciximab)、因福利美(infliximab)、莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)、帕利珠单抗(palivizumab)、阿来组单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、硫索单抗(sulesomab)、帕利珠单抗(palivizumab)、白细胞介素-2(interleukin-2)、西莫白介素(celmoleukin，rIL-2)、复合干扰素-1(interferon alfacon-1)、干扰素α、干扰素α+病毒唑、猪干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-3n、干扰素β-1a、干扰素β、干扰素β1b、干扰素γ、干扰素γ-1b、非格司亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)、来格司亭(lenograstim)、莫拉司亭(molgramostim)、米立司亭(mirimostim)、那托司亭(nartograstim)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、肽酪氨酸-酪氨酸(peptide tyrosin-tyrosin，PYY)、载脂蛋白A-IV、瘦体素(leptin)、黑色素皮质素(melanocortin)、胰淀素(amylin)、、食欲素(orexin)、脂联素(adiponectin)和饥饿素(ghrelin)。在一个实施方案中，活性试剂是活性多肽，例如治疗性或预防性多肽，和具有小于150kDa，更优选地小于100kDa，并且更优选小于50kDa的分子量的多肽。在一个实施方案中，活性试剂是活性多肽，例如治疗性或预防性多肽，和具有分子量为大约500Da-5kDa、5-10kDa、10-30kDa、18-35kDa、30-50kDa、50-100kDa、100-150kDa的多肽。在一个实施方案中，活性多肽是胰岛素或其活性片段或衍生物。在另一个实施方案中，该活性多肽是人生长激素或者其活性片段或衍生物。在另一个实施方案中，该多肽是干扰素。在其他的实施方案在中，肝素分子与非活性试剂相连接。非活性试剂的实例包括生物探针或用于成像的对照试剂。在另一个实施方案中，该活性试剂可以是小分子药物，例如现在可用于治疗性、诊断性或预防性用途的小分子药物，或者在开发中的药物。在一些实施方案中，活性试剂与制品中的一种或多种肝素分子相连接。作为实例，小分子药物和基于蛋白质的药物可以通过已知的化学方法(例如EDC、CNBKt/DMSO/乙酸等等)连接至用于递送的肝素分子。

本发明也涉及具有抗Xa和/或抗IIa活性提高的分级的肝素制品，其通过将肝素与多形拟杆菌GAG裂解酶II和/或多形拟杆菌GAG裂解酶IV分子接触来制备。这样的制品可用于，例如治疗或预防与凝血相关的疾病，例如血栓形成、心血管疾病、血管疾病或心房纤维性颤动；偏头痛、动脉硬化症；炎性疾病，例如自身免疫性疾病或特应性疾病；肥胖病或脂肪过多，过敏症；呼吸系统疾病，例如哮喘、肺气肿、急性活性窘迫综合征(adult respiratory distress，ARDS)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、或肺再灌注损伤(lung reperfusion injury)；癌症或转移性疾病，例如脂肪瘤(lipomas)；糖尿病；血管生成性疾病，例如眼睛的新生血管疾病、骨质疏松症、牛皮癣、关节炎、阿尔茨海默症，将要、正在或已经经受手术程序、器官移植、整形外科、骨折治疗的病症，例如臀部骨折、臀部替换、膝盖替换、经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)、支架替换(stent placement)、血管生成术、冠状动脉旁路移植手术(CABG)。

药学组合物

通过多形拟杆菌GAG裂解酶分子切割而制备的多形拟杆菌GAG裂解酶分子以及肝素分子可并入药用组合物中。这样的组合物通常包括药用可接受载体。如本文所用的词语“药用可接受载体”包括与药学施用相适应溶剂、分散介质、涂层(coating)、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。补充的活性化合物也可并入该组合物中。

配置药用组合物。使其与规定的施用途径相适应。施用途径的实例包括胃肠道外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直肠施用。胃肠道外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、固定的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗细菌剂例如苯甲醇甲基安息香酸酚酯(methyl parabens)；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合试剂例如乙二胺四乙酸；缓冲液例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用来调节毒性的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠道外制品包装入由玻璃或塑料制成的安培瓶、一次性注射器或多剂量瓶。

可选地，该药学组合物可用于在将样品(例如生物反应器中的血液，例如对血液去肝素化)引入受试者前处理该样品。

适用于注射用途的药学组合物包括无菌的水溶液(其中是水溶性的)或分散液，以及用于及时制备无菌的注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且流动性应当达到易于注射的程度。其应当在生产和储存条件下稳定，并且受到保护而免疫微生物例如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和流体聚乙二醇(liquid polyethylene glycol)等等)，以及其适宜的混合物。可维持合适的流动性，例如通过使用涂层，例如蛋黄素，通过在分散剂的情况下维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活化剂。阻止微生物的作用可通过多种抗细菌和抗真菌试剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类(parabens)、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选地在组合物中包括等渗试剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在该组合物中包括延缓吸收的试剂例如硬脂酸铝和明胶来产生。

无菌的注射用溶液可通过下述方法制备：将在合适的溶剂中的所需量的活性化合物与上述列举成分的一种或组合合并，如果需要，随后过滤灭菌。通常，通过将所述活性化合物并入灭菌的载体来制备分散剂，所述载体包含基本分散介质和来自上述列举的成分的所需其它成分。在用于制备无菌的注射溶液的无菌粉末情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，可得到所述活性组合物粉末外加来自其上述灭菌过滤溶液的任何所需成分。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。为了口服治疗性施用，活性化合物可与赋形剂合并，并以药片、锭剂(troches)或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。也可施用流体性载体制备口服组合物用作漱口剂。药用相容性结合试剂，和/或佐剂材料可作为该组合物的一部分包括在内。所述药片、药丸、胶囊、锭剂等可包含任何以下成分，或具有相似性质的化合物：结合剂，例如微晶纤维素、黄芪胶(gum tragacanth)或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者增味剂，例如薄荷油(peppermint)、甲基水杨酸或橙味香精(orange flavouring)。

