KR101869917B1 - 포유류와 인간 세포에서 ｈｉｖ 복제를 억제하는 방법 - Google Patents

포유류와 인간 세포에서 ｈｉｖ 복제를 억제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부정적인 변조 또는 변경 세포골격(cytoskeleton)에 의해 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 복제를 억제 할 수 있는 방법에 관한 것으로, 더 정확하게 중간 세포골격 수술대(filament)를 형성하는 단백질에 관한 것으로, 상기 단백질은 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10이다. 바이러스의 복제는 이러한 단백질의 구조에 개입하여 인간의 세포를 억제한다. 본 발명은 또한 물질(agents)의 사용과 관련하며, 펩티드(peptides) 및/또는 방해 RNA 및/또는 지질 화합물(lipidic compounds)을 포함하며, 상기 물질(agent)은HIV 감염을 방지하거나 치료하는 세포골격의 부정적인 변조(modulation) 또는 변경(alteration)을 생산한다. 본 발명은 HIV에 의한 인간 세포의 감염이 교란되는, 심지어 완전히 저해 될 수 있는 결과로, 세포의 세포골격(cytoskeleton)/필라멘트(filament) 구조를 변경하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 세포골격은 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)(예를 들면, 방해 RNA를 사용하여 전사조절(transcriptional control)에 의해)의 양을 줄이거나 세포골격을 파괴하는 펩티드(peptides)를 변경한다.

Description

포유류와 인간 세포에서 ＨＩＶ 복제를 억제하는 방법 {METHOD FOR INHIBITING HIV REPLICATION IN MAMMAL AND HUMAN CELLS}
본 발명은 바이오 의약품(biomedicine) 분야에 관련한 것이며, 보다 상세하게는 감염, 특히 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)의 감염에 대한 치료에 관한 것이다. 본 발명은 세포골격(cytoskeletal) 중간섬유(IFs), 특히 세포골격 중간섬유를 형성하는 단백질을 변화시켜 HIV 복제를 억제하는 방법을 설명한다. 본 발명은 또한 부정적인 HIV 감염을 예방하고 치료하는 약품을 제조하는 목적으로 세포골격을 조절하거나 수정할 물질(agent)의 용도에 관한 것이다.
HIV/후천성 면역 결핍증의 유행의 출현은 최근 30 년 동안 전 세계적으로 발생하는 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 이것은 감염의 진행을 막고 사망률을 감소시킬 수 있는 항레트로바이러스 치료(antiretroviral treatments)를 발전 시켜왔다 (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG. Boletin de la Organizacion Mundial de la Salud 2009; 87: 488-488).
유엔에이즈프로그램(UNAIDS)의 2008년 보고에 의하면, 330만 명이 HIV에 감염되었고, 그 중 270만의 새로운 케이스로 추정되었다. 이는 세계 감염의 67%가 사하라 사막 이남의 아프리카에서 발생한 것으로 추정된다 (2008 세계 에이즈 전염병 보고서, 제네바, UNAIDS). 2009년 세계보건기구에서 발행한 게시판에 따르면, 전 세계적으로 두 가지 주요 경향이 있다: 이들은 각각 세계의 나머지 부분에 걸쳐 특정 위험 그룹에 있는 사하라 사막 이남의 아프리카의 인구 전체의 영향 및 감염의 농도 (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG 2009. Boletin de la Organizacion Mundial de la Salud 87: 488-489).
HIV 감염의 연간 발병률은 1990년도 중반에 최고조였다 (Bongaarts J, Buettner T, Heilig G, Pelletier F. Popul Dev Rev 2008; 34: 199-224). 그러나, HIV에 감염된 사람의 총 수는 바이러스의 지속적으로 높은 발병률과 인구 성장 속도로 인해 아프리카에서 증가하고 있다 (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG 2009. Boletin de la Organizacion Mundial de la Salud 87: 488-489).
