CN101426489A - 抑制血管生成的成分和方法 - Google Patents
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Abstract
血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)是肿瘤最常表达的血管生成因子中的一个。VEGF对抗剂的发展成为了一种治疗癌症的重要方法。本发明涉及抗VEGF策略，其特征是VEGF从肿瘤的分泌被阻止。胎盘生长因子－1(PLGF－1)是VEGF家族成员中缺乏血管生成活性中的一个成员，其在一个同时表达PLGF－1以及VEGF的细胞里倾向于与VEGF形成细胞内异源二聚体。含有人PLGF－1(SEQ ID NO：7)或C末端带有KDEL序列的VEGF的反转录病毒载体被构建，上述的KDEL是一个细胞内的内质网滞留信号。以PLGF－1－KDEL反转录病毒载体转导大鼠Lewis肺癌细胞(LLC)几乎完全停止了肿瘤的生长并诱导肿瘤休眠。与这明显的抗肿瘤效果相一致地，大多数VEGF分子仍然保持为细胞内的VEGF/PLGF－1异源二聚体，仅仅有非常少量的VEGF同源二聚体被分泌。结果，在PLGF－1－KDEL(SEQ ID NO：3)肿瘤里，血管仍然维持在非常低的数目，并缺少分枝和毛细血管网络。VEGF－KDEL结构的基因传送进入肿瘤细胞内也产生了明显的抗肿瘤效果。因此，本发明提供了组合物和方法用于抑制VEGF从细胞内分泌。
Description
本发明的技术领域
本发明涉及细胞尘物学领域，尤其涉及含有细胞滞留信号的VEGF结合成员族。
本发明的背景技术
肿瘤的生长和血管生成很大程度上取决于瘤床新血管形成的程度(Carmeliet，P et al.，(2000)Nature 407，249-57；Folkman，J(1995)Nat Med 1，27-31；Hanahan，D.& Folkman，J.Cell(1996)86，353-64)。血管内皮生长因子(VEGF)是一个重要的血管生成因子，经常被肿瘤或其他组织利用来启动血管的生长(Dvorak，H.F.(2000)Semin Perinatol 24，75-8；Ferrara，N.& Alitalo，K(1999)Nat Med 5，1359-64；Yancopoulos，G.D.et al.，(2000)Nature 407，242-8；Benjamin，L.E.& Keshet，E.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94，8761-6)。VEGA也能够增加血管的通透性，而这对于肿瘤的侵入和转移具有重要作用(Dvorak，H.F et al.，(1999)Curr TopMicrobiol Immunol 237，97-132；Senger，D.R.et al.，(1983)Science 219，983-5)。除了病理性的血管生成外，VEGA在胚胎的发育阶段通过刺激血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)而有助于血管系统的形成(Carmeliet，P.et al.，(1996)Nature 380，435-9；Ferrara N.et al.，(1996)Nature 380，439-42)。
VEGF成员族由结构上相关的成员组成，这些成员包括但不限于：VEGA，原型VEGA，胎盘生长因子(PLGF)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E(Eriksson，U.& Alitalo，K.(1999)Curr Top Microbiol Immunol 237，41-57)。VEGF成员的生物功能由至少三种结构同源的酪氨酸激酶受体，VEGFR-1/Flt-1，VEGFR-2/F1k-1/KDR和VEGFR-3/Flt-4，的活化所介导(Cao，Y.elal.，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95，14389-94)。VEGF和PLGF也结合到一个非酪氨酸激酶受体上(Migdal，M.et al.，(1998).J Biol Chem 273，22272-8，S et al.，1998)Cell 92，735-45)。根据它们的受体的结合模式和血管生成的特性，VEGF成员族可被进一步分成亚组，例如，但是不限于：1)VEGF，其与VEGFR-1和VEGFR-2结合，并诱导血管发生，血管生成和血管通透性；2)PLGF和VEGF-B，它们选择性地与VEGFR-1结合，而它们的生理学和病理学作用仍然未知；3)VEGF-C和VEGF-D，它们与VEGFR-2和VEGFR-3相互作用，并诱导血管生成和淋巴管生成(Cao，Y.et al.supra；Makinen，T.et al.，(2001)Nat Med 7，199-205；Marconcini，L et al.，(1999)Pro Natl Acad Sci USA 96，9671-6；Skobe，M.et al.，(2001)Nat Med 7，192-8；Stracker，S.A.et al.，(2001)Nat Med 7，186-91)。积累下来的证据表明VEGFR-2，对VEGF做出响应，为血管生长介导血管生成信号，而VEGFR-3则为淋巴管的生长转导信号(Dvorak，H.F.supra；Ferrara，N.& Alitalo，K.supra；Ferrara，N.(1999)Curr Top Microbiol Immunol 237，1-30)。
与血小板生长因子(PDGF)成员族相似，为了与它们特定的受体结合，VEGA成员族自然地以二聚体的形式存在。除了同源二聚体外，PLGF(SEQ ID NO：2)和VEGF-B(SEQ ID NO：11或4)在同一个细胞内被产生时也能够形成异源二聚体(Cao，Y.et al.(1996)J Bio Chem 271，3154-62；DiSalvo，J.et al.，(1995)J Biol Chem 270，7717-23)。分布研究表明这些因子通常在一些重叠的组织或细胞中表达。因此，当两种因子在同样的细胞群中被合成时，PLGF/VEGF或VEGF/VEGF-B异源二聚体自然地在组织中出现(Cao，Y.et al.supra；Cao，Y.et al.，(1996)supra)。这些异源二聚体与VEGF同源二聚体比较，展现出较低的血管生成活性，可如申请号为10/346,589，申请日为2003年1月17日的美国专利申请所描述的那样，被用作抑制血管生成。
发明内容
本发明的一个方面是提供带有细胞滞留信号的VEGF结合成员。该VEGF结合家族成员可包括，PLGF(SEQ ID NO.2)，VEGF-B(SEQ ID NO.11或14)，VEGF受体(VEGFR)1(VEGFR-1)，VEGFR-2，神经菌毛素—1(neuropilin—1)，神经菌毛素—2(neuropilin—2)，或者针对表达VEGF的细胞的VEGF结合抗体的衍生物。细胞滞留信号可包括内质网滞留信号，例如KDEL(SEQ ID NO：7)。其他合适的细胞滞留信号包括但不限于：内质滞留信号序列，高尔基体滞留信号序列(例如，但不限于YQRL(SEQ ID NO：19))，核内体/溶酶体滞留序列(例如，但不限于KFERQ(SEQ ID NO：16))，线粒体靶序列，细胞核靶序列，和/或过氧物酶体靶序列。滞留信号在本技术领域的技术人员中是众所周知的，合适的滞留信号能很容易地被选定并被并入蛋白编码序列中，翻译后形成带有该滞留信号的蛋白。编码滞留信号的cDNA序列可被直接插入到编码需要被保留的蛋白的cDNA序列的终止密码子前。
本发明的又一方面是提供一个能够与VEGF形成异源二聚体的分子。在一些的实施方式中，该分子可包括带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物。
本发明的又一方面是提供一种抑制VEGF的方法，该方法包括施加了带有细胞滞留信号的VEGA结合成员或它们的衍尘物。在一个实施例中，抑制VEGF的方法包括施加VEGF-B-KDEL(SEQ ID NO：12或15)。
进一步地，还提供一种抑制个体内的血管生成的方法，包括对该个体施加有效量的带有滞留信号的VEGF结合成员，或它们的衍生物。所述的带有滞留信号的VEGF结合成员或它们的衍生物可进一步与细胞内的VEGF形成异源二聚体。在一些实施方式中，带有滞留信号的VEGF结合成员或它们的衍生物可抑制细胞内的VEGF的分泌，VEGF同源二聚体的形成或VEGF同源二聚体的分泌。
本发明的又一方面是提供抑制VEGF活性(也叫VEGF-A)的方法，该方法是把一细胞内的滞留信号连接到一VEGF结合蛋白或它们的衍生物。该方法可被用来治疗各种VEGF诱导血管生成所引致的疾病。该方法的一个例子包括传送编码VEGF结合成员或它们的衍生物的基因进入到表达VEGF的细胞内，并且保留细胞内滞留信号，从而当这两种蛋白都在细胞内表达时，该结合成员或它们的衍生物与VEGF形成异源二聚体。上述的VEGF结合成员或它们的衍生物可为PLGF(SEQ ID NO：1)、VEGF-B(SEQ ID NO：10或13)、VEGF受体(VEGFR)1(VEGFR-1)、VEGFR-2、神经菌毛素—1、神经菌毛素—2、或者针对表达VEGF的细胞的VEGF结合抗体。正如这里所述的研究表明，与VEGF/VEGF同源二聚体相比，异源二聚体VEGF/PLGF和VEGF/VEGF-B降低了血管生成的活性，因此抑制了VEGF的血管生成活性。
在本发明的一个特定的实施方式中，编码带有细胞内滞留信号的合成员或它的衍生物的基因被包含在一个适合于基因基因传送的载体上。这样的载体包括腺病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、牛豆病毒载体、腺相关病毒载体、RNA载体、脂质体载体、阳离子脂类、转座子等。在一较佳的实施方式中，该基因被包含在反转录病毒载体或慢病毒载体。该基因也能与另一抗血管尘成介质或抗肿瘤介质一起传送或施用。
本发明方法的一个实施例能在体外或回体法被用于抑制血管生成、糖尿病视网膜病和/或肿瘤生长。该方法也能被在体外用作治疗多种在人或动物个体内由VEGF诱导血管生成所导致的疾病。这些疾病包括多种癌症、糖尿病视网膜病和自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎。
本发明的进一步的应用包括但不限于：形成一种生长因子对抗剂(例如蛋白质、多糖或脂类)，该对抗剂是通过一个生长因子结合成员来吸收细胞内的生长因子。细胞内滞留信号将发挥作用而影响蛋白质在细胞内的路线。ER滞留信号KDEL(SEQ ID NO：7)，一个哺乳动物的ER滞留信号序列，就是可应用在本发明的滞留信号的一个例子。其它合适的内质滞留信号可包括但不限于具有同样功能的氨基酸序列。例如，这些氨基酸序列可以是源自细菌毒素的氨基酸序列，例如ETA，或者是源自酵母的氨基酸序列，例如HDEL(SEQ ID NO：24)。
本发明的进一步的实施例是一个被分离的核酸，该核酸含有编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或它的衍生物的核苷序列。该被分离的编码VEGF结合成员或它的衍生物的核酸包括但不限于VEGF-B(SEQ ID NO：10或13)、或PLGF-1(SEQ ID NO：1)。在一个实施方式中，细胞内滞留信号可以是一个含有KDEL(SEQ ID NO：7)的内质网滞留信号。
