CN101444485A - 吉西他滨脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为吉西他滨脂质体及其制备方法，解决已有吉西他滨脂质体包封率不高的问题。吉西他滨脂质体，吉西他滨脂质体的组成物包括吉西他滨、磷脂、胆固醇，由磷脂和胆固醇制成空白脂质体，吉西他滨与磷脂的重量比为：1∶(2～80)，经优化后重量比为1∶(40～80)，通过硫酸铵梯度法制成。

Description

吉西他滨脂质体及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种药物制剂及其制备方法，具体涉及到一种吉西他滨脂质体及其制备方法。

技术背景：

根据美国癌症协会2005年的统计，肺癌是世界各地发病率和死亡率急剧增长的恶性肿瘤，在我国也已经成为恶性肿瘤之首。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80％，而且70％左右的NSCLC患者在确诊时已经属于晚期，化疗成了其综合治疗的主要手段。吉西他滨作为治疗NSCLC的一线药物，地位已经得到肯。

吉西他滨是一个新型的脱氧胞苷类似物和核苷还原酶抑制剂，是脱氧胞苷糖链上的2位氢被氟取代的一种核苷衍生物，结构类似于阿糖胞苷。其化学名为：1-(2-氧代-4-氨基-1，2-二氟胞苷-1-基)-2-脱氧-2，2-二氟核糖。临床上用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈部肿瘤。常见的不良反应有骨髓抑制、消化系统反应、肾脏毒性、过敏反应、流感样反应、水肿、低血压、脱发、嗜睡、深静脉血栓等。吉西他滨(Gemcitabine，GC)是一种核苷类抗代谢化疗药物，属于前体药物，在体内代谢为活性的磷酸盐而发挥药效。美国FDA于1996年批准上市，目前临床应用的剂型仅有用于输液的注射用无菌粉末。

化疗治疗药物的市场近两年增长迅速，年均增幅超过两成以上。其中以抗代谢类化疗药物的市场份额增长最为迅速，目前市场份额已经达到18％。抗代谢类药物市场主要是在吉西他滨、卡培他滨和去氧氟尿苷三个药物的带动下增长。据国内数据，吉西他滨、卡培他滨和去氧氟尿苷三个药物在医院市场的年销售合计在7亿元以上，占整个抗代谢药物市场份额的3/4以上。其中尤以吉西他滨的增长最为迅速，其增幅明显高于以片剂在临床应用的卡培他滨。早在2004年吉西他滨的全球销量已达12亿美元，目前仍呈上升趋势。

吉西他滨作为一种抗代谢类抗肿瘤药物，细胞毒性强，在临床应用的过程中常伴随毒副反应。脂质体是由磷脂聚集而自发形成的一种双分子层的囊泡结构，作为药物载体具有降低药物毒副作用特点，吉西他滨脂质体的毒副反应明显低于游离药物吉西他滨，同时脂质体增加了其组织靶向性，达到缓释的目的。这一研究可以进一步扩大其在临床的应用范围。

国内外关于吉西他滨的研究绝大多数是常规剂型分析方法和生物利用度、药代动力学方面的。近年，国外开始出现吉西他滨脂质体的相关研究报道，但是常规方法制得的脂质体包封率很低(小于10％)。脂质体的大部分研究都立足于前体药物的结构修饰，这一方法在一定程度上可以提高药物的包封率，但是药物衍生化后进入体内的代谢也发生相应变化。目前只有极少数文献报到了pH梯度法制备吉西他滨脂质体，但仍然不是很成熟，并且尚未建立系统方法。国内目前还没有吉西他滨新型给药系统的任何研究报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种制作工艺简单，成本低廉、包封率高的吉西他滨脂质体及其制备方法，解决国外已有吉西他滨脂质体研究中包封率低的问题。

本发明这样实现的：

本发明吉西他滨脂质体，吉西他滨脂质体的组成物包括盐酸吉西他滨、磷脂、胆固醇，由磷脂和胆固醇制成空白脂质体，盐酸吉西他滨与磷脂的重量比为：1∶(2～80)，经优化后重量比为1∶(40～80)。

空白脂质体中磷脂与胆固醇的重量比为10∶(1—10)优化后其重量比为10∶(1～5)。

磷脂浓度为1～20mg/ml，优化后浓度为2～10mg/ml。

磷脂为两条脂肪烃链8～26个饱和或不饱和碳原子的天然来源、人工合成、人工半合成或人工修饰的磷脂类物质，选自大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇氨、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、烷基醚磷脂酰胆碱中的一种或几种。

