CN101467038B - 即用全血收集容器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于收集和处理全血样品的采样管。该采样管含有用于差异溶血全血的试剂，其中所述用于差异溶血的试剂含有用于差异溶血的化学品和抗凝剂，其中所述采样管为即用型一次性使用的采样管。本发明还涉及所述采样管在处理液相色谱的全血样品中的用途，还涉及在此采样管中处理过的血样在基于液相色谱的分析中的用途。

Description

即用全血收集容器
本发明涉及用于收集和处理全血样品的采样管。该采样管含有用于差异溶血全血的试剂，其中所述用于差异溶血的试剂含有用于差异溶血的化学品和抗凝剂，其中所述采样管为即用型(ready-to-use)一次性使用的采样管。本发明还涉及所述采样管在处理液相色谱的全血样品中的用途，还涉及在此采样管中处理过的血样在基于液相色谱的分析中的用途。 
发明背景
在临床常规中，血液是最重要的待分析样品源。尽管全血是首先获得的样品，但全血样品通常必须进一步处理，以便进行便利的样品操作或可靠的分析物检测。 
样品中存在的成分越多，分析其中包含的目标分析物就越困难。红细胞含有显著量的蛋白和小分子量成分，其潜在干扰待检测的任何分析物。这就是为什么在临床常规中优选分别使用血浆(经常简称为血浆，即抗凝结的全血样品；没有细胞和红细胞)或血清(经常简称为血清，即凝结的全血；没有细胞、红细胞和凝血系统的大部分蛋白，尤其是没有血纤维蛋白/血纤维蛋白原)的主要原因之一。全血样品往往还更难以操作，例如与血清或血浆相比。全血往往不稳定，红细胞的缓慢破裂损害相当多的目标分析物的可靠检测。另外，全血样品的运输和储存需要特殊的防护措施。 
如果必须检测全血中的分析物，一般习惯于收集全血样品并在用适宜的抗凝剂收集血液的过程中或之后立即处理该样品。在临床常规中，预装有适宜的抗凝剂的管用于收集全血样品。顾名思义，这些抗凝剂阻断凝结系统的活化。血细胞和红细胞应尽可能多并尽可能长时 间地保持完整。对抗凝结的血液必须非常小心地操作，以便避免例如由血细胞或红细胞沉降引起的问题，或由红细胞裂解引起的问题。通常，等份试样的该抗凝结全血样品随后用于检测目标分析物，例如至少部分地包含在红细胞中的分析物。 
另外，在这一方面，目前在所有现有的在线检测方法中使用全血样品似乎都不可行。例如，在需要基于液相色谱(LC)的分离步骤的临床诊断常规程序中，不可能使用全血样品。常规液相色谱分离通常基于基本上由保护柱材料的过滤单元或滤头和分离目标分析物所需的柱材料组成的柱子。如果将全血施加于这样的柱子，则该柱将相当快地乃至立刻被阻塞，这取决于柱子大小和系统。该问题使得几乎不可能在与例如在临床常规诊断中优选的LC-法组合的在线检测方法中使用全血。目前，似乎必须通过例如离心、过滤、沉淀或分析物提取适宜地分离/处理血样，然后可以正确地和可靠地分析这些已处理样品。 
如上所述，可由全血获得血清或血浆，并用于检测分析物。在理论上，细胞和红细胞还可以通过过滤或离心由全血中除去。然而，这些方法既不适用于常规诊断环境，又不会使它们正确检测至少部分地存在于红细胞中的那些分析物。 
在另一种样品处理方式中，首先通过选择性沉淀或提取方法将目标分析物与大量潜在干扰物质分离。提取可以在液相中或在固相上进行。这将通过举例说明用于检测免疫抑制药物的某些方法加以例证。 
众所周知的免疫抑制药物为例如霉酚酸酯(MMF)、雷帕霉素(RAPA，也称为西罗莫司)和他克莫司(FK-506)。免疫抑制药物的治疗药物监测对移植患者以及罹患AIDS的患者尤其重要(参见例如：Drug.Ther.Perspect 17(2001)8-12)。进行实体器官移植的大部分患者需要终身的免疫抑制治疗，以防止同种异体移植排斥。但是，因为许多免疫抑制剂的治疗范围(也称为治疗窗)狭窄，并伴有多种毒性和药物相互作用潜力，所以治疗药物监测(TDM)连同患者的临床评价一起使用可能特别重要。
霉酚酸酯是一种前药。在口服给药后，霉酚酸酯(MMF)在肠和血液中进行快速水解，形成其活性代谢物霉酚酸(MPA)。MMF可广泛应用，在美国和英国被批准与皮质类固醇和环孢菌素联合用于预防肾脏、肝脏或心脏的同种异体移植排斥。该药物在降低肾脏同种异体移植的急性排斥发病率方面已证实优于咪唑硫嘌呤。治疗剂谷浓度在1-3.5mg/L的范围内。MMF可由血浆和全血检测。 
他克莫司是大环内酯抗生素，首先由美国食品和药品监督管理局(FDA)于1994年批准用于预防肝脏同种异体移植排斥。其在体外的效力高达环孢菌素的100倍，在临床上，其与组织排斥发病率的大幅下降相关。他克莫司在进行各种不同移植程序的患者中作为一线免疫抑制治疗和作为拯救治疗用于肝脏或肾脏移植后难医治的急性同种异体移植排斥患者这两方面均已经证实有效。治疗剂谷浓度在5-20μg/L的范围内。 
因为循环中存在的至少部分他克莫司被分隔在红细胞中，所以在该药物的临床常规检测中使用全血样品。他克莫司例如可以通过高效液相层析(HPLC)、HPLC质谱(MS)、放射性受体测定(RRA)或免疫测定(IA)检测。后两种方法检测他克莫司及其多种代谢物中的某一些的灵敏度不同。这可能对所用方法产生干扰(Murthy，J.N.等，Clin.Biochem.31(1998)613-617)。至少在多种他克莫司代谢物的检测中HPLC-MS-法可被认为是金标准。然而，以上提及的所有方法均需要由全血提取他克莫司。通常，在临床常规中使用乙腈由全血提取他克莫司，似乎不存在会允许由全血样品在线检测他克莫司的方法。 
西罗莫司和他克莫司一样，是一种大环内酯抗生素。其首先在1999年被US FDA批准用于预防肾脏移植后的同种异体移植排斥，实际上其在联合环孢菌素和皮质类固醇急性使用时在这方面已经显示出有前景的结果。在体外，西罗莫司的效力高达环孢菌素的100倍，在临床上，其可以与环孢菌素表现出协同性，这可能使环孢菌素剂量下降。治疗剂谷浓度在5-15μg/L的范围内。
对于他克莫司，在红细胞中存在显著量的西罗莫司。因此，不论使用哪种检测方法，都需要提取全血样品。在临床常规中，对疑似含有西罗莫司的样品进行HPLC，西罗莫司通过紫外线(UV)或通过MS/MS检测。最近，还已描述了一种微粒酶免疫测定(Jones，K.等，Clinical Therapeutics 22，增刊B(2000)B49-B61)。 
叶酸是氧化状态不同的一类相关分子的共同名称。叶酸是水溶性维生素B族的组成部分，作为辅酶对高半胱氨酸代谢和DNA复制所需的一碳基团的转移很重要。叶酸不足状态与神经管缺陷的风险增加相关，与心血管疾病、贫血、某些癌症和阿尔茨海默氏病有关联。血清或血浆叶酸浓度反映出近期的膳食摄取，而红细胞叶酸浓度更加表现出身体储备(Gunter，E.W.等，Clin.Chem.42(1996)1689-1694；Fazili，Z.等，Clin.Chem.51(2005)2318-2325；Pfeiffer，C.M.等，Clin.Chem.50(2004)423-432)。红细胞总叶酸(红细胞叶酸＝RBC-叶酸)是整个机体叶酸状态的最佳检测。近期的研究已经表明，5-甲基四氢叶酸是循环红细胞中的优势叶酸类维生素。为了诊断叶酸缺乏，推荐不仅由血清或血浆进行测定，而且由红细胞进行测定，因为95％以上的叶酸位于后者当中。红细胞中的浓度更真实地反映了实际叶酸状态。 
众多方法可用于检测不同基质中的叶酸。主要的分析方法是微生物测定、放射免疫测定、化学发光、色谱法和质谱法。大部分方法基于与叶酸结合蛋白竞争性结合叶酸。 
