CN101479279B

CN101479279B - 培南前药

Info

Publication number: CN101479279B
Application number: CN200780024449XA
Authority: CN
Inventors: 凯瑟琳·伊丽莎白·布莱格蒂; 安东尼·马法特; 戴尔·戈登·马克劳德; 约翰·保罗·欧'杜奈尔
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 2006-06-28
Filing date: 2007-06-18
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2027-06-18
Also published as: CN101479279A; ZA200810520B; ES2355950T3

Abstract

本发明涉及经口可生物利用的硫培南前药，例如式(I)化合物、其溶剂化物和水合物，所述硫培南前药的制备、制剂以及所述硫培南前药在治疗和预防诸如人类的哺乳动物中的感染的用途。

Description

培南前药

技术领域

本发明涉及抗感染药、抗生素、口服抗生素及前药，具体而言，涉及硫培南(sulopenem)前药、其制剂及用途。

背景技术

美国专利5013729描述了硫培南，其是一种广谱抗生素，可被命名为(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸。也可参见J.Org.Chem.，57，4352-61(1992)。

例如美国专利4952577、美国专利5506225、WO1992/003444及WO2004/067532中描述了其它培南(penem)及前药。

人们已对硫培南及其某些前药实施了各种临床前及临床研究。硫培南自身无显著的经口生物利用性。美国专利5013729还讨论了硫培南前药，包括硫培南的新戊酰氧基甲基前药(硫培南POM酯)。当该POM酯以两种立体异构体的混合物形式经口给药时，其显示在人体中具有经口生物利用度。参见Foulds等人的Antimicrobial Agents and Chemotherapy，第665-671页(1991年4月)。然而，POM酯前药在水解并释放新戊酸或三甲基乙酸后会与组织肉碱损耗相关。参见Brass，Pharmacological Reviews，54，589-598(2002)。

发明内容

本发明解决了对新型硫培南前药的需求，该种硫培南前药组合了如下性质的一种或多种：经口暴露量或生物利用度较高、不存在损耗组织肉碱的倾向、有益地适于实际药物调配及使用的物理化学性质(例如结晶性、熔点、水溶性及渗透性)。

在一些方面中，本发明包括式I的化合物：

在其它方面中，本发明包括式II的化合物：

本发明进一步包括用于治疗或预防细菌感染的化合物的配制品及用途。

具体实施方式

化合物

本发明包括上文示出及描述的式I及II的前药化合物。上图涵盖并包括了所有立体异构体及其混合物，其考虑到并包括在不同立体中心上的R构型和S构型二者。

式I及II化合物的优选构型为：

具体而言，该氧代硫杂环戊基(oxothiolanyl)部分优选构型1R、3S，如下所示：

举例来说，提供：(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙基-1-氧代丁氧基)甲基酯(本文的化合物1)，其如下所示：

另一实例提供：(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙氧基-2-甲基-1-氧代丙氧基)甲基酯(本文的化合物2)，其如下所示：

本发明的前药可为无定型的或可以以不同结晶形式或多晶形形式存在，包括溶剂化物及水合物。多晶形前药是本发明的一部分，其可以通过在多种条件下结晶本发明的前药来制备。还可以通过加热或熔融前药随后逐渐或快速冷却获得多晶形。可以通过固体探针NMR谱、IR谱、差示扫描量热法、粉末X-射线衍射或其它的这类技术来测定多晶形的存在。因此，当提及化合物本身时，也包括其多晶形(多晶形包括与所述化合物结合的水或溶剂分子)。

制备

本发明的前药可例如由硫培南的游离酸根据诸如本文中或美国专利3951954；美国专利4234579；美国专利4287181；美国专利4452796；美国专利4342693；美国专利4348264；美国专利4416891；美国专利4457924；及美国专利5013729中公开那些已知方法制备，所有这些专利文献的全文通过引用插入本文。

用途

本发明的前药可用于治疗人体中多种从医院及社区获得的感染，例如呼吸道感染、外科感染、中枢神经系统感染、胃肠道感染、生殖泌尿感染、妇科感染、皮肤和软组织感染和眼科感染以及从社区获得的肺炎。这种前药的抗菌活性也可有益地发挥预防作用。口服是优选的。生物活性数据如下所示。

施予的前药最小量是最小治疗有效量。施予的前药最大量是毒理学上的可接受量。在一些实施方式中，施予的硫培南前药的量如下：将硫培南的血浆抗生素浓度维持在高于感染病原体的MIC₉₀(90％最小抑制浓度，例如约0.5微克/毫升或约1微克/毫升)长达两次给药间隔的至少约30％(例如，对于BID(2x/天)给药为至少约3.6小时，或对于TID(3x/天)为2.4小时)。在一些实施例中，将该血液水平维持在或高于目标水平长达给药间隔的至少约40％(例如，对于BID为至少约4.8小时，或对于TID为3.2小时)。

一般而言，对于成人，硫培南前药的日剂量可以为约500mgA(相当的硫培南毫克数)至约6gA，或约1gA至约5gA。成年人的硫培南前药的疗法可以为约500mgA至约1500mgA，一天两次，每次间隔约12小时。可以在约1周至约2周的时间段内采用这个疗法。对某些感染，可能需要或期望使用这些参数之外的剂量。

