CN101450165A - 一种抗癌中药复方灵芝制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口服给药的中药复方灵芝制剂及其制备方法，属医药、保健品技术领域。它是由下述原料按所述重量份制备而成：灵芝1500－4000份、灵芝孢子粉400－600份、白术250－400份、三七100－200份、川芎100－200份、僵蚕70－150份、白花蛇舌草70－150份、土茯苓70－150份、甘草40－60份。本发明药物抗癌有效成分稳定，经各种体内外试验证实，具有较高的抑瘤率，可显著提高机体免疫力，具有确切的抗肿瘤作用，与化疗药物联合应用能够提高化疗药的疗效，同时可减轻化疗药物的毒性。

Description

一种抗癌中药复方灵芝制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种口服给药的中药复方灵芝制剂及其制备方法。本发明中药复方灵芝制剂以灵芝药材和其孢子粉为主要原料，经过提取精制、制粒制备而成，主要用于预防、治疗癌症，提高机体免疫力，属医药、保健品技术领域。

背景技术

灵芝是中医药学宝库中的珍品，是中药中一种极为重要的药材，大量的药理学及临床实践证明，灵芝药材及孢子粉具有较强的抗肿瘤作用，所含有化学成分，灵芝多糖，灵芝三萜酸对多种癌症肿瘤细胞具有较强抑制作用，对癌症的发生，发展阶段均有预防治疗作用。能够提高机体免疫功能。可以同化学治疗和放射治疗同时配合使用，提高对癌症的治疗效果，提高肿瘤患者对化疗和放疗的耐受性，减轻化学治疗和放疗引起的白细胞减少，食欲减退、脱发等副任用，改善肿瘤患者的恶病质，提高患者免疫功能，具有扶正，固本作用。目前，以灵芝及孢子粉为原料制成的产品从处方组成角度主要包括单方和复方两类，以往的文献及临床实践表明，采用单方灵芝药材对治疗肿瘤疾病具有一定局限性，其使用效果低于灵芝的复方制剂。已上市的产品灵芝单方制剂较多，而以灵芝为主要原料的复方制剂较少。文献报道及已上市的复方灵芝产品，其使用用途包括保肝、降糖、抗癌、提高机体免疫力等。经调查，市场上已上市的灵芝复方产品包括，复方灵芝颗粒，适应症为治疗乙肝，未见具有抗癌作用报道，处方组成为灵芝、五味子、郁金，与本发明专利处方组成不同。复方灵芝冲剂，适应症为治疗乙肝，未见具有抗癌作用报道，处方组成灵芝、五味子、郁金，与本发明处方不同。双灵固本散，适应症为抗癌，处方由灵芝药材、灵芝孢子粉两味组成，属于单方，与本发明处方不同，不具有复方协同作用。复方灵芝健脑胶囊，功能主治健脑，未见具有抗癌作用报道，处方组成由灵芝、枸杞子、当归、酸枣、刺五加等组成，与本发明处方不同。复方灵芝降糖胶囊，由灵芝、黄芪、三七等组成的复方，适应症为治疗糖尿病，未见具有抗癌作用报道，处方组成与本专利处方组成不同。文献报道，灵芝扶正胶囊初步研究报告，山东中医药大学学报，1997年第3期，报道灵芝扶正胶囊主要由灵芝、人参4味药组成，主要作用抗癌，处方与本专利处方不一致，未见有详细的抑瘤试验及制备方法。高效液相法测定灵芝颗粒中五味子素的含量，广东药学院学报，2006年第1期，灵芝颗粒由灵芝、五味子、柴胡等药材组成，未见具有抗癌作用报道，处方组成与本专利处方组成不同。专利文献报道，中国专利200410051704.8公开了复方灵芝中药制剂及制法，处方组成为灵芝、羊蒮、丹参、灰树芪、姬松茸，功能为抗癌提高免疫力，未见有详细的抑瘤试验及提高免疫力试验，与本发明处方组成不同。中国专利200410020957.9公开了一种复方灵芝片剂及制备方法，处方由人参、灵芝、鹿茸、覆盆子、天门冬、枸杞子组成直接粉碎入药，与本专利处方不同。中国专利93100151.X公开了复方灵芝口服液及其制备方法，处方由灵芝、刺五加、首乌、乌豆、等组成，未见有详细的抑瘤试验及提高免疫力试验，与本发明处方不同。以上技术中较多采取药材直接粉碎入药方法，较少采用提取和挥发油包合入药方法，方剂中杂质较多，人体吸收利用有一定局限性。另外以上文献或专利中抗癌的灵芝复方制剂未公开其系统的药效及毒理学研究结果。以上专利文献及现有产品中的复方灵芝处方组成，均与本专利处方不同。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗癌中药复方灵芝制剂，它采用以灵芝为主要药材，按照中医理论并结合现代药理学进行复方组方，经过药理药学筛选后，得到灵芝复方，同以往的复方技术相比，具有较强的抗癌和提高免疫力的作用，并得到体内和体外试验的证实。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，它按照方剂中各种药材中有效成分性质，分别进行了提取精制，并且考虑到挥发油的不稳定易挥发的特性，采用了环糊精的包合入药的工艺，所采用的工艺均进行了药效学筛选，最终得到了可以工业化生产稳定的生产工艺。