对于吸入施用，该化合物可以以气雾剂喷雾(aerosol spray)的形式从受压容器或分散器(其含有适宜的推进物例如气体例如二氧化碳)或喷雾器中递送。

全身施用也可通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用，在该制品中使用适于待穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂是本领域已知的，并且包括例如，用于透粘膜施用的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物(fusidic acidderivative)。可通过施用鼻喷雾或栓剂来完成透粘膜施用。对于透皮施用，将活性化合物配制成本领域众所周知的药膏(ointments)、油膏(salves)、凝胶(gels)或乳剂(creams)。

化合物也可配制成用于直肠递送的栓剂(例如与常规的栓剂基质，例如可可油和其它甘油酯)或保留灌肠剂(retention enema)。

在一个实施方案中，将活性化合物与载体一起制备，所述载体可以保护该化合物免受身体的快速排除，例如控制释放的制品，其中包括植入物(implants)和微胶囊化的递送系统。可使用生物可降解的、生物相容性的多聚体，例如乙烯醋酸乙酯、聚酸酐(polyanhydrides)、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。制备这类制品的方法对本领域技术人员是显而易见的。该材料也可从Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals，Inc购买获得。脂质体悬浮液(包括以病毒抗原的单克隆抗体靶向感染的细胞的脂质体)可用作药学可接受载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如美国专利号4,522,811所述的。

以剂量单位(dosage unit)形式制成口服或胃肠道外组合物对于施用便利和剂型一致是有益的。如本文所使用的，剂量单位形式指适和用作待治疗受试者的单位剂量(unitary dosage)的物理上离散的单位，用于；每单位包含预定量的活性化合物，该量经过计算与所需的药学可接受载体一起产生所需的治疗性作用。

这些化合物的毒性和治疗功效可通过标准的药学程序在细胞培养或实验动物中测定，例如测定LD50(群体中50％致死的剂量)和ED50(群体中50％治疗性有效的剂量)。毒性和治疗性作用之间的剂量比是治疗指数(therapeuticindex)，其可表示为LD50/ED50之比。优选表现出高治疗指数的化合物。当使用表现出毒性副作用的化合物时，应仔细设计递送系统将此类化合物靶向至受影响的组织的位点，以使对非感染细胞的潜在损伤最小化，并因此降低副作用。

从细胞培养分析和动物研究中得到的数据可用于配置用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有很少或者没有毒性的ED50。该剂量依赖于所应用的制品剂量形式和所用的施用途径而可在此范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，该治疗性有效剂量可最初根据细胞培养分析进行评估。可在动物模型中配制品量，以达到循环血浆浓度范围，包括在细胞培养物种测定的IC50(即，达到最大症状抑制一半的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更精确地测定在人体中的有用剂量。在血浆中的水平可通过例如高效液相色谱来测量。

本领域熟练的技术人员应当认识到，某些因素可以影响到有效治疗受试者所需的剂量和定时，包括但不局限于疾病或病症的严重程度、之前的治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄、以及患有的其他疾病。

药学组合物可与施用说明书一起包括于容器、包装或分配器中。

治疗应用

多形拟杆菌GAG裂解酶分子可作为新型诊断和治疗剂，用于控制一种或多种细胞增殖和/或分化疾病，例如通过阻止或抑制那些或者表现出不需要的增值和/或分化或者与不需要的增值和/或分化相关的细胞的血管新生。细胞和/或分化疾病的实例包括：糖尿病；关节炎，例如风湿性关节炎；眼病，例如眼部新血管生成，糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼、视网膜纤维增生、葡萄膜炎、与新血管生成相关的眼病；以及癌症，例如恶性肿瘤、肉瘤、转移性疾病或造血瘤疾病，例如白血病。

如本文所用的术语“癌症”、“过度增值性”和“肿瘤性(neoplastic)”指具有自主生长能力的细胞。这样的细胞的实例包括具有以快速增殖性细胞生长为特征的异常状态或病症(condition)的细胞。过度增殖和肿瘤性疾病状态可归类为病理性的，即表征或构成一种疾病状态，或可被归类为非病理性的，即与正常状态存在偏差但不与疾病状态相关。该术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌性过程，转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论侵入的组织病理学类型或时期如何。“病理性过度增殖性”细胞存在于以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态中。非病理性增殖性细胞的实例包括与创伤修复相关的细胞的增值。

术语“癌症”或“肿瘤”包括多种器官系统的恶性肿瘤，例如侵袭肺、乳腺、淋巴、胃肠和泌尿生殖道，以及腺癌，其包括恶性肿瘤，例如大部分的结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺非小细胞癌、小肠癌和食道癌。

术语“癌”是本领域公认的，并指上皮或内分泌组织的恶性肿癌，包括呼吸系统癌、胃肠道系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。癌的实例包括形成自子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢的组织的那些癌。该术语也包括癌肉瘤(carcinosarcomas)，例如由癌和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺瘤”指衍生自腺体组织的癌或其中的肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。

术语“肉瘤(sarcoma)”是本领域公认的，指间充质衍生的恶性肿瘤。

增值性疾病的其它实例包括造血瘤性疾病(hematopoietic neoplasticdisorder)。如本文所用的，术语“造血瘤性疾病”包括涉及造血起源的增生性/瘤性细胞的疾病。造血瘤性疾病可产生自骨髓、淋巴或红细胞系(lineages)，或者其前体细胞(precursor cell)。优选地，该疾病产生自低分化的急性白血病，例如成红细胞性白血病(acute erythblastic leukmia)和急性成巨核细胞性白血病(acute megakaryoblastic leukemia)。其它示例性的骨髓疾病包括，但不局限于急性早幼粒细胞白血病(acute promyeloid leukemia，APML)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)和慢性骨髓性白血病(chronic melogenousleukemia，CML)(在Vaickus，L.(1991)Crit Rev.in OncoL/Hemotol.11：267-97中进行了综述)；淋巴恶性肿瘤包括，但不局限于急性成淋巴细胞性白血病(acutelymphoblastic leukemia，ALL，其包括B细胞系ALL和T细胞系ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、幼淋巴细胞白血病(prolymphocytic leukemia，PLL)、毛发细胞白血病(hairy cell leukemia，HLL)以及华氏巨大球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia，WM)。恶性淋巴瘤的其他形式包括，但不局限于非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成熟T细胞白血病/淋巴瘤(adult T cellleukemia/lymphoma，ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma，CTCL)，大颗粒淋巴细胞白血病(large granular lymphocytic leukemia，LGF)、霍奇金氏病以及Reed-Stemberg病(Reed-Stemberg disease)。从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于配制用于人体的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。该剂量在此范围内依赖于所使用的制品剂量形式和所用的施用途径而变化。对于在本发明中所用的任何化合物，所述治疗上的有效剂量可最初通过细胞培养分析建立。可在动物模型中配制品量以达到包括在细胞培养中确定的IC50(即，所述测试化合物达到半最大综合征抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。此类的信息可用于更精确地确定在人体中有用的剂量。在血浆中的水平可通过例如高效液相色谱来测量。