本发明前药的日剂量通常可以以每天1至4次来施予，通常等量施予。在一些实施方式中，该前药剂量可以为约500至约2500毫克BID或TID；约800毫克至约1克BID；或对更严重的感染为约2克BID或TID。在一些实施方式中，该剂量可以为约7至约25毫克/千克BID；约17至约45毫克/千克BID；或约17至约45毫克/千克TID。

在一些实施方式中，首先经静脉内施予硫培南自身或其它抗生素开始治疗，随后采用本发明的口服前药继续治疗。

如下进一步讨论，人们发现在口服1000毫克化合物1的前药(相当于约730毫克硫培南)后，该前药在长达3.18至4.84小时的时间内提供高于0.5微克/毫升的人类血液水平。在不同实验中，发现在口服2000毫克化合物1的前药(相当于约1460毫克硫培南)后，该前药在长达4.28至5.94小时的时间内提供高于1微克/毫升的人类血液水平。

前药可与其它活性试剂结合使用。硫培南或硫培南前药可与丙磺舒或对肾小管分泌具有抑制作用的类似活性试剂结合使用。

配制品

本发明包括含有本发明前药化合物的药物组合物，所述前药化合物与一种或多种赋形剂和/或一种或多种其它活性成分一起或在没有一种或多种赋形剂和/或一种或多种其它活性成分的情况下配制用于口服。该前药可以是溶剂化物或水合物形式。

根据标准的药物实践，本发明的口服剂型可以是片剂(包括可咀嚼片剂)、胶囊、丸剂、锭剂、糖锭、散剂、糖浆、酏剂、溶液及悬浮液等。本发明的药物组合物也可经鼻胃管直接递送至患者胃肠道。

在一些实施方式中，口服剂型可含有约800至约2500毫克的前药。

可根据所需剂型选择赋形剂。非限制性实例包括，聚乙烯基吡咯啶酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、蔗糖、明胶、阿拉伯胶、黄蓍胶或玉米淀粉；填充剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸和淀粉；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单元形式为胶囊时，其除上述类型的物质之外还可包含诸如脂肪油的液体载剂。赋形剂还可包括悬浮助剂(例如黄原胶或羟丙基甲基纤维素)、助流剂(例如胶体二氧化硅)、稀释剂和填充剂(例如二氧化硅)、调味剂(尤其在儿科口服悬浮液和药囊中)。还可使用稳定剂(例如琥珀酸)。多种其它物质可作为包衣形式存在，或存在以修饰剂量单元的物理形式。例如，锭剂可被虫胶、糖或二者包衣。改进释放剂型也包括在内。

前药以足够提供期望治疗剂量在本文所述范围内的量存在于药物组合物中。前药与赋形剂的比自然取决于如下因素：诸如活性组份的化学性质、溶解性和稳定性及预期的剂型。通常，本发明的药物组合物可含有约20重量％至约95重量％的前药。

硫培南的生物学活性

硫培南对广泛的病原体(包括医院病原体)具有活性。这包括对表达广谱β-内酰胺酶(赋予头孢菌素(K.pneumoniae，ESBL+)抗性)的Enterobacteriaceae成员具有有效活性。而且，许多分离株还对氟喹诺酮具有抗性。硫培南对许多厌氧菌的临床相关种类具有高度活性。

评价硫培南(母酸(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸)对社区和医院感染所涉及的病原体的活体外活性，总结列于表1中。

表1.硫培南的MIC₉₀值(微克/毫升)

苯唑西林-易感型Staphylococcus aureus	0.125
		Staphylococcus saprophyticus	0.5
Alloiococcus otitidis	1
		Streptococcus pyogenes(A群)	0.03
Streptococcus agalactiae(B群)	0.125
		Streptococcus bovis(D群)	0.06
Viridans Streptococcu	0.25
		盘尼西林-易感型Streptococcus pneumoniae	0.03

盘尼西林-中间型Streptococcus pneumoniae	0.25
		盘尼西林-抵抗型Streptococcus pneumoniae	1
左氧氟沙星抵抗型Streptococcus pneumoniae	0.5
		Listeria monocytogenes	0.125
Corynebacterium spp(非C.jeikeium)	2
		Citrobacter diversus	0.06
Citrobacter freundii	0.25
		Enterobacter aerogenes	0.5
Enterobacter cloacae	1
		Escherichia coli	0.06
Klebsiella oxytoca	0.125
		Klebsiella pneumoniae	0.125
Klebsiella pneumoniae ESBL+	0.25
		Morganella morganii	2
Proteus mirabilis	0.5
		Salmonella/Shigella	0.125
Haemophilus influenzae β-内酰胺酶-	0.25
		Haemophilus influenzae β-内酰胺酶+	0.5
Moraxella catarrhalis β-内酰胺酶-	0.03
		Moraxella catarrhalis β-内酰胺酶+	0.125
Legionella pneumophila	0.06
		Neisseria meningitides	0.06
Bacteroides fragilis	0.5
		Clostridium perfringens	0.06
Prevotella spp	0.125

因此，硫培南对广泛的病原体，包括对头孢菌素和氟喹诺酮具有抗性的医院病原体，具有活性。该抗菌谱支持其广泛用在其中感染性病原体被鉴别并确认了对硫培南的易感性的医院中。这包括广泛的呼吸道适应症和外科适应症(其中很可能涉及混合菌群)，尤其当怀疑混合感染时作为多种药物疗法的一部分。