本发明的组方是按照中医理论，结合以抗癌抑瘤率和免疫力为药效学指标的筛选试验结果，组成了以灵芝药材及孢子粉为主要原料，辅以其它抗癌及提高免疫力的中药材成分组成了中药复方灵芝颗粒的复方制剂。处方由灵芝、灵芝孢子粉、白术、三七、川芎、白花蛇舌草、土茯苓、僵蚕、甘草九味中药构成，其中灵芝和灵芝孢子粉为方中的君药，作用为扶正祛邪，增效互补，驱逐癌毒；白术的作用为补气健脾，助脾运化，白术挥发油成分具有抑制肿瘤细胞作用，为方中的臣药；川芎活血行气，三七活血散瘀，两药相需为用，行血中之气，散血中之瘀。白僵蚕软坚，白花蛇舌草通泄解毒，土茯苓消肿通络，三种药均有较强抗癌作用。以上诸药共奏活血化瘀，消肿散结之功，为佐药；甘草解毒和中，调和诸药，为使药。

为了解决上述技术问题，按照上述组方方法，本发明是这样实现的，一种抗癌中药复方灵芝制剂，它由下述原料按所述重量份制备而成：灵芝1500—4000份、灵芝孢子粉400—600份、白术250-400份、三七100—200份、川芎100—200份、僵蚕70—150份、白花蛇舌草70—150份、土茯苓70—150份、甘草40—60份。

本发明中药灵芝复方制剂，它由下述原料按所述重量份制备而成：灵芝2000—2300份、灵芝孢子粉400—500份、白术270—300份、三七140—160份、川芎120—140份、僵蚕80—100份、白花蛇舌草80—100份、土茯苓80—100份、甘草40—50份。

一种所述抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，它包括以下工艺步骤：它包括以下工艺步骤：按上述重量比取白术，加水8—10倍水蒸汽蒸馏1.5-2.5小时，蒸馏所得挥发油，加入5—10倍量β—环糊精，加入胶体磨中，研磨30分钟，低于40℃真空干燥，得白术挥发油包合物；按上述重量比取灵芝、川芎、白花蛇舌草、土茯苓、僵蚕、甘草及上述蒸馏白术挥发油后的残渣，加水8—10倍，煎煮2次，每次0.5-1.5小时，过滤，滤液浓缩至比重为1.1～1.2g/ml，残渣弃去，然后，按上述重量比加入灵芝孢子粉及粉碎过筛的三七粉，充分混合，70—80℃干燥1.5-2.5小时，粉碎过筛，同白术挥发油包合物充分混合，置于流化床或湿法制粒机中制粒，得到本发明的复方灵芝颗粒。

一种所述抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，也可以采用如下直接煎煮法，它包括以下工艺步骤：按上述重量比取各种药材，按总量9-11倍量加水，煎煮2次，每次1.5-2.5小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至干，75-85℃真空干燥1.5-2.5小时，粉碎过筛，采用流化床一步粒机制粒，即得。

一种所述抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，也可以采用如下方法，它包括以下工艺步骤：按上述重量比取除灵芝孢子粉外各种药材，按总量9-11倍量加水，煎煮2次，每次1.5-2.5小时，同时收集挥发油，收集的挥发油，采用9-11倍量的β—CD进行包合，即在胶体磨中研磨0.3-0.8小时，烘干，粉碎，得挥发油β—CD包合物；煎煮液过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至比重为1.1—1.2g/ml；将浸膏与灵芝孢子粉及挥发油包合物混合，75-85℃烘干1.5-2.5小时，粉碎过筛，采用流化床一步制粒，即得。

一种所述抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，取上述制备的颗粒3份，取3份填充辅料，0.1份崩解剂，压片，得到中药复方灵芝片剂。

取上述制备的颗粒直接灌装胶囊，得中药复方灵芝胶囊。

本发明的颗粒剂质量标准如下，性状，本品为棕褐色的颗粒、气芳香、味甜。鉴别包括(1)取本品，置显微镜下观察：灵芝孢子呈卵圆形或卵形大小为6～8x9～12um；顶端平截或钝圆锥形；孢壁双层，外壁透明、平滑；内壁棕色或近褐色，孢内细胞质呈淡棕色或淡黄色；有时可观察到孢内有呈黄绿色的小油滴。(2)取本品3g，研细，加乙酸乙酯30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取灵芝对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮-甲酸(9：6：4：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(1→10)，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(3)取本品6g，研细，加水30ml、正丁醇30ml，超声处理30分钟，加水60ml使之分层，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5g，加水10ml、正丁醇10ml，超声处理30分钟，加水20ml使之分层，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(1→10)，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(4)取本品1g，研细，加乙醚20ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(8：1)为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(5)取本品1g，研细，加具塞的锥形瓶中，加无水乙醇50ml，水浴(40～50℃)30分钟，冷却后，超声10分钟，过滤，浓缩滤液至约2ml加乙酸乙酯溶解并定容至10ml量瓶中，作为供试品溶液。另取白术油对照品加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI E)测定，吸取上述两种溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，测定，记录色谱峰即得。含量测定，照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—0.2％磷酸水溶液(30：70)为流动相；检测波长为203nm。理论塔板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于2500。

对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，75℃水浴回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液25ml蒸干，残渣加水10ml，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10ml，正丁醇提取液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品与供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱峰即得。