在另一个实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子，可作为控制肝素相关疾病的预防性或治疗性试剂。此类疾病的实例包括，但不局限于肝素诱导的抗凝血和/或抗血管生成。因此，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子，可在例如手术中或手术后，用于降低或消除(例如中和)肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种抗凝血和/或抗血栓特性。在其它的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子，可用于例如在生物反应器使血液去肝素化，例如在心肺和/或肾脏透析中使用的生物反应器。

本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶分子可用于设计分级的GAG制品，例如肝素和/或硫酸乙酰肝素制品。此类分级的HLGAG制品可具有许多治疗应用。例如，已知HLGAG组合物可用于预防和治疗痴呆例如阿尔茨海默症、凝血、血管生成、血栓疾病、心血管疾病、血管疾病、动脉硬化、呼吸系统疾病、循环性休克和相关疾病，以及抑制癌细胞生长和转移。这些疾病中的每一种在本领域内是熟知的，并且描述于例如Harrison′s Principles of InternalMedicine(McGraw Hill，Inc.，New York)中，其通过引用并入本文。HLGAG组合物在多种治疗方法中的用途描述并总结于Huang，J.and Shimamura，A.，Coagulation Disorders，12，1251-1281(1998)中。

分级HLGAG制品可用于，例如治疗或预防其中需要所具有的活性FGF例如aFGF和/或bFGF增加的疾病。

HLGAG制品用于治疗或预防与凝血相关的疾病。当凝血途径中的失衡转换为过量凝血时，结果是血栓倾向的发展，其经常表现为心脏病、中风、深静脉血栓(deep venous thrombosis)、急性冠状动脉综合征(acute coronarysyndromes，ACS)例如不稳定绞痛和心肌梗塞。如本文所用的，“与凝血相关的疾病”指以局部炎症为特征的疾病，所述炎症由在对组织的血液供应中的中断或降低产生，所述中断或降低作为例如负责向组织供应血液的血管阻塞的结果而发生，例如在心肌或脑侵害或外周血管疾病中见到的，或作为与疾病例如心房颤动或深静脉血栓相关的栓子形成的结果而发生。凝血疾病包括，但不局限于心血管疾病和血管疾病，例如脑缺血。因为肺递送系统的快速吸收和作用，其和多糖一起通过该肺递送用于治疗如心肌梗塞和ACS，。

分级的HLGAG制品可用于治疗心血管疾病。心血管疾病包括，但不局限于急性心肌梗塞、ACS、例如不稳定的绞痛和心房震颤。心肌梗塞是一种疾病状态，其有时由于突然的冠状动脉血流减少而发生，并随即是由之前动脉硬化而变窄的冠状动脉发生血栓闭塞。这样的受损可由以下因素产生或促进：如吸烟、高血压和脂肪堆积。急性绞痛起因于瞬时心肌缺血。该疾病通常与胸骨下的重压(heaviness)、压榨(pressure)、挤压(squeezing)、窒息(smothering)和憋闷(choking)感相关。上述情况通常由于运动(exertion)和情绪造成，但也发生在休息的时候。

心房震颤是心律不齐的常见形式，其通常作为心理压力的结果或者伴随手术、锻炼和急性乙醇中毒而发生。心房震颤的永久形式通常发生在患有心血管疾病的患者中。心房震颤的特征在于紊乱的心肌活动而在表面ECG中不具有分离的P波。该紊乱的活动在心房中导致不适当血流以及导致血栓的形成。这些血栓可发生栓塞，从而导致脑缺血和其它疾病。

正处于手术、麻醉和卧床休息的延长时期或者其它非活动状态下的个体经常易患称为深静脉血栓或DVT的疾病，其是在下肢(lower extremities)和/或骨盆中的静脉血凝结。由于在下肢缺少泵静脉血(静)所需的肌肉活性、局部血管受损或高凝血状态，而导致该凝块发生。如果血液凝块迁移到肺，导致“肺栓塞”或其它对心血管循环的干扰，则该疾病是威胁生命的。治疗的一种方法涉及施用抗凝血剂。

该分级的HLGAG制品可单独用于治疗心血管疾病，或与其它治疗剂组合用于降低心血管疾病的风险或用于治疗心血管疾病。其它治疗剂包括，但不局限于抗炎症剂、抗血栓剂、抗血小板剂、纤维蛋白分解剂、脂质减少剂、直接凝血酶抑制品、抗Xa抑制品、抗Ha抑制品、糖蛋白Ub/IIIa受体抑制品和直接凝血酶抑制品，例如水蛭素、水蛭素原(hirugen)、比伐卢定(Angiomax)、阿加曲班(agatroban)、PPACK、凝血酶适配体。

HLGAG制品也可用于治疗血管疾病。血管疾病包括，但不局限于以下疾病：例如深静脉血栓、外周血管疾病、脑缺血，包括中风和肺栓塞。大脑缺血疾病发作或脑缺血是缺血病(ischemic condition)的一种形式，其中包括对大脑的血液供应被阻挡。所述对大脑的血液供应的中断或降低可由多种原因造成，包括血管自身的内部阻挡或闭塞，闭塞的远端起源、降低的灌注压或增加的血液粘稠度导致的不充分脑血流，或者在蛛网膜下的空间或脑内组织的血管破裂。

HLGAG制品可用于治疗脑缺血。脑缺血可导致瞬时或永久的缺陷，并且在经历脑缺血的患者中的神经损伤的严重程度依赖于缺血时间的强度和持续时间。瞬时缺血发作是一种供向大脑的血流仅仅短暂中断的缺血，并引起暂时的神经缺陷，其通常在24小时内清除。TIA综合征包括面部或肢体的麻木或虚弱、丧失清晰说话和/或理解别人表述的能力、丧失视觉或视觉模糊、以及眩晕感。永久性脑缺血发作也称为中风，是由血栓或栓塞产生的供给大脑的血流更长的中断或降低造成。中风产生神经元的丧失，通常导致神经缺陷，其可得到改善但不能完全解决。