本发明的又一个方面是提供一个重组质粒，该重组质粒编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物，而该带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物能与细胞内的VEGF形成异源二聚体。本发明的更进一步是提供一个重组病毒载体，该病毒载体含有编码带有细胞内滞留信号的并能与细胞内的VEGF形成异源二聚体的VEGF结合成员或其衍生物的核苷酸序列，所述的核苷酸序列是一个cDNA序列。重组病毒载体内的VEGF结合成员的核苷酸序列可以是VEGF-B(SEQ ID NO：10或13)或PLGF-1(SEQ ID NO：1)。所述的内质网滞留信号可以是KEDL(SEQ ID NO：7)。所述的重组病毒载体可以是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、反转录病毒载体、疱疹病毒载体等。
本发明的一个具体实施方式是一种药物组合物，该药物组合物包含有附有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物。在一些具体实施方式中，该药物组合物可进一步含有药学上可接受的载体。所述的药物组合物中的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物能与细胞内的VEGF形成异源二聚体。在一个具体实施方式中，所述的药物组合物是一个病毒载体以及药学上可接受的载体，该病毒载体含有编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的基因。
本发明的一个具体实施方式是一种抑制细胞内的VEGF分泌的方法，该方法通过对某一个体施加有效量的带有细胞内滞留信号的VEGF成员或其衍生物来实现的，所述的带有细胞内滞留信号的VEGF成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异源二聚体并抑制VEGF的分泌。在本发明的一些方面，带有细胞内滞留信号的VEGF成员或其衍生物能够从一重组质粒或一重组病毒载体得到表达。
本发明的一个具体实施方式是在细胞内抑制VEGF活性的方法，该方法通过对某一个体施加有效量的带有细胞内滞留信号的VEGF成员或其衍生物来实现的。所述的VEGF成员或其衍生物可与细胞内的VEGF形成异源二聚体并抑制或破坏病原细胞的生长。在进一步的具体实施方式中，所述的个体患有以下疾病中的一种：癌症、炎性关节炎(例如类风湿性关节炎)、糖尿病视网膜病以及其他新生血管性眼睛疾病(例如角膜新生血管、新生血管性青光眼、晶状体后面的纤维细胞化病、黄斑变性)、动静脉畸形、过度出血(月经过多)、Osler-Webber综合症、心肌血管新生、血小板新血管生成、毛细管扩张、血友病关节症、血管纤维瘤、伤口肉芽以及过度的或不正常的内皮细胞累积疾病。在一个具体的实施方式中，在个体的细胞内，抑制VEGF的活性的方法包括施加带有细胞滞留信号的VEGF-B(SEQ ID NO：12或15)或PLGF-1(SEQ ID NO：3)。在进一步的具体实施方式中，所述的细胞滞留信号包括KDEL(SEQ IDNO：7)。
再一个具体实施方式是抑制VEGF的分泌的方法，该方法通过对患者施加足量的反转录病毒载体来转导病人的VEGF分泌细胞来实现。所述的反转录病毒载体含有编码带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核甘酸序列，而所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物被表达有足够的数量来与VEGF结合以形成异源二聚体，用于抑制VEGF从细胞内分泌。本发明的具体实施方式包括多个方面，主要涉及患有以下疾病的病人：癌症、炎性关节炎(例如类风湿性关节炎)、糖尿病视网膜病以及其他新生血管性眼睛疾病(例如角膜新生血管、新生血管性青光眼、晶状体后面的纤维细胞化病、黄斑变性)、动静脉畸形、过度出血(月经过多)、Osler-Webber综合症、心肌血管新生、血小板新血管生成、毛细管扩张、血友病关节症、血管纤维瘤、伤口肉芽以及过度的或不正常的内皮细胞积累疾病。带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物可以是VEGF-B(SEQ ID NO：12或15)或PLGF-1(SEQ ID NO：3)。所述的细胞滞留信号可以是KDEL(SEQ ID NO：7)。
再一个具体实施方式是一个药物组合物，该药物组合物含有至少一个反转录病毒载体，该反转录病毒载体含有编码带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核甘酸序列。所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物可以是VEGF-B(SEQ NO：12或15)或PLGF-1(SEQ ID NO：3)。所述的细胞滞留信号可以是KDEL(SEQ ID NO：7)。
这些方面进一步包括在个体内抑制血管生成的方法，该方法是通过对个体施加有效量的附有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物来实现的。所述的附有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异源二聚体，并抑制细胞内的VEGF的分泌。
本发明的再一个方面是治疗个体内的血管生成疾病的方法，该方法是通过对个体施加有效量的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物来实现的。所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异源二聚体，抑制细胞内的VEGF的分泌从而使与血管生成疾病相关联的血管生成受到抑制。
再一个方面是治疗个体内的血管生成疾病的方法，该方法是通过对个体施加有效量的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物来实现的。所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异源二聚体，抑制细胞内的VEGF的分泌从而使与血管生成疾病相关的血管尘成收到抑制。
附图说明
图1各种细胞系产生的趋化活性和细胞形态的变化/肌动蛋白重组。纯化的PLGF-1(SEQID NO：2)、VEGF、PLGF-1/VEGF异源二聚体(a、d、h、i和j)，或来自各种被转导的或未被转导的LLC肿瘤细胞系的条件培养基(b、c、e、f和k-p)对VEGF-1/PAE(a-c)以及VEGFR-2/PAE(d-q)内皮细胞的趋化和细胞形态的影响的分析。每个光场内(32×)的迁移细胞被统计，数据代表每个样品(a-f)一式四份的％(土SEM)。为了进行形态分析，生长因子或条件培养基以VEGFR-2/PAE细胞进行培植，通过TRITC-鬼笔[毒]环肽染色观察到肌动蛋白重组(g-p)。在每个样品的任意5个光场(20×)里，纺锤状细胞被统计数量，并被表示为所有细胞的平均百分数(土SEM)(q)。*P<0.05；**P<0.01；和p<0.001。
图2是用PLGF-1KDEL(SEQ ID NO：3)抑制肿瘤的生长，在显示的时间点，wtLLC、载体-LLC、hPLGF-LLC以及hPLGF_KDEL-LLC肿瘤细胞的生长率。大约地，每个细胞系地1×106个肿瘤细胞皮下注射入6周大的C57B1/6雌鼠。从第6天开始，每隔两天，测量一次肿瘤的尺寸(c和d)。在肿瘤被种植的第14天，典型的肿瘤外观被拍照(b)，按照标准的公式：长2×宽2×0.52测量肿瘤的体积。数据表示为每组的6个小鼠的平均数％(土SEM)(c和d)。对于hPLGF-1和对照肿瘤与hPLGF-1-KDEL-LLC肿瘤的对比，*p<0.05；**p<0.01；和***<0.001。
图3是用hVEGF-KDEL抑制肿瘤细胞的生长，在显示的时间点，wt LLC、载体-LLC、hVEGF-LLC和hVEGF-KDEL-LLC肿瘤细胞的生长速率。大约每个细胞系的1×106个肿瘤细胞皮下注射入6周大的C57B1/6雌鼠体内。从第5天开始，每隔2天测量一次肿瘤的大小。在种植后的第14天(b)和第10天(c)，典型的肿瘤外观被拍照，按照标准的公式：长2×宽2×0.52测量肿瘤的体积。黄色箭头指向种植的肿瘤。数据被表示为每组的6个小鼠的平均％(土SEM)。对于以hVEGF(c和e)及对照肿瘤(b和d)与hVEGF-KDEL-LLC肿瘤对比；*p<0.05；**p<0.01；和***<0.001。
图4是肿瘤血管的免疫组织化学检测。wt LLC、hVEGF-LLC、hVEGF-KDEL-LLC、hPLGF-1和hPLGF-1-KDEL-LLC肿瘤长到同样的大小，组织切片采用传统的免疫组织化学方法(a-f)或整体染色/共聚焦方法(h-m)，以抗CD31抗体进行染色。在光学显微镜的至少任意6个光场(20×)统计微血管密度，并表示为平均值(土SEM)(g)。**p<0.01；和***p<0.001。
图5是肿瘤细胞凋亡。wt LLC、载体-LLC、hVEGF-LLC、hVEGF-KDEL-LLC、hPLGF-1-LLC和hPLGF-1-KDEL-LLC肿瘤的组织切片用TITC-labelled TUNEL试剂盒染色，接着用Hoescht染料(蓝色)统计染色量。箭头指向之处为凋亡的绿色细胞(a-f)凋亡的细胞数在10个任意选定的光场(optical field)(40×)进行统计，且用平均数来表示(土SEM)(g)。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。
具体实施方式
在描述本发明的组合物和方法之前，应该明白，本发明不应该局限于所描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些都是可以变化的。同时，也应该明白，本说明书中使用的术语仅仅是为了描述特定的具体实施方式，而不应用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围应该由权利要求来限制。
这里所使用的术语的意思对本技术领域的人员来说都是清楚的，然而，为了方便和完整起见，对特定的术语和它们的意思做如下的阐述。
应该注意到，在这里以及权利要求中所使用的单数形式“a”，“an”和“the”包括复数形式，除非上下文清楚表明是单数。因此，例如，“球状体”被看作为一个或多个球状体和本技术领域地人员所知道的等同物。除非有专门的定义，这里所使用的技术和科学术语的意思都与本技术领域的技术人员所懂得的通常意思一样。虽然与这里所描述的方法和物质相似或等同的任何方法和物质虽然能够在实际中使用或用于验证本发明的具体实施方式，但是这里描述较佳的方法、装置和物质。所有提及的公开资料被加入进来作为参考。
“病人”和“个体”的意思是所有的动物，包括人。例如，病人和个体包括人、牛、狗、猫、山羊、绵羊和猪。
“血管生成”指从已有的血管组织(例如，脉管系统)产生新的血供，例如，毛细血管、血管和静脉。血管生成的过程涉及到许多组织细胞类型，例如，形成所有的血管的单一细胞层内衬，并用作调节血流与周边组织的交换的内皮细胞。通过内皮细胞的生长，新血管(血管生成)会从现有的小血管壁形成。血管生成与肿瘤的生长也有关系，因为它为肿瘤提供肿瘤细胞存活和繁殖(生长)所必需的血供。