本发明的优点效果如下：按照本发明制备的抗癌中药复方灵芝颗粒，生产工艺操作性强，质量可控，组方有利于发挥灵芝等各种药材抗癌效果，方剂中抗癌有效成分稳定，产品稳定，经各种体内外试验证实，具有较高的抑瘤率，可显著提高机体免疫力，具有确切的抗肿瘤作用，与化疗药物联合应用能够提高化疗药的疗效，同时可减轻化疗药物的毒性。临床应用中取得了较好的抗癌临床效果。本发明中药复方灵芝颗粒其抗肿瘤作用的机制可能与其调节免疫机能、抑制肿瘤细胞生长有关。作为一个抗肿瘤辅助用药具有很好的潜在临床应用前景，适宜各期肿瘤患者作为抗肿瘤辅助治疗剂使用，同化疗药合用能起到增效、减毒、改善生存质量等作用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步详细说明，但这不能用于限定本发明的保护范围，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1

本发明中药复方灵芝颗粒由下述原料按所述重量制备而成：

灵芝150kg、灵芝孢子粉40kg、白术30kg、三七10kg、川芎10kg、僵蚕7kg、白花蛇舌草7kg、土茯苓7kg、甘草4kg。

其颗粒剂的制备工艺如下：

按上述重量取白术，蒸汽蒸馏1.5-2.5小时，蒸馏所得挥发油，加入5—10倍量β—环糊精，加入适量水，加入胶体磨中，研磨30分钟，低于40℃真空干燥，得白术挥发油包合物；按上述重量比取灵芝、川芎、白花蛇舌草、土茯苓、僵蚕、及上述蒸馏白术挥发油的残渣，加水8—10倍，煎煮2次，每次1小时，过滤，滤液浓缩至比重为1.1～1.2g/ml，残渣弃去，然后，按上述重量比加入灵芝孢子粉及粉碎过筛的三七粉，充分混合，70—80℃干燥1.5-2.5小时，粉碎过筛，同白术挥发油包合物充分混合，置于流化床或湿法制粒机中制粒，得到本发明的复方灵芝颗粒。

实施例2

本发明中药复方灵芝颗粒由下述原料按所述重量比制备而成：

灵芝4000g、灵芝孢子粉600g、白术400g、三七200g、川芎200g、僵蚕150g、白花蛇舌草150g、土茯苓150g、甘草60g。

其颗粒剂按实施例1制备方法制备。

实施例3

本发明中药复方灵芝颗粒由下述原料按所述重量比制备而成：

灵芝2100g、灵芝孢子粉430g、白术290g、三七145g、川芎130g、僵蚕87g、白花蛇舌草87g、土茯苓87g、甘草50g。

其颗粒剂按实施例1制备方法制备。

实施例4

本发明中药复方灵芝颗粒由下述原料按所述重量比制备而成：

灵芝2000g、灵芝孢子粉485g、白术380g、三七155g、川芎175g、僵蚕100g、白花蛇舌草95g、土茯苓100g、甘草45g。

上述的本发明复方灵芝颗粒，可以采用如下直接煎煮法，按上述重量比100倍量取各种药材，按总量10倍量加水，煎煮2次，每次2小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至干，80℃真空干燥2小时，粉碎过80目筛，采用流化床一步粒机制粒，即得。

上述的本发明复方灵芝颗粒，也可以采用如下方法，按上述重量比100倍量取除灵芝孢子粉外各种药材，按总量10倍量加水，煎煮2次，每次2小时，同时收集挥发油，收集的挥发油，采用10倍量的β—CD进行包合，即在胶体磨中研磨0.5小时，烘干，粉碎，得挥发油β—CD包合物；煎煮液过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至比重为1.1—1.2g/ml；将浸膏与灵芝孢子粉及挥发油包合物混合，80℃烘干2小时，粉碎过80目筛，采用流化床一步制粒，即得。

实施例5

本发明中药复方灵芝颗粒由下述原料按所述重量制备而成：

灵芝1800g、灵芝孢子粉455g、白术350g、三七175g、川芎135g、僵蚕130g、白花蛇舌草130g、土茯苓120g、甘草47g。

除按照实施例1的方法制备外，最后制粒采用湿法制粒，即用摇摆制粒机制粒，烘干即得。

实施例6

取按照实施例1制备的颗粒3份，加入乳糖3份，加入0.1份的羧甲基纤维素钠，压片，包装，得到复方灵芝片剂。

实施例7

取按照实施例1制备的颗粒，直接灌装胶囊，包装即得。

实施例8

本发明中药复方灵芝颗粒由下述原料按所述重量制备而成：

灵芝2500g、灵芝孢子粉450g、白术330g、三七160g、川芎145g、僵蚕90g、白花蛇舌草90g、土茯苓90g、甘草40g。

其颗粒剂按实施例4中的任意一种制备方法制备。

实施例9

本发明中药复方灵芝颗粒由下述原料按所述重量制备而成：

灵芝2750g、灵芝孢子粉560g、白术360g、三七180g、川芎165g、僵蚕110g、白花蛇舌草110g、土茯苓110g、甘草60g。

其颗粒剂按实施例4中的任意一种制备方法制备。

实施例10

按照本发明实施例3制备的复方灵芝颗粒，其药效学结果如下：

抗肿瘤药效学试验：

名称：复方灵芝颗粒(以下简称灵芝颗粒)