血栓栓塞性中风源于由血栓或栓塞造成的颅外或颅内血管的凝结。因为经常难于分辩中风是否是由血栓或栓塞造成的，术语“血栓栓塞”用于概括由这些机制中任一个造成的中风。

HLGAG例如UFH或LMWH在吸入后的快速吸收在治疗静脉血栓栓塞中是十分有价值的。UFH的静脉内施用与口服华法林(Warfarin)组合已经广泛用于治疗静脉血栓栓塞。然而，由于改善的功效和降低的风险，LMWH日益用作静脉内UFH治疗静脉血栓栓塞的替代品。以及确认肝素治疗的功效有赖于在治疗的第一个24小时内达到的关键治疗水平(例如，抗因子Xa或抗因子IIa活性的值)。肝素颗粒在肺内递送以达到在血栓栓塞的早期阶段的肝素的快速治疗水平，也可以与LMWH或肝素施用的其它途径组合用于延长抗血栓/抗凝血作用，例如口服施用。

HLGAG制品也可用于治疗急性血栓栓塞中风。急性中风是涉及由缺血事件产生的神经受损的医学综合征，其是供给大脑血液的中断或减少。

用于治疗中风的单独HLGAG的有效量制品或与另一种治疗剂的组合的有效量是在体内有效降低由中风产生的大脑损伤的量。大脑受损的降低是任何防止大脑的受损，否则受损将发生在经历血栓栓塞中风而没有本文描述的治疗的受试者体内。几种生理性参数可用于评估大脑受损的降低，包括更小的梗塞尺寸、改善的区域脑血流和降低的颅内压，例如与预治疗的患者参数、未治疗的中风患者和单独用溶解血栓试剂治疗的中风患者相比。

该药学HLGAG制品可单独或预治疗性试剂组合使用，用于治疗与凝血相关的疾病。在治疗与凝血相关的疾病中有用的疗法的实例包括抗凝血剂、抗血小板剂和溶解血栓剂。抗凝血剂防止血液成分的凝结，并从而防止凝块形成。抗凝血剂包括，但不局限于华法林、可迈丁(Coumadin)、双香豆素(dicumarol)、苯丙香豆素(phenprocoumon)、醋硝香豆素(acenocoumarol)、双香豆素乙酯和茚二酮衍生物。“直接血栓抑制品”包括水蛭素、水蛭素原、比伐卢定、阿加曲班、PPACK和凝血酶适配体。抗血小板剂抑制血小板聚集，并经常用于抑制患有瞬时缺血心脏病或中风的患者的栓塞性中风。溶解血栓剂溶解引起血栓栓塞中风的凝块。血栓栓塞剂已经用于治疗急性静脉血栓栓塞和肺栓塞，并且是本领域已知的(例如参见Hennekens et al，J Am Coll Cardiol；v.25(7supp)，p.18S-22S(1995)；Holmes，et al，JAm Coll Cardiol；v.25(7suppl)，p.10S-17SQ995)。

如本文所用的，肺栓塞指与肺动脉的内腔中血凝块的截留相关的疾病，其造成严重的呼吸功能紊乱。肺栓塞经常起源于下肢静脉，其中凝块在大腿深静脉中形成并通过静脉循环转移到肺内。因此，肺栓塞经常以下肢静脉内的深静脉血栓的并发症出现。肺栓塞的症状包括呼吸短促的急性发生、胸痛(呼吸恶化)以及快速的心率和呼吸频率。一些个体可能经历咳血。

HLGAG制品和方法也可用于治理活预防动脉粥样硬化。已发现肝素在多种试验模型中对预防动脉粥样硬化是有益的。由于与血管系统的内皮更直接接近，所以吸入的肝素可用于预防动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是动脉硬化的一种形式，认为是大多数冠状动脉疾病、大动脉瘤和下肢心房疾病的原因，并促成脑血管疾病。

由于其快速吸收和可变的消除速率，具有或不具有赋形剂的HLGAG可用作静脉内肝素的替代物，用于手术和诊断程序。例如，HLGAG颗粒可在手术前通过自愿吸入，或在手术前或手术中的麻醉期间通过气管导管被动吸入。手术患者，特别是年龄超过40岁的患者发展为深静脉血栓的风险增加。因此，设想使用HLGAG颗粒用于预防与手术程序相关的血栓发展。除了一般的手术程序例如经皮介入治疗(例如经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronaryintervention，PCI))、PCTA、支架和其他相似的方法、臀部和膝盖替换、心肺搭桥手术、冠状动脉血管再形成手术、整形外科手术和修复替换手术外，该方法也用于经受组织或气管移植程序或骨折(例如臀部骨折)治疗的受试者。

另外，肝素的肺吸入在治疗呼吸道疾病中有价值，例如囊性纤维化、哮喘、过敏、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺再灌注损伤和肺、肾脏、心脏和肠的缺血-再灌注损伤，以及肺肿瘤生长和转移。

囊性纤维化是影响呼吸系统的慢性进行性疾病。囊性纤维化的一个严重后果是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的肺感染，其本上占囊性纤维化中发病率和致死率的几乎90％。治疗囊性纤维化的疗法包括用于治疗病原体感染的抗菌剂。

肝素也是弹性蛋白酶以及肿瘤生长和迁移的已确定的抑制因子。气雾化的肝素颗粒能够在急性肺气肿模型中抑制弹性蛋白酶诱导的肺损伤。哮喘是一种呼吸系统疾病，其特征在于炎症、气道狭窄和气道对吸入试剂的增高反应性。哮喘虽不专一地，但经常与遗传性过敏或过敏性综合症相关。哮喘也包括运动性哮喘、响应支气管刺激的支气管收缩、延时型超敏性、自身免疫脑脊髓炎和相关的疾病。过敏通常由针对过敏原的IgE抗体的产生而引起。肺气肿是位于具有已破坏的肺泡隔的末端细支气管的末梢处空气的膨胀。肺气肿产生自弹性蛋白酶诱导的肺损伤。肝素能够抑制这种弹性蛋白酶诱导的损伤。急性呼吸急促综合征包括不同形态的许多急性排除渗透性肺伤害，其伴随严重的动脉血氧不足。ARDS的最常见原因之一是脓血症。炎症包括但不限于自身免疫病和遗传性过敏病。可用HLGASs治疗的其他类型的炎症是难治愈的溃疡性结肠炎、克罗恩病、多发性硬化症、自身免疫病、非特异性溃疡性结肠炎和间质性膀胱炎(interstitial cystitis)