“癌”是指由不正常的和失控的细胞分裂导致的任何恶性生长或瘤；它可以通过淋巴系统或血流扩散至身体的其他部分。癌包括实体瘤和血瘤。实体瘤包括但不限于卡波济肉瘤、血管瘤、实体瘤、血瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、结肠癌、横纹肌肉癌、眼癌、犹文氏肉瘤、成神经细胞瘤和骨肉瘤。血管生成也与血瘤有关，例如白血病，各种急性或慢性骨髓疾病，在骨髓中，白细胞无限制地繁殖，通常伴随有贫血、血液凝固受损、以及淋巴结、肝和脾的肿大。相信血管生成在导致白血病等类似的肿瘤发生的骨髓异常中起一定的作用。
此处使用的“抑制血管生成”是指血管生成的全部或部分抑制。
此处使用的“基因”是指编码目标蛋白质的DNA(cDNA)或RNA，例如在编码序列的3’末端，终止密码前含有一段编码KDEL(SEQ ID NO：7)的序列的PLGF(SEQ ID NO：3)或VEGF-B(SEQ ID NO：12或15)。DNA基因是互补的DNA(cDNA)序列，因此缺少基因内区和包含编码目标蛋白序列(例如，附有细胞内滞留信号的VEGF结合成员)。编码本发明所使用的VEGF的基因通常与细胞表达该基因所必须的遗传元素一起被包含在一个表达载体上。在本技术领域中，众所周知地，这些元素包括合适地启动子和强化子。
“VEGF结合成员或其衍生物”指除了VEGF外，能与VEGF(也叫做VEGF-A)结合并抑制VEGF活性(例如VEGF诱导血管生成)的蛋白或多肽。VEGF结合成员包括PLGF、VEGF-B、和其它能够自然地与VEGF结合的蛋白，该蛋白也可和VEGFR-1结合(正如VEGF与VEGFR-1结合一样)。
“PLGF”和“VEGF-B”指PLGF和VEGF-B生长因子以及能够与VEGF结合(与VEGF形成异源二聚体)并降低VEGF活性的具有相同功能的类似物。这些具有相同功能的类似物包括具有相同功能的多肽以及从PLGF和/或VEGF-B衍生出来同系物，这些同系物保留了与VEGF结合且降低VEGF活性(相对于其内没有PLGF、VEGF-B或类似物的细胞而言)的功能。
“功能等同物”指具有抗血管生成活性，且通过标准分析确定，与附有细胞滞留信号的VEGF成员具有类似作用的成分。“标准检测”包括但不限于，在分子生物领域用作评估抗血管生成活性的方法、细胞形态检测和肌动蛋白着色、细胞周期阻滞、细胞死亡检测、趋化现象检测和内皮细胞迁移。这些分析在此后的实施例中提供。
与VEGF结合成员(例如，PLGF和VEGF-B)有关的“在足够量的水平上表达或施加”是指能够部分或全部抑制VEGF活性(例如，VEGF诱导血管生成)所必需的量。VEGF结合成员表达量与细胞内表达的内尘VEGF的表达量相等(1：1)是比较合适的，而高于细胞内表达的内生VEGF的表达量则是更好的，这样在细胞内，VEGF与含有KDEL(SEQ ID NO：7)的VEGF结合成员形成的异源二聚体的量高于VEGF/VEGF同源二聚体的量。例如，细胞内，VEGF的表达量与VEGF结合成员的表达量的比率可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7或更高。在没有VEGF结合成员表达的情况下，VEGF将会产生活性，而VEGF结合成员这样的表达量则降低了全部VEGF的这种活性，这被叫做VEGF的“过量表达”。另外，在一些情况下(视被处理的细胞的情况而定)，VEGF结合成员可能已经在细胞内自然地(内生地)被表达，以致于把编码VEGF结合成员的基因转入到细胞内将会增加VEGF结合体的量到足以降低或阻隔VEGF的活性。
药物组合物的“治疗有效量”指足以降低或阻止与健康状况或虚弱有关的症状的药量，或者指足以使处于疾病或功能紊乱而导致身体某些功能受到损害的状况下的身体功能恢复正常的药量，或者指足以改善疾病的一项或多项临床上测得的指标参数的药量。与本申请相关的，治疗有效量是足以降低或抑制VEGF的分泌或表达或者血管生成的药量。
VEGF结合成员与VEGF相对比的蛋白质水平的测定或定量的分析(例如标准ELISA分析)，以及测量VEGF活性的分析方法都是本技术领域众所周知的，例如包括这里所提供的研究所描述的各种分析方法。
术语“反转录病毒载体”指一种载体，该载体含有来源于反转录病毒，例如C型反转录病毒，的结构上的和功能上的遗传成分。合适的翻转录病毒包括莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维大鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、大鼠乳房肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLY)、泡沫病毒、Friend、大鼠干细胞病毒(MSCV)和鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)。本发明所使用的“反转录病毒”还可以包括来源于人T细胞白血病病毒、HTLV-1和HTLV-2，以及反转录病毒的慢性病毒家族成员的载体，所述的反转录病毒的慢性病毒家族成员例如可为人免疫缺陷病毒、HIV-1、HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SlY)、猫免疫缺陷病毒(FIY)、马免疫缺陷病毒(EIY)、以及其它类型的发转录病毒。
“反转录病毒”是一种在复制周期内使用反转录酶的RNA病毒。该反转录病毒染色体RNA通过反转录酶的作用被转化成双链DNA。所述的病毒双链DNA形式能够被整合入被侵染的细胞的染色体内；一旦被整合，就被称作“前病毒”。该前病毒被用作RNA聚合酶II模板以及编码产生新的病毒所需要的结构蛋白以及酶的mRNA分子的模板。前病毒的每个末端是一种被叫做“长末端重复序列”或“LTRs”的结构。该LTR包含有多种调节信号，这些调节信号包括病毒的染色体组复制和整合所需要的翻译控制元件、多聚核苷酸化信号以及序列。所述的病毒LTR被分成三个区，分别叫做U3、R、和U5。U3区包含增强子和启动子元件。U5区是位于引物结合位点和R区之间的序列，它包含多聚核苷酸化序列。R(repeat)区连接在U3和U5之间。LTR由U3、R和U5区组成，均出现在病毒基因组的两端。
术语“慢性病毒”指缓慢导致疾病产生的反转录病毒组(类)。属于这些反转录病毒组的病毒包括HIV(艾滋病毒；包括HIV型1，和HIV型2)，人类获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原；导致绵羊脑炎或肺炎的梅迪/维斯那病(visna-maedi)病原，导致山羊免疫缺陷、关节炎和脑病的山羊关节炎脑炎病毒；导致马自身免疫性溶血性贫血和脑病的马传染性贫血病毒；导致猫免疫缺陷的猫免疫缺陷病毒(FIV)；导致牛淋巴结病、淋巴球增多、中枢神经系统感染的牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及导致灵长类动物免疫缺陷和脑病的猿免疫缺陷病毒(SIV)。由这些病毒导致的疾病具有长潜伏期和迁延期的特点。通常，这些病毒隐蔽地侵染单核细胞和巨噬细胞，并从这些细胞传播至其他细胞。HIV、FIV、和SIV也很容易侵染T淋巴细胞(例如T-细胞)。
术语“载体”指能够把连接于其上的另外一个核酸进行传送(例如进入细胞内)的核酸分子。术语“表达载体”指包含有以适合于细胞表达的形式(例如，与启动子连接)出现的基因结构的任何载体(例如质粒、粘粒或者噬菌体染色体)。在本说明书中，“质粒”和“载体”是互用的，因为质粒是载体的常用形式。另外，本发明中，其他具有相同功能的载体也需要包括在内。
术语“基因传送”或“转染”是指把外源DNA或RNA转入真核细胞内。本发明所述的基因传送可以使用本技术领域总所周知的技术以in vitro、in vitro以及ex vivo的方式完成。例如，in vitro以及ex vivo方式的基因传送采用DNA-磷酸钙共沉淀法、DEAE-dextranmediated转染法、聚凝胺接导转染法、电穿孔法、显微注射法、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、生物弹射击法以及病毒转染。In vivo方式的基因传送可通过各种本技术领域的技术实现，这些技术包括最常用的注射法(例如静脉注射、肌肉注射等)。
本发明的一个方面是基于以下的发现：当C末端带有内质网滞留信号的PLGF与VEGF在同一细胞内被产尘时，C末端带有内质网滞留信号的PLGF，例如KDEL(SEQ ID NO：7)，能够抑制VEGF(例如VEGF-A)的功能，其基本原理是产生了VEGF异质聚体。VEGF与通过遗传工程产生的并在C末端有内质网滞留信号的PLGF(SEQ ID NO：3)之间形成异源二聚体，将会抑制VEGF的血管生成活性。相应的，本发明的一个方面是提供一种抑制包括VEGF诱导血管生成(例如在肿瘤里)在内的VEGF的活性的方法，该方法通过施加除了VEGF本身外的VEGF结合成员，例如PLGF-KDEL(SEQ ID NO：7)。
在本发明的一个具体实施方式中，带有细胞滞留信号的VEGF结合成员的施加方式可通过传送在一个病毒载体内，最好是在反转录病毒或慢性病毒内，的编码附有细胞滞留信号的VEGF结合成员的基因来实现。在本发明中使用的慢性病毒载体包括美国临时专利申请60/288042所描述的自我失活型慢性病毒载体。
在本发明的进一步的具体实施方式中，用于基因传送的载体(例如，反转录病毒和慢性病毒载体)在与细胞接触之前，也能够通过使用包装细胞系而被整合入病毒体内，这在本技术领域是众所周知的。“包装细胞系”指含有产生病毒粒子所必须的编码序列的细胞系(尤其是哺乳动物细胞)，该细胞系缺乏包装DNA或RNA和产生增殖型辅助病毒的能力。当包装功能在细胞系内被提供(例如，通过质粒载体的方式转导)，该包装细胞系产生重组病毒，从而成为“生产细胞系”。根据载体的性质，任何合适的包装细胞系可被用于本发明中。
另外，编码VEGF成员的基因，例如PLGF-KDEL(SEQ ID NO：3)和VEGF-B-KDEL(SEQID NO：12或15)，可单独地或者与一个或多个的其它血管生成抑制(抗血管生成)因子一起被传送，这些其他血管生成抑制(抗血管生成)因子包括但不限于血管内皮抑制素或血管生成抑制素(见美国专利6174861和6024688，该两专利的内容被整合到这里作为参考)，或者一个或多个抗癌剂，例如化疗剂或放射物。此外，编码带有细胞内滞留信号的不同的VEGF结合信号的多个基因可以一起被传送以增强对VEGF的抑制。
细胞内滞留信号包括但不限于内质滞留信号序列、高尔基体滞留信号序列、核内体/溶酶体滞留信号序列、线粒体靶序列、细胞核靶序列、和/或过氧物溶酶体靶序列。这些滞留信号可以位于VEGF结合蛋白序列的任何位置，只要该蛋白的部分功能活性能够被保留就可以了。被保留的部分活性功能，在一个具体实施方式中，至少是天然蛋白的功能活性的50％。在进一步的具体实施方式中，被保留的部分功能活性至少是天然蛋白的功能活性的75％。在又一个具体实施方式中，被保留的部分功能活性至少是天然蛋白的90％。
相应地，本发明的几个方面是提供多个治疗由VEGF活性和VEGF诱导血管生成导致的疾病(例如癌症、糖尿病视网膜病、和类风湿性关节炎)的方法，这些方法使用基因治疗和多种基因传送系统，例如反转录病毒和慢性病毒基因传送系统。这些系统使体内持续的、高水平地表达被转送的治疗基因，而且在以无毒的方式侵染并整合入各种细胞型的染色体组内方面高度有效。