前药的口服疗效

在三个不同体内感染模型中描述化合物的口服疗效。基于导致各个感染的细菌病原体的抗性特征及在人类疾病相关模型中导致感染的能力，对其进行选择。Klebsiella pneumoniae分离株1109及6485来自广谱β-内酰胺酶-阳性(ESBL⁺)菌株的近来临床分离株的收集物，且对环丙沙星和头孢他啶以及其它β-内酰胺抗生素具有高MIC。已证实两种分离株都能导致小鼠致死全身性感染。Streptococcus pneumoniae 1095是一种耐盘尼西林、抗大环内酯的菌株，其在鼠全身性感染模型和呼吸道感染模型中都可致病。Haemophilus influenzae菌株Rd/AH5-3衍生自实验室菌株Rd；PBP3中的定点突变使该β-内酰胺酶阴性菌株具有氨苄西林抗性(BLNAR)。该菌株能够在蒙古沙鼠中耳炎模型中导致中耳炎疾病。结果汇总在下表2中。

鼠急性全身性感染模型：对该模型，通过腹膜腔内注射致死接种物Kpneumoniae 1109、6485或S.pneumoniae 1095来感染CF-1小鼠。感染并治疗由每组8至10只小鼠组成的4个剂量组，从而涵盖宽范围的剂量水平。以30分钟/感染后4小时、或以1小时/感染后5小时，对小鼠施以BID疗法；根据在感染后第4天时存活动物的数量计算PD₅₀(经感染、治疗小鼠50％存活时的剂量)。

鼠呼吸道感染模型：该模型开始从鼻内接种S.pneumoniae 1095的致死激发物，从而导致肺炎。感染并治疗由每组8至10只小鼠组成的4个剂量组，从而涵盖宽范围的剂量水平。感染后18小时开始BID疗法，并持续2天。使用在感染后第10天各剂量组内存活小鼠的数量确定PD₅₀。

沙鼠中耳炎模型：为建立中耳炎模型，通过疱内(intrabulla)接种H.influenzae的BLNAR菌株感染蒙古沙鼠。感染并治疗由每组5只沙鼠组成的4个剂量组，从而涵盖宽范围的剂量水平。感染后18小时开始TID疗法，并持续2天。在感染后第4天，对动物实施安乐死，收集中耳冲洗液，并测定其中包含的细菌数。基于细菌水平计算ED₅₀；计数低于100菌落形成单位/毫升的中耳冲洗液样品被视为通过。

收集化合物1和2中以下化合物的数据；化合物A(如下所示)的数据；和化合物B1的数据，化合物B1为如下所示的硫培南((1R，3S)氧代硫杂戊环立体化学)的新戊酰氧基甲基酯(POM-酯)。化合物B2为非对映异构体的混合物(如下所示)。

化合物A：

化合物B1：

化合物B2：

表2.体内疗效(PD₅₀或ED₅₀，毫克/千克)

模型	化合物1	化合物2	化合物A	化合物B1
					鼠急性全身性感染与K.pneumoniae 1109(PD₅₀)	25.1(13.6-36.6)	12.5(12.4-12.6)	10.1(3.8-16.4)	38.2(27.7-48.7)
″	9.0(8.7-9.3)	16.2(15.9-16.6)	15.3(9.0-21.6)	11.4(11.3-11.5)
					-	-	-	-	-
鼠急性全身性感染与K.pneumoniae 6485(PD₅₀)	88.6(87.8-89.4)	88.3(68.5-108.2)	40.7(29.1-52.3)	>100
					″	63.4(2.1-124.6)	32.7(23.7-41.7)	-	>100
″	-	63.4(58.5-68.3)	-	-
					-	-	-	-	-
鼠急性全身性感染与S.pneumoniae 1095(PD₅₀)	12.5(12.4-12.6)	7.9(7.3-8.5)	9.0(8.7-9.3)	7.9(7.3-8.5)
					″	6.3(1.5-11.1)	6.3(3.4-9.1)	15.3(9.0-21.6)	4.3(4.2-4.5)
″	-	11.0(8.6-13.5)	-	9.0(8.7-9.3)
					-	-	-	-	-
鼠呼吸道感染与S.pneumoniae 1095(PD₅₀)	16.4(9.8-23.0)	19.7(18.2-21.2)	17.8(0-38.6)	49.9(34.7-65.2)
					″	12.5(5.6-19.4)	38.5(37.7-39.3)	20.8(8.7-50.1)	18.1(1.4-34.9)

″	9.5(4.0-15.0)	-	-	16.2(11.5-20.9)
					-	-	-	-	-
沙鼠中耳炎与H.influenzae BLNAR(ED₅₀)	8.7(8.4-9.0)	5.7(3.6-7.7)	6.9(4.4-9.4)	12.6(6.8-18.3)
					″	4.5(4.4-4.6)	12.6(6.8-18.3)	8.7(8.4-9.0)	5.7(5.6-5.7)

前药临床药物代谢动力学

健康人类志愿者对硫培南前药化合物：化合物1、化合物B2(数据来自Foulds等人)和化合物A的临床药物代谢动力学(PK)数据汇总在下表3中。化合物B2非对映异构体的混合物，其中氧代硫杂戊环部分的构型为(1R，3S)的非对映异构体是化合物B1(参见上图)。未得到前药化合物2的临床数据。