规格：每克相当于生药材3.93g

配制方法：精密称取一定量的灵芝颗粒加入0.5％的CMC-Na混悬至所需浓度。

阳性对照药

注射用环磷酰胺(CTX)：上海环联制药有限公司，批号：050310；

5-氟尿嘧啶(5-Fu)：上海旭东海普药业有限公司，批号：041006；

注射用丝裂霉素(MMC)：日本协和发酵工业株式会社，批号：224AEJ；

华蟾素片：安徽金蟾生化股份有限公司，批号：050910；

香菇菌多糖片：湖北吉达药业有限公司。批号：050603。阳性药选择依据：①环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素分别属烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素类抗肿瘤药物，临床广泛用于肿瘤的治疗。试验中用于考察试验方法的成功与否，同时联合增效试验中作为传统化疗药物的单方用药。②华蟾素片为市售较好的抗肿瘤辅助用药，可作为复方灵芝颗粒主要药效学的比较实验用药。③香菇菌多糖片为市售较好的免疫调节药，可作为灵芝扶正颗粒辅助药效学的比较实验用药。

空白对照药

0.5％羧甲基纤维素钠：中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号：F20020715。

实验方法及实验结果

(一)抗肿瘤作用

1 体外实验

1.1 灵芝颗粒药液的配制

取3g灵芝颗粒，充分研细，加水10mL混悬，超声30min，离心取上清，用0.22μm无菌微孔滤膜过滤除菌，即为药物的饱和水溶液(母液)。将母液与RPMI 1640培养液按1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320配成6个浓度的药液，分别称药液I、II、III、IV、V、VI。

1.2 灵芝颗粒对人癌细胞体外增殖的影响

采用SRB法，取对数生长期的Hela及HepG-2细胞，台盼蓝排染法计数活细胞数，RPMI 1640培养液调整细胞密度分别为4×10⁴/mL，以100μL/well接种于96孔板内，置5％CO₂培养箱内37℃培养24h。分别加入含不同浓度药物的培养液100μL/well，每个浓度5个复孔，同时设阴性对照、阳性对照(盐酸多柔米星，终浓度2ng/mL)。继续培养48h后，SRB法490nm处检测OD值，按下述公式计算药物对肿瘤细胞体外增殖的抑制率。实验重复三次，结果见表1。

IR＝(OD_空白-OD_给药)/OD_空白×100％

1.3 灵芝颗粒对骨髓细胞的影响

昆明种小鼠3只，体重18-22g，雄性。无菌取股骨，放入RPMI1640培养液中，用1mL注射器吹出骨髓，200目筛网过滤，1000rpm离心5min，去上清，用RPMI1640培养液(含20％FBS)混悬，放入25mL培养瓶培养。以下实验步骤同上，阳性药盐酸多柔米星终浓度为0.02ng/mL。试验重复三次，实验结果见表2。

由表1结果可见，灵芝扶正颗粒水溶液对Hela及HepG-2细胞体外增殖有一定得抑制作用，抑制率随药液浓度的降低而降低，最大浓度药液抑制率约为30％左右。

表1 灵芝扶正颗粒水溶液对人癌细胞体外增殖的影响

预实验结果显示，盐酸多柔米星0.02ng/mL对Hela细胞体外增殖的抑制率约为30％，相同剂量的盐酸多柔米星对小鼠骨髓细胞的抑制率大于30％。而灵芝扶正颗粒溶液对骨髓细胞体外增殖无显著影响。结果见表2。

表2 灵芝颗粒水溶液对骨髓细胞体外增殖的影响

2 体内试验

2.1 给药途径、剂量及容量

灌胃给药，与拟临床给药途径一致。

灵芝颗粒设低、中、高三个剂量，分别相当于灵芝颗粒生药量2.25、4.50、9.0g/kg。

给药容量：0.2mL/10g。

表3 给药途径、给药剂量及给药容量

2.2 灵芝颗粒对小鼠移植性肉瘤S₁₈₀的生长抑制作用^[1～2]

昆明种小鼠60只，雄性，随机分为6组，每组10只。分别为空白对照组(0.5％CMC-Na)，灵芝扶正颗粒低、中、高剂量组(相当于灵芝扶正颗粒生药量2.25、4.50、9.00g/kg)，阳性药环磷酰胺组(0.03g/kg)，阳性药华蟾素组(0.75g/kg)。除阳性药环磷酰胺组外，其余各组动物连续灌胃给药6天。第6天时，无菌吸取接种8～10天的肉瘤S₁₈₀传代小鼠腹水，用生理盐水稀释成5×10⁶/mL的瘤细胞悬液，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2mL。接种后，环磷酰胺组隔日腹腔注射给药，其余各组继续每天灌胃给予药物或溶媒1次。第14天处死各组小鼠，称体重，剥取瘤块并称瘤重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率＝(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％。实验重复3次。

由表4～6结果可见，灵芝颗粒可剂量依赖性的抑制小鼠移植性肉瘤S₁₈₀的生长。中、高剂量对小鼠肉瘤S₁₈₀的生长均有明显的抑制作用，试验重复3次的抑瘤率分别为32％、34％、30％和41％、42％、41％。灵芝颗粒低剂量虽有抑制小鼠肉瘤S₁₈₀生长的趋势，抑瘤率约为20％，但与空白对照组比较瘤重无显著性差异。受试物各剂量组动物一般状态良好，体重正常增长，未见明显毒性反应。阳性对照药环磷酰胺抑瘤作用明显，抑瘤率约为80％左右，但与空白组比较动物体重明显降低。