为了检测RBC-叶酸，使用溶血试剂明显是强制性的。例如，用于测定RBC叶酸的ElecsysTM测定(Elecsys是Roche Group成员的商标)使用抗坏血酸作为裂解试剂。Elecsys RBC-叶酸溶血试剂与Elecsys叶酸测定一起用于红细胞中叶酸(RBC-叶酸)的定量测定。用抗坏血酸溶液(0.2％)稀释用抗凝剂(肝素或EDTA)处理的全血，并于20-25℃温育约90分钟。红细胞发生裂解，释放胞内叶酸。然后，溶血产物用作“预稀释”样品(和血清类似)，用于随后在Elecsys叶酸测定中进行检测。在全血中测定的血细胞比容值和通过预处理样品产生的稀释作用 在红细胞叶酸浓度计算中被补偿(Greiling，H.，Gressner，A.M.，Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie，第3版，Stuttgart，New York，Schattauer(1995)460-462页；Gunter，E.W.等，Clin.Chem.42(1996)1689-1694)。 
用抗坏血酸处理产生的溶血产物不能用于常规色谱方法。为了在色谱方法或质谱测定中使用这样的溶血产物，必须在分析前除去细胞碎片和沉淀蛋白。 
通常通过离心、离线过滤或固相提取由样品中除去碎片和沉淀蛋白。 
固相提取(SPE)是一种例如广泛用于预浓缩和后处理分析样品、纯化多种化学品和由水溶液中除去毒性物质或取出有价值物质的色谱技术。SPE通常使用含有适当树脂的柱或筒进行。已开发出使用吸附剂的SPE方法，所述吸附剂可通过疏水、离子交换、螯合、吸附和其它机制与分析物相互作用，以结合和除去流体中的分析物。因为用于不同类型分析物的不同SPE应用可能需要不同的吸附剂，所以伴随需要具有特定特性的吸附剂，其对目标分析物或目标分析物类型具有专一选择性。SPE材料和SPE柱的代表性实例可分别见于US6,322,695和US 6,723,236。 
和相当多的其它目标分析物一样，似乎没有可用的方法会允许以在线方法由全血样品检测西罗莫司或他克莫司。 
血红蛋白自身的浓度以及糖化血红蛋白(HbAlc)对非糖化血红蛋白的比率是血液学和糖尿病的重要分析物。在该类评价中，包含在全血样品中的红细胞被裂解，然后检测血红蛋白。US6,050,956描述了预装有标准化量的血液溶解液的溶血管。然而，全血首先被收集到常规采血管中。此后，将血液以1加100稀释入溶血管中。由于血红蛋白的浓度非常高，所以全血的1加100稀释度是可以接受的，不需要差异溶血，即不需要溶血来避免如蛋白沉淀和/或DNA释放的不利副作用。
Coulter International Inc.的多个同族专利，如US 5,874,310、EP1000 356、EP 0 874 988、EP 0 305 491或EP 0 185 048，涉及血液学领域，尤其是涉及血细胞分析。EP 1 000 356例如描述了一种用于稀释血样的改善的稀释剂，其适于单个血样中的血细胞的计数和筛分、血红蛋白参数的测定和白细胞亚群的分化。分析使用适宜的电子设备进行。对于该分析，血液通常由医师收集，然后必须运输到临床实验室，仅仅在分析前不久才加入溶解试剂。 
显而易见的是，小心运输抗凝结的全血样品是至关重要的。必须避免冷冻和温度升高。还有与运输抗凝结的全血样品相关的显著的生物危害。在运输过程中泄露或破裂的管可能污染包装材料，或者可能是传染性的。 
由上述现有技术状态显而易见的是，全血在临床常规中还是没有受到足够的重视(stepchild)。所有的常规方法即便在现今也似乎需要抗凝处理、高度稀释样品和/或将目标分析物或某些类型的化合物与包含在该样品中的剩余化合物分离或分级分离。另外，似乎没有可用的在线检测全血样品的方法。 
然而，如果全血可直接并容易地用作样品，则它应当是高度合乎需要的。这应当尤其有利于利用液相色谱(LC)分离步骤的在线检测方法。同样显而易见的是，直接处理全血样品使处理过的样品更易于储存、操作和运输，对临床常规诊断应用应当是一个重大的进步。 
令人惊奇的是，现在已经发现并可以确认，将全血样品收集到即用型一次性使用的全血采样管中是极为有利的，所述采样管预装有用于差异溶血所述全血样品的试剂。本发明的采样管极大地促进了全血样品的使用，使该样品的操作还有该样品的运输容易且便利，并允许直接检测全血样品中的分析物。将全血收集到本发明的采样管中，例如使全血成为适于通过色谱直接分离的样品，和例如通过质谱法进行检测的分析物。这对于在红细胞中也以相关程度存在的分析物尤其有价值，所述分析物例如为叶酸或免疫抑制药物西罗莫司和他克莫司。
发明概述
在第一个实施方案中，本发明涉及收集和加工全血样品的采样管，所述采样管含有用于差异溶血所述全血样品的试剂，其中所述差异溶血试剂含有用于差异溶血的化学品和抗凝剂，其中所述采样管为即用型一次性使用的采样管。 
在又一个实施方案中，本发明涉及本发明的采样管在用于液相色谱的全血样品处理中的用途。 
在又一个实施方案中，本发明描述了在本发明的采样管中通过差异溶血获得的已处理血样在基于液相色谱的分析中的用途。 
本发明还涉及适于差异溶血全血样品的试剂组合物在用于液相色谱的全血样品处理中的用途，其中所述试剂组合物包含抗凝剂。 
发明详述
在优选的实施方案中，本发明涉及用于收集和处理全血样品的采样管，该采样管含有用于差异溶血所述全血样品的试剂，其中所述差异溶血试剂包含用于差异溶血的化学品和抗凝剂，其中所述采样管为即用型一次性使用的采样管。 
在本发明意义上，“抗凝剂”是用于阻止实验室血液标本凝结的物质。这些物质包括肝素和几种使钙离子不能用于凝结过程并由此防止形成凝结的物质；这些物质包括例如乙二胺四乙酸(通常称为EDTA)、EGTA、柠檬酸盐、草酸盐和氟化物。用于本发明采样管中的差异溶血试剂的优选抗凝剂为肝素、EGTA和柠檬酸盐。优选地，抗凝剂为肝素或柠檬酸盐。 
本发明的“采样管”可以为具有适于容纳收集的血样的贮存库的任何装置。技术人员会意识到，采样管实际上优选为管状物。优选地，采样管具有适于匹配自动化分析仪的样品接受站要求的大小和尺寸，所述自动化分析仪例如为Roche Diagnostics的Elecsys
Figure G200780021092XD00071
分析仪。采样 管可以具有圆锥形底或优选具有圆底。在临床常规中，使用标准管尺寸，其与市场上的分析仪系统相适。标准并优选的管例如具有以下尺寸：13×75mm、13×100mm或16×100mm。 
本文使用的冠词“一种”或者没有翻译出不定冠词的名词是指一个或一个以上(即至少一个)的冠词的语法宾语。作为实例，没有译出不定冠词的“红细胞”意指1个红细胞或1个以上的红细胞。 
本发明的采样管预装有差异溶血试剂，即其含有该试剂。该管以即用形式提供给用户。用户不需要制备或处理差异溶血试剂，因为其提供了适于实现血样的差异溶血的量和浓度。 
在又一个优选实施方案中，本发明的采样管具有低于大气压的内部压力。优选地，采样管提供与BD Diagnostics，Franklin Lakes，NJ经销的vacutainer
Figure G200780021092XD0008101852QIETU
品牌系相关的优势。 
本发明的血液收集管仅使用一次，即其是一次性使用装置。 
本发明的采样管不仅适于收集全血样品，而且适于对全血样品进行处理。通过将全血收集到预装有差异溶血试剂的采样管中，实现所需结果，即差异溶血。 
在本发明的又一个优选的实施方案中，用于收集和处理全血样品的采样管的特征还在于，差异溶血试剂引起红细胞细胞膜裂解，同时不会引起样品成分沉淀。 
在本发明意义上，“红细胞”为不具有细胞核的红细胞。这样的不具有细胞核的红细胞例如为存在于哺乳动物循环中的成熟红细胞。本发明不涉及有核红细胞，例如已知得自鸟类物种的有核红细胞。后者应满足有核细胞或真核细胞的标准。 
用于本发明用途的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、竞赛动物或宠物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选地，所述哺乳动物为人。 
在本发明意义上，“真核细胞”或“有核细胞”为来源于真核生 物并仍具有其细胞核的细胞。真核细胞的实例为来源于有核组织的细胞、有核组织培养细胞和有核血细胞。在一个优选实施方案中，真核细胞为有核血细胞，如血小板、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或白细胞。低等生物如细菌的细胞，尽管含有遗传物质，但不是真核细胞。 