对化合物1及化合物A，6名受试者以逐步增加的方式接受剂量。在施予之前及在施予之后0.5、1、2、3、4、6、8和12小时时获得全血样品，并处理得到血浆。然后使用有效的HPLC方法，对血清和血浆样品的硫培南浓度进行定量。化合物A的Tmax数据以中值和范围给出。

向总共10名受试者施予单一剂量的化合物B2。参见Foulds等人，见上文。在施予之前及在口服相当于500毫克硫培南母体化合物(5名受试者)和相当于1000毫克硫培南母体化合物(5名受试者)的化合物B2之后0.08、0.17、0.33、0.5、1、1.5、2、3、4、6和8小时时获得血样，并处理得到血清。Foulds等人还评估了存在于化合物B2中的1R，3S(化合物B1)和1S，3R非对映异构体对PK的贡献。

表3.化合物1、化合物B2及化合物A的临床药物代谢动力学

口服前药

剂量(mg)

相当于硫培南的剂量(mg)

Cmax(ng/mL)

Tmax(hr)

AUC_last(hr-ng/mL)

t_1/2(hr)

化合物1

400

292

1464±442

1.17±0.93

3455±670

0.85±0.16

″

600

438

1508±340

1.33±0.82

3914±514

0.76±0.096

″

1000

730

2860±570

0.83±0.41

6421±1208

1.00±0.17

″

2000

1460

4667±1181

1.33±0.82

13131±2101

1.10±0.62

化合物B2(Foulds等人)

273

205

1180±280

NC

2260±440

NC

″

544

409

1790±490

NC

4190±730

NC

化合物A

300

196

715±303

1.0(0.5-1.5)

818±480

NC

″

1000

654

1380±372

0.5(0.5-1.0)

2350±642

1.11±0.21

″

1000喂食

654喂食

1130±300

1.0(0.5-3.0)

3900±535

NC

″

3000

1960

2260±335

1.0(0.5-1.5)

5180±1500

1.59±0.80

口服化合物B2后的硫培南暴露量表示为，在与同一项研究中与静脉内AUC相比的吸收分数(表4，Foulds等人)。对相当于205至409毫克硫培南剂量的化合物B2而言，吸收分数介于38.5-33.5％范围内。使用Foulds等人表4中的相同静脉内数据，可估计相当于292和438毫克硫培南剂量的化合物1的吸收分数分别为37.1％及28.0％。

虽然施予的相当剂量数不同，但前药在全身中暴露量具有低于剂量比例增加的趋势。化合物A的数据至少示明了，增加前药的亲脂性不一定会转化为改善的口服暴露量。使用ACD Labs 9.0软件(LogP/DB；www.acdlabs.com)计算亲脂性(ClogP)，得到以下结果：化合物1：-0.29；化合物A：0.83；化合物B1：-1.0；化合物B2：-1.0。对化合物A的进一步评估显示其在胃肠道中的固有不稳定性。通过化合物1在体外使用人类肠液所表现出的胃肠道稳定性增高与口服暴露量相对于剂量的增加相关联。

前药评估和选择

评估前药的最终目的是识别会显示或预测会显示以下中的一种或多种的化合物：有利的PK，例如在人口服后的高暴露量或生物利用度；不存在损耗组织肉碱的倾向；和有利地适于实际药物调配和使用的物理化学特性。

对化合物A等的评估得出以下结论：前药的胃肠道稳定性预计在口服生物利用度中发挥重要作用。如下所详述，根据在猪胰脂酶(PPE)存在时的稳定性和在人类肠液(HIJ)中的稳定性对新型前药化合物进行评估和分级。在人类肝匀浆中转化为硫培南的效率也被认为是与前药口服生物利用度相关的重要参数。对于肝S9、PPE和HIJ的体外终点汇总在表4中。根据以下一般程序对前药进行测试。

肝S9转化效率

评估前药在人肝匀浆(S9级分)中的稳定性及转化效率。对于每次完成的分析，肝S9由保存在-70℃下的肝块新鲜制备。将大约5克冷冻肝组织在15毫升冰冷的100mM磷酸钾(pH 7.4)缓冲液中匀浆化为均一状态。然后在5℃、9000g下将该匀浆离心20分钟，以分离该S9上层清液部分。将S9上层清液在100mM磷酸钾(pH 7.4)缓冲液中的1:10稀释液进行培育。通过在37℃下加入底物(最终达50μM)来启动反应(1毫升)。在第0、0.5、1、2、3、5、10和20分钟获得等分试样(75微升)，并在150微升包含内标(氨苄西林，5微克/毫升)的80/20乙腈/100mM乙酸铵(pH 4.5)中淬火。在3000g下将样品离心10分钟，并将上清液转移至注射小瓶。通过LC/MS/MS监测前药的一级降解，如下文所述。转化为硫培南的效率被表示为，在强化样品中的摩尔当量(50μM)百分比。一般，对转化效率为约75％或更高的化合物实施处理以供进一步评估。