表4 灵芝颗粒对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

表5灵芝颗粒对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

表6 灵芝颗粒对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

2.3 灵芝颗粒对小鼠移植性H₂₂肝癌生长的抑制作用^[1～2]

实验方法同“2.2灵芝颗粒对小鼠移植性肉瘤S₁₈₀的生长抑制作用”。结果见表7～9。

结果表明，灵芝颗粒低、中、高剂量对小鼠移植性H₂₂肝癌的生长均有一定的抑制作用。高、中剂量组瘤重与空白组相比，差别具有显著性意义，抑瘤率分别大于40％和30％。受试物组动物状态良好，体重增长正常。阳性对照药环磷酰胺抑瘤作用明显，抑瘤率约为80％左右，但与空白组比较动物体重明显降低。

表7 灵芝颗粒对小鼠移植性H₂₂肝癌生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

表8 灵芝颗粒对小鼠移植性H₂₂肝癌生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

表9 灵芝颗粒对小鼠移植性H₂₂肝癌生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

2.4 灵芝颗粒对C57BL/6小鼠移植性Lewis肺癌的生长抑制作用^[1～2]

无菌剥离接种10-14天的C57BL/6小鼠Lewis肺癌瘤块，用组织研磨器研碎，生理盐水稀释成5×10⁷/mL的瘤细胞悬液，每只C57BL/6小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2mL。接种24小时后，将小鼠随机分为6组，每组10只。分别为空白对照组(0.5％CMC-Na)，灵芝颗粒低、中、高剂量组(相当于灵芝颗粒生药量2.25、4.50、9.00g/kg)，阳性药环磷酰胺组(0.03g/kg)，阳性药华蟾素组(0.75g/kg)。除阳性对照药环磷酰胺隔日腹腔注射给药外，其余各组每日均灌胃给药或溶媒1次，连续10天。第11天处死小鼠，称体重，剥取瘤块并称瘤重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率＝(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％。实验重复3次。

结果显示，灵芝颗粒对小鼠移植性Lewis肺癌的生长有一定的抑制作用，且动物一般体征、生长状态良好，体重与空白对照组比较未见显著性差异。低、中、高剂量对小鼠移植性Lewis肺癌的生长均有明显的抑制作用，试验重复3次的抑瘤率分别为23％、22％、22％，30％、30％、35％和43％、44％、43％。华蟾素亦可显著抑制小鼠移植性Lewis肺癌的生长，抑瘤率约为40％。实验结果见表10～12。

表10 灵芝颗粒对小鼠移植性Lewis肺癌生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

表11 灵芝颗粒对小鼠移植性Lewis肺癌生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

表12 灵芝颗粒对小鼠移植性Lewis肺癌生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

(二)与传统化疗药物联合应用的增效作用

1 与环磷酰胺联合应用对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响

昆明种小鼠90只，雄性，随机分为9组，每组10只。分别为空白对照组(0.5％CMC-Na)，环磷酰胺中剂量组(0.02g/kg)，环磷酰胺低剂量组(0.01g/kg)，灵芝颗粒低、中、高剂量组(相当于灵芝颗粒生药量2.25、4.50、9.00g/kg)，灵芝颗粒低剂量和环磷酰胺低剂量合用组，灵芝颗粒中剂量和环磷酰胺低剂量合用组，灵芝颗粒高剂量和环磷酰胺低剂量合用组。

除环磷酰胺外，其余药物或溶媒连续灌胃给药6天。第6天时，无菌吸取于接种8～10天的肉瘤S₁₈₀传代小鼠腹水，用生理盐水稀释成5×10⁶/mL的瘤细胞悬液，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2mL。接种后，环磷酰胺每日腹腔注射给药，其余各组继续每天灌胃给予药物或溶媒1次。第14天处死各组小鼠，称体重，剥取瘤块并称瘤重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率＝(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％。实验重复3次。

结果显示，灵芝颗粒与化疗药物环磷酰胺联合应用，抑瘤率高于单纯应用环磷酰胺药物组。灵芝颗粒9.00g/kg与CTX 0.01g/kg合用可以提高CTX的抑瘤率，使CTX的抑瘤率从27％提高到59％，与CTX 0.02g/kg抑瘤作用相当。结果见表13。

表13 灵芝颗粒与环磷酰胺联合应用对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01与环磷酰胺低剂量组比较

2与5-氟尿嘧啶联合应用对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响

昆明种小鼠90只，雄性，随机分为9组，每组10只。分别为空白对照组(0.5％CMC-Na)，5-氟尿嘧啶高剂量组(0.02g/kg)，5-氟尿嘧啶低剂量组(0.01g/kg)，灵芝颗粒低、中、高剂量组(相当于灵芝颗粒生药量2.25、4.50、9.0g/kg)，灵芝颗粒低剂量和5-氟尿嘧啶低剂量合用组，灵芝颗粒中剂量和5-氟尿嘧啶低剂量合用组，灵芝颗粒高剂量和5-氟尿嘧啶低剂量合用组。