根据本发明，全血样品被装填到即用型采样管中。将该样品与所述管中含有的差异溶血试剂混合，由此实现差异溶血。使用适宜的差异溶血试剂确保满足以下两种要求：a)裂解红细胞膜和b)同时不引起样品成分沉淀。在本文中，使红细胞膜破裂但同时不引起样品成分沉淀的过程或处理称为差异溶血。处理过/处理后的样品被称为已差异溶血的血液或已差异溶血的血样。 
优选差异溶血试剂将使样品中存在的红细胞的至少95％裂解。进一步优选的差异溶血试剂将使样品中存在的红细胞的至少97％、98％、99％、99.5％裂解。 
尽管希望不囿于以下理论，但是人们仍然可能认为有利的平衡点(在该平衡点时红细胞膜破裂，但同时不引起样品成分沉淀)是克服本领域已知的至少某些问题所必需的。通过在适宜的条件下应用合适的差异溶血试剂，细胞膜失去完整性，而完整的细胞膜是例如屏蔽红细胞内容物和血浆所必需的。红细胞内容物(例如血红蛋白，还有某些目标分析物)被释放到周围液体中。同时不引起样品成分沉淀。 
本领域技术人员会意识到，可能干扰随后分析的样品成分尤其可能分别为DNA和变性蛋白。只要真核细胞(例如淋巴细胞或单核细胞)的核不被破坏，则这些细胞核不会释放DNA。只要没有蛋白沉淀，包含在进行差异溶血的样品中的蛋白不会干扰(至少未达到显著程度)色谱步骤或分析。 
例如通过适宜的活体染色可易于评价红细胞的完整性。在本发明的一个优选实施方案中，使用锥虫蓝，以便评价红细胞膜的完整性。完整的红细胞不累积锥虫蓝，而膜破裂的红细胞被锥虫蓝染色。在用 锥虫蓝染色样品后，红细胞的膜完整性易于在显微镜下评价。破裂红细胞的百分率如下计算：计数处理之前和之后的完整红细胞，然后用前一数目除后一数目，之后将该值乘以100。溶解的红细胞被称为裂解红细胞。 
适宜的处理将裂解红细胞，但同时不会引起样品成分沉淀。预期适于本发明方法的溶血处理也会影响真核细胞的外膜。然而，能够并且必须注意的是，没有包含在细胞核中的DNA释放到样品中。用于差异溶血的溶血试剂和条件优选不影响核膜，从而细胞核在宏观上是完整的，或者至少DNA不会由其周围的稳定DNA的核蛋白中释放出来。如果DNA会被显著程度地释放，则该DNA可能乃至会干扰样品的进一步操作。释放的DNA例如趋向于使液体非常粘稠。那么，就不再可能移取或转移这些样品或使其通过某些滤器或柱子。 
此外，能够并且必须注意的是，不要发生蛋白沉淀。本领域技术人员知晓，在生物样品(例如全血样品)中存在许许多多不同的蛋白。所有这些蛋白都具有影响它们沉淀或聚集的趋势的不同特性。 
现已发现，可以描述和定义是否可以在合适的条件下用差异溶血试剂进行如该术语所述的样品处理，以便一方面裂解红细胞细胞膜，同时不引起样品成分沉淀。未裂解的红细胞以及沉淀的样品成分这二者对这样的样品的特性均具有负面影响。 
差异溶血的条件是否适合可容易地并优选通过使用以下标准化步骤确定。1:10稀释血细胞比容为40的全血样品，然后与候选溶血试剂1:1混合。目测观察产生差异溶血的试剂的效率。在红细胞裂解时，混合物变得澄清。如果发生样品成分沉淀，则样品变得混浊或粘稠或二者兼有。 
如上所述，可容易地目测评价用于本发明的差异溶血方法的条件。如果全血样品与适宜的候选差异溶血试剂温育，则溶解红细胞所需的最小浓度可被认为是使混浊血样透明或澄清的浓度。最高的可能浓度是仍产生透明且不粘稠的样品的浓度。
确定候选溶血试剂的适宜的最小终浓度已变得相当容易，因为该浓度导致所处理的全血样品的透明度发生变化。该透明度变化与这些已处理样品对通过HPLC直接分析的适宜性良好关联。 
溶血试剂的最大浓度可能是仍不引起DNA释放和/或蛋白沉淀的浓度。由此，样品会变得粘稠或混浊或二者兼有，并且不再适于直接HPLC应用。而粘度和混浊度可目测跟踪，优选通过如下所述的HPLC法证实溶血试剂的最大浓度。 
仍含有太多未裂解的红细胞的全血样品以及含有沉淀的样品成分的已处理全血样品将不适于任何色谱步骤。这就是为什么优选通过以标准化方式将用候选差异溶血试剂处理的全血样品施加于HPLC柱来确定适于产生差异溶血的条件的原因。 
将50×10μl处理过的全血样品施加至HPLC柱，评价不完全的溶血和/或样品成分沉淀。为了评价候选化学品或试剂是否适于差异溶血，将所述溶血试剂与全血样品混合。优选使用已用生理盐水1:10预稀释的EDTA-血液。其与候选溶血试剂以1:1比率混合，于20℃温育混合物30分钟。该混合物中全血的最终稀释度因此为1:20。将50等份的10μL该混合物，即处理过的全血样品，施加至为HPLC系统组成部分的滤器，该滤器直径为2mm，孔径为0.5μm。如果滤头为HPLC柱的组成部分，则必须对固定相进行选择，以便不引起任何干扰或阻塞。监测反压。如果第50次注射的反压和第1次注射的反压彼此相比，用于差异溶血的候选试剂会引起20bar以上的反压增加，则该候选试剂应被认为是不合适的。这样，用于差异溶血的适宜试剂的最小以及最大浓度均易于鉴定。最小浓度是如在上述环境中评价的导致差异溶血的候选溶血试剂的最低浓度。 
优选用于以上候选差异溶血试剂评价的滤器为HPLC滤头。还优选该滤头为20mm长的HPLC柱的组成部分，该柱装填孔径为100
Figure G200780021092XD0011101938QIETU
的3.5μm Symmetry
Figure G200780021092XD00111
C18粒子作为床料，柱内径为2mm。 
技术人员容易认识到，用于该评价的全血样品得自健康个体，即 没有已知疾病并具有正常范围的生物化学值的个体。 
在本发明中业已发现并确认，可确定对相当多的试剂适宜的条件，以便满足对差异溶血的两种要求。 
本发明的差异溶血试剂优选基于作为溶剂的水、产生如上所述的差异溶血的化学品或试剂、抗凝剂，还优选其可含有缓冲剂、酶和/或防腐剂。用于差异溶血的化学品为具有膜溶解活性或膜裂解活性的化学品。差异溶血试剂优选基于具有溶血活性或膜裂解活性的化学品，该化学品的分子量低于1000道尔顿，并产生差异膜溶解。 
差异溶血试剂优选基于一种或多种以下具有溶血活性的化学品：KBr；KJ；和KSCN，或由一种或多种以下的阳离子和阴离子组成的盐： 
阳离子优选选自 
Figure G200780021092XD00121
其中m为0或1，n为4或6。 
阴离子优选选自氯离子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘离子和硫氰酸根。还有可能使用以上提及的化学品的混合物。技术人员会认识到，就是这些化学品促进差异溶血，而溶血试剂的其它成分可用作缓冲剂或防腐剂。 
优选用于差异溶血的化学品为一种这样的盐：其中阳离子优选选自
其中m为0或1，n为4或6，其中阴离子优选选自氯离子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘离子和硫氰酸根。 
适用于差异溶血的化学品优选选自：四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓、四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、辛基硫酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓、氯化1-己基吡啶鎓、氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓、氯化N-辛基吡啶鎓、氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓、KBr、KJ和KSCN及其组合。 