所述吉西他滨为吉西他滨及其硫酸盐，硝酸盐、盐酸盐、磷酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、马鬃酸盐、酒石酸盐和重酒石酸盐中的一种。

为注射液或加入冻干保护剂制成的冻干制剂，冻干保护剂为：甘露醇、山梨醇、木糖醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精中的一种或几种，其使用量为5％～15％(W/V)。

吉西他滨脂质体制备步骤如下：

1.空白脂质体制备：称取重量比为10∶(1～5)的磷脂与胆固醇溶于适量氯仿中，将适量浓度为150～250mmol/L的硫酸铵溶液加入上述脂质溶液中，在搅拌的状态下水浴超声，直至形成稳定的W/O型乳剂后转入圆底烧瓶内，40℃减压旋转蒸发除去部分氯仿，达到胶态后，另加入适量浓度为150～250mmol/L的硫酸铵溶液，40℃减压条件下继续蒸发除尽氯仿后，水化，得空白脂质体，

2.吉西他滨脂质体制备：将此空白脂质体于37℃、50rpm、0.9％氯化钠溶液中透析1～24h，空白脂质体与0.9％氯化钠的体积比为1：200，取出后于60℃恒温水浴保温15min，加入同温保温的浓度为0.1～10mg/ml吉西他滨水溶液适量，使吉西他滨与磷脂的重量比为：1∶(40～80)，轻摇使之混合均匀，于40～70℃孵育5～30min后立即用冰浴冷却，即得吉西他滨脂质体溶液，

3.注射用吉西他滨脂质体制备：将吉西他滨脂质体溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥得疏松块状的固体注射用吉西他滨脂质体。

本发明的创新性主要体现在以下几个方面：

1.利用主动载药法制备包裹原形药物的盐酸盐脂质体。

2006年底，国外出现了吉西他滨脂质体的研究报道，但多数都是采用制备前体药物或者药物衍生物的形式来提高包封率，虽然在提高包封率上有显著的效果，但是药物的修饰将会影响药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄，进而影响药物发挥药效，降低其生物利用度。目前很多化疗药物的盐酸盐制备的脂质体包封率都不高，本发明采用新型的方法制备了包封率较高的盐酸吉西他滨脂质体。

2.硫酸铵梯度法是一种新型的离子梯度载药法，比pH梯度法更具有优势。

通常认为，硫酸铵梯度法也是pH梯度法的一种，但硫酸铵梯度法与pH梯度法相比无需调节pH，不会使脂质体处于一种过酸过碱的环境中，有利于脂质体和药物的稳定性，同时减少了包封于脂质体内的药物的泄漏。

3.引入药物保留率的概念来筛选最佳的冻干保护剂。

以往一些试验中，筛选脂质体冻干保护剂的指标都是一些外在指标，如：外观色泽、成型性、再分散性等。本发明在筛选冻干保护剂的时候引入了包封药物保留率作为评价指标，更加形象、贴切的概括了冻干保护剂对脂质体的保护作用，这一评价指标比以往的外在指标更为具体可靠。

综上所述，本发明具有工艺简单、包封率高、适合于大规模生产等优点，不仅可提高吉西他滨的临床疗效，且可减轻其毒性作用，为癌瘤患者提供了一个新的抗癌药物。由于是高科技的新剂型，也会给生产企业带来较好的经济效益。

采用上述方法制得的吉西他滨脂质体经透射电镜观察，脂质体囊泡呈球状、均匀完整、分散性较好，双层膜结构清晰可见，脂质体的平均粒径为584nm，pH测定的结果为4.00～4.50，包封率可达78.99％，平均载药量为1.55％。冷冻干燥后所得固体为白色疏松状物，再分散性良好；透射电镜照片显示，冻干后的脂质体囊泡基本保持其完整的双层膜结构；粒径及其分布亦无明显变化；冻干后脂质体包封药物保留率可达97.33±1.05％，药物从脂质体中的泄漏少。体外释放行为研究表明，脂质体冻干针剂比模拟的普通剂型释放缓慢，吉西他滨脂质体冻干针剂在体外的释药规律符合Weibull分布模型。