현재 사용 가능한 안티-HIV 약물과 환자의 치료에 대한 미비한 반응에 대항하여 저항력이 있는 HIV 변종의 출현(appearance)은 치료 실패의 주요 원인으로 남아있다. 바이러스 저항은 각각 서로 다른 작용기구(mechanism of action)로 두 개 이상의 안티-HIV 물질(agents)와 함께 결합된 안티-HIV 치료의 등장으로 이어져 항레트로바이러스 치료(antiretroviral monotherapy)가 시작된 이래로 관찰되었다. 고효능 항레트로바이러스 치료요법(HAART, highly active antiretroviral therapy)의 도입으로 치료한 환자 중에는 질병과 사망률이 현저히 감소되었다. 이러한 치료는 뉴클레오사이딕(nucleosidic)과 비-뉴클레오사이딕(non-nucleosidic) 역전사 효소 억제제(reverse transcriptase inhibitor)와 단백질 가수분해 효소 억제제(protease (PR) inhibitors)를 병용한다. 그럼에도 불구하고, 다중 약물 치료(multi-drug therapy)는 일반적으로 몇 가지 약물에 대한 내성의 결과로 장기간 치료로도 완전히 HIV를 제거하지 못한다. 병용된 안티-HIV 치료요법을 받는 환자의 절반은 적용된 약물 중 하나 이상에 대해 내성으로 인해 완벽하게는 치료에 반응하지 못한다. 또한, 환자에 대한 치료 옵션을 크게 제한한 최근 감염된 환자에게서 내성이 발견되었다
병용 안티-HIV 치료요법의 성공은 바이러스 퇴치의 가능성을 전망하게 해주었다. 그러나, 바이러스 저장포(reservoirs)의 존재는 잠복성으로 감염된 세포, 및 치료와 상관없이 바이러스 지속성이 있는 조직으로 설명된다. 이러한 치료요법(therapy)는 산혈증(lactic acidosis), 당뇨병, 지방이상증(lipodystrophy), 췌장염 및 기타 등의 때때로 치명적인 신진대사 합병증 및 이차효과(secondary effects)를 내포하고 있어 사실상 있을 수 없다는 사실로 인해 바이러스 저장포(reservoirs)를 뿌리뽑기 위해서는 70여 년간의 지속적인 치료가 필요할 것으로 추정 된다 (Iglesias E 2009. Biotecnologia Aplicada 26: 189-194).
약물 복용을 불규칙하게 투약하거나 치료를 파괴하는 경우 내성이 빠르게 생기기 때문에 HIV 항레트로바이러스 치료요법(antiretroviral therapy)에의 집착은 고효능 항레트로바이러스 치료요법(HAART, highly active antiretroviral therapy), 특히 단백질 가수분해효소 억제제(PR (protease) inhibitors)와 관련하여 논란의 여지가 있는 사안 중 하나이다.
병용 요법(Combination therapy)은 AIDS에 대해 진행을 지연시키지만, 감염된 환자를 치유하지는 못한다(Marsden MD, Zack JA 2009. J Antimicrob Chemoth 63: 7-10). 이러한 치료요법은 오히려 불치의 병보다는 만성병으로 감염을 균체시키고, 또한 일반 인구의 비슷한 수준으로 환자 중에서 기대수명을 증가시키는 경우에도, 여전히 항레트로바이러스(antiretrovirals)의 사용을 감소시키는 새로운 전략에 대한 검색이 요구되는 풀리지 않는 심각한 문제점들을 나타낸다. 그것은 새로운 치료 변이 균을 찾아내는 것이 목표이다.
사용 가능한 안티-HIV 치료요법의 모든 단점은 메커니즘(mechanisms) 및/또는 활동의 대상에 대부분 서로 다른 새로운 안티-HIV 약물에 대한 필요성을 뒷받침한다. 본 발명의 목적은 복제 및/또는 HIV의 감염을 억제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 이러한 HIV 중합효소(polymerase) 또는 HIV 단백질 가수분해 효소(protease)를 억제하기보다는 다른 메커니즘을 갖는 HIV복제 또는 HIV감염을 억제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 바이러스가 아닌 숙주세포(host cell)를 대상으로 하여 HIV 복제 및?/또는 감염을 억제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 세포골격, 구체적으로 숙주세포의 중간섬유(IFs)를 표적으로 한다. 특히, 본 발명의 또 다른 목적은 호스트 단백질 비멘틴(host proteins vimentin)과 케라틴-10(keratin-10)을 표적으로 하는 것이다. 숙주세포를 표적으로 하여 이탈 돌연변이를 생성하도록 HIV에 대해 더 어려워 질 것이다. 비멘틴(vimentin)과 케라틴-10(keratin-10)은 중간섬유(IFs)의 구조에서 중요하며, 본 발명은 그들이 HIV를 억제하는 적합한 대상임을 보여 주었다. 본 발명의 다른 목적은 비멘틴(host proteins vimentin)과 케라틴-10 호스트 단백질(keratin-10 host proteins)을 감소시키거나 세포의 중간섬유(IFs)를 파괴시키는 물질(agents) 및 약리학적 성분(pharmaceutical composition)을 제공하는 것이다.