还优选用于差异溶血的化学品选自四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓、四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、辛基硫酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓、氯化1-己基吡啶鎓、氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓、氯化N-辛基吡啶鎓和氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓。还优选使用这些试剂中的一种和KSCN的混合物。 
对技术人员显而易见的是，一旦已在以上定义的基于1:20稀释度的全血样品的候选溶血试剂溶液的方法中鉴定出候选差异溶血试剂的适宜浓度，则可根据需要使用全血样品对调整过的溶血试剂的另一个比率。 
如果预期目标分析物在所研究血样中是高度浓缩的，则溶血试剂的浓度可保持与在以上环境中鉴定的相同，并可以使用低比率的全血对溶血试剂，例如1:30、1:40或1:50。优选地，在差异溶血试剂中， 以如上确定的足以实现差异溶血的至少最小浓度使用具有溶血活性的化学品。 
如果目标分析物以相当低的浓度存在，则可能不必1:20稀释全血样品，而是不到1:20。这是可行的，方法为相应地调整溶血试剂的浓度，使得在溶血试剂和全血样品的混合物中溶血试剂对全血的最终相对浓度保持与对如在上述评价中确定的溶血试剂的所需最小浓度鉴定的比率相同。最大浓度是如在上述环境中评价的导致差异溶血但不引起样品成分沉淀的候选溶血试剂的最高可能浓度。 
作为实例：业已发现，氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN如果分别以1％和0.4％的终浓度使用，则适于实现所需结果，即以最终的1:20稀释度差异溶血全血样品。如果例如该溶血试剂的浓度被分别调整到2％(针对氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓)和0.8％(针对KSCN)，则分析物在已处理血样中的稀释度可以降低。此调整过的溶血试剂如果以后与1:5稀释的全血样品以1:1混合，也导致全血样品差异溶血，因为全血对溶血试剂的比率保持恒定。如果1ml分别含有10％氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓和4％ KSCN的溶血试剂与1ml用PBS以1:1稀释的全血混合，则也观察到差异溶血。或者，可将1ml全血加入2ml分别含有10％氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓和4％ KSCN的溶血试剂中。 
对于许多常规应用，预期全血样品对溶血试剂的理想比率在10:1至1:20之间。优选地，在本发明方法中，全血样品以5:1至1:15的比率与溶血试剂混合。更优选地，该比率介于2:1至1:10之间，还优选1:1至1:5。用于临床常规的已调整溶血试剂的最终浓度，即最高可能浓度，取决于溶解性还有该试剂的价格。 
如果四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓或四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓在差异溶血试剂中分别用作唯一的膜溶解化学品，则本发明的采样管优选以10-30％的浓度含有该化学品，还优选以12-25％的浓度含有该化学品。
如果辛基硫酸1-丁基-3-甲基咪唑鎓在差异溶血试剂中用作唯一的膜溶解化学品，则本发明的采样管优选以1-30％的浓度含有该化学品，还优选以2-10％的浓度含有该化学品。 
如果1-丁基-3-甲基吡啶鎓在差异溶血试剂中用作阳离子，则其优选与作为阴离子的碘离子或硫氰酸根一起使用，本发明的采样管优选以5-30％的浓度含有1-丁基-3-甲基吡啶鎓，还优选以10-25％的浓度含有1-丁基-3-甲基吡啶鎓。 
如果氯化1-己基吡啶鎓在差异溶血试剂中用作唯一的膜溶解化学品，则本发明的采样管优选以15-30％的浓度含有该化学品，还优选以20-25％的浓度含有该化学品。 
如果氯化1-己基吡啶鎓与等摩尔浓度的KSCN在差异溶血试剂中组合用作膜溶解化学品，则本发明的采样管优选以4-30％的浓度含有氯化1-己基吡啶鎓，还优选以5-20％的浓度含有氯化1-己基吡啶鎓。 
如果氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓在差异溶血试剂中用作唯一的膜溶解化学品，则本发明的采样管优选以5-30％的浓度含有该化学品，还优选以10-25％的浓度含有该化学品。 
如果氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓与等摩尔浓度的KSCN组合用于差异溶血试剂，则本发明的采样管优选以1-30％的浓度含有氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓，还优选以1-20％的浓度以及1-10％或1-5％的浓度含有氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓。 
如果氯化N-辛基吡啶鎓在差异溶血试剂中用作唯一的膜溶解化学品，则本发明的采样管优选以10-30％的浓度含有该化学品，还优选以10-25％的浓度含有该化学品。 
如果氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓在差异溶血试剂中用作唯一的膜溶解化学品，则本发明的采样管优选以0.5-30％的浓度含有该化学品，还优选以0.75-25％的浓度以及1-10或1-5％的浓度含有该化学品。 
进一步优选的用于本发明溶血管的差异溶血化学品为1-己基吡 啶鎓阳离子组合SCN-阴离子、1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓阳离子组合SCN-阴离子和3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓阳离子。 
优选地，包含在本发明的即用型管中的差异溶血化学品以不超过50％重量/体积、还优选不超过30％或还优选不超过25或20％重量/体积的浓度使用。 
差异溶血伴随着胞内成分如蛋白(包括蛋白酶)的释放。在某些应用中，如蛋白检测，封闭酶如蛋白酶的活性将是有利的。在一个优选的实施方案中，本发明的采样管包含差异溶血试剂，该试剂还含有酶抑制剂。优选地，酶抑制剂为蛋白酶抑制剂。 
蛋白酶的数量一直在增加，对应的蛋白酶抑制剂也一直在增加，可根据需要选择适宜的蛋白酶抑制剂。一类重要的蛋白酶是所谓的丝氨酸蛋白酶，其在它们的活性中心具有氨基酸丝氨酸。丝氨酸蛋白酶的众所周知的实例为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶和尿激酶。技术人员熟知以下事实：某些蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶有活性。这些蛋白酶的抑制潜力及其活性谱例如描述于供应商(如Serva，Heidelberg或Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的资料表。优选地，丝氨酸蛋白酶抑制剂选自AEBSF-HCl(例如Serva目录号12745)、APMSF-HCl(例如Serva目录号12320)、抑肽酶(例如Roche Diagnostics，目录号10 981 532 001)、抑凝乳蛋白酶抑制剂(例如Roche Diagnostics，目录号11 004 638 001)、Pefabloc
Figure G200780021092XD0016102124QIETU
 SC(例如Roche Diagnostics，目录号11 585 916 001)和PMSF(例如Roche Diagnostics，目录号10 837091 001)。 