具体实施方法

实施例1：

称取大豆卵磷脂(8mg/ml)，胆固醇，二者比例为10∶5，溶于氯仿中，将一定量浓度为200mmol/L的硫酸铵溶液加入上述脂质溶液中，在搅拌的状态下水浴超声，直至形成稳定的W/O型乳剂后转入圆底烧瓶内，40℃减压旋转蒸发除去部分氯仿，达到胶态后，另加入200mmol/L的硫酸铵溶液，40℃减压条件下继续蒸发除尽氯仿后，水化洗膜20min，制得空白脂质体。将空白脂质体装入透析袋中，用0.9％NaCl溶液透析24h。透析后的空白脂质体加入一定量的盐酸吉西他滨溶液，使药脂比为1∶50，置于70℃恒温水浴孵育5min，即得盐酸吉西他滨脂质体。所得吉西他滨脂质体的包封率为72.4％。

实施例2：

称取蛋黄卵磷脂(8mg/ml)，胆固醇，二者比例为10∶1，溶于氯仿中，将一定量浓度为180mmol/L的硫酸铵溶液加入上述脂质溶液中，在搅拌的状态下水浴超声，直至形成稳定的W/O型乳剂后转入圆底烧瓶内，40℃减压旋转蒸发除去部分氯仿，达到胶态后，另加入180mmol/L的硫酸铵溶液，40℃减压条件下继续蒸发除尽氯仿后，水化洗膜20min，制得空白脂质体。将空白脂质体装入透析袋中，用0.9％NaCl溶液透析8h。透析后的空白脂质体加入一定量的盐酸吉西他滨溶液，使药脂比为1∶40，置于50℃恒温水浴孵育10min，即得盐酸吉西他滨脂质体。所得吉西他滨脂质体的包封率为78.1％。

实施例3：

称取氢化大豆卵磷脂(2mg/ml)，胆固醇，二者比例为10∶4，溶于氯仿中，将一定量浓度为250mmol/L的硫酸铵溶液加入上述脂质溶液中，在搅拌的状态下水浴超声，直至形成稳定的W/O型乳剂后转入圆底烧瓶内，40℃减压旋转蒸发除去部分氯仿，达到胶态后，另加入250mmol/L的硫酸铵溶液，40℃减压条件下继续蒸发除尽氯仿后，水化洗膜30min，制得空白脂质体。将空白脂质体装入透析袋中，用0.9％NaCl溶液透析12h。透析后的空白脂质体加入一定量的盐酸吉西他滨溶液，使药脂比为1∶80，置于65℃恒温水浴孵育15min，即得盐酸吉西他滨脂质体。所得吉西他滨脂质体的包封率为83.4％。

实施例4：

称取氢化蛋黄卵磷脂(10mg/ml)，胆固醇，二者比例为10∶2，溶于氯仿中，将一定量浓度为150mmol/L的硫酸铵溶液加入上述脂质溶液中，在搅拌的状态下水浴超声，直至形成稳定的W/O型乳剂后转入圆底烧瓶内，50℃减压旋转蒸发除去部分氯仿，达到胶态后，另加入150mmol/L的硫酸铵溶液，50℃减压条件下继续蒸发除尽氯仿后，水化洗膜30min，制得空白脂质体。将空白脂质体装入透析袋中，用0.9％NaCl溶液透析5h。透析后的空白脂质体加入一定量的盐酸吉西他滨溶液，使药脂比为1∶50，置于40℃恒温水浴孵育30min，即得盐酸吉西他滨脂质体。所得吉西他滨脂质体的包封率为70.3％。

实施例5：

称取氢化大豆卵磷脂(5mg/ml)，胆固醇，二者比例为10∶4，溶于氯仿中，将一定量浓度为200mmol/L的硫酸铵溶液加入上述脂质溶液中，在搅拌的状态下水浴超声，直至形成稳定的W/O型乳剂后转入圆底烧瓶内，40℃减压旋转蒸发除去部分氯仿，达到胶态后，另加入一定量的浓度为200mmol/L的硫酸铵溶液，40℃减压条件下继续蒸发除尽氯仿后，水化30min，得空白脂质体。将此空白脂质体5ml于37℃、50rpm、1000ml0.9％氯化钠溶液中透析6h，取出后于60℃恒温水浴保温15min，加入同温保温的一定量的盐酸吉西他滨水溶液，使药脂比为1：50，轻摇使之混合均匀，于60℃孵育15min后立即用冰浴冷却，即得盐酸吉西他滨脂质体溶液。所得吉西他滨脂质体的包封率为85.7％。