앞서 언급 한 목적 중 하나 이상은 본 발명에 의해 달성된다.
본 발명은 HIV 복제 및/또는 감염을 억제하는 방법으로 포유류 세포의 세포골격(cytoskeleton)을 변경하는 것에 관한 것이다. 세포골격은 세포 무결성에 기여하고 세포에 대한 몇 가지 역할을 담당하는 삼방향 스캐폴드(tridimensional scaffold)이다. 세가지 주요 구조로 형성되며, 그것은 미세소관(microtubules), 미세섬유(microfilaments) 및 중간섬유(IFs)이다. 중간섬유(IFs)는 각 세포 유형, 그 중 비멘틴(vimentin) 및 케라틴-10(keratin-10) 단백질에 대한 특정 단백질의 집합을 포함한다.
비멘틴(vimentin)은 특정 상피세포(epithelial cells) 및 간엽세포(mesenchymal cells)에 있어서 일반적으로 혈관 내피세포로 나타내고 중간섬유(IFs)를 형성하는 58kDa-분자량(MW) 단백질이다 (Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P 2002. Molecular Biology of the Cell, 4th ed., Garland Publishing, New York). 비멘틴(vimentin)은 HIV 단백질가수분해(PR)의 기질(substrate)이며, 단백질가수분해 (PR)의 활동이 비멘틴(vimentin)에 영향을 미침으로써 세포골격구조에 영향을 미칠 수 있다 (Blanco R, Carrasco L, Ventoso I 2003. J Biol Chem 278: 1086-1093). 또한, 단백질 가수분해 프로세싱에 의해 얻어진 비멘틴 엔말단 펩티드(vimentin N-terminal peptides)와 함께한 치료는 세포핵 구조를 재배열할 수 있는지 입증되었다. 이러한 핵 구조 재배열은 또한 HIV에 감염된 세포에서 관찰된다 (Shoeman RL, Huttermann C, Hartig R, Traub P 2001. Mol Biol Cell 12:143-154). 이전 증거들은 HIV가 그것의 수명주기에 대한 비멘틴(vimentin)의 제거에 의해 결정되는 것으로 제안하고 있다.
케라틴(keratins)은 10 내지 68kDa 분자량의 범위 내에서 중간섬유(IFs) 단백질의 집합(약 30요소)을 포함한다. 그들은 산성(pKi = 4-6; 타입 I) 및 중성 염기성(pKi = 6-8; 타입 II)에서 그들의 분자량 및 그들의 전기영동 행동에 따라 분류하고 번호를 매긴다. 케라틴-10(keratin-10)은 주로 완전히 차별화된 표피세포의 중간섬유(IFs)에서 발견된 대략 60kDa의 타입-I 케라틴(keratins)이다 (Zhou XM 1988. J Biol Chem 263: 15584-9). 본 발명은 포유류 세포에서 세포골격 중간섬유(의 구조)를 파괴하는 것을 포함하는 포유류 세포에서 HIV의 복제 및/또는 감염을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HIV의 감염을 예방하거나 치료하도록 세포골격 중간섬유를 파괴(disrupts) 하는 물질(agents)에 관한 것이다.
첫 번째 양태로, 본 발명은 포유류의 세포에서 HIV의 복제를 억제할 수 있는 방법을 제공하며, 상기 방법은 포유류의 세포에 세포골격 중간섬유(의 구조)를 파괴하거나 부정적으로 변조하는 단계를 포함한다. 특히 포유류의 세포가 HIV 바이러스에 의해 감염에 대한 표적세포이다.
상기 방법의 바람직한 실시 예로, 중간섬유(IFs)는 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴-10(keratin-10) 단백질을 포함한다.
상기 방법의 다른 바람직한 실시 예로, 상기 방법은 세포골격 중간섬유(의 구조)를 파괴하거나 부정적으로 변조되도록 중간섬유(IFs)에서 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴-10(keratin-10)의 양을 감소시키는 단계, 및/또는 새로운 중간섬유를 만들도록 가능한 무(free) 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴-10(keratin-10)의 양을 감소시키는 단계를 포함한다.
상기 방법의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 방법은 세포골격 중간섬유(의 구조)를 파괴하거나 부정적으로 변조되도록 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴-10(keratin-10)을 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키는 단계를 포함한다.