更重要的一类蛋白酶是所谓的半胱氨酸蛋白酶，其在它们的活性位点具有氨基酸半胱氨酸。众所周知的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶和钙蛋白酶(calpain)。技术人员熟知以下事实：某些蛋白酶抑制剂对半胱氨酸蛋白酶有活性。这些抑制剂的某一些还对丝氨酸蛋白酶有活性，例如，PMSF可用作半胱氨酸蛋白酶的抑制剂以及丝氨酸蛋白酶的抑制剂。这些蛋白酶的抑制潜力及其活性谱例如描述于供应商(如 Serva，Heidelberg或Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的资料表。优选地，半胱氨酸蛋白酶抑制剂选自亮抑酶肽(leupeptine)(例如RocheDiagnostics，目录号11 034 626 001)、PMSF(参见上文)和E-64(例如Roche Diagnostics，目录号10 874 523 001)。 
更重要的一类蛋白酶是所谓的金属蛋白酶。金属蛋白酶的特征在于在活性中心含有金属离子，例如Zn2+、Ca2+或Mn2+。众所周知的金属蛋白酶实例为消化酶，例如羧肽酶A和B以及嗜热菌蛋白酶。技术人员熟知以下事实：某些蛋白酶抑制剂对金属蛋白酶有活性。金属蛋白酶最容易被结合金属离子并与其形成金属螯合复合物的物质失活。优选地，使用乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)和/或1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸(CDTA)失活金属蛋白酶。其它适宜的金属蛋白酶抑制剂为膦酰二肽钠(Phosphoramidon)(＝N-(α-吡喃鼠李糖基氧基羟基氧膦基)-L-亮氨酰基-L色氨酸二钠盐；例如Roche Diagnostics目录号10 874 531 001)和苯丁抑制素(例如Roche Diagnostics目录号10 874 515 001)。这些蛋白酶抑制剂的抑制潜力及其活性谱例如描述于供应商(如Serva，Heidelberg或Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的对应资料表。优选的金属蛋白酶抑制剂为EDTA、EGTA和/或苯丁抑制素。 
更重要的一类蛋白酶已知为天冬氨酸(酸性)蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶的特征在于在活性中心具有天冬氨酸残基。天冬氨酸蛋白酶的众所周知的实例为胃蛋白酶、组织蛋白酶D、凝乳酶和肾素。技术人员熟知某些蛋白酶抑制剂对天冬氨酸蛋白酶有活性的事实。优选的天冬氨酸蛋白酶抑制剂为α2-巨球蛋白(例如Roche Diagnostics目录号10602 442 001)和抑肽素(例如Roche Diagnostics目录号11 359 053 001)。 
对于某些应用，有可能使用含有针对某些蛋白酶类型的蛋白酶抑制剂的差异溶血试剂。 
以下代表了本发明的一个优选实施方案：使用两种或更多种蛋白酶抑制剂的混合物在差异溶血的血样中抑制不需要的蛋白分析物降 解。优选地，用于本发明采样管的差异溶血试剂含有至少两种不同的蛋白酶抑制剂，其具有针对选自以下的两类蛋白酶的活性：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。还优选这些酶类型中的至少3种被合适的抑制剂混合物抑制。优选地，本发明的粪便样品稀释液含有蛋白酶抑制剂混合物，其由分别具有针对丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶的活性的蛋白酶抑制剂组成。 
优选地，使用10种以下的不同蛋白酶抑制剂，其足以实现足够的蛋白酶抑制，以稳定在差异溶血血样中的目标蛋白分析物。 
优选地，蛋白酶抑制剂选自：抑肽酶、抑凝乳蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽、EDTA、EGTA、CDTA、抑胃肽A、苯甲基磺酰氟(PMSF)和Pefabloc
Figure 200780021092X100002G200780021092XD0016102124QIETU
 SC。优选地，差异溶血试剂中另外含有的蛋白酶抑制剂包含蛋白酶抑制剂抑凝乳蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽、CDTA、抑胃肽A、PMSF和Pefabloc
Figure 200780021092X100002G200780021092XD0016102124QIETU
 SC中的一种或多种。还优选其含有抑肽酶、亮抑酶肽、EDTA和Pefabloc
Figure 200780021092X100002G200780021092XD0016102124QIETU
 SC。 
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的采样管含有如上所述的用于差异溶血的化学品和抗凝剂，并另外包含核酸酶。差异溶血的血样的长期储存或运输可以伴发核酸释放，尤其是可由真核血细胞的核释放DNA。如果会释放出显著量的DNA，则这会产生高粘度的样品，该样品不能再用于诊断常规。该作用可使用核酸酶抵消。优选地，本发明的采样管含有包含DNA酶的差异溶血试剂。优选的DNA酶为benzonase。 
在一个优选实施方案中，本发明涉及含有差异溶血化学品和抗凝剂的即用型一次性使用的采样管在处理用于液相色谱的全血样品中的用途。上述对采样管和包含在其中的差异溶血试剂优选的实施方案也适用于该采样管在处理用于液相色谱的全血样品中的使用。 
液相色谱(LC)是一种极为重要的分析技术，用于分离、鉴定和定量目标分析物，即便目标分析物存在于不同样品成分的复杂混合物 中。在LC当中，混合物中的化学组分借助液体流动相的流动通过固定相。利用分析物与流动相和固定相这二者的相互作用的差异实现在液相色谱中的分离。技术人员会认识到，必须选择对所研究分析物均适合的固定相和流动相。另外，用户将确定在样品通过固定相柱向检测器移动的同时适于保持分析物条带清晰度的色谱条件。 
高效液相色谱，也称为高压液相色谱，缩写为HPLC，是一种特殊形式的液相色谱，现今经常用于生物化学和分析化学。分析物在高压下于液体(流动相)中被强行通过柱子的固定相，这减少了分离组分保留在固定相上的时间，由此减少了它们必须在柱子内扩散的时间。这在所获的色谱图中产生窄峰，由此产生与LC相比更好的分辨率和灵敏度。 
选择流动相，以确保样品溶质的溶解性。对于固定相，优选地，使用微粒二氧化硅(无修饰的或化学修饰的)，因为其高表面积增强了溶液相-固定相相互作用的差异。使用相对于溶质流动相相互作用与溶质强相互作用的固定相产生非常长的保留时间，这是一种在分析上没有用的情况。因此，必须选择固定相，以便提供相对于在流动相中的溶质相互作用弱至中等的溶质相互作用。因此，溶质的性质决定选定的LC类型。在流动相中应发生较强的相互作用，以确保样品溶解性和预备洗脱，而固定相应对溶质之间更细微的差别有反应。例如，通常使用极性流动相连同分辨溶质分散特征的细微差别的非极性固定相更好地分析极性中性化合物。HPLC的强有力方面之一在于可改变流动相，以改变保留机制。可向流动相加入修饰物以控制保留。例如，pH是水性流动相的一个重要变量。 
可以区分5种一般类型的LC： 
1.正常相色谱要求使用极性固定相连同非极性(分散的)流动相。 
2.反相色谱，相反的可能性，要求使用非极性固定相和极性流动相(由一种或多种溶剂(水、甲醇、乙腈和四氢呋喃)组成)。 
3.离子交换色谱涉及离子相互作用。在此情况下，流动相必须支 持离子化，以确保离子溶质的溶解性。固定相必须也是部分离子化的，以促进一定的保留。因此，与固定相的相互作用强，这通常反映为较长的分析时间和宽峰。 