稳定性

在这些实验中，将

HP(USP胰脂酶制剂由以下组成：脂酶8000USP单位、蛋白酶30,000USP单位和淀粉酶30,000USP单位；SchwarzPharma公司，Milwaukee，WI)胶囊中的物质在50毫升的100mM磷酸钾(pH7.4)中搅拌并混合均匀。培育(1毫升)在37℃下进行，并通过加入底物(最终达50μM)启动。加入底物后0、0.5、1、2、3、5、10和20分钟时取等分试样(100微升)，并用200微升含有内标(氨苄西林，5微克/毫升)的80/20乙腈/100mM乙酸铵(pH 4.5)淬火。在3000g下将样品离心10分钟，并将上层清液转移至注射小瓶。通过LC/MS/MS监测前药的一级降解，如下文所述。对稳定性半衰期为约10分钟或更长的化合物实施处理以供进一步评估。

在表4中，单个数值代表两次重复测定的平均值。在对给定化合物实施进一步测定的情况下，数据表示为平均值及标准偏差。所有化合物均使用第一批(批次1)ku-zyme进行评估。

也使用第二批ku-zyme(批次2)对化合物1、A、B1及B2进行评估，其数据表示在括号内。

在HIJ试验中，收集来自4名个体受试者的HIJ(每名1毫升)与1毫升600mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)混合。在采用浓度为300、100、30、10、3的1μM的底物强化后，将300微升×6个经缓冲人肠液的等分试样在37℃下进行培育。两种前药化合物可同时进行。在第0、0.5、1、2、10和20分钟时取出35微升样品，并用70微升含有内标(氨苄西林，5微克/毫升)的80/20乙腈/100mM乙酸铵(pH 4.5)淬火。在3000g下将该样品离心10分钟，并将上层清液转移至注射小瓶。通过LC/MS/MS监测前药的一级降解，如下文所述。将各浓度下剩余前药的百分比与时间的关系代入一级分解函数，以确定底物损耗速率常数或k_dep。k_dep与浓度的线性-对数图可以以下方程式拟合，其中：

k_{dep} = k_{dep [S] = 0} \cdot (1 - \frac{[S]}{[S] + K_{m}})

在底物浓度无限小的情况下(其中，k_dep～k_dep[S]＝0)，k_dep的数值代表系统的最大消耗速率或内在清除率，且K_m是达到该系统最大速率(V_max)一半时的浓度。以Michaelis-Menton观点来看，内在清除率CL_int代表当[S]比K_m小很多时V_max/K_m的比率。对于这些K_m研究，底物的单位以μM计，内在清除率(Gl_int)以毫升/分钟计。一般，对内在清除率<0.1毫升/分钟或K_m比其水性溶解度(为了饱和酶催化作用)低3倍的化合物实施处理以供进一步评估。

溶解度

在环境温度下，在25mM磷酸盐缓冲液(pH 5)中测定平衡溶解度。将含有处于磷酸盐缓冲液中的过量前药的小瓶旋转长达48小时。平衡阶段之后，倒出样品，通过0.45微米Gelman Acrodisc尼龙针头过滤器过滤，并使用HPLC分析药物浓度。HPLC条件：柱子：C18，SymmetryShield RP，Waters，4.6×150毫米，3.5微米；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％的TFA水溶液；流速：1毫升/分钟；运行时间：30分钟；注射体积：20微升；检测波长：210纳米；溶解溶剂：乙腈/水(50:50，体积：体积)。结果如表4所示。

所用梯度：

时间％A ％B

0分钟 5 95

25分钟 95 5

27分钟 5 95

30分钟 5 95

熔点

熔点在MEL-TEMP 3.0毛细管熔点仪上测定，未经修正。

前药的定量

使用LC/MS/MS对来自这些体外实验的淬火样品进行定量。在Phenomonex Primesphere C18-HC柱子(5微米，30×2.0毫米)上使用由溶剂A(95％水/5％乙腈/0.1％乙酸)和溶剂B(5％水/95％乙腈/0.1％乙酸)组成二元梯度液实现分离。注射体积为20微升。对柱子实施平衡，梯度从流速为1000微升/分钟的100％A起始。在0.4分钟内，该梯度变化为100％B，且然后经0.9分钟返回至100％A。使用氨苄西林作为内标(5微克/毫升)。通过安装有涡轮离子喷雾接口的质谱检测仪(Sciex API 3000)分析流出物，该检测仪在去簇电压(declustering potential)为10伏、温度为400℃且碰撞能量为25伏的阳离子模式下运作。在碰撞诱导解离谱中，通过质子化的母体质量到主片段离子的MRM转变，来监测所有前药、硫培南和氨苄西林。该试验的典型动态范围在10.0至10,000纳克/毫升范围内。

表4

损耗肉碱

相对于羧酸的α碳被完全取代的小烷基酸(如新戊酸)不能通过β-氧化充分降解。因此，肉碱被酰化，且酰基肉碱积累在组织和血流中，从而使游离肉碱浓度降低。因此，α碳被完全取代的酸为降低体内肉碱储量提供了可能。参见Brass，见上文。这已表明在使用含新戊酸前药的短期治疗中，肉碱损耗会影响脂肪酸氧化并影响酮体生成。参见Abrahamsson等人的Biochem.Med.Metab.Biol.，52，18-21(1994)。期望前药侧链能被快速、安全地清除且不会损耗体内的肉碱储量。某些小烷基酸代谢转化为其葡糖苷酸共轭物是一条从体内清除的有效途径。例如，已表明可通过葡糖苷酸化大量清除丙戊酸(valproic acid)(参见Zaccara等人的Clin.Pharmacol.，15，367-389(1988))，而在人体中新戊酸以其酰基肉碱共轭物的形式几乎被完全排泄出。参见Totsuka等人的Antimicrob.Agents andChemother.，36，757-761(1992)。应理解到，结构上的细微变化可转变为这些烷酸的代谢处置上的重大差异。