상기 방법의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 중간섬유(IFs)의 파괴는 폴리텝티드(polypeptides), 펩티드(peptides), 핵산(nucleic acid) 및 화학 화합물(chemical compounds)로 이루어진 그룹에서 선택된 물질(agents)를 효과적인 복용량을 약리학적으로 상기 포유류 세포에 투여 관리하여 달성된다. 바람직한 일 실시 예로, 상기 물질(agent)은 SEQ ID No. 1 내지 10, 및 그것의 유사체(homologues)와 같이 식별된 펩티드(peptides)의 그룹에서 선택된 펩티드이다. 다른 바람직한 일 실시 예로, 상기 물질(agent)은방해 RNA 또는 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 또는 그것의 전사물(transcripts)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)이다. 또 다른 바람직한 일 실시 예로, 상기 물질(agent)은화학 화합물(chemical compounds) 또는 지질 유도체(lipidic derivative)이다.
다른 양태로, 본 발명은 HIV 감염을 방지하거나 치료하도록 약의 제조에 있어서 세포골격 중간섬유(IFs)를 교란하는 물질(agent)를 제공한다.
이러한 양태의 바람직한 실시 예로, 상기 중간섬유(IFs)는 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴-10(keratin-10)을 포함한다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은상기 중간섬유(IFs)에서 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴-10(keratin-10)의 양을 감소를 포함하여 달성된다.
이러한 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 물질(agent)은비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴-10(keratin-10)를 암호화하여 유전자의 발현을 감소시킨다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은폴리텝티드(polypeptides), 펩티드(peptides), 핵산(nucleic acid) 및 화학 화합물(chemical compounds)로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은SEQ ID No. 1 내지 10, 및 그것의 유사체(homologues)와 같이 식별된 펩티드(peptides)의 그룹에서 선택된 펩티드(peptide)를 포함한다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 또는 그것의 전사물(transcripts)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide) 또는 방해 RNA 이다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은siRNA, shRNA, 및 miRNA로 구성되는 그룹에서 선택된 방해 RNA(interfering RNA)이다. 바람직하게는, 상기 방해 RNA는 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10, 바람직하게는 18 내지 25 세포핵(nucleotides)의 메신저 RNA(messenger RNA)의 영역에 상호 보완적인 15 내지 50 뉴클레오티드(nucleotides)의 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은화학적 화합물이고, 상기 화합물은 지질 화합물(lipidic compound) 또는 지리 유도체(lipidic derivative)이다. 바람직하게는, 상기 지질 화합물(lipidic compound)은 프로스타글란딘(prostaglandin) 사이클로펜테인(cyclopentane) 15-디옥스(deoxy)-△-12,14-PGJ2이다.
또 다른 양태로, 본 발명은 HIV 감염을 치료하거나 방지하기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기에서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 물질(agent)를 포함하는 상기 성분은 상기에서 언급한 바와 같이 본 발명에 따른 세포골격 중간섬유를 파괴하거나 부정적으로 변조되고, 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier) 또는 첨가제(excipient)를 제공한다.
본 발명에 따른 성분의 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10를 포함하는 중간섬유(IFs)를 방해하는 폴리텝티드(polypeptides), 펩티드(peptides), 핵산(nucleic acid), 화학 화합물(chemical compounds)로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명에 따른 성분의 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은SEQ ID No. 1 내지 10, 및 그것의 유사체(homologues)와 같이 식별된 펩티드(peptides)의 그룹에서 선택된 펩티드이다.
바람직하게는, 상기 물질(agnet)는 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 또는 그것의 전사물(transcripts)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide) 또는 방해 RNA 이다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 매우 바람직한 실시 예로, 상기 물질은 HIV 감염을 예방하거나 치료하는 용도로 사용되며, 또는 HIV 감염을 예방 또는 치료를 위한 약의 제조에 사용된다. HIV 감염의 예방 및 치료는 바이러스 복제의 억제 또는 방해에 대한 참조를 포함한다.
본 발명에 따른 물질(agent)의 또 다른 바람직한 실시 예로, 상기 물질(agent)은비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 또는 그것의 전사물(transcripts)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide) 또는 방해 RNA 이다.
상기 약제학적 조성물의 바람직한 일 실시 예로, 상기 방해 RNA는 siRNA, shRNA, 및 miRNA로 구성된 그룹에서 선택된다.