4.大小排阻色谱包括基于单独的分子大小的分离，理论上需要溶质与固定相没有有力的相互作用。 
5.亲和色谱基于特异性相互作用，例如特异性结合对成员之间的相互作用，例如抗原和对应的抗体或者受体和对应的配体。例如，结合对的首个配偶体结合适宜的固定相，并用于捕获结合对的第二个配偶体。第二个配偶体可通过适宜的方法被释放和分离。 
在常规应用中，将RP-HPLC应用中的固定相(所谓的床料，例如包被烷基硅烷醇的多孔二氧化硅颗粒)装填到适宜的柱子中。对于大部分HPLC应用，固定相颗粒的直径通常在1-10μm的范围内，这些颗粒的平均孔径由几纳米至数百纳米变化。在某些HPLC应用中还使用无孔颗粒。另外，所谓的整体材料(monolithic material)也可用于HPLC应用。固定相材料的小颗粒迫使在HPLC中使用高压。床料通常受到滤头的保护。典型的滤头具有1μm、0.45μm或0.2μm孔径。颗粒越小，滤头的孔径通常就越小。如果样品包含能够阻塞HPLC滤头的成分，则这对任何常规分析都是有害的。 
全血样品以及含有样品成分沉淀的“过处理的”全血样品使任何常规的HPLC滤头或柱子快速阻塞。技术人员会认识到，滤头孔径越低，固定相颗粒的直径越小，柱子直径越小，用于HPLC柱的滤头就越快发生阻塞。如果没有适宜地选择滤头，即孔径太大，则柱填料的颗粒大小也应是个问题，颗粒越小，柱子本身就应越快阻塞。 
通过将全血样品直接采集到本发明的采样管中，获得处理过的全血样品，其可直接施加至HPLC柱，而不会形成阻塞柱子的风险。在一个优选实施方案中，本发明涉及将血样收集到本发明的即用采样管中的方法，由此处理全血样品，以差异溶解血样，此后对所述已处理 血样实施HPLC步骤。 
优选地，用于此HPLC步骤的固定相颗粒的直径在1-10μm的范围内，还优选在2-7μm的范围内。优选地，用于此HPLC步骤的滤头的孔径为0.45μm，或者还优选0.2μm。 
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及通过将全血收集到本发明的采样管中获得的差异溶血血样在目标分析物的基于液相色谱的分析中的用途。 
目标分析物可通过任何适宜的方法检测。适宜的和优选的检测器感应通过的化合物的存在情况，并提供电信号至记录仪或计算机数据站。输出通常为色谱图的形式，目标物质通常存在于某一个峰中。峰面积或峰高度可用于定量所研究样品中存在的分析物的量。 
用于HPLC系统的检测器是由于洗脱样品化合物而发射应答并随后在色谱图上发出峰信号的组分。其紧邻固定相后方定位，以便在化合物由柱中洗脱出来时检测它们。技术人员可以控制检测参数和灵敏度参数。有许多类型的检测器可与HPLC一起使用。一些更常见的检测器包括：折射率(RI)、紫外线(UV)、荧光、放射化学、电化学、近红外(Near-IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)和光散射(LS)。 
折射率(RI)检测器测量样品分子变向或折射光的能力。每种分子或化合物的该特性都被称为其折射率。对于大多数RI检测器，光穿过双模流动池到达光探测器。流动池的一个通道引导流动相通过柱，而另一个仅引导流动相。当光由于样品由柱中洗脱出来而变向时发生检测，这被读作两个通道之间的差异。 
荧光检测器分别检测化合物于给定波长吸收光然后再发射光的能力。每种能够发射荧光的化合物都具有特征性激发和发射波长。激发光通过流动池，同时在垂直位的光检测器检测特定波长的发射光。 
放射化学检测包括使用放射性标记的物质，通常为氚(3H)或碳-14(14C)。其通过检测与β-粒子离子化相关的荧光来运行，其在代谢物研究中最常见。
电化学检测器测量经历氧化或还原反应的化合物。这通常通过在迁移样品于给定电位差在电极之间通过时测量它们获得或失去的电子来完成。 
质谱法是一种用于检测离子的质荷比(m/z(或m/q))的分析技术。其最通常通过产生代表样品组分质量的质谱用于分析实际样品的组成。该技术具有几种用途，包括：通过化合物和/或其片段的质量鉴定未知的化合物；确定化合物中的一种或多种元素的同位素组成；通过观察化合物的片段化确定化合物的结构；使用精心设计的方法定量样品中化合物的量(质谱法不一定是定量的)；研究气相离子化学的基本原理(离子化学和真空中的中性)；用多种其它方法确定化合物的其它物理、化学乃至生物特性。 
质谱仪是一种用于质谱法的装置，并产生样品的质谱，以分析其组成。这通常如下实现：离子化样品，并分离不同质量的离子，通过检测离子流的强度记录它们的相对丰度。典型的质谱仪包括3个部分：离子源、质量分析器和检测器。 
离子源的种类是强烈影响质谱法可分析什么类型样品的影响因素。电子电离和化学电离用于气体和蒸汽。在化学电离源中，分析物通过在所述源中碰撞的过程中的化学离子-分子反应被电离。经常使用液体和固体生物样品的两种技术包括电喷雾电离(ESI)和基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)。其它技术包括快原子轰击(FAB)、热喷雾、大气压化学电离(APCI)、二次离子质谱(SIMS)和热电离。 
在一个优选的实施方案中，用本发明的方法检测分析物是通过质谱进行。 
核磁共振(NMR)检测基于以下事实：某些原子核具有奇数质量，包括H和13C，以随机方式在轴附近自旋。然而，当处于强磁场时，自旋与磁场平行或反向平行排列，平行方向是有利的，因为其能量稍低。这些磁核在处于特定强度的磁场中时可吸收RF能量。在发生这种吸收时，所述核被说成是处于共振状态。令分析科学家感兴趣的是， 分子内的不同原子在给定磁场强度以不同频率共振。分子共振频率的观测结果使用户可以发现有关该分子的结构信息。 
当某个光源发射的平行光束遇到溶液中粒子时，光被反射、吸收、透射或散射。这些现象可以通过光散射(LS)检测器来检测。最主要的LS检测形式被称为浊度测定和浊度分析。浊度测定被定义为检测由照射体积的悬浮液发射的散射光的强度。将散射强度对照射强度的比率与标准已知特性相比较。浊度分析被定义为检测由于溶液中的颗粒而透射的光的减少。其检测由于透过颗粒溶液的光的减少的光散射。因此，其定量透过的残余光。 
近红外检测器通过在700-1100nm的光谱中扫描化合物来操作。于特定波长检测每个分子中的具体化学键的伸缩振动和弯曲振动。 
在本发明的一个优选实施方案中，来源于哺乳动物的全血样品或来源于哺乳动物的抗凝结的全血样品将被收集到本发明的即用采样管中，在线检测包含在由此获得的已处理样品中的目标分析物，即没有任何额外的步骤，如过滤、沉淀或离心。在一个优选的实施方案中，本发明由此涉及分析全血样品的方法，包括以下步骤：将样品收集到本发明的即用采样管中，获得差异溶血的全血样品，对该已处理样品实施HPLC步骤，并由此或此后检测所述样品中的目标分析物。 
本发明的分析物可以为任何无机或有机分子，包括生物分子。优选分析物不是核酸，尤其是其不为DNA。优选地，分析物选自多肽、碳水化合物和无机或有机药物分子。优选目标分析物的分子量为10,000Da以下，还分别优选9kDa以下、8kDa以下、7kDa以下、6kDa以下或5kDa以下的分子量。 
多肽或蛋白是基本上由氨基酸组成的分子，其具有至少两个通过肽键连接的氨基酸。就本文公开的方法中研究的目标分析物而言，多肽优选由至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25和30个至多达约100个氨基酸组成。优选多肽包含5-100个氨基酸，还优选包含10-40个氨基酸。适宜的目标肽分析物为例如肽激素，在循环中 存在的其它多肽，尤其是例如由于全血样品在本文公开的采样管中温育而由红细胞释放的多肽。 
优选本发明的方法用于在线检测全血样品中的分析物，其中所述分析物至少部分地位于红细胞中。 
本发明的优选的目标分析物选自滥用药物和免疫抑制药物。 
优选的目标分析物为滥用药物。滥用药物优选选自安非他明、可卡因和可卡因代谢物，如苯甲酰芽子碱、去氧麻黄碱、鸦片剂和鸦片剂衍生物、大麻类物质如四氢大麻醇和苯环己哌啶。 