除5-氟尿嘧啶外，其余药物或溶媒连续灌胃给药6天。第6天时，无菌吸取于接种8～10天的肉瘤S₁₈₀传代小鼠腹水，用生理盐水稀释成5×10⁶/mL的瘤细胞悬液，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2mL。接种后，5-氟尿嘧啶每日腹腔注射给药，其余各组继续每天灌胃给予药物或溶媒1次。第14天处死各组小鼠，称体重，剥取瘤块并称瘤重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率＝(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％。实验重复3次。

结果显示，灵芝颗粒与化疗药物5-氟尿嘧啶联合应用，抑瘤率亦高于5-氟尿嘧啶单纯应用药物组。与5-Fu0.01g/kg合用能提高5-Fu单方的抑瘤率，灵芝颗粒2.25g/kg、4.50g/kg、9.00g/kg使5-Fu的抑瘤率从24％分别提高到26％、48％、59％。结果见表14。

表14 灵芝颗粒与5-氟尿嘧啶联合应用对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较；##P<0.01与5-氟尿嘧啶低剂量组比较

3 与丝裂霉素联合应用对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响

昆明种小鼠90只，雄性，随机分为9组，每组10只。分别为空白对照组(0.5％CMC-Na)，丝裂霉素高剂量组(0.0015g/kg)，丝裂霉素低剂量组(0.0010g/kg)，灵芝颗粒低、中、高剂量组(相当于灵芝颗粒生药量2.25、4.50、9.0g/kg)，灵芝颗粒低剂量和丝裂霉素低剂量合用组，灵芝颗粒中剂量和丝裂霉素低剂量合用组，灵芝颗粒高剂量和丝裂霉素低剂量合用组。

除丝裂霉素外，其余药物或溶媒连续灌胃给药6天。第6天时，无菌吸取于接种8～10天的肉瘤S₁₈₀传代小鼠腹水，用生理盐水稀释成5×10⁶/mL的瘤细胞悬液，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2mL。接种后，丝裂霉素每日腹腔注射给药，其余各组继续每天灌胃给予药物或溶媒1次。第14天处死各组小鼠，称体重，剥取瘤块并称瘤重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率＝(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％。实验重复3次。

结果显示，灵芝颗粒与化疗药物丝裂霉素1mg/kg合用，抑瘤率亦高于单纯应用丝裂霉素药物组。结果见表15。

表15灵芝颗粒与丝裂霉素联合应用对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤生长的影响(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较；#P<0.05与丝裂霉素低剂量组比较

(三)对传统化疗药物所致骨髓抑制的保护作用[³]

1 灵芝颗粒对环磷酰胺引起的白细胞减少的保护作用

昆明种小鼠60只，雄性，随机分为6组，分别为空白对照组，环磷酰胺模型组，阳性药香菇多糖组(0.005g/kg)，灵芝颗粒低、中、高剂量组(相当于灵芝颗粒生药量2.25、4.50、9.0g/kg)。各给药组连续灌胃给药7天，空白对照组，环磷酰胺模型组每天给予等容积的0.5％CMC-Na。第1天给药1小时后，除空白组外，各组腹腔注射环磷酰胺100mg/kg复制免疫低下模型，空白组腹腔注射等量生理盐水。分别于第3，5，7天给药1.5小时后眼眶静脉丛取血，进行白细胞计数。实验结果见表16。

结果表明，环磷酰胺100mg/kg给药后3-5天时动物外周血白细胞计数明显较空白组低。灵芝颗粒高剂量组在给药第5天时与环磷酰胺模型组相比白细胞数明显提高，给药第3天时高剂量组动物外周血白细胞数有增加趋势，但与环磷酰胺模型组相比统计不显著。

表16 灵芝颗粒对环磷酰胺造成的白细胞减少的保护作用(x±s)

^**P<0.001与空白组比较；#P<0.05与模型组比较

2 灵芝颗粒对5-氟尿嘧啶引起的白细胞减少的保护作用

试验方法同3.1，实验结果见表17。

结果表明，灵芝颗粒对5-氟尿嘧啶造成的白细胞减少具有保护作用，灵芝颗粒高剂量在给药第7天时的白细胞数相对模型组有明显提高。

表17 灵芝颗粒对5-氟尿嘧啶造成的白细胞减少的保护作用(x±s)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较；#P<0.05与模型组比较

(四)免疫调节作用

1 灵芝颗粒对环磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫器官脏器系数的影响

实验方法同“3.1灵芝颗粒对环磷酰胺引起的白细胞减少的保护作用”，实验结束后，处死小鼠并称体重，解剖脾脏、胸腺称重，计算脾指数，胸腺指数。结果见表18。

脾指数＝脾重/体重(mg/g)

胸腺指数＝胸腺重/体重(mg/g)

由表18可见，灵芝颗粒高剂量能明显提高免疫低下小鼠的胸腺指数，与环磷酰胺模型组比较有显著性差异。灵芝颗粒对免疫低下小鼠的脾指数未见明显影响。

表18 灵芝颗粒对胸腺指数、脾指数的影响(x±s)

^**P<0.01与空白组比较；#P<0.05与模型组比较

2 对免疫低下小鼠碳粒廓清能力的影响^[4]