在一个实施方案中，该HLGAG制品可用于抑制血管生成。将HLGAG用于抑制血管生成的有效量施用于需要此种治疗的受试者。如本文所用的，血管生成是新血管的不适当形成。“血管生成”经常发生在肿瘤中，当内皮细胞分泌一组内皮促有丝分裂生长因子，引起内皮细胞的延长和增殖，其导致新血管的产生。几种造血有丝分裂原是肝素结合肽，其与内皮细胞生长因子相关。对血管生成的抑制可引起动物模型中的肿瘤衰退，说明可用作治疗性抗癌剂。用于抑制血管生成的有效量是制品有效减少生长入肿瘤的血管数目的HLGAG的量。可在肿瘤和血管生成的动物模型中评估该量，其中许多是本领域已知的。血管生成疾病包括，但不局限于眼的新生血管疾病、骨质疏松、牛皮癣、关节炎、癌和心血管疾病。

HLGAG制品也可用于抑制与眼病相关的新血管生成。在另一个实施方案中，施用该HLGAG制品治疗牛皮癣。牛皮癣是由慢性炎症引起的常见皮肤疾病。

含有组合物的HLGAG也可以抑制癌细胞生长和转移。因此，该方法可用于治疗和/或预防受试者体内肿瘤细胞的增殖或迁移。所述癌可以试恶性或非恶性癌。癌或肿瘤包括，但不局限于胆道癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、上皮肿瘤、白血病和淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞)、黑素瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌和肾癌，以及其他癌症和肉瘤。

需要癌症治疗的受试者可以是非常可能发展癌症的受试者。这些受试者包括，例如遗传异常的受试者，已经证明遗传异常出现与发展癌症的更高可能性具有相关联系，以及接触致癌剂的受试者，致癌试剂例如烟草、石棉和其它化学毒素，或者之前接受癌症治疗并处于明显的好转期的受试者。

其它实施方案

本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不能理解为对本发明的限制。在本申请中引用的所有参考、专利和公布的专利申请通过引用并入本文。

实施例

实施例1：多形拟杆菌GAG裂解酶I的克隆和重组表达

多形拟杆菌GAG裂解酶I序列(图1；SEQ ID NO：1)大约1251个核苷酸长，包含大约1179个核苷酸的推测的甲硫氨酸起始的编码序列，其中包括终止密码子(SEQ ID NO：1图1A)。编码序列编码392个氨基酸的蛋白质(图1B中的SEQ ID NO：2)。

多形拟杆菌GAG裂解酶氨基酸序列与肝素黄杆菌肝素酶I序列共享一些结构同源性。这两个裂解酶的氨基酸序列的比较显示于图2中。

通过PCR，使用来自目录号为29148D的美国典型培养物保藏中心(ATCC)的多形拟杆菌的基因组DNA克隆多形拟杆菌GAG裂解酶基因。由IntegratedDNA technologies，Inc.(IDT)，根据以下核苷酸序列合成用于M17变体的DNA寡核苷酸引物：1)5′CATATGCTGACTGCTCAGACTAAAAATAC 3′(正向引物)(SEQ ID NO：11)；2)5′CTCGAGTTATCTTTCCGAATATCCTGCGAGAT 3′(反向引物)(SEQ ID NO：12)。引物经设计在5’和3’端分别引入Nde1和Xho1核酸内切酶限制性位点。将所得的基因序列克隆入pET28a细菌表达质粒(EMDBiosciences)中，作为Ndel-Xhol片段，用于随后在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的重组表达，得到包含序列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH(SEQ ID NO：13)的改造融合蛋白，其中所述序列从位置17处的甲硫氨酸(M17)开始与多形拟杆菌GAG裂解酶的氨基末端融合。

将氨基端修饰的多形拟杆菌GAG裂解酶变体-其开始于SEQ ID NO：2所列蛋白质序列的26位置处的谷氨酸(Q26)，克隆入用于重组表达的pET28a，作为融合蛋白。分别在SEQ ID NOs：4和3中提供编码Q26变体的氨基酸序列和核苷酸序列。由Integrated DNA technologies，Inc.(IDT)，根据以下核苷酸序列合成Q26变体的DNA寡核苷酸引物：1)5′CAT ATG CAA ACA CTG ATGCCA CTC ACC GAA 3′(正向引物)(SEQ ID NO：41)和5′CTCGAGTTATCTTTCCGAATATCCTGCGAGAT 3′(反向引物)(SEQ IDNO：12)。

将全长M17和Q26多形拟杆菌GAG裂解酶融合蛋白在大肠杆菌中重组表达，得到溶解的、高活性酶，其完全能够切割肝素和硫酸乙酰肝素(参见以下实施例2)。将包含M17编码序列和Q26编码序列的已验证序列的载体pET28转化至BL21(DE3)中。将2升培养物在补充40μg/mL卡那霉素的LB培养基中、室温(22-25℃)下培养。以在1.0的A₆₀₀时加入的500μM的IPTG诱导蛋白质表达。使诱导后的培养物在室温下生长15-18小时。

重组多形拟杆菌GAG裂解酶的纯化。通过6000×g离心15分钟来收获细菌细胞，并将其重悬浮于30mL的结合缓冲液(50mM Na2HPO4，pH 7.9、0.5M NaCl和5mM咪唑)中。添加0.1mg/mL溶菌酶(室温下20分钟)来起始裂解，其后使用Misonex XL超声仪以40-50％的输出在冰水浴中间断超声处理。通过低速离心(20,000×g、4℃；30分钟)分级粗裂解物，并通过0.45微米的滤膜过滤上清。通过Ni2+螯合层析在5mL Hi-Trap柱(GE Healthcare，)上纯化6X-His重组多形拟杆菌GAG裂解酶，所述Trap柱用200mM NiSO4预填充并随后用结合缓冲液平衡。该柱在大约3ml/分钟的低速下运行，其中包括用50mM咪唑的中间洗涤步骤。使用高咪唑洗脱缓冲液(50mM Na2HPO4，pH 7.9、0.5MNaCl和250mM咪唑)将裂解酶从柱上洗脱至5mL的分级中。也可使用纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA或生物素纯化这些酶。