优选的目标分析物为免疫抑制药物。免疫抑制药物优选选自环孢菌素(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、雷帕霉素(RAPA，也称为西罗莫司)、他克莫司(FK-506)、咪唑硫嘌呤(AZA)和甲基强的松龙(MP)。 
进一步优选的目标分析物为叶酸，尤其是包含在血浆和红细胞这二者中的总叶酸。 
收集到本发明的采样管中的全血样品中待检测的优选分析物为西罗莫司、他克莫司和叶酸。 
在又一个实施方案中，本发明涉及含有全血样品的差异溶血试剂的采样管在处理用于液相色谱的全血样品中的用途，其中所述差异溶血试剂含有具有溶血活性的化学品和抗凝剂，其中所述采样管为即用型一次性使用的采样管。上述对包含在本发明采样管中的差异溶血试剂的优选实施方案也适用于溶血试剂在处理用于液相色谱的全血样品中的用途。 
本发明的用于全血样品的即用型一次性使用采样管及其在常规诊断环境中的用途具有突出优势：全血样品在采样时被直接处理为差异溶血血样。这避免了防范措施，要不然操作和储存全血样品或抗凝的全血样品需要这些防范措施。差异溶血的血液可如血浆或血清样品一样操作。没有细胞能沉淀下来，不再发生可能干扰正确的分析物检测的溶血未逐渐增加。运输差异溶血的血样是容易且方便的。病毒颗粒如果存在的话，则在与差异溶血试剂接触的情况下也应被溶解并破 坏。尽管没有检验，但由此预期，通过使用本发明的全血采样管甚至极大降低生物危害风险。 
提供以下的实施例和附图是为了帮助理解本发明，本发明的真实范围由随附的权利要求陈述。可在不偏离本发明宗旨的情况下对所陈述的方法进行修改。 
附图简述
图1用水溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已应用了May-Grünwald染色。红细胞膜和细胞核是可见的。 
图2用四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓(25％)溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已应用了May-Grünwald染色。没有剩下红细胞或膜，细胞核仍是完整的。 
图3用水溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已使用锥虫蓝染色。 
图4用四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓(25％)溶血的1:10稀释的全血的光学显微镜检查。已应用了锥虫蓝染色。a)2.5分钟温育时间：只剩下少量残余红细胞，b)15分钟温育时间：没有剩下红细胞或膜。 
实施例1
多种候选溶血试剂的评价 
实施例1.1溶血的目测评价 
溶液A：用0.15摩尔氯化钠溶液以1:10比率稀释新鲜EDTA-稳定的全血(50μL EDTA-血液加450μL氯化钠溶液)。 
溶液B：制备候选溶血试剂在0.15摩尔氯化钠中的溶液，其中溶血试剂的浓度为溶血产物中所需终浓度的2倍高，例如为得到25％四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓的终浓度，制备50％溶液(50mg盐加50mL0.15摩尔氯化钠的水溶液)。在加入第二种阴离子如碘化物的情况下，所述盐(氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KJ)以等摩尔的量加入。
通过将溶液A和溶液B等量混合，例如500μL溶液A加500μL溶液B，制备溶血产物。 
在混合后即时、混合后1分钟、2分钟、5分钟、6分钟、7分钟、20分钟和40分钟目测检查溶血产物的混浊度和澄清度。记录直至观察到澄清溶液的时间。 
表1：候选差异溶血试剂的目测评价 
  
溶血试剂 终浓度(重量/体积) (分钟)后澄清
四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓 25％ 20分钟
四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓 12.5％ 40分钟
四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓 6％ 混浊
四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓 25％ 20分钟
辛基硫酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓 25％ 立即
氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓 25％ 混浊
氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KJ 25％/22％ 20分钟
氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KSCN 25％/13％ 5分钟
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 25％/12％ 立即
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 12.5％/6％ 1分钟
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 6.25％/3％ 6分钟
氯化1-己基吡啶鎓/KSCN 3.12％/1.5％ 混浊
氯化1-己基吡啶鎓 25％ 7分钟
氯化1-己基吡啶鎓 12.5％ 混浊
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 25％/10％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 12.5％/5％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 6.25％/2.5％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 3.12％/1.25％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 2.5％/1％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 1.25％/0.5％ 2分钟
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN 0.62％/0.25％ 混浊
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓 25％ 立即
氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓 2.5％ 混浊
  
溶血试剂 终浓度(重量/体积) (分钟)后澄清
氯化N-辛基吡啶鎓 25％ 2分钟
氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓 12.5％ 立即
氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓 6.25％ 立即
氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓 1.5％ 立即
由上表清楚可见，通过目测评价可以目测鉴定良好的候选差异溶血试剂。 
实施例1.2溶血的显微镜评价 
溶液A：用0.15摩尔氯化钠溶液以1:10比率稀释新鲜的EDTA-稳定的全血(50μL EDTA-血液加450μL氯化钠溶液)。 