昆明种小鼠60只，雄性，随机分为6组，即空白对照组，环磷酰胺模型组，阳性药香菇多糖组(5mg/kg)，灵芝颗粒低、中、高剂量组(相当于灵芝颗粒生药量2.25、4.50、9.0g/kg)。各给药组每日灌胃给药一次，空白对照组，模型组给予等容积的0.5％CMC-Na，连续给药7天。第2、3天给药1小时后，除空白组外，各组每只小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg/kg复制免疫低下模型，空白组腹腔注射等量的生理盐水。末次给药1.5小时后，尾静脉注射25％印度墨汁10mL/kg，于注射后2、12min眼眶静脉丛取血20uL，溶于2mL0.1％Na₂CO₃溶液中，在640nm测定吸光度OD值，同时摘取小鼠肝脏、脾脏，称湿重，按下式计算廓清指数K及吞噬指数α，实验结果见表19。

K＝(logOD₁-logOD₂)/(t₂-t₁)

α＝k^∧3^*体重/(肝重+脾重)

(OD₁、OD₂分别为两次取血所得的光密度；t₂-t₁：为两次取血样的时间差，此次实验中t₂-t₁＝10)

结果显示：腹腔注射环磷酰胺80mg/kg能显著降低小鼠的廓清指数K和吞噬指数α。灵芝颗粒各剂量组能明显提高免疫低下小鼠的廓清指数K，高、中剂量的廓清指数为0.047±0.016和0.048±0.013，与模型组比较有显著性差异；灵芝颗粒高、中剂量亦有可提高免疫低下小鼠的吞噬指数α的趋势，但与模型组比较差异不显著。可见灵芝扶正颗粒能提高小鼠的非特异性免疫功能。

表19 灵芝颗粒对廓清指数和吞噬指数的影响(x±s)

^*P<0.05与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01与模型组比较

3 对免疫低下小鼠血清溶血素的影响

昆明种小鼠60只，雄性。分组、给药剂量及给药方式同“4.2对免疫低下小鼠碳粒廓清能力的影响”，各给药组每日灌胃给药一次，空白对照组，模型组给予等容积的0.5％CMC-Na，连续给药9天。除空白组，各组于第3、4天给药1小时后腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，复制免疫低下模型，空白组腹腔注射等量的生理盐水。第3、4、5天每鼠腹腔注射5％绵羊红细胞悬液0.2mL致敏。最后一次给药1.5小时后眼球后静脉丛采血，分离血清，用生理盐水稀释300倍。取稀释的血清1mL、5％绵羊红细胞悬液0.5mL、10％补体1mL混合，37℃水浴保温30min，0℃冰箱中终止反应，1500rpm离心5min，取上清液于7230分光光度计540nm处比色，测光密度。实验结果见表20。

结果显示：腹腔注射环磷酰胺80mg/kg能显著降低小鼠的OD值，灵芝颗粒各剂量组能明显提高免疫低下小鼠的OD值，中剂量组与模型组比较有显著性差别，作用与阳性药香菇多糖组相当。可见灵芝颗粒能提高小鼠的体液免疫功能。

表20 灵芝颗粒对血清溶血素的影响(x±s)

^*P<0.05与空白组比较；#P<0.05与模型组比较

4 二硝基氯苯诱导的小鼠迟发型变态反应实验^[5]

昆明种小白鼠60只，雄性。分组、给药剂量及给药方式同“4.2对免疫低下小鼠碳粒廓清能力的影响”，各给药组每日灌胃给药1次，空白对照组，模型组给予等容积的0.5％CMC-Na，连续给药10天。除空白组外，各组于第4、5天灌胃给药1小时后腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，复制免疫低下模型，空白组腹腔注射等量的生理盐水。第4天灌胃给药1.5小时后每鼠颈部皮下注射20μL7％二硝基氯苯-丙酮溶液致敏。于第9天每鼠右耳(两面)均匀涂抹7％二硝基氯苯溶液20μL，进行攻击。24小时后处死小鼠剪下两耳，用直径8mm的不锈钢圆冲沿耳缘相同部位冲下耳片，称量耳片重量，以左右两耳重量之差表示迟发超敏反应的程度。实验结果见表21。

灵芝颗粒高、中、低剂量组可提高二硝基氯苯诱导迟发型超敏反应小鼠的耳肿胀度；灵芝颗粒高剂量组动物耳肿胀度与模型组比较有显著性差别。提示灵芝颗粒可能对迟发型超敏反应中T淋巴细胞活化有促进作用。

表21 灵芝颗粒对左右耳片重差的影响(x±s)

^*P<0.05与空白组比较；#P<0.05与模型组比较

4.5 NK细胞测定实验^[6]

昆明种小鼠42只，雄性。分组、给药剂量及给药方式同“4.2对免疫低下小鼠碳粒廓清能力的影响”，各给药组每日灌胃给药一次，空白对照组，模型组给予等容积的0.5％CMC-Na，连续给药9天。除空白组，各组第1、2天给药1小时后腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，复制免疫低下模型，空白组腹腔注射等量的生理盐水。第9天脱臼处死小鼠，无菌条件取脾，用眼科镊轻轻将脾磨碎，200目筛网过滤，制成单个脾细胞悬液；1000rpm离心5min，去上清，低渗除去红细胞，1000rpm离心5min，去上清，用RPMI-1640培养液稀释成3×10⁶/mL的脾细胞悬液。靶细胞取HeLa体外培养细胞，RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1.5×10⁵/mL，使效靶细胞之比为20∶1。取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另设效应细胞和靶细胞对照，于37℃5％CO₂条件培养12小时后，加入MTT染色液，继续培养4小时，离心吸弃上清，加入DMSO，摇匀，570nm测OD值。按公式计算NK细胞活性。实验结果见表20。