所得的峰在用20mM Na2HPO4，pH 6.8、150mM NaCl平衡的SephadexG-25柱上缓冲交换，使用source 15S柱(GE healthcare)并应用0.05M-1M NaCl的线性盐梯度，随后进行阳离子交换层析

通过Bio-Rad蛋白质分析法测定蛋白质浓度，并通过UV光谱验证。通过SDS-PAGE及其随后的考马斯亮蓝染色和/或Sypro Ruby Red(Invitrogen)对蛋白质纯度进行评估。

实施例2：多形拟杆菌GAG裂解酶I与肝素黄杆菌肝素酶I和II的不同 硫酸乙酰肝素底物特异性

使用硫酸乙酰肝素作为底物，比较了重组多形拟杆菌GAG裂解酶I与肝素黄杆菌肝素酶I和II的切割模式和由此的底物特异性。在有利于确保完全消化的条件下，用重组多形拟杆菌GAG裂解酶I消化200μg来自猪小肠粘膜的硫酸乙酰肝素“III”级分(Celsus Labs)。使HS与大约50μg多形拟杆菌GAG裂解酶I、50mM磷酸钠、100mM NaCl，pH8.0，在37℃接触18小时。通过HPLC，通过使用强阳离子层析的HPLC(strong anion chromatography-HPLC，SAX-HPLC)，分析裂解酶的消化产物。SAX-HPLC的条件如下：将50μg样品以1mg/ml注射入4×250mm CarboPac Pal分析级柱(Dionex Corporation)中。流速是1ml/min。流动相是溶于水的0.2M-2M NaCl，pH 3.5，在120分钟内成梯度。用0.2M NaCl对该柱预平衡10分钟。将结果与除使用肝素黄杆菌肝素酶I消化硫酸乙酰肝素外其他都相同的试验的结果进行比较。简单来说，使HS与大约50μg肝素黄杆菌肝素酶I、25mM醋酸钠、1mM醋酸钙、5％甘油，pH7.0，在37℃接触18小时。肝素酶I的消化谱(digestion profile)与多形拟杆菌GAG裂解酶I的消化谱十分相似，除了在多形拟杆菌GAG裂解酶I谱中出现的新峰不出现在肝素酶I的谱中，证明裂解酶具有不一致的底物特异性。而且，将使用多形拟杆菌GAG裂解酶I的痕量谱(trace profile)与除使用肝素黄杆菌肝素酶II消化硫酸乙酰肝素的相同实验的结果进行比较。简单来说，使HI与大约50μg肝素黄杆菌肝素酶II、25mM醋酸钠、1mM醋酸钙，pH7.0，在37℃接触18小时。在此种情况下，使用肝素酶II的消化谱与多形拟杆菌GAG裂解酶和肝素黄杆菌肝素酶I的消化谱十分不同。这些数据表明多形拟杆菌GAG裂解酶的底物特异性与肝素黄杆菌肝素酶I和II的特异性不同，但更加接近“肝素样”(例如，更与肝素黄杆菌肝素酶I相似)而更少接近“硫酸乙酰肝素样”(例如，其较不象肝素黄杆菌肝素酶II)。

实施例3：多形拟杆菌GAG裂解酶I对ARIXTRA(R)的解聚作用和中和 作用

重组多形拟杆菌GAG裂解酶I可以切割并从而中和ATIII五糖ARIXTRA(R)为五硫化三糖和不饱和的二硫化二糖。ARIXTRA(R)是抗血栓药物，其以因子Xa的选择性抑制因子发挥作用，因子Xa是凝血级联的组分。基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI MS)明确证明了ARIXTRA(R)的解聚作用(图7)。A版显示在没有裂解酶时对ARIXTRA(R)的扫描。也显示了ARIXTRA(R)的结构。B版显示在用多形拟杆菌GAG裂解酶切割ARIXTRA(R)后的扫描。简单来说，在20μL反应体积中，用大约5μg多形拟杆菌GAG裂解酶I、25mM醋酸钠、1mM醋酸钙，pH7.0，在37℃处理1mg/ml ARIXTRA(R)2小时。注意在A版中所具有的质量4723.7Da(净质量＝1506Da)在B版中消失，而伴随质量4133.2Da(净质量＝915.6Da)的出现。后者质量代表五硫化三糖的切割产物。在将Arixtra切割为2个更小的片段中，该药物的抗Xa活性被多形拟杆菌GAG裂解酶有效中和。

实施例4：多形拟杆菌GAG裂解酶II的克降和重组表达

通过PCR，使用来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录号为29148D的多形拟杆菌的基因组DNA，克隆多形拟杆菌GAG裂解酶II的完整编码序列(本文中描述为“全长基因”)以及2个在本文中描述的变体。由Integrated DNAtechnologies，Inc.(IDT)，根据以下核苷酸序列合成DNA寡核苷酸引物：1)用于全长基因：5′CAT ATG AAT AAA ACC CTG AAA TAT ATC GTC CTG 3′(正向引物)(SEQ ID NO：14)，5′CTC GAG TTA TAA TTT ATA TTT TAA TGA CTGTTT CTT GC 3′(反向引物)(SEQ ID NO：15)；2)基因编码变体No.1(氨基末端平截以除去假定的信号序列)：5′CAT ATG CAA GAG TTG AAA AGC GAGGTA TTC TCG 3′(正向引物)(SEQ ID NO：16)，5′CTC GAG TTA TAA TTTATA TTT TAA TGA CTG TTT CTT GC 3′(注意：对于全长基因而列出的相同反向引物)(SEQ ID NO：15)。引物经设计分别在5’和3’端引入Nde1和Xho1核酸内切酶限制性位点。将所述基因序列克隆入pET28b细菌表达质粒(EMDBiosciences)，作为Nde 1-Xho 1片段，用于随后在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的重组表达，得到改造的融合蛋白，该融合蛋白包含全长基因和变体1(Q23变体，SEQ ID NO：8)分别对应的序列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMNKTLKY...KVNGKKQSLKYKL(SEQ IDNO：17)或MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMQELKSEVF....KVNGKKQSLKYKL(SEQ ID NO：18)(多形拟杆菌GAG裂解酶序列以粗体显示)。完整序列参见图4。