溶液B：制备溶血试剂在0.15摩尔氯化钠中的溶液，其中溶血试剂的浓度为溶血产物中所需终浓度的2倍高，例如为得到25％四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓的终浓度，制备50％溶液(50mg盐加50mL0.15摩尔氯化钠的水溶液)。在加入第二种阴离子如碘化物的情况下，所述盐(氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KJ)以等摩尔的量加入。 
通过将溶液A和溶液B等体积混合，例如20μL溶液A加20μL溶液B，制备溶血产物。 
May-Grünwald染色和显微镜检查： 
在溶血产物混合后，在显微镜载玻片上涂布液滴，于室温风干，并用May-Grünwald染色试剂(Merck目录号：1.01424 May-Grünwald的曙红亚甲基蓝溶液)染色。在May-Grünwald染色的核染色至可变的紫色阴影之后，可见蓝色调至浅粉色色调的胞质，在某些细胞类型的胞质中可存在精美的微红色至淡紫色颗粒，嗜碱细胞在胞质中表现为深蓝黑色颗粒，嗜酸细胞在胞质中表现为鲜橙色颗粒，而红细胞被染色为粉色至橙色。
通过油浸光学显微镜(放大倍率x630)进行显微镜检查 
比较结果：图1，通过水获得的裂解物，图2，用适于差异溶血的试剂获得的裂解物，表明在几分钟内加入适宜的溶血试剂将导致红细胞完全裂解。 
锥虫蓝染色和显微镜检查： 
处理过的全血样品(1:1)与锥虫蓝溶液(Merck目录号1.11732；Trypanblau C.I.23850)混合，并分配入显微镜的Neugebauer-室中。显微镜检查通过油浸光学显微镜进行(放大倍率x630)。 
比较结果-图3，通过水获得的裂解物，以及图4a)和b)，用适于差异溶血的试剂获得的裂解物，表明，在几分钟内加入适宜的溶血试剂将导致红细胞完全裂解。 
实施例2
通过HPLC评价多种候选溶血试剂 
为评价裂解效率，将按照实施例1制备的已溶血的全血样品注射入HPLC系统中，并监测系统的反压。 
HPLC系统由配有DR5溶剂输送系统的HP1090液相色谱仪(Agilent)、配备自动取样器的自动调温器和自动进样器组成。通过将50×10μL已处理全血样品施加至HPLC柱评价裂解效率，该HPLC柱以5μm Symmetry C18颗粒作为床料，柱内径为2mm，柱长为20mm，滤头为0.5μm孔径。洗脱液为5分钟内含0.1％甲酸的水至含0.1％甲酸的乙腈的梯度，流速为0.2mL/分钟。在50次注射后观察到的反压增加低于20bar。 
如果裂解仅用蒸馏水实现，则在以上HPLC条件下观察到的反压增加大于100bar。 
实施例3
将EDTA抗凝结的全血吸取到含有差异溶血试剂的管中并温和振荡混合物，处理EDTA抗凝结的全血 
3.1 四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓 
将11.25mL硫氰酸钾溶液(0.1摩尔；即9.72克KSCN溶于1升蒸馏水中)与12.5mL四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓(BMPBF4)和23.7mL氯化钠(0.15摩尔的水溶液)混合，制备裂解试剂。该差异溶血试剂因此具有约25％ BMPBF4的浓度。硫氰酸钾以低得多的摩尔浓度存在，因此多半不会显著影响所观测到的作用。 
将250μl EDTA-抗凝结的全血吸取入含有5ml该裂解试剂的小瓶中。为了溶血，通过振荡温和混合管的内容物。5分钟内获得光学上澄清的裂解物。将裂解物于4℃储存。在1、4和7天后通过目测检查来检查裂解物的稳定性。裂解物在7天内保持光学澄清。 
3.2 硫氰酸钾和氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓 
将23.7mL硫氰酸钾溶液(0.2摩尔；9.72克KSCN溶于0.5升蒸馏水中)与1000mg氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓(Me-octPCl)和23.7mL氯化钠(0.15摩尔的水溶液)混合，制备该裂解试剂。该差异溶血试剂因此具有约2％ Me-octPCl的浓度。 
将250μl EDTA-抗凝结的全血吸取入含有5ml该裂解试剂的小瓶中。为了溶血，通过振荡温和混合管的内容物。5分钟内获得光学上澄清的裂解物。将裂解物于4℃储存。在1、4和7天后通过目测检查来检查裂解物的稳定性。裂解物在7天内保持光学澄清。 
3.3 氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓和硫氰酸钾 
将470μL硫氰酸钾溶液(1摩尔)与300μL氯化钠溶液(0.15摩尔的水溶液)和110mg氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓混合，制备这种与实施例3.2相比更浓的裂解试剂。该差异溶血试剂具有约15％ Me-octPCl的浓度。
将20μl EDTA-抗凝结的全血吸取入含有80μl该裂解试剂的容器中。为了溶血，通过振荡温和混合管的内容物。5分钟内获得光学上澄清的裂解物。将裂解物于4℃储存。在1和2天后通过目测检查来检查裂解物的稳定性。裂解物保持光学澄清。 
3.4 氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓 
将80μL水与50μL氯化钠溶液(0.15摩尔的水溶液)和20mg氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓混合，制备该裂解试剂。该差异溶血试剂具有约10％ COMPCl的浓度。 
将50μl EDTA-抗凝结的全血吸取入含有130μl该裂解试剂的容器中。为了溶血，通过振荡温和混合管的内容物。5分钟内获得光学上澄清的裂解物。将裂解物于4℃储存。在1和2天后通过目测检查来检查裂解物的稳定性。裂解物保持光学澄清。 
根据以上论述的实验，对技术人员显而易见的是，现在有可能并有利的是在即用型采样管中直接包含抗凝剂，由此产生含有用于差异溶血全血样品的试剂的采样管，其中所述差异溶血试剂还含有抗凝剂。

Claims (5)

1.一种用于收集和处理全血样品的采样管，所述采样管含有用于差异溶血全血样品的试剂，其中所述用于差异溶血的试剂包括盐和抗凝剂，其中所述盐选自四氟硼酸1-丁基-4-甲基吡啶鎓、四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓、氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KI、氯化1-丁基-3-甲基吡啶鎓/KSCN、氯化1-己基吡啶鎓/KSCN、氯化1-己基吡啶鎓、氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓/KSCN、氯化1-甲基-1-辛基吡咯烷鎓、氯化N-辛基吡啶鎓和氯化3-氨甲酰基-1-辛基氧基甲基吡啶鎓，其中所述采样管为即用型一次性使用的采样管，其中当50等份的10μl溶血产物，即血样以1:10稀释在生理盐水中并以1:1与所述差异溶血试剂混合，施加至具有2mm直径和0.5μm孔径的HPLC-系统的滤器，而不阻塞所述滤器时，则存在所述差异溶血。 
2.权利要求1的采样管，其中所述用于差异溶血的试剂引起红细胞细胞膜裂解，同时不会引起样品成分沉淀。 
3.权利要求1或权利要求2的采样管，其中所述用于差异溶血的试剂还包含蛋白酶抑制剂。 
4.前述权利要求中任一项的采样管在处理用于液相色谱的全血样品中的用途。 
5.在权利要求1-3中任一项的采样管中通过差异溶血获得的已处理血样在基于液相色谱的分析中的用途。 
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