상기 약제학적 조성물의 바람직한 일 실시 예로, 상기 화학 화합물(chemical compounds)은 지질 화합물(lipidic compound) 또는 지리 유도체(lipidic derivative)이다. 바람직하게는, 상기 지질 화합물(lipidic compound)은 프로스타글란딘(prostaglandin) 사이클로펜테인(cyclopentane) 15-디옥스(deoxy)-△-12,14-PGJ2이다.
또 다른 양태로, 본 발명은 위에서 설명한대로 본 발명에 따른 세포골격 중간섬유(cytoskeletal IFs)를 방해하는 물질(agent)를 포함하는 약제학적 조합물(pharmaceutical combination)을 제공하며, 적어도 하나의 안티-HIV 약물을 포함한다. 본 발명의 양태에서 사용하기에 적합한 안티-HIV 약물의 실시 예는 HIV 단백질 가수분해 효소 억제제(protease inhibitors), 가장 바람직하게는 아타자나비어(atazanavir, 상품명: 레야타즈), 암프레나비어(amprenavir, 상품명: 아제네라제), 다루나비어(darunavir, 상품명: 프레지스타), 넬피나비어(nelfinavir, 상품명: 비라셉트), 사퀴나비어(saquinavir, 상품명: 인비라제 또는 포토바제), 인디나비어(indinavir, 상품명: 크릭시반), 포삼프레나비어(fosamprenavir, 상품명: 렉시바), 로피나비어(Lopinavir, 상품명: 알루비아), 리토나비어(ritonavir, 상품명: 노비르), 티프라나비어(Tipranavir, 상품명: 아프티부스), 이러한 약물의 기능성 파생세포(functional derivatives), 및 로피나비어(Lopinavir) + 리토나비어(ritonavir, 상품명: 칼레트라)와 같은 그들의 조합물로 구성되는 그룹에서 선택되는 단백질 가수분해 효소 억제제(protease inhibitors)을 포함한다. 본 발명의 양태에서 사용될 수 있는 다른 항레트로바이러스(antiretroviral) 약물로는 에파비렌즈(efavirenz, 상품명: 스토크린), 네비라핀(nevirapine, 상품명: 바이라문), 릴피비린(rilpivirine; TMC-278), 로비리드(loviride; R89439), 델라비르딘 (delavirdine, 상품명: Rescriptor), 이러한 약물의 기능성 파생세포(functional derivatives), 및 그들의 조합물과 같은 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors; nNRTI)가 있다. 본 발명의 양태에서 사용될 수 있는 다른 항레트로바이러스(antiretroviral) 약물로는 라미부딘(lamivudine, 상품명: 3TC 또는 Epivir), 아바카비어(abacavir, 상품명: 지아겐), 지도부딘(zidovudine, 상품명: 아지도민), 스타부딘(stavudine, 상품명; d4T 또는 제리트), 잘시타빈(zalcitabine, 상품명: ddC 또는 히비드), 디다노신(didanosine, 상품명: 디디엘 또는 바이덱스), 엠트리시타빈(emtricitabine, 상품명: FTC 또는 엠트리바), 테노포비어(Tenofovir, 상품명: 바이리드), 아프리시타빈(apricitabine, AVX754), 스템피딘(stampidine), 엘부시타빈(elvucitabine, L-Fd4C), 라시비르(racivir), 암도조비어(amdoxovir), 이러한 약물의 기능성 파생세포(functional derivatives), 및 엠트리시타빈(emtricitabine, 상품명: 엠트리바) + 테노포비어(Tenofovir, 상품명: 트루바다), 지도부딘(zidovudine) + 라미부딘(lamivudine, 상품명; 콤비르), 및 아바카비어(abacavir) + 라미부딘(lamivudine) + 지도부딘(zidovudine, 상품명: 트리지비르)과 같은 그들의 조합물과 같은 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(nucleoside reverse transcriptase inhibitors; NRTIs) 또는 뉴클레오시드 아날로그 역전사효소 억제제(nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors; NARTIs)가 있다.