有多种疾病是多余的血管尘成的结果。因此，如果在某些情况、特定的时间或者特定的组织内能够停止毛细血管的尘长和扩展，那么许多疾病和不良健康状况能够被阻止或减轻。能够通过本发明公开的内容所治疗的血管尘长依赖型疾病是需要或诱导血管生长的那些健康状况/疾病。例如，癌症、炎性关节炎(例如类风湿性关节炎)、糖尿病视网膜病及其它眼睛新生血管性疾病(例如，角膜新生血管、新生血管性青光眼、眼晶状体后面的纤维细胞化和黄斑变性)、动静脉畸形、流血过度(月经过多)、Osler-Webber综合症、心肌血管新生、血小板新血管生成、毛细管扩张、血友病关节症、血管纤维瘤、伤口肉芽。这里提供的抗血管生成成分可用于治疗过度的或不正常的内皮细胞积累疾病。这些疾病包括但不限于肠粘连、克朗氏病、动脉硬化症、硬皮病和增生性瘢痕(例如瘢痕疙瘩)。
虽然本发明按照其较佳实施方式进行描述，但是其它的具体实施方式也能得到同样的结果。本技术领域的技术人员利用常规试验就可认识到或发现许多与在此描述的特定的具体实施方式等同的技术方案。这些等同技术方案被认为是落入本发明的范围，并被以下的段落所包围。
基因治疗
基因治疗指对个体施加核酸的治疗方法。在本发明的这个实施方式中，编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核酸序列被传送到一个细胞内，并通过抑制VEGF的分泌而产生治疗效果。在一个基因治疗方案中，为了抑制VEGF的分泌，包含有表达盒的载体可以被直接施加到细胞，例如肿瘤细胞，而上述的表达盒编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员及其衍生物，例如VEGF-KDEL、PLGF-KDEL(SEQ ID NO：3)。近来，合成了许多带有嵌合外被蛋白的反转录病毒载体。这些嵌合蛋白由两个典型的区域组成，其中一个区域被嵌入病毒的外被且来源于反转录病毒。而第二区域与病毒不同源，是结合对家族成员中的一员。例如，第二区域由包括一结合到肿瘤细胞表面标记的单链的Fv片断，或者它是在细胞表面表达的抗体的结合配合体。其它结合对，不一定是单克隆抗体，它们的配合体对于本技术领域的人员来说是很清楚的。这些配合体将会把治疗基因导向合适的细胞。
根据本发明，本技术领域中可以用于基因治疗的方法都可以使用。举例性的方法在下面进行描述。
对基因治疗的方法进行综合回顾，见Goldspiel et al.1993，Clinical Pharmacy12：488-505；Wu and Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science 260：926-932；以及Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155—215)。这些方法在被使用的重组DNA技术的领域都是很常见的，重组DNA技术在Ausubel et al.(eds.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY；和Kriegler，1990，Gene Transfer and Expressin，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY有描述。
在一个具体实施方式中，药物化合物包括作为表达载体的一部分的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核酸，上述的表达载体表达带有细胞内滞留信号蛋白的VEGF结合成员或其衍生物。尤其是，这样的核酸有一个启动子连接在编码区，所述的启动子是可诱导的或组成型的，并且也可以是组织特异性的。在另外一个详细的实施方式中，一核酸分子被使用，在该核酸分子里，前面提及的结合成员或其衍生物、编码序列以及其它需要的任何序列的两端被连接有在染色体需要的位点启动同源重组的区域，从而供作核酸的染色体内表达。
核酸可以直接或间接地被转入病人体内，在直接传送的情况下，病人直接直接接触核酸或核酸运载载体，在间接传送的情况下，细胞在体外首先用核酸进行转化，然后被移植入病人体内。这两种方法分别被叫做in vivo或ex vivo基因治疗。
在一个特定的具体实施方式中，核酸在体内被直接施加，并在体内表达产生被编码的产品。这过程能够通过本技术领域通知的多种方法中的一种得以完成。这些方法例如可以是把该核酸构建入核酸表达载体并将其施加而进入到细胞内，该施加的方式例如可通过使用有缺陷的或减毒的反转录病毒或其它病毒载体(见美国专利4980286)进行侵染，或者直接注射裸露的DNA，或者采用微粒子轰炸(例如，基因枪、生物弹击法、Dupont法)，或者用脂类或细胞表面受体或转染剂进行嵌合，或者在脂质体、微粒子或微胶囊进行包封。这些施加方法例如还可是把核酸连接到可以进入细胞核的多肽上来进行施加，或者是把核酸连接到可以进行受体介导细胞内吞作用的配合基体上来进行施加。(见Wu and Wu，1987，J，Biol.Chem.262：4429-4432)(这方法可以被用于特异性表达受体的靶细胞型)。
在另外一个具体实施方式中，形成了一核酸-配合基体的联合体，而该联合体内的配合基体是一个能够破坏内函体的融合病毒多肽，使核酸不会被溶酶体所降解。在又一个具体实施方式中，为了能够让细胞对核酸进行特异性地吸收并表达，所述的核酸可以通过靶向特异性的受体而被标靶((见PCT的1992年4月16的公告WO92/06180(Wu et al.)；1992年12月23日的公告WO92/22635(Wilson et al.)；1992年11月26日的公告WO92/20316(Findeis et al)；1993年7月22日的公告WO93/14188(Clarke et al.)；1993年10月14日的公告WO93/20221(Young))。作为选择，通过通源重组的方式，核酸可被导入细胞内并被整合入宿主细胞DNA内用于表达(Koller and smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra et al.，1989，Nature342：435-438)。
编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员的反转录病毒载体
在一个专门的具体实施方式中，一含有编码带有细胞内滞留信号的VEGF接合成员或其衍生物的核酸的病毒载体被使用。例如，反转录病毒载体可以被使用(见Miller et al.，1993，Meth.Enzymol.217：581-599)。这些反转录病毒载体被修饰，删除了那些与病毒染色体的包装以及整合入宿主细胞DNA无关的反转录病毒的序列。用作基因治疗并编码带有细胞内滞留信号的VEGF成员或其衍生物的核酸被克隆到载体上，通过该载体很容易地把基因传送入病人体内。如下的文献举例说明了在基因治疗中使用了反转录病毒载体：Clowes et al.，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Kiem et al.，1994，Blood 83：1467-1473；Salmons and Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4：129-141；和Grossmanand Wilson，1993，Curr.Opin.In Genetics and Devel.3：110-114。
反转录病毒载体作为一种用作介导病毒-介导基因传送入真核细胞的媒介物是有用的。反转录病毒载体通常被构建，删除了病毒结构基因编码序列的主体部分，并用目的基因进行替代。很经常地，通过使用本技术领域通知地基因工程技术，结构基因(例如，gag、pol、和env)从反转录病毒的主链被移走。
Gag、pol以及env基因的移走形成了一载体主链，该主链包括一个5′LTR、一个包装信号、用于引入一个或多个外源目标基因的一个或多个克隆位点，以及一个3′LTR。可以被使用的载体主链的一个例子是G1载体主链，其在以下的文献中被公开：McLachlin，et al.，Virology，195：1-5(1993)以及1991年7月25公告的PCT申请，公告号为WO91/10728，发明名称“新型的病毒载体”。
外源基因通过标准技术，被整合入前病毒主链，形成了反转录病毒载体。用作制备反转录病毒的技术公开在PCT申请WO91/10728以及以下的文章中：Armentano，et al.，J.Virol.，61：1647-1650(1987)、Bender，et al.，J.Virol.，61：1639-1646(1987)、以及Miller，et al.，Biotechniques，7：980-990(1989)。最直接的构建方法是把反转录病毒的结构用单一的一条基因所取代，接着该基因在长端重复序列(LTR)内的病毒调节序列的控制下被转录。能够引入多个基因进入靶细胞的反转录病毒载体也可以被构建。通常，在这样的载体内，第一个基因是受到病毒LTR的调控，然而第二个基因要么是在没有拼接信号的情况下被表达，要么是在它自己的调控，内部启动子下进行表达。合适的启动子包括SV40启动子、人类细胞巨化病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、以及任何与外源目标自然地基因有关联的启动子。
反转录病毒载体可以质粒、病毒RNA的一个片断、或者前病毒DNA的一个片断形式存在。反转录病毒载体被导入一个包装细胞以形成生产细胞。包装细胞提供gag、pol、yi以及env基因，这些基因可以让反转录病毒载体包装成为重组病毒，而该重组病毒具有感染性但是复制缺陷。所述的载体通过标准的基因传送技术被传送入包装细胞内，这些基因传送技术包括转染、转导、磷酸钙共沉淀、电穿孔、以及脂质体介导DNA传送。可以被使用的包装细胞包括但不限于PE501、PA317、Psi-2、Psi-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、Psi-CRE、Psi-CRIP、GP+E-86、GP+envAM12、以及DNA细胞系。可被用于产生反转录病毒重组体的的生产细胞系PA317/G1TK1SvNa生产细胞系，该细胞系被公开在PCT申请WO96/06486中。
反转录病毒载体以足以抑制、阻止或破坏肿瘤细胞或其它病原细胞产生的VEGF的血管生成特性的有效量被施加到宿主。所述的宿主可以是哺乳动物宿主，包括人类和非人类的灵长类动物宿主。施加的方式可以是直接把反转录病毒载体施加到宿主的病原细胞区域(例如肿瘤本身、或糖尿病视网膜病患者的视网膜区域)，在那里，反转录病毒载体转导复制的细胞。反转录病毒载体的施加部位取决于多个因素，这些因素包括被治疗的疾病的特性。一般来说，反转录病毒载体以至少104cfu/剂的量进行施加，但药量不超过108cfu/剂。较佳的，反转录病毒载体以105cfu/剂到107cfu/剂的量来进行施用。确切的药量取决于多种因素，这些因素包括病人的年龄、体重和性别，被治疗的疾患的性质、以及被治疗的疾患的严重程度。
反转录病毒载体可与可接受的药物载体一起被施用，这些载体例如为食盐水、鱼精蛋白硫酸盐(Elkins-Sinn，Inc.，Cherry Hill，N.J.)、水、磷酸盐和Tris等缓冲水溶液、或者聚凝胺(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)。根据这里的教导，本技术领域的技术人员对于合适的药物载体的选择是很清楚的。
在一个具体实施方式中，编码带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的反转录病毒成分与化疗剂一起被施用，两者一起抑制和/或破坏了复制的病原细胞的生长。在另外一个具体实施方式中，编码带有细胞滞留信号的VEGF结合成员的反转录病毒成分与抗血管生成剂联合施用，两者一起抑制和/或阻止血管生成。