某些小烷基酸代谢转化为其葡糖苷酸共轭物提供了一条可从体内清除的有效途径。例如，已表明可通过葡糖苷酸化大量清除丙戊酸(参见Zaccara等人的Clin.Pharmacol.，15，367-389(1988))，而在人体中新戊酸以其酰基肉碱共轭物的形式几乎被完全排泄出。

令人感兴趣的是，在代谢完整前药后，对化合物1与化合物B1之间的前药侧链损耗血浆肉碱的倾向或不存在此倾向进行比较。这在Sprague-Dawley大鼠中使用肉碱损耗急性模型实施体内评估。为解释体内的潜在影响，以200毫克/千克BID的剂量将放射性标记的新戊酸(化合物B1侧链)和2-乙基丁酸(化合物1侧链)经口施予2个单独动物组共4天。在羰基碳(1-位)上用¹⁴C标记新戊酸，该新戊酸具有0.482 μCi/mg的比活性。与羰基碳相邻的碳(2-位)上用¹⁴C标记2-乙基丁酸，该2-乙基丁酸具有0.503μCi/mg的比活性。以10毫升/千克的剂量体积施予在100mM磷酸钠(pH6.6)中的各剂量。研究开始后间隔24小时获取血样，处理得到血浆并通过LC/MS/MS分析肉碱水平。完成口服相等体积不含化合物的缓冲液的媒介对照实验以作为基线比较。如图1所示，接受200毫克/千克BID新戊酸的动物相对于媒介对照显示低血浆肉碱水平。与之相比，在4天时间里接受相同剂量2-乙基丁酸的动物表明血浆肉碱没有显著的统计学变化，这表明了该化合物不会导致肉碱损耗。

在大鼠中使用单一200毫克/千克剂量的各个经放射性标记的化合物(新戊酸和2-乙基丁酸)完成各自的研究，以测定口服后全身性剂量暴露量。选择口服路径的原因是，预测该前药在进入全身循环之前在肠中发生大部分水解。在给药之前和给药后第0.25、0.5、1、4、8和24小时时获得血浆样品。通过液相闪烁计数对样品的放射性进行定量，并将该计数转换成微克当量/毫升。如表5和图2中所示，一旦吸收，2-乙基丁酸放射活性的消除比新戊酸快4.5倍，这反映了对该化合物的代谢处理及排泄有效。

因此，预测口服前药化合物1不会导致肉碱损耗，而施予化合物B1会导致肉碱损耗。

表5.以200毫克/千克(100μCi/kg)的剂量口服 ¹⁴ C-新戊酸或 ¹⁴ C-2-乙基丁酸后在Sprague-Dawley大鼠中总放射性的药物代谢动力学

施予的化合物	Cmax(微克当量/毫升)	半衰期(小时)	AUC(小时*微克当量/毫升)	CL/F(毫升/小时/千克)
					新戊酸	247±36	13.8±6.7	6624±2948	35.6±14.3
2-乙基丁酸	158±47	5.7±0.8	1332±402	163.3±53.5

其它特性

为了便于调配药物产品和适于作为药物产品的目的，在一些实施例中，该化合物优选在室温下为固体，优选易于形成结晶固体，且对降解合理稳定。

讨论

经测定化合物1显示多种有益特性。除了为晶体且在水中充分可溶以外，化合物1在肝S9实验中完全转化成硫培南，显示相对较长的PPE半衰期及对人肠液中的肠道酶的内在清除率和饱和度相对较低。基于这个数据，预测化合物1可显示有益的临床PK，这被上述临床数据证实。而且，通过化合物1的结构和本文所阐述的肉碱作用证实，该化合物1不对肉碱产生作用。因此，化合物1同时具有至少以下所有特性：良好的口服生物利用度、不对肉碱产生作用和有利的物理特性。比较而言，预测其它前药，尤其是带有烷基侧链的其它前药，不具有上述属性。例如，化合物C至AA中的一些在前体部分的酯羰基上具有叔α碳(例如，化合物C)。预测它们对肉碱具有潜在的作用。其它测试化合物具有相对低的PPE稳定性和/或S9转化率，这预示了更低的GI稳定性和口服生物利用度。还有其它化合物因难以获得易于测试的样品而未予以测试。参见表4。

显示前药化合物2也具有有利的属性，这些有利属性包括其预测的GI稳定性和生物利用度以及物理特性。参见表4。

化合物实例

将通过以下非限制性实例进一步阐明本发明。用于本实例中的结晶硫培南根据美国专利5013729的实例11制备。

实例1：(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙基-1-氧代丁氧基)甲基酯(化合物1)。

根据以下方案和描述制备标题化合物。

步骤1：将2-乙基丁酸(1500克)经1小时加至亚硫酰氯(1800克)在二氯甲烷(0.75升)的溶液中。加热该混合物至回流且通过GC(气相色谱)监测。大约2小时后，通过在大气压力下蒸馏来浓缩该反应混合物。然后将其冷却至22℃，加入二氯甲烷(0.75升)，并在大气压力下再次浓缩该混合物。因为所使用试剂具有高度腐蚀性，因此所有废气都流经湿苛性碱洗涤器。