另一个变体，K169变体(SEQ ID NO：10)代表包含蛋白质内部区域的18个连续氨基酸的改造缺失，并具有以下线性序列：KMDKKEYELVSDGKIKGE(SEQ ID NO：19)。在该基因序列(图5A)以及在相应蛋白质序列(图5B)中的该区域的缺失用灰色阴影注明。通过基于PCR的诱变，使用Quick-change试剂盒(Stratagene)根据制造商的说明书完成DNA水平上该区域的缺失。在基因(DNA)水平产生这种缺失所用的诱变引物是如下序列：5′GG ATT AAA AAGAAT CCG TTG GTG GAA AAT GTA CGT TTC GC 3′(SEQ ID NO：20)和5′CCTAA TTT TTC TTA GGC AAC CAC CTT TTA CAT GCA AAG CG 3′(SEQ IDNO：21)，分别对应于有义和反义链。此所述基因变体在大肠杆菌中的表达也可以实现，同样基于重组表达的pET表达。很大程度上如对多形拟杆菌GAG裂解酶I所述的，进行纯化。

这种变体的初步生化特征征说明所述氨基酸的缺失对该酶的可溶性表达，以及其切割肝素和硫酸乙酰肝素的能力无害。然而，这确实表明了，相对于全长蛋白质，在该酶变体的催化功效和/或底物特异性方面的潜在差别。

实施例5：多形拟杆菌GAG裂解酶III的克隆、重组表达和纯化

通过PCR，使用来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录号为29148D多形拟杆菌的基因组DNA，克隆GAG裂解酶III基因。至少2622个碱基对的全长基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)显示于图8。编码线性序列中至少873个氨基酸的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)显示于图9中。

由Integrated DNA technologies，Inc.(IDT)，根据以下核苷酸序列合成DNA寡核苷酸引物：1)5’CATATGATGAAACAACGATATTATATTTTC 3’(正向引物)(SEQ ID NO：30)；

2)5′GGATCCTCGAGTTATATCTCAAAATCCGGTAAATAGTC 3′(反向引物)(SEQ ID NO：31)。引物经设计分别在5’和3’端引入Nde1和Bam H1/Xho1核酸内切酶限制性位点。将所述基因序列(SEQ ID NO：28)克隆入pET28a细菌表达质粒(EMD Biosciences)中，作为Nde 1-Xho 1片段，用于随后在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的重组表达得到改造的6X组氨酸融合蛋白。

相似的，将氨基端修饰的GAG裂解酶III的基因变体(SEQ ID NO：33和34克隆入pET28a中用于重组表达)，所述变体开始于所列蛋白质序列(SEQ IDNO：29)中的23位谷氨酸(Q23)。为此使用以下正向(5’)引物：CATATGCAGAAAAGCATCCTGCGTCTGAGT 3′(SEQ ID NO：35)。

将所克隆的酶的初级氨基酸序列直接与来自多形拟杆菌和肝素黄杆菌的4种功能性相关的裂解酶相比较。多重序列的比对(使用CLUSTALW程序进行)描述在图10中。该比对结果显示本文所公开的GAG裂解酶III和与其所比较的其他酶是不同的。

酶重组在大肠杆菌中表达为高可溶性、开始于Q23(SEQ ID NO：33和34)的活性氨基末端变体，如图9所示。该Q23变体易于在大肠杆菌中表达为高度可溶的酶。该酶表达为氨基末端的6X组氨酸融合蛋白也有助于基本上在一步纯化步骤中的纯化。其他纯化包括使用0.05M-1M NaCl线性梯度，在Source15S柱上的阳离子交换层析。其他可用于获得这些酶的纯化方法包括亲和纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA或生物素。

实施例6.多形拟杆菌GAG裂解酶III的功能和酶活性分析

评估了重组GAG裂解酶III切割肝素样粘多糖的能力。包括来自杆菌黄杆菌的肝素酶II和肝素酶III用于比较。分析了4种“肝素样”底物的切割：猪小肠肝素、两种不同的硫酸乙酰肝素(称为HI和HO，每一种具有不同的硫化程度)和依诺肝素(一种低分子量药用肝素)。同时对通过在232nm处的UV吸收测量的切割的程度(产物形成)以及特异性，评估了生化酶活性。通过毛细管电泳对二、四和更高寡糖产物的分级来评估后者参数。

多形拟杆菌GAG裂解酶III的总酶活性总结在图11中。这些数据表明GAG裂解酶III表现出对高硫化的、“肝素样”的GAG及其低分子量衍生物的偏爱。同时，该酶能够切割具有更低硫化的GAG，即那些更“硫酸乙酰肝素样”的GAG。同时，图11描绘的底物谱(substrate profile)证明该酶的特异性与来自肝素黄杆菌的肝素酶II和肝素酶III不同。

进一步分析了多形拟杆菌GAG裂解酶III和来自肝素黄杆菌的肝素酶II的差异并将其显示于图12中。分析了3种底物的切割：肝素和2种不同的硫酸乙酰肝素(称为HI和HO，每一种具有不同的硫化程度)。通过毛细管电泳分级切割产物，并通过在232nm处的吸收(Y轴)对其进行监视。这些数据证明当这两种酶功能上相关时，他们的底物特异性是不同的。

实施例7：多形拟杆菌GAG裂解酶IV的克隆、重组表达和纯化

多形拟杆菌GAG裂解酶IV序列(图13，SEQ ID NO：36)大约2109个核苷酸长，编码至少702个氨基酸的多肽(图14，SEQ ID NO：37)。

通过PCR，使用来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录号为29148D的多形拟杆菌的基因组DNA，克隆GAG裂解酶基因。由Integrated DNAtechnologies，Inc.(IDT)，根据以下核苷酸序列，合成DNA寡核苷酸引物：

1)5′CCA TGG CAT ATG AAG AAC ATC TTC TTT ATT TGC 3′(正向引物，SEQ ID NO：32)；

2)5′CTC GAG TTA TAA GGT ATA AGA TAA TGT ATG TGT 3′(反向引物，SEQ ID NO：40).