NK细胞活性％＝{[靶细胞对照组OD均值-(实验组OD均值-效应细胞OD均值)]/靶细胞对照组OD均值}×100％

由表22可见，灵芝颗粒高剂量能明显提高免疫低下小鼠的NK细胞活性，与模型组比较有显著性差异。

表22 灵芝颗粒对NK细胞活性的影响(x±s，n＝7)

^*P<0.05与空白组比较；#P<0.05与模型组比较

结论

1 抗肿瘤作用

复方灵芝颗粒对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤、H₂₂肝癌、Lewis肺癌的生长均有明显的抑制作用，复方灵芝颗粒高、中剂量的抑瘤率分别约为40％和30％左右。且实验的重复性较好。

复方灵芝颗粒水溶液对人宫颈癌HeLa细胞及肝癌HepG-2细胞体外增殖有一定的抑制作用。

2 联合增效作用

复方灵芝颗粒各剂量与环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素合用，均能提高三种化疗药的抑瘤率，其中高剂量作用最明显。

3减毒作用

复方灵芝颗粒高剂量能减轻传统化疗药物环磷酰胺和5-氟尿嘧啶造成的白细胞降低。

4 免疫调节作用

复方灵芝颗粒具有调节免疫作用，能够提高免疫低下小鼠的胸腺指数、巨噬细胞吞噬能力、特异性免疫应答和NK细胞活性。

因此，综上所述，本发明复方灵芝颗粒具有确切的抗肿瘤作用，与化疗药物联合应用能够提高化疗药的疗效，同时可减轻化疗药物的毒性。其抗肿瘤作用的机制可能与其调节免疫机能、抑制肿瘤细胞生长有关。

实施例11

稳定性试验，取按照本发明实施例3制备得到的颗粒做相关稳定性试验：

1.样品来源灵芝颗粒，批号：050701 050702 050703为三批中试样品。

2.考察项目性状、鉴别、装量、水分、粒度、溶化性、微生物限度、含量等。

3.稳定性考察

3.1.加速试验：将三批包装样品置于留样室(温度40±2℃、RH75±5％)中，放置6个月，于第1、2、3、6个月取样测定。检验结果见表。

加速试验结果

结果表明：加速样品的各项指标与0月相比均无明显变化，各项检验均符合规定。

Claims (7)

1、一种抗癌中药复方灵芝制剂，其特征在于它是由下述原料按所述重量份制备而成：灵芝1500—4000份、灵芝孢子粉400—600份、白术250-400份、三七100—200份、川芎100—200份、僵蚕70—150份、白花蛇舌草70—150份、土茯苓70—150份、甘草40—60份。

2、根据权利要求1所述的抗癌中药复方灵芝制剂，其特征在于它是由下述原料按所述重量份制备而成：灵芝2000—2300份、灵芝孢子粉400—500份、白术270—300份、三七140—160份、川芎120—140份、僵蚕80—100份、白花蛇舌草80—100份、土茯苓80—100份、甘草40—50份。

3、一种权利要求1或2所述的抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：按上述重量比取白术，加水8—10倍水蒸汽蒸馏1.5-2.5小时，蒸馏所得挥发油，加入5—10倍量β—环糊精，加入胶体磨中，研磨30分钟，低于40℃真空干燥，得白术挥发油包合物；按上述重量比取灵芝、川芎、白花蛇舌草、土茯苓、僵蚕、甘草及上述蒸馏白术挥发油后的残渣，加水8—10倍，煎煮2次，每次0.5-1.5小时，过滤，滤液浓缩至比重为1.1～1.2g/ml，残渣弃去，然后，按上述重量比加入灵芝孢子粉及粉碎过筛的三七粉，充分混合，70—80℃干燥1.5-2.5小时，粉碎过筛，同白术挥发油包合物充分混合，置于流化床或湿法制粒机中制粒，得到本发明的复方灵芝颗粒。

4、一种权利要求1或2所述的抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：按上述重量比取各种药材，按总量9-11倍量加水，煎煮2次，每次1.5-2.5小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至干，75-85℃真空干燥1.5-2.5小时，粉碎过筛，采用流化床一步粒机制粒，即得。

5、一种权利要求1或2所述的抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：按上述重量比取除灵芝孢子粉外各种药材，按总量9-11倍量加水，煎煮2次，每次1.5-2.5小时，同时收集挥发油，收集的挥发油，采用9-11倍量的β—CD进行包合，即在胶体磨中研磨0.3-0.8小时，烘干，粉碎，得挥发油β—CD包合物；煎煮液过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至比重为1.1—1.2g/ml；将浸膏与灵芝孢子粉及挥发油包合物混合，75-85℃烘干1.5-2.5小时，粉碎过筛，采用流化床一步制粒，即得。

6、根据权利要求3、4或5所述的抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，其特征在于取上述制备的颗粒3份，取3份填充辅料，0.1份崩解剂，压片，得到中药复方灵芝片剂。

7、根据权利要求3、4或5所述的抗癌中药复方灵芝制剂的制备方法，其特征在于取上述制备的颗粒直接灌装胶囊，得中药复方灵芝胶囊。