步骤2：同时，制备氯化锌(18克)与低聚甲醛(480克)的混合物。在环境温度下将半成品纯酰氯在1小时内添加至该混合物中，同时进行机械搅拌。在一小段诱导期后，观察到显著的放热。该反应混合物的温度在5分钟内由环境温度(25℃)上升至50℃。减缓添加速率以控制放热，并将反应保持在50℃下。添加完成后，使该反应混合物冷却，并在环境温度下额外搅拌18小时。

然后加入正庚烷(4升)和10％碳酸氢钠水溶液(9升)并使各相分离。采用正庚烷(3.4升)萃取水相。将合并的有机相过滤，并在真空下蒸馏，从而得到粗制品。通过真空蒸馏(10-20mmHg)纯化该产物得到587克2-乙基丁酸氯甲基酯。

步骤3：将2-乙基丁酸氯甲基酯(700克)溶解于丙酮(3升)中。将碘化钠(1.0千克)添加至这个溶液中。将所得反应混合物加热回流直至反应完成(2小时，通过GC监测)。然后将该溶液冷却至环境温度，并于其中添加叔丁基甲基醚(7升)和5％硫代硫酸钠水溶液(4升)。分离各相，并以硫代硫酸钠水溶液(4升)、低热原水(4升)和10％氯化钠溶液(4升)洗涤有机相。将有机层通过硫酸镁(350克)干燥、过滤并以叔丁基甲基醚(2×0.7升)洗涤滤饼。将该滤液蒸发至小体积(大约2升)以得到2-乙基丁酸碘甲基酯在叔丁基甲基醚中的溶液。

步骤4：将来自步骤3的半成品2-乙基丁酸碘甲基酯的叔丁基甲基醚溶液添加至硫培南在丙酮(5.9升)中浆液(750克)中。添加N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)(319克)在丙酮(0.5升)中的溶液，并在环境温度下搅拌该混合物直至反应完成。添加低热原水(6.5升)和庚烷(3.75升)并分离各相。首先以庚烷(5升)然后以乙酸乙酯(2×6升)萃取水层。将乙酸乙酯萃取物合并，并以5％硫代硫酸钠溶液(6升)、低热原水(6升)和10％氯化钠水溶液(6升)洗涤。以活性碳(75克)和硫酸镁(150克)对有机萃取物进行处理，然后过滤。以乙酸乙酯(2×1升)洗涤滤饼，并将滤液蒸发至干燥以提供粗产物(0.8千克)。添加乙酸乙酯(2.4升)并加热该溶液(45℃)以实现溶解。然后对该溶液实施热过滤，并添加叔丁基甲基醚(4.7升)。在40℃至50℃下使所得浆液粒化10分钟，然后缓慢冷却至10℃以下。收集所得固体，以乙酸乙酯与叔丁基甲基醚(4×0.5升)的1:2混合物洗涤，并在真空、高达50℃下干燥至恒重以得到0.57千克期望产物(60％产率)。

步骤5：在环境温度下，将半粗制产物(0.55千克)在乙酸乙酯(1.65升)中浆化。然后将温度调节至大约50℃以实现溶解。对该溶液实施热过滤，以除去不溶杂质，然后添加叔丁基甲基醚(3.6升)。将所得溶液缓慢冷却至5℃以下，以引发结晶。收集固体产物，以乙酸乙酯与叔丁基甲基醚(4×150毫升)的1:2混合物洗涤并在真空、高达50℃下干燥至恒重以得到0.48千克期望产物(86％产率)。经测定该结晶物质为非溶剂化物。

¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)：5.71(m，3H)，5.19(d，1H，J＝4.56Hz)，3.92(m，2H)，3.81(m，1H)，3.70(m，1H)，2.96(m，1H)，2.80(m，1H)，2.65(m，2H)，2.36(m，1H)，2.19(m，1H)，1.45(m，4H)，1.10(d，3H，J＝6.22Hz)，0.78(t，6H)。

熔点：105℃；质谱：(M+H)⁺478。

分子量：477.92克/摩尔；分子式：C₁₉H₂₇NO₇S₃。

水溶解度(pH5磷酸盐缓冲液，25℃)：1209微克/毫升。

对采用上述步骤5的方式制备的化合物1晶体进行X-射线粉末衍射。以装备有石墨单色光镜和在50kV、40mA下运行的Cu(λ＝1.54埃)X-射线源的Siemens D500自动粉末衍射仪分析样品。使用NBS云母标样实施2θ校准。使用零背景样品板制备样品。化合物1晶体的衍射图案示于图3中并列表于图5中。

实例2：(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙氧基-2-甲基-1-氧代丙氧基)甲基酯(化合物2)。