药物组合物及其施用
为了预防或治疗，本发明的药物组合物包括带有细胞滞留信号的VEGF结合成员及其衍生物，它们可以非肠道的、局部的、口服的方式被施用，例如采用喷雾方式或经皮肤用药的方式。药物化合物可以多种药剂形式被施用，采用何种方式取决于药物施用的方法。例如，适合于口服形式用药的药剂形式包括粉末、药片、药丸、胶囊和糖锭。本发明的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的药物化合物(例如，编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核酸、包含有编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核酸的病毒载体，等等)，在口服用药时，必须采取防护措施以阻止被消化。这通常是通过以下两种方式来实现的：把药物化合物与另外一种成分结合以对酸和酶水解产生抗性，或者用具有抗性的载体包装药物化合物，例如脂质体。阻止药物组合物(例如那些含有核酸和/或蛋白质的药物化合物)被消化的手段在本技术领域是众所周知的。
本发明的药物组合物对于非肠道用药尤其有用，例如静脉注射用药、或向身体的空腔或器官的内腔施用药物。作为一种选择，药物组合物也可以直接被施加到治疗部位，例如直接进入到肿瘤内、或直接进入视网膜内，这是治疗糖尿病视网膜病所必须的。用于施用的成分被溶解在药学上可接受的载体里，优选液体载体，该药物化合物通常包括带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的溶液。多种液体载体可以被使用，例如食盐缓冲液等。这些溶液被消毒并去除没用的物质。这些成分可以采用传统的公知灭菌技术来进行灭菌。这些成分还可包含有药学上可接受的，并用作使药物接近生理状况的辅助物质，这些辅助物质可以为pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙乳酸钠等。带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物(或编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核酸)的浓度可以有很大的变化，初步是根据液体体积、粘度、体重、所选择的特定用药方式以及病人的需要等来确定。
因此，静脉注射的典型药物用量将会是每天每个病人0.1mg到10mg。0.1mg到100mg每人每天的用药量可以被施用，尤其是当药物是施加在一个被隔离的部位而不会进入到血流中的时候，例如进入到身体的空腔中或器官的内腔中。非肠道用药的方法对于本技术领域的技术人员来说是很清楚的，并在以下的文献中有详细的描述：REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCE，15th en.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980)。
本发明的药物化合物也可包括药学上可被接受的赋形剂或辅剂，包括但不限于助流剂、分散剂、表面活性剂、稀释剂、粘合剂包括低温溶解粘合剂、分解质、增溶剂和/或润滑剂。
包含有带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物或其组合(例如，与其它治疗剂，例如化疗剂、抗血管生成剂等)可以为治疗的目的而被施用。在治疗的应用中，对遭受疾病痛苦的患者是以细胞毒性的量，即足以抑制或/或阻止血管生成的药量，来给药物的。足以实现这的药量被定义为“治疗有效剂量”。为此而使用的有效的药物量取决于疾病的严重程度以及病人的总体健康状况。
单次或多次给药可以按照病人需要的及能忍受的剂量和频率来进行。在任何情况下，药物化合物应该有足够的数量来有效地治疗病人。
在此提供的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物可以与其它用于治疗疾病的成分和方法一起使用。例如，但不限于，通常情况下，肿瘤的治疗是以外科手术、放疗、化疗或免疫疗法，联合使用带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物来进行，接着带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物可随后施加给患者来延长微转移的潜伏期并稳定和抑制任何残留的初尘肿瘤的生长。带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物可也与其它抗血管生成的化合物、或蛋白质、片断、抗血清、受体拮抗剂、其它抗血管生成的蛋白的受体对抗剂(例如，血管抑制素、血管内皮抑制素)。该成分可进一步包括其它物质，这些物质用于增强带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的活性，或者强化它在治疗的活性或作用，例如化疗剂、或放疗剂等。这些添加的因子和/或药剂可被包含在本组合物中，用作与本发明所述的蛋白质产生增效作用，或减少副作用。
虽然，为了能够清楚明白本发明，本发明通过举例的方式做了一些详细的描述，但是对本发明进行的些改变和修饰也应该落入本发明的保护范围。
血管生成因子的表达
血管内皮生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)是常被肿瘤或其它组织用作接通血管生成显型的一个血管生成因子。事实上，几乎所有的肿瘤都高水平地表达VEGF。最近地研究表明，VEGF刺激血管不仅对初生肿瘤的生长，也对转移很重要。除了病态的血管生成，在胚胎的发育期间，VEGF作为一个因子，通过刺激血管出现和血管生成，对循环系统的形成起了很大的作用。VEGF诱导血管形成对于多种生理过程是很重要的，这些生理过程包括器官的形成、女性生殖和伤口愈合。VEGF是生长因子家族成员中的原型，这些生长因子家族成员包含了结构相关的成员，包括胎盘生长因子(PLGF)、VEGF-B、VEGF-C、和VEGF-D。由任何VEGF家族成员触发的血管生成信号可被两个结构相关的同系列酪氨酸激酶受体，VEGFR-1和VEGFR-2，所介导。VEGFR-1和VEGFR-2基本上仅在内皮细胞被表达。VEGF结合VEGFR-1和VEGFR-2，并诱导血管出现、血管生成和血管通透，然而PLGF和VEGF-B仅与VEGFR-1结合，其生理和病理功能仍然未知。然而，一些近期的研究表明PLGF-2对内皮前体细胞的分化起一定的作用。
除了VEGFR-1和VEGFR-2，淋巴内皮细胞特异性的酪氨酸激酶受体，VEGFR-3，也被发现。VEGF-C和VEGF-D均能与VEGFR-2和VEGFR-3相互结合，并诱导血管生成和淋巴管生成。VEGFR-2偶尔在淋巴内皮细胞表达。越来越多的证据表明VEGFR-2的激活能够为血管生长触发血管生成信号，而VEGFR-3的激活能够诱导淋巴管生成。
对VEGFR-1的功能知道并不多。一些研究暗示在转导血管生成信号有直接作用，而其它的研究报道VEGFR-1可能为VEGF/VEGFR-2发出信号而作为诱发受体。最近，VEGFR-1被发现其在向新形成的血管补充干细胞分化的内皮细胞起一定的作用。
与VEGF类似，对人PLGF进行剪接，产生成熟PLGF蛋白的至少三种构体，PLGF-1(SEQID NO：2)、PLGF-2(SEQ ID NO：5)和PLGF-3。类似其它生长因子，为了与其它特异性的受体结合，VEGF的所有成员都以二聚蛋白的形式自然存在。根据它们的表达模式，具有截然不同的生物活性的同源二聚体和异型二聚体被形成。PLGF-1与VEGF在细胞内形成同源二聚体。当PLGF-1及VEGF均在同一细胞内被产生，PLGF-1/VEGF异源二聚体自然地出现在组织里。
知道分子机理和信号传递的途径，多种作为治疗策略的方案被设计出来以阻隔VEGF的功能。从而，抗VEGF的反应物，包括VEGF中和抗体、VEGF反义寡核苷酸、可溶VEGF受体、抗VEGF受体抗体以及细胞内信号传递抑制子，在动物模型中产生有价值的抗肿瘤效果。受到这些临床前的研究的鼓舞，大约10个VEGF抗剂最近用作人癌症试验。然而，这些抗VEGF化合物的早期临床评估产生了一些意想不到的结果。例如，人化的抗VEGF抗体核几个抗VEGF小分子没有产生多少有益的效果。这些失败引发几个重要的争论，包括急迫的需要改进现有的抗VEGF治疗策略。今天所使用的方法主要是基于功能性重组蛋白对抗剂的发展和和施用，这些对抗剂可中和细胞外的VEGF的功能或阻隔靶细胞内的VEGF信号的传递。然而，所有这些策略都没有把目标设定于阻隔肿瘤细胞内的VEGF的分泌。
现有的治疗策略的缺点是很多的，包括难以生产有活性的重组蛋白、需要高剂量、对身产和消费者来说高成本、以及对病人可能需要终生治疗。因相对短的半衰期，重组蛋白必须以注射的方式重复施用，从一天一次到好几次。基因治疗作为一种可供选择的方法，能够避免蛋白治疗的好几个缺陷。本发明提供几个可供选择的抗VEGF的基因治疗方法，这些方法通过阻隔VEGF从细胞，例如肿瘤细胞，内分泌来实现的。
结果
含有PLGF-KDEL或VEGF-KDEL的反转录病毒载体的产生
经由传统的分泌途径，PLGF-1和VEGF被释放出来，它们的功能二聚体可以在内质网里形成。为了构建被内质网滞留的PLGF-1或VEGF，人或VEGF的C-末端融合有KEDL(SEQ IDNO：7)，一个哺乳动物内质网滞留信号。基因结构的正确融合通过序列分析来确定。融合基因产物被分别克隆到一带有绿色荧光蛋白(GFP)标记的反转录病毒载体上，而该重组反转录病毒被用于转导一被特性化的大鼠Lewis肺癌(LLC)细胞系，该细胞系在体内依赖VEGF来进行生长。HPLGF-1(SEQ ID NO：1)和hVEGF cDNA的存在是通过Southern Blot分析来确定的，而GFP阳性细胞则通过FACS分析被挑选出来。
肿瘤细胞内的VEGF分泌的隔断
为了确定细胞内和细胞外的二聚体分子的数量，灵敏的夹心酶联免疫吸附测试法被用于分析细胞溶解产物以及被转导和未被转导的LLC细胞系的条件培养基。针对每个因子，特异性的抗体被使用，两个抗体针对同一个因子但产生不同的类型(同源二聚体)，或两个抗体针对不同的因子(异源二聚体)。正如所预料的，大量的mVEGF同源二聚体被检测存到在于条件培养基、wtLLC以及质粒转导的LLC细胞里(表1)。由wt和质粒转导的LLC细胞所产生的大部分mPLGF-1与mVEGF发生异质二聚化，这表明mPLGF-1倾向于与mVEGF形成异源二聚体，而不是形成mPLGF-1/mPLGF-1同源二聚体。在这些细胞内过度表达hVEGF导致除了hVEGF/hVEGF同源二聚体(41880pg/ml)外，还有足量的hVEGF/mVEGF异源二聚体分子(3779pg/ml)的分泌。
相反地，以hVEGF-KDEL转导LLC细胞有效地阻止了VEGF的分泌，大部分hVEGF/mVEGF和hVEGF/hVEGF(分别为1578pg/ml和2624pg/ml)滞留在细胞内，只有很小量部分的hVEGF/mVEGF(268pg/ml)和hVEGF/hVEGF(628pg/ml)出现在条件培养基中。这表明KDEL(SEQ ID NO：7)功能序列被有效地滞留在内质网中。与我们之前的报道一致，事实上，所有的mVEGF分子以hPLGF/mVEGF异源二聚体的形式出现在PLGF-1高效表达的LLC细胞的条件培养基中(5581pg/ml)(表1)。在这些肿瘤细胞中，HPLGF-1/mVEGF异源二聚体的优先形成使被分泌的mVEGF同源二聚体被有效地耗尽(表1)。非常显著地，在LLC细胞里，hPLGF-1-KDEL的基因传送不仅使几乎所有的mVEGF分子形成hPLGF-1NEGF异质而聚体，而且也阻止了hPLGF-1/hPLGF-1同源二聚体以及hPLGF-1/mVEGF异质而聚体的分泌。各种异质或同源二聚体大部分在细胞内存在，而只有小部分出现在条件培养基中。