实施例6：

在吉西他滨脂质体混悬液中分别加入一定量(5％)的冻干保护剂，按照常规冷冻干燥过程制备吉西他滨脂质体的冻干粉针剂，考察其成型性和再分散性，将以上指标以10分制进行评分，试验及结果见表一：

表1 实施例5

从外观成型来看，除了山梨醇和木糖醇作为支持剂的冻干样品发生萎缩、塌陷外，其他几种支持剂的冻干样品都能满足外观成型性良好的要求。从复溶的再分散性来看，麦芽糖糊精冻干的样品在复溶再分散的速度稍显缓慢，木糖醇冻干样品复溶再分散后留存晶体状固体物质，其余几种支持剂的冻干样品复溶后再分散性良好，形成均一的脂质体混悬液。

实施例6：

在制备的盐酸吉西他滨脂质体混悬液中分别加入不同用量的冻干保护剂。按照常规冷冻干燥过程制备盐酸吉西他滨脂质体的冻干粉针剂，分测定冻干前后脂质体的包封率(EE％，EE’％)，计算包封药物的保留率(R％)，试验及结果见表二。

表2 实施例6

(EE％＝85.19)

表2数据显示，编号5选用无水海藻糖为冻干保护剂，用量为15％(W/V)时得到的冻干制剂的包封药物的保留率最高。

Claims (10)

1、吉西他滨脂质体，其特征在于吉西他滨脂质体的组成物包括吉西他滨、磷脂、胆固醇，由磷脂和胆固醇制成空白脂质体，吉西他滨与磷脂的重量比为：1∶(2～80)，经优化后重量比为1∶(40～80)，通过硫酸铵梯度法制成。

2、根据权利要求1所述的吉西他滨脂质体，其特征在于空白脂质体中磷脂与胆固醇的重量比为10∶(1—10)，优化后其重量比为10∶(1～5)。

3、根据权利要求1所述的吉西他滨脂质体，其特征在于：所述磷脂浓度为1～20mg/ml，优化后浓度为2～10mg/ml。

4、根据权利要求1所述的吉西他滨脂质体，其特征在于：所述的磷脂为两条脂肪烃链8～26个饱和或不饱和碳原子的天然来源、人工合成、人工半合成或人工修饰的磷脂类物质，选自大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇氨、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、烷基醚磷脂酰胆碱中的一种或几种。

5、根据权利要求1所述的吉西他滨脂质体，其特征在于所述吉西他滨为吉西他滨及其硫酸盐，硝酸盐、盐酸盐、磷酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、马鬃酸盐、酒石酸盐和重酒石酸盐中的一种。

6、根据权利要求1所述的吉西他滨脂质体，其特征在于为注射液或加入冻干保护剂制成的冻干制剂，冻干保护剂为：甘露醇、山梨醇、木糖醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精中的一种或几种，其使用量为5％～15％(W/V)。

7、根据权利要求5所述的吉西他滨脂质体的制备方法，其特征在于步骤如下：

1.空白脂质体制备：称取重量比为10∶(1～5)的磷脂与胆固醇溶于适量氯仿中，将适量浓度为150～250mmol/L的硫酸铵溶液加入上述脂质溶液中，在搅拌的状态下水浴超声，直至形成稳定的W/O型乳剂后转入圆底烧瓶内，40℃减压旋转蒸发除去部分氯仿，达到胶态后，另加入适量浓度为150～250mmol/L的硫酸铵溶液，40℃减压条件下继续蒸发除尽氯仿后，水化，得空白脂质体，

2.吉西他滨脂质体制备：将此空白脂质体于37℃、50rpm、0.9％氯化钠溶液中透析1～24h，空白脂质体与0.9％氯化钠的体积比为1∶200，取出后于60℃恒温水浴保温15min，加入同温保温的浓度为0.1～10mg/ml盐酸吉西他滨水溶液适量，使盐酸吉西他滨与磷脂的重量比为：1∶(40～80)，轻摇使之混合均匀，于40～70℃孵育5～30min后立即用冰浴冷却，即得吉西他滨脂质体溶液，

3.注射用吉西他滨脂质体制备：将吉西他滨脂质体溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥得疏松块状的固体注射用吉西他滨脂质体。