根据以下方案和描述制备标题化合物

在步骤1-4中，2-羟基-异丁酸被苄基溴保护，被碘化乙烷烷基化，被脱保护并被酯化以提供2-乙氧基-异丁酸氯甲基酯。

在步骤5中，在适当的反应烧瓶中，将碘化钠(23.9克，159.45毫摩尔，1.6当量)溶解于丙酮(96毫升)中。然后添加2-乙氧基-异丁酸氯甲基酯(18克，99.65毫摩尔，1当量)在额外丙酮(18毫升)中的溶液，然后在氮气氛下将反应混合物加热回流约2小时。通过GC监测该反应。完全转化后，边搅拌边将反应物冷却至室温。然后使反应物在庚烷(120毫升)和10％硫代硫酸钠水溶液(105毫升)之间分配。搅拌反应容器的物质至少5分钟，然后使各相分离。留下轻有机相，并丢弃较重水相。然后以第二部分10％硫代硫酸钠水溶液(105毫升)洗涤有机相，并在分离后再次丢弃较重的相。然后以10％氯化钠水溶液(105毫升)洗涤有机层。丢弃较重的水相，然后在低压(<35℃)下浓缩有机相。这提供了16.26克2-乙氧基-异丁酸碘甲基酯，其未经额外纯化(分析：～60％)即用于随后的化学反应中。

在步骤6中，将硫培南(13.92克，39.83毫摩尔，1当量)和丙酮(110毫升)加入在氮气氛下的适当反应容器中。然后添加在丙酮(14毫升)中的2-乙氧基-异丁酸碘甲基酯(16.26克，59.9毫摩尔，1.5当量，100％效力)，并搅拌该悬浮液至少10分钟。然后添加在丙酮(14毫升)中的N，N-二异丙基乙基胺(5.11克，39.54毫摩尔，1当量)，并将内部温度保持在<35℃(放热)。在环境温度下搅拌该反应混合物整夜(大约2小时后，硫培南已溶解)。然后使反应混合物在庚烷(80毫升)和水(129毫升)之间分配，然后搅拌反应容器中的物质至少5分钟。分离各相，丢弃较轻的有机相。以额外的庚烷(80毫升)洗涤较重的相。再次分离各相，且丢弃较轻的有机相。然后在低压下将该反应容器中的物质浓缩大约50％，同时将内部温度保持在低于35℃。添加乙酸乙酯(120毫升)，且搅拌反应容器中的物质至少5分钟。使各相分离，且留下较轻的有机相。以额外的乙酸乙酯(2×120毫升)反萃取较重的水相。将合并的有机相采用10％硫代硫酸钠水溶液(120毫升)、水(120毫升)和10％氯化钠水溶液(120毫升)进行洗涤。然后在环境温度下以活性碳(2.9克)、硅藻土(2.9克)和硫酸镁(MgSO₄)(8.2克)处理有机相并搅拌至少1小时。通过过滤除去固体后，在低压下浓缩该溶液，并将内部温度保持在低于45℃(乙酸乙酯沸点76.5-77.5℃)。

步骤7：将所得在乙酸乙酯(100毫升)中的粗制化合物2(23克)加热接近回流以完全溶解该固体，且随后逐渐添加叔丁基甲基醚(100毫升)并保持60℃的内部温度以回流。在60℃下缓慢搅拌所得混合物以回流5分钟，随后在5-15℃下粒化该混合物至少1小时。将白色至米色产物进行过滤，以甲基叔丁基醚(MTBE)(28毫升)洗涤并在环境温度、真空下干燥至少16小时。这得到白色固状产物(化合物2)(12.57克，63.9％产率)。

对这个产物的晶体进行X-射线粉末衍射射。以装备石墨单色光镜及在50kV、40mA下运行的Cu(λ＝1.54埃)X-射线源的Siemens D500自动粉末绕射仪分析样品。使用NBS云母标样实施2θ校准。使用零背景样品板制备样品。该衍射图案示于图4并列表于图6中。

¹H NMR：(d₆-DMSO，400MHz)：5.83(d，1H，J＝5.81Hz)5.73(m，2H)，5.20(m，1H)，3.92(m，2H)，3.81(m，1H)，3.70(m，1H)，3.28(q，2H，J＝7.05Hz)，2.96(m，1H)，2.80(m，1H)，2.65(m，2H)，2.36(m，1H)，1.29(s，6H)，1.10(d，3H，J＝6.63Hz)，1.00(t，3H，J＝6.63Hz)。

熔点：111-113℃。

分子量：493.62克/摩尔；分子式：C₁₉H₂₇NO₈S₃。

水溶解度(pH5磷酸盐缓冲液，25℃)：2900微克/毫升。

Claims

1.化合物(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙基-1-氧代丁氧基)甲基酯。

2.如权利要求1所述的化合物，所述化合物是结晶形式的(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙基-1-氧代丁氧基)甲基酯，其具有与图3基本相同的X-射线粉末衍射图案和与图5基本上相同的X-射线粉末衍射峰。

3.化合物(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙氧基-2-甲基-1-氧代丙氧基)甲基酯。

4.如权利要求3所述的化合物，所述化合物是结晶形式的(5R，6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R，3S)-四氢-1-氧代-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(2-乙氧基-2-甲基-1-氧代丙氧基)甲基酯，其具有与图4基本上相同的X-射线粉末衍射图案和与图6基本上相同的X-射线粉末衍射峰。

5.一种包含800mg至2.5g的权利要求1至4中任意一项所述的化合物的药物组合物，所述组合物与一种或多种赋形剂和/或一种或多种其它活性成分一起调配用于口服，或者在没有一种或多种赋形剂和/或一种或多种其它活性成分的情况下调配用于口服。

6.如权利要求1至4中任意一项所述的化合物在制造药物中的用途，所述药物用于通过口服来治疗需要所述药物的人中的细菌感染。