肿瘤细胞释放的内皮刺激物活性的消耗
为了监测VEGF介导的内皮细胞活性，使用各种被转导的肿瘤细胞的条件培养基，利用改良过的Boyden趋化分析方法来确定内皮趋化活性。表达VEGF-1和VEGF-2的猪大动脉内皮(PAE)细胞之前已经被用作检测VEGF的活性。在这检测过程中，当对纯化的重组二聚体生长因子进行检测，仅VEGF同源二聚体能够明显地引起VEGF-2/PAE细胞运动。PLGF-1同源二聚体和PLGF-1/VEGF异源二聚体均不能使细胞的运动高于对照的水平。正如所预料的，为被转导的或载体转导的LLC细胞明显刺激VEGFR-2/PAE细胞的转移(图1e和f)。然而，PLGF-1(SEQ ID NO：2)或PLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)的过量表达明显地阻止了LLC细胞产生地VEGF的活性(p<0.001)(图1e)。hVEGF的高水平表达增强了LLC细胞产生的趋化活性(图1f)。相反的，在这些肿瘤细胞里，VEGF-KDEL的过度表达彻底地破坏了VEGFR2/PAE细胞的迁徙(P<0.001)(图1f)。所有的重组因子或条件培养基都不能诱导VEGF-1/PAE细胞的运动(图1a-c)。类似的试验结果也从初级HUVE细胞的试验中获得(试验数据没有显示)。与ELISA数量测定一致，这些结果表明KDEL(SEQ ID NO：7)与PLGF-1(SEQ ID NO：2)或VEGF的结合有效地阻隔了鼠的内生VEGF活性。
除了趋化现象外，表达VEGF-1或VEGFR-2的PAE内皮细胞的形态变化也被检测，作为一个独立的指标来评估肿瘤细胞释放的VEGF活性。把浓度为SOng/ml的重组hVEGF同源二聚体添加至VEGF-2/PAE细胞，随着肌动蛋白纤维的重组，细胞变成纺锤形(图1h)，PLGF-1同源二聚体及PLGF-1/VEGF异源二聚体则不能够产生这种特征(图li和j)。用wtLLC或载体转染LLC细胞的条件培养基进行培养，也导致在VEGFR-2PAE细胞出现伸长的纺锤状细胞形(图1k和1)，这与rhVEGF所导致的细胞形态类似。在LLC细胞内过量表达hVEGF导致表达VEGFR-2的PAE细胞的细胞形态明显的变化以及肌动蛋白重组(图1o)。相反的，hPLGF-1则完全阻止了由VEGF引起的细胞形态的变化。这表明大部分VEGF分子与hPLGF-1形成了异源二聚体(图1m)，这与ELISA数量分析和趋化分析相一致。类似的，VEGF导致的细胞形态的变化被PLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)或VEGF-KDEL在这些肿瘤细胞中的表达所抑制(图1n和p)。另外，细胞系的条件培养基不能导致在VEGF-1/PAE细胞的内皮形态发生类似的变化(数据没有显示)。
肿瘤生长的抑制
虽然PLGF-1和VEGF被看作是作用于血管内皮细胞的特异性生长因子，但是这些因子在内质网的过量表达和滞留可以影响肿瘤细胞生长。为了排除可能性，PLGF-1-KDEL(SEQ IDNO：3)和VEGF-KDEL细胞的生长速率与对照细胞的生长率进行比较。与wtLLC和载体转导的LLC细胞相比，把PLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)或PLGF-1(SEQ ID NO：2)转导入LLC细胞不能改变生长速率，这表明PLGF-1在内质网腔的积累不能影响肿瘤在体外的生长(图2a)。类似的，与VEGF过量表达细胞或2个对照细胞系相比，VEGF-KDEL转导的LLC细胞并没有显示出有所变化的体外的生长速率(图3a)。LLC肿瘤是在体内最具有侵略性和迅速生长的大鼠肿瘤之一。对于对照来说，在培养了5天后，肉眼可见的肿瘤就出现了，而在培养了2个星期内肿瘤就已经长至瑞典规范的极限(1500mm3)(图2c和3c)。与我们最近在大鼠T241纤维肉瘤模型的发现5相一致，hPLGF在LLC的表达明显延缓了肿瘤的生长，且肉眼可见的肿瘤在培养的第10天才被发现(图2c)。与wt-和被载体转导的肿瘤比较，在肿瘤培养的第14天，在hPLGF-1表达型的肿瘤细胞里，大约90％的肿瘤尘长抑制被记录下来。这些肿瘤在培养的第16天仍然维持在比较低的平均体积，小于200mm3(图2d)。
在培养的第14天，hPLGF-1-KDEL-LLC细胞的细胞大小几乎不能被检测到，40mm(图2b-d)。在延长试验期间，又经过3个星期，这些肿瘤仍然维持较小的体积(图2d)。在培养了3个星期后，当hPLGF-1-LLC肿瘤继续生长成平均尺寸大于600mm时，hPLGF-1-KDEL-LLC肿瘤的平均尺寸小于100mm(图2d)。因此，hPLGF-1-KDEL-LLC和hPLGF-1-LLC被测得的肿瘤体积明显不一样(p<0.001)。hPLGF-1-KDEL-LLC肿瘤的生长速率被明显地延缓，这表明在体内，这些肿瘤细胞产生相对休止状态的肿瘤，反之hPLGF-1-LLC肿瘤不能够促使肿瘤休止，而仅延缓血管生成的启动。
为了进一步研究KEDL(SEQ ID NO：7)序列融合与VEGF的融合体是否也能抑制肿瘤生长，hVEGF-KDEL-LLC细胞被移植到C57B1/6鼠体内。虽然wt和被载体转染的细胞高水平产生VEGF，在这些细胞里hVEGF的高度表达能够进一步加速肿瘤的生长。在仅仅10天后，hVEGF-LLC肿瘤的平均大小就已经达到1400mm(接近瑞典规范的极限)(图3c和e)，与此相反，wt-LLC细胞和载体-LLC细胞需要14天才能产生类似大小的肿瘤(图3b和d)。带有hVEGF-LLC肿瘤的老鼠在移植肿瘤细胞后的第10天被宰杀，在此时，与hVEGF-LLC肿瘤相比，在hVEGF-KDEL-LLC肿瘤，90％的抑制被检测出(图3c和e)。与hVEGF-LLC相反，与wt和载体肿瘤相比，hVEGF-KDEL-LLC细胞的移植在第14天几乎抑制了50％的肿瘤生长(图纸3b和d)。在体内的这些肿瘤生长的差异不能归因于改变了肿瘤细胞的生长速率，因为所有被转导或未被转导的肿瘤细胞在体内以基本相同的速率生长(图2a和3a)。
VEGF诱导的肿瘤新血管化的抑制
为了研究肿瘤的新血管化，用抗-CD31抗体进行了免疫组织化学的检测。与wt或载体转导的LLC肿瘤比较，人PLGF-KDEL-LLC肿瘤明显地减少了新血管化(图4a、b、f和g)。与早期在大鼠纤维肉瘤模型的发现相一致，在LLC内PLGF-1的过量表达导致LLC肿瘤新血管化的显著抑制(图4e和g)。然而，hPLGF-1-KDEL在阻止肿瘤新血管化方面比PLGF-1明显更有效。以hPLGF-KDEL转导LLC也显著地阻止了肿瘤新血管化。与hPLGF-1(SEQ IDNO：2)、hPLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)以及hVEGF-KDEL相反，单独以hVEGF转导LLC明显增加了肿瘤新血管化(图4c和g)，平均高于350微血管/光场(×10)。
对肿瘤血管的共焦点检测发现wt和载体转导的肿瘤包含有较多的血管和更高密度的毛细血管芽(图4h和I)。有趣的是，在hVEGF-LLC肿瘤发现特别多的毛细血管或微型血管，这些毛细血管核微型血管很可能融合入原有的血管神经从。这种类型的血管结构看起来是有漏洞的和出血的，因为对肿瘤组织的解剖检查显示hVEGF-LLC肿瘤由大量的出血的组织流体组成。相反的，以hVEGF-KDEL转导的LLC肿瘤阻止了毛细血管芽的形成导致没有通常的支血管的血管结构的形成(图4k)。很明显，在LLC肿瘤里过量表达hPLGF-1-KDEL(SEQID NO：3)导致不仅血管数目的大量减少，而且几乎所有的微毛细血管被耗尽(图4m)。这些数据显示在鼠肿瘤两中，内质网滞留的hPLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)或hVEGF-KDEL蛋白的过量表达有效地阻止了VEGF的分泌和肿瘤新血管化。
诱导肿瘤细胞凋亡
血管生长进入肿瘤不仅为肿瘤细胞提供了营养和氧气，也提供了生存因子。因此，抑制肿瘤血管生成可影响肿瘤细胞凋亡率。为了确定肿瘤细胞的凋亡数，进行了TUNEL染色。大约地，在快速生长的wt和载体转导肿瘤中，平均8个凋亡细胞/光场(40×)被发现(图5a、b和g)。hVEGF的过量表达明显肿瘤细胞的凋亡数目(4个凋亡细胞/光场，p<0.05)，这表明hVEGF诱导的血管能够提供而外的存活因子，因此防止肿瘤细胞的凋亡(图5c和g)。然而，hVEGF-KDEL转导入LLC肿瘤细胞导致细胞凋亡明显增多(17个凋亡细胞/光场，p<0.001)(图5d和g)。在hPLGF-1-KDEL(SEQ IDNO：3)和hPLGF-1(SEQ IDNO：2)转导的LLC细胞里，凋亡细胞的数目增加也是非常显著的(分别为19和22个凋亡细胞/光场，p<0.001)(图5e、f和g)。根据我们之前的结果，即使是肿瘤细胞凋亡地小量增多也会对肿瘤的体积长生较大的影响，因为肿瘤细胞的周转率是相对比较块的。这些数据表明在hVEGF-KDEL和hPLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)转导的肿瘤里，有大量的肿瘤细胞因供血不足而凋亡。
讨论
在大多数肿瘤，VEGF被确信是启动血管生成的一个因子。VEGF在疾病的调控的作用不仅限于癌症。其它的血管生成依赖型疾病，包括糖尿病视网膜病、与年纪相关的斑点退化、与动脉硬化有关的局部缺血性心脏病、以及中风，也与VEGF有关。因此，VEGF对抗剂的发展成为了用作治疗癌症和其它普通疾病的抗血管生成疗法的一个中心焦点之一。这些对抗剂以VEGF配合基体、受体以及细胞内的信号传送元件为目标。在动物疾病模型中，成功地传送了大多数VEGF对抗剂，在阻碍病理过程和改善疾病状况方面产生了显著的影响。例如，VEGF中和抗体阻碍了老鼠体内的肿瘤生长。来至动物研究的良好结果唤起了把这些化合物用于治疗人类疾病的热情。事实上，多于10种不同的VEGF抗剂已经进入了用于治疗人类癌症的临床试验。
因为大多数抗-VEGF反应剂抑制细胞外的VEGF的功能，很有可能，这些VEGF抗剂可能不能完全抑制VEGF的活性。另外，这些方法在临床试验中可能面临着几个潜在的问题，包括：1)为了维持在血液中的药物的稳定的量，需要经常注射抗VEGF重组蛋白或化合物；2)一些对抗剂，例如可溶的VEGF受体，在血液循环中仅有非常短的半衰期，这些分子可能通过结合到肝磷脂状的结构，而被吸附在细胞外的基质层，或者从身体里快速地被清除；3)作为蛋白分子，一些VEGF对抗剂可能很容易被体内地蛋白酶所破坏；4)为了产生有益地效果，需要使用相对大剂量的VEGF对抗剂；5)因为通过交叉的RNA剪接，能够产生几个VEGF的异型体，不是所有的对抗剂可以有效抑制所有VEGF异型体的功能；6)VEGF和VEGF受体可能会与身体内的其它蛋白结合，从而得到一个改变的结构，因此，抗-VEGF抗体可能不能识别原始的抗原决定部位；7)长期使用VEGF对抗剂治疗对于制造者和病人均需要高昂的成本。所有的这些潜在的问题使优化抗-VEGF的方法的需要特别突出。