引物经设计以引入Nde1和Xho1核酸内切酶限制性位点，如粗体字所显示的。将所扩增的基因亚克隆入基于T7的表达载体pET28中，用于在大肠杆菌中异源表达为改造的融合物，其中在氨基末端有6X组氨酸标签作为纯化该重组表达的蛋白的方式。其他可用于纯化该酶的方法包括使用GST、MBT、Trx、DsbC、NusA和生物素化。也可构建该基因的变体，即是其中去除了代表假定的细菌分泌信号的最初的19个氨基酸的变体。该变体(认为是D20)开始于天冬氨酸20(asp 20)。

将克隆的酶的初级氨基酸序列与来自多形拟杆菌和肝素黄杆菌两者的4种功能相关的裂解酶直接比较。该多重序列的比对显示于图15中。对应于多形拟杆菌裂解酶IV的氨基酸序列表现出与来自肝素黄杆菌的肝素裂解酶大约30％的同一性。因此，此对比清楚地表明在本公开中描述的GAG裂解酶不同于与之比较的其他酶。

也检查了此假定的裂解酶的功能性。特别是，评估了重组的多形拟杆菌裂解酶IV切割不同组合物的肝素样粘多糖的能力，特别是当其与硫酸化密度有关时。在本实验中，筛选了3种GAG底物：来自猪小肠粘膜(PM)的肝素、同样从猪小肠粘膜分离的硫酸乙酰肝素样“HI”级分(HI-HS)和代表最低硫酸化密度的、被称为硫酸乙酰肝素的“HO”级分。除了通过在232nm处测量的UV吸光度观察切割程度(产物形成)外，还进行实时的、基于UV的动力学分析来测量切割速率，从而评估生化酶活性。数据总结在图18中，并表示针对所报道的最大活性而标准化的相对值。根据这些数据，该重组表达的GAG裂解酶表现出对介质硫酸化密度的GAG的偏爱。此种偏爱广泛地描述为硫酸乙酰肝素样，而不是肝素样。

多形拟杆菌GAG裂解酶IV也可以具有底物特异性，该特异性当与其它硫酸乙酰肝素裂解酶相比时是独特的，所述硫酸乙酰肝素裂解酶例如来自肝素黄杆菌的肝素酶III或甚至是来自类杆菌属的其它“肝素酶III样”酶。特别是，该酶切割不经常在肝素或多数硫酸乙酰肝素部分中发现的二糖，例如I_2SH_NAC。也可能，该酶以类似至少部分地保护AT-III结合位点的方式切割肝素。

等价物

本领域技术人员仅仅通过常规试验就可以认识到或能够确认许多本文所述的发明的具体实施例的等价物。规定下述权利要求包括这些等价物。

Claims (17)

1.特异性切割肝素或硫酸乙酰肝素的方法，其包括：

选择一种分离的多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)GAG裂解酶I多肽，其中所述分离的多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽切割肝素或硫酸乙酰肝素的与硫酸化的糖醛酸有关的一种或多种糖苷键和与硫酸化的氨基己糖有关的一种或多种糖苷键，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽为SEQ ID NO:2、4或23的氨基酸序列；

将肝素或硫酸乙酰肝素与所述分离的多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽相接触，从而在与硫酸化的糖醛酸有关的一种或多种糖苷键和与硫酸化的氨基己糖有关的一种或多种糖苷键处特异性地切割肝素或硫酸乙酰肝素。

2.权利要求1所述的方法，进一步包括使所述肝素或硫酸乙酰肝素与多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽接触，并且其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽为SEQ ID NO:6、8或10的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的方法，其中所述肝素或硫酸乙酰肝素进一步与多形拟杆菌GAG裂解酶III多肽接触，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶III多肽为SEQ ID NO:29或34的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的方法，其中所述肝素或硫酸乙酰肝素进一步与多形拟杆菌GAG裂解酶IV多肽接触，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶IV多肽为SEQ ID NO:37或39的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的方法，其中将肝素或硫酸乙酰肝素与以下两种或更多种相接触：

（1）分离的多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽为SEQ ID NO:6、8或10的氨基酸序列；

（2）分离的多形拟杆菌GAG裂解酶III多肽，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶III多肽为SEQ ID NO:29或34的氨基酸序列；和

（3）分离的多形拟杆菌GAG裂解酶IV多肽，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶IV多肽为SEQ ID NO:37或39的氨基酸序列。

6.权利要求1所述的方法，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽由选自如下组成的组中的核苷酸序列编码：编码SEQ ID NO:2、4或23的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

7.权利要求2所述的方法，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽由选自如下组成的组中的核苷酸序列编码：编码SEQ ID NO:6、8或10的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

8.权利要求3所述的方法，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶III多肽由选自如下组成的组中的核苷酸序列编码：编码SEQ ID NO:29或34的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

9.权利要求4所述的方法，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶IV多肽由选自如下组成的组中的核苷酸序列编码：编码SEQ ID NO:37或39的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

10.前述任一项权利要求所述的方法，其中肝素或硫酸乙酰肝素被切割成二、三、四、五、六、八和/或十糖。

11.权利要求1-9中任一项所述的方法，其还包括确定所述被切割的肝素或硫酸乙酰肝素的序列。

12.权利要求1所述的方法，其还包括将肝素或硫酸乙酰肝素与除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽外的一种或多种HLGAG降解酶接触。

13.权利要求12所述的方法，其中所述HLGAG降解酶选自：肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)肝素酶I、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV、乙酰肝素酶、硫酸酯酶和Δ4,5-葡糖醛酸糖苷酶。

14.权利要求1或2所述的方法，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽切割肝素的2-O硫酸化糖醛酸的一个或多个糖苷键。

15.权利要求2所述的方法，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽切割肝素的硫酸化的或未硫酸化的糖醛酸的一个或多个糖苷键。

16.权利要求1所述的方法，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽切割肝素或硫酸乙酰肝素的一个或多个糖苷键，从而降低抗Xa活性和/或降低的抗IIa活性。

17.权利要求10所述的方法，还包括确定所述被切割的肝素或硫酸乙酰肝素的序列。

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