本发明的一些方面是提供资料方法来阻止VEGF从肿瘤细胞分泌。因为肿瘤细胞缺乏高度亲和的VEGF受体，作为细胞内蛋白质的VEGF的吸收可能不会导致激发胞内分泌信号传导途径。与这原理相一致，本发明的一个具体实施方式揭示细胞内的VEGF的过量表达不会改变肿瘤的体外生长速率。为了阻止VEGF的分泌，一个细胞内滞留信号，KDEL(SEQ IDNO：7)，一个把分泌蛋白滞留在内质网的四氨基酸多肽，被融合到PLGF-1的c末端。应用到这个方案的原理是用PLGF-1作为诱饵，与VEGF形成没有活性的异源二聚体。在肿瘤细胞里，hPLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)的过量表达使大部分内生VEGF单体形成异源二聚体。因此，这种策略几乎完全抑制了VEGF被肿瘤细胞分泌。
除了异源二聚体，大多数PLGF-1同源二聚体被滞留在内质网腔中而没有进一步分泌。阻止PLGF-1同源二聚体的分泌是进一步抑制VEGF功能的重要步骤。与VEGFR-2比较，VEGF对VEGFR-1具有更高的结合亲和力。过量的细胞外的PLGF-1能够与VEGF竞夺与VEGFR-1受体的结合。因此，阻止PLGF-1同源二聚体分泌将会降低VEGF与VEGFR-2，一种转导血管生成和血管泄漏信号的受体，结合的可能性。防止PLGF-1/VEGF异源二聚体分泌可进一步抑制血管生成活性，因为这些异源二聚体可能具有一些未知的血管生成的特性。因为许多肿瘤过量表达PLGF-1和PLGF-2，通过hPLGF-1_KDEL(SEQ ID NO：3)阻止内生PLGF分泌能够进一步降低VEGF诱导的血管生成和肿瘤生长。因此，在此公开的本发明的几个方面在细胞内和细胞外，在两个水平上阻隔VEGF。正如所预料的，hPLGF-1-KDEL(SEQID NO：3)的过量产生比原有的PLGF-1表现出更强的抗肿瘤活性的能力。
虽然把hVEGF转到入肿瘤细胞进一步加强了肿瘤血管生成和肿瘤生长，但是，与对照肿瘤相比，过量表达的hVEGF-KDEL有力地抑制肿瘤生长。这些数据表明把KDEL(SEQ ID NO：7)序列结合到hVEGF序列，形成hVEGF-KDEL，有效地阻隔了内生的老鼠VEGF分泌和抵制其活性。因此，本发明的一些方面是提供通过抑制和/或阻止VEGF分泌来有效地抵抗血管生成的治疗方法。
试验过程
动物
6-7周大的C57B1/6雌鼠被驯化并以6个或更少为一组用笼子关住。动物在进行任何步骤之前，先用1:1的多美康和芬多尼混合物对动物注射来使其麻醉，然后用致死量的二氧化碳杀死动物。所有的动物研究都是在Stockholm Animal Board的动物关怀和使用委员会的监督和同意之下进行的。
PLGF-1/VEGF异源二聚体的产生和纯化
如先前的描述，重组人PLGF-1(SEQ ID NO：1)和VEGF1单体在E.Coli里被表达。克分子数相等的PLGF-1和VEGF1同源二聚体混合物，总蛋白浓度0.5mg/ml，存放在还原缓冲溶液中(20mM Tris-HCl，pH8.0，6M Guanidine-HCl，和10mM DTT)，4℃过夜。第二天，蛋白溶液以10倍体积的再重叠缓冲液(2M urea，20mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM GSH(Glutathione-SH)和0.5mM GSSG(glutathione-S-S-glutathione))进行透析。使用这再重叠方法，PLGF-1和VEGF1同源二聚体的混合物以及异源二聚体PLGF-1/VEGF被制造。
该同源二聚体和异源二聚体蛋白用山羊多克隆的抗hVEGF亲和柱以及多克隆的山羊抗hPLGF亲和柱来进行亲和层析分离。该蛋白溶液，先用PBS透析，然后以2ml/min的流速加入到预先用PBS平衡的抗hVEGF亲和柱。接着，用同样流速的PBS冲洗柱子，直到在280nm的吸光率到达基线水平。VEGF同源二聚体和PLGF-1/VEGF异型二聚体，而不是PLGF同源二聚体，被柱子所留住，并用0.1M的柠檬酸钠、pH2.5、0.3M NaCl溶液(洗脱缓冲液)洗脱。从抗VEGF柱上被洗脱的二聚体立刻用2M Tris缓冲液，pH8，中和，随后20倍体积的PBS于4℃透析4小时。在透析后，用同样的条件，把蛋白样品加入到预先用PBS平衡过的抗PLGF亲和柱。只有异源二聚体被留住并用同样的洗脱缓冲液从柱子洗脱。纯化的hPLGF-1、hVEGF和hPLGF-1/hVEGF蛋白最有用PBS透析出并在还原和非还原的条件下用SDS-PAGE进行分析，最后测量蛋白质的浓度。
反转录病毒载体的设计和肿瘤细胞转导
编码人PLGF-1(SEQ ID NO：1)、PLGF-1-KDEL、VEGF和VEGF-KDEL的足量cDNA被克隆入带有GFP的大鼠干细胞病毒(MSCV)载体(来自DR.R.Hawley at the Holland Laboratory，Rockville，MD)。采用传统的磷酸钙转染法，把反转录病毒结构与编码亲嗜性的gag/pol以及水疱性口炎病毒-糖蛋白(VSV-G)包膜蛋白的表达质粒一起转染进入293T细胞，产生反转录病毒上清液。在RetronectinTM(Biowhittaker，East Rutherford，NJ)被培养皿上，在连续的2天里，把对数期生长的大鼠LLC细胞暴露在加有8ug/ml硫酸鱼精蛋白的反转录病毒上清液的滤液中6小时。GFP阳性细胞用配备有5-w氩气以及30-mW氖气激光的FACStar+(BectonDikinson，San Jose，CA)进行筛选。PCR以及Southern blot检测也按标准方式进行。
肿瘤细胞增殖检测
用载体-、hPLGF-1-(SEQ ID NO：2)、hPLGF-1-KDEL(SEQ ID NO：3)-、hVEGF-以及hVEGF-KDEL转导的LLC细胞和wtLLC细胞被种植在24孔板上，细胞密度为1×104个细胞/孔，培养基为添加有10％FCS的DME培养基，并在37℃。在各个时间点，细胞用胰蛋白酶消化，用Isoton II溶液(Beckman Coulter，Sweden)再次悬浮，并用Coulter计数器计数。每个样品一式三份，且所有的试验均做三次。
细胞形态检测和肌动蛋白染色
表达VEGFR-1或VEGFR-2的PAE细胞在12孔板里的盖玻片上培养，培养基为添加有10％FCS的Ham’s F12培养基。当达到40％—60％的铺满时，培养基用新鲜的F12培养基替换，该新鲜的培养基F12含有仅2％的FCS和50ng/ml的重组因子(hVEGF、hPLGF-1或hPLGF-1/VEGF)或者25％(v/v)的来自LLC细胞系的条件培养基，所述的LLC细胞系包括wt，、vector、hPLGF-1、hPLGF-1-KDEL、hVEGF或hVEGF-1-KDEL。没有被处理的细胞作为负对照。在培养16小时后，用3％的多聚甲醛PBS(pH7.5)溶液固定15分钟。用PBS冲洗三次，并用0.5％TritonX-100的PBS溶液使其通透化15分钟。细胞被再次用PBS冲洗，并用1ug/ml的TRITC-phalloidin(Sigma)PBS稀释液染色30分钟。在用PBS冲洗后，盖玻片安装在甘油和PBS(9:1)的混合物中。细胞用光和荧光显微镜进行检测，在5个光场(20×)里统计纺锤状的细胞数量。数据表示平均％(SEM)。
趋化检测
使用之前描述过的修饰过的Boyden趋化小室技术，检测VEGF-1/PAE和VEGFR-2/PAE细胞对各种重组生长因子以及LLC条件培养基的运动反应。简要地说，表达VEGFR的PAE细胞迁移通过一微孔硝化纤维过滤器(8um厚，8um孔)的能力被检测作为趋化刺激的一个标准。补充有0.2％BSA和50ng/ml的重组因子(hVEGF、hPLGF-1或hPLGF-1/hVEGF)或25％(V/V)的来自被反转录病毒转导的不同细胞的条件培养基之一的无血清培养基被添加至下层室内。没有被处理的细胞作为负对照。细胞被消化并用无血清的培养基(0.2％BSA)悬浮，悬浮的细胞密度为0.8×10个细胞/ml，而且40000个细胞被添加到上层腔室内。37℃培养4小时后，Boyden腔室被拆开，粘附在过滤器上的细胞用甲醇固定并用吉姆萨溶液染色。每个样品细胞的四倍量被使用，且所有的试验均做三次。迁移通过过滤器的细胞用光学显微镜统计个数，并被划分为每个光场(32×)的迁移细胞个数。
酶联合免疫吸附试验(ELISA)
所有的夹心ELISA用Quantikine ELISA系统按照操作手册的说明来(R&D系统)进行。简要地说，标准鼠(m)VEGF和样品被添加到一个96孔的微孔板，该微孔板预先用亲和纯化的并对mVEGF具有专一性的多克隆抗体包被。用对VEGF具有专一性的酶联多克隆抗体检测到含有mVEGF的同源二聚体。类似地，mPLGF-1、hVEGF和hPLGF-1的同源二聚体用Quantikine M mPLGF-1 ELISA试剂盒、Quantikine hVEGF ELISA试剂盒和Quantikine hPLGFELISA试剂盒来进行测量。这三个试剂盒含有特异性单克隆抗体。
异源二聚体用交叉捕获和以上提及的用ELISA检测到的抗体来测量。对于mVEGF/mPLGF-1异源二聚体，样品被添加到一个预先用抗mVEGF的微孔板上。酶联抗mPLGF-1接着被用于检测mVEGF/mPLGF-1异源二聚体。为了使检测标准化，一个重组mPLGF-1标准物在该PLGF-1板上同时进行分析检测。该同源二聚体没有被发现有交叉反应。类似的，用预先以抗hVEGF抗体以及用作检测异源二聚体的抗mVEGF耦联物来包被的微孔板对mVEGF/hVEGF异源二聚体进行测量。在mVEGF板进行分析的重组mVEGF标准物被用作标准。从每个同源二聚物，大约1-2％的交叉反应被观察到，而这些结果被相应地修正。用微板对mVEGF/hPLGF-1异源二聚体进行测量，该微板预先用抗mVEGF抗体以及抗hPLGF-1耦联物包被。在hPLGF-1板上进行分析的重组hPLGF-1标准物被用做标准。大约3％来自于hPLGF的同源二聚体的交叉反应被观察到，且该结果被相应地修正。
小鼠身上的肿瘤研究
表达hPLGF-1、hPLGF-1-KDEL、hVEGF或hVEGF-KDEL的野生型LLC、载体转导的LLC以及LLC细胞被用于6-7周大的同源C57B1/6小老的肿瘤移植研究。大约1×106个肿瘤细胞以皮下方式被移植到小鼠背部。被处理的组和对照组都使用6个小鼠。在所显示的天数里，初生肿瘤用数码测径器进行测量。肿瘤体积按照以下公式进行计算：宽度2×长度2×0.52，而且，当达到瑞典规范的极限(1500mm3)，肿瘤被摘除。
组织学
当肿瘤达到瑞典规范的极限时用外壳手术摘除。为了确定肿瘤血管的数量，利用抗-CD31抗体，进行免疫组织化学研究。肿瘤组织用3％PFA固定，脱水和用石蜡包裹。样品被切片(6um厚)并用20umml-1蛋白酶K(Life Technologies)处理。过氧化物酶活性的背景水平以0.3％H2O2消除，而内源生物素和抗生物素蛋白的活性用Avidin/Biotin Blocking试剂盒(VectorLaboratories Inc.，Burlingame，CA)阻断。首先使用针对CD31(Pharmingen，San Diego，CA)的生物素酰化的单克隆抗体，接者用山葵过氧化物酶(HRP)耦联的链霉抗生物素蛋白(SA)来对切片用生物素进行免疫染色。酪胺信号放大(TSA)试剂盒(NEN Life Science，Boston，MA)被用来增强染色信号。利用二氨基联苯胺(DAB，Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)形成过氧化物酶的活性。切片被拍照，且用光学显微镜在6个光场(20×)对血管的数目进行统计。数据表示平局％(土SEM)。
共聚焦显微镜术分析
为了能直接形象化地显现肿瘤血管形成，进行了整体染色和共聚焦显微术分析。肿瘤被切成组织薄片，并用3％PFA固定过夜。组织内抗体抗的原决定基通过蛋白酶K(20ugml-1)消化和甲醇通透化而被暴露出来。在用内生生物素和抗生物素蛋白的活性在染色前用生物素酰化的针对CD31(Pharmingen，San Diego，CA)的老鼠抗-鼠单克隆抗体阻断。用SACy3(JackonImmunoResearch Laboratories Inc.)找出血管，并用共聚焦显微(Zeiss Confocal LSM510Microscope)显现血管。通过扫描每个样品的16片薄切片(5-6um间距)，得到每个组织的三维影像。
TUNEL染色
为了在肿瘤里找出凋亡细胞，进行了TUNEL染色。肿瘤组织用3％的多聚甲醛固定、脱水并用石蜡包裹。按照标准的但被修饰过的荧光素Death Detection试剂盒(Amersham)，脱蜡和再脱水的组织切片(5um厚)被进行TUNEL染色。简单地说，组织用20ugml-1蛋白酶K(Life Technologies)处理，且过氧化物酶的背景水平在甲醇里用3％的H2O2消除。TUNEL反应混合物被添加到切片，并在潮湿的气氛下37℃培养1小时，接着用Hoescht33258(500ngml-1)统计被染色的细胞。切片被拍照，并在荧光显微镜的10个光场(40×)里统计凋亡细胞个数。数据表示平均抗原决定簇(土SEM)。
统计分析
统计分析在Microsoft Excel里采用标准的Student’s two-tailed t-test进行。P-值小于0.05和<0.001分别被看作显著和非常显著。
序列表
<110>ACUITY PHARMACEUTICALS，INC.
Cao，Yihai
<120>抑制血管生成的方法和成分
<130>129402.00602
<140>not yet assigned
<141>2005-4-18
<150>60/562,841
<151>2004-04-16
<160>24
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>451
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<223>带有KDEL的PLGF-1氨基酸序列
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<223>PLGF-2的cDNA序列
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<223>不带KDEL的PLGF-2氨基酸序列
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<223>蛋白质的内质网滞留信号
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<223>不带KDEL的VEGF-B isoform 1氨基酸序列
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<223>不带KDEL的VEGF-B isoform 2氨基酸序列
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<223>酵母内质网滞留信号
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Claims (33)
1.一种被分离的核酸，包括编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核苷酸序列，其特征在于：所述的核苷酸序列是一个cDNA序列。
2.按照权利要求1所述的被分离的核酸，其特征在于：所述的VEGF结合成员是VEGF-B(SEQ ID NO：10或13)。
3.按照权利要求1所述的被分离的核酸，其特征在于：所述的VEGF结合成员是PLGF-1(SEQID NO：1)。
4.按照权利要求1所述的被分离的核酸，其特征在于：所述的细胞滞留信号是一个包含有KDEL(SEQ ID NO：7)的内质网膜滞留信号。
5.一用作表达带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员的重组质粒，其特征在于：带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异质二聚体。
6.一重组病毒载体，包含有编码带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核苷酸序列，其特征在于：所述的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成双链体，且所述核苷酸序列是一个cDNA序列。
7.按照权利要求6所述的重组病毒载体，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物是VEGF-B。
8.按照权利要求6所述的重组病毒载体，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物是PLGF-1(SEQ ID NO：1)。
9.按照权利要求6所述的重组病毒载体，其特征在于：所述的细胞内滞留信号是一个包含有KDEL(SEQ ID NO：7)的内质网膜滞留信号。
10.按照权利要求6所述的重组病毒载体，其特征在于：所述的重组病毒载体选至腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢性病毒载体、反转录病毒载体以及疱疹病毒载体。
11.一种药物组合物，包括带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物以及药学上可接受的载体。
12.按照权利要求11所述的组合物，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与VEGF形成异源二聚体。
13.一种药物组合物，包括权利要求6所述的病毒载体以及药学上可接受的载体。
14.一种抑制细胞内的VEGF分泌的方法，包括向个体施加有效剂量的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与所述的细胞内的VEGF形成异源而聚体并抑制所述的细胞内的VEGF分泌。
15.按照权利要求14所述的方法，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物从一重组质粒表达。
16.按照权利要求14所述的方法，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物从一重组病毒载体表达。
17.在病人细胞内抑制VEGF活性的方法，包括向个体施用有效量的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物，其特征在于：所述的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异源二聚体并抑制或破坏病原细胞的生长。
18.按照权利要求17所述的在细胞内抑制VEGF活性的方法，其特征在于：所述的病人患有以下疾病的一种：癌症、炎性关节炎、糖尿病视网膜病、新生血管性眼睛疾病、动静脉畸形、过度出血、Osler-Webber综合症、心肌血管新生、血小板新血管化、毛细管扩张、血友病关节症、血管纤维瘤、伤口肉芽以及过度的或不正常的内皮细胞积累疾病。
19.按照权利要求17所述的在细胞内抑制VEGF活性的方法，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物是VEGF-B(SEQ ID NO：12或14)。
20.按照权利要求17所述的在细胞内抑制VEGF活性的方法，其特征在于：所述的带有细胞内滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物是PLGF-1(SEQ ID NO：3)。
21.按照权利要求17所述的在细胞内抑制VEGF活性的方法，其特征在于：所述的细胞滞留信号是KDEL(SEQ ID NO：7)。
22.一种抑制VEGF从VEGF分泌细胞分泌的方法，包括向病人施用足量的反转录病毒载体以转导病人体内的VEGF分泌细胞，其特征在于：所述的反转录病毒载体包括一编码带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核苷酸序列，而带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物表达有足够的量以和所述的VEGF形成异源二聚体，而所述的异源二聚体抑制VEGF从所述的VEGF分泌细胞分泌。
23.按照权利要求22所述的抑制VEGF从VEGF分泌细胞分泌的方法，其特征在于：所述的病人患有以下疾病的一种：癌症、炎性关节炎、糖尿病视网膜病、新生血管性眼睛疾病、动静脉畸形、过度出血、Osler-Webber综合症、心肌血管新生、血小板新血管化、毛细管扩张、血友病关节症、血管纤维瘤、伤口肉芽以及过度的或不正常的内皮细胞积累疾病。
24.按照权利要求22所述的抑制VEGF分泌的方法，其特征在于：所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物是VEGF-B(SEQ ID NO：3)。
25.按照权利要求22所述的抑制VEGF分泌的方法，其特征在于：所述的带有细胞滞留信号的VEGF成员或其衍生物是PLGF-1(SEQ ID NO：3)。
26.按照权利要求22所述的抑制VEGF分泌的方法，其特征在于：所述的细胞滞留信号是KDEL(SEQ ID NO：7)。
27.一种药物组合物，包括至少一个反转录病毒载体，该反转录病毒载体包含有编码带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物的核苷酸序列。
28.按照权利要求27所述的药物组合物，其特征在于：所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物是VEGF-B(SEQ ID NO：10或13)。
29.按照权利要求27所述的药物组合物，其特征在于：所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物是PLGF-1(SEQ ID NO：1)。
30.按照权利要求27所述的药物组合物，其特征在于：所述的细胞滞留信号是KDEL(SEQ IDNO：7)。
31.在一个体里抑制血管生成的方法，包括向个体施用有效量的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物。
32.按照权利要求31所述的方法，其特征在于：所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异源二聚体。
33.一种在个体内治疗血管生成疾病的方法，包括向该个体施加有效量的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物，其特征在于：所述的带有细胞滞留信号的VEGF结合成员或其衍生物与细胞内的VEGF形成异源二聚体，抑制了所述的细胞内的VEGF的分泌从而抑制了血管生成以及与血管生成有关的疾病。
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