위에서 언급 한 항레트로바이러스(antiretroviral) 약물뿐만 아니라, 본 발명의 약제학적 조합물(pharmaceutical combination)은 위의 목록 중 에파비렌즈(efavirenz) + 지도부딘(zidovudine) + 라미부딘(lamivudine), 에파비렌즈(efavirenz) + 테노포비어(tenofovir) + 엠트리시타빈(emtricitabine), 리토나비어(ritonavir) + 지도부딘(zidovudine) + 라미부딘(lamivudine)을 이용한 로피나비어(Lopinavir), 그리고 리토나비어(ritonavir) + 테노포비어(tenofovir) + 엠트리시타빈(emtricitabine)을 이용한 로피나비어(Lopinavir)의 조합물과 같은 항레트로바이러스 약물의 다양한 클래스의 조합물을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조합물의 바람직한 실시 예에서 물질(agents) 및 약물(drugs)이 투여요법의 일환으로, 개별적으로 또는 순차적으로 동시에 관리된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요에 따라 HIV 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하며, 청구항 20항 내지 26항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물(pharmaceutical composition) 또는 청구항 27항 내지 28항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조합물(pharmaceutical combination)을 치료요법으로 효과적인 복용량을 관리하는 단계를 포함한다.
도 1은 비교 프로케오믹스(proteomics)에 의해 식별되는 인간 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 단백질의 상대 강도(Relative intensity)를 나타낸 것이다. 그림 A는 안티-HIV 활동-베어링 추출물(anti-HIV activity-bearing extract)로 치료된 배양(cultures)으로 비멘틴(vimentin) 단백질이 감소한 것을 나타낸 것이다. 그림 B는 안티-HIV 활동-베어링 추출물(anti-HIV activity-bearing extract)로 치료된 배양(cultures)으로 케라틴(keratin)-10 단백질이 감소한 것을 나타낸 것이다. 에러 바(error bars)는 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 2는 비멘틴(vimentin) 및 케라틴(keratin)-10 단백질 각각에 대해 침묵(silenced)한 배양에서 안정적으로 비멘틴(vimentin) 및 케라틴(keratin)-10 단백질을 감지한 것을 나타낸 것이다. 비멘틴 (A)와 케라틴-10 (B)는 MT4vim (s) 및 MT4K -10(S) 각각의 단백질에 대해 침묵(silencing)을 유도하도록 영향을 주는 MT4 세포 라인의 웨스턴흡입법(western blot)에 의해 평가되었다. MT4vim (s) 및 MT4K -10(s) 배양(cultures)은 MT4 세포 배양에 비해 각각의 단백질의 감소 발현을 나타낸 것이다. β액틴(β actin) 단백질은 웨스턴흡입(western blot) 분석을 정상화하기 위해 조절되어 사용되었다. 각각의 균체(strain)는 중복 레인(lane)에서 분석되었다. 도 2에서 K-10은 케라틴-10을 의미한다.
도 3은 p24 항원을 판정하는 것으로 평가된 MT4vim (s)와 MT4K -10(S) 세포 배양에서 HIV-1 복제를 억제한 것을 나타낸 것이다. MT4, MT4vim (s) 및 MT4K -10(S) 세포 배양은 0.01의 감염의 다중성(m.o.i.)에서 HIV-1 균체 브루(Bru)로 면역성을 테스트 하였다. 바이러스 복제는 MT4vim(s) 및 MT4K -10(S) 세포 배양에서 90% 이상으로 억제되었다. 에러 바(error bars)는 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 4는 MT4, MT4vim (s) 및 MT4K -10(S) 세포 배양에서 피엘지더블유 렌티바이러스 벡터(pLGW lentiviral vector)와 함께 측정하여 테스트한 것을 나타낸 것이다. 배양된 세포는 도입 후 HIV-1 바이러스의 복제주기의 첫 단계와 유사한 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)와 형질도입 되었고, 또한 GFP의 보고유전자(reporter gene)가 운반되었다. A) 침묵을 유도하지 않는 MT4세포와 비교하여, 렌티바이러스(lentiviral)와 함께 한번 형질 도입된 형광세포(fluorescent cells)의 감소한 퍼센트(percent)를 보여주는 MT4vim (s) 및 MT4K -10(S) 세포 배양을 나타낸 것이다. 에러 바(error bars)는 표준 편차를 나타낸 것이다. B) 각 배양의 세포계수를 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 MT4 세포 배양에서 중간섬유(IFs) 구조 분석을 나타낸 것이다. MT4, MT4vim(s) 및 MT4K -10(S) 세포 배양은 투과 전자현미경으로 분석하였다. 침묵을 유도한 배양(B, C)는 컨트롤(A)로 사용된 침묵을 유도하지 않은 MT4 세포 배양에서 관찰된 긴 필라멘트(long filaments) 대신에 짧은 중간섬유(IFs)를 보여 주었다. D는 MT4 세포에 SEQ ID No. 1로 식별된 펩티드(peptide)의 활동에 의해 조각난 중간섬유(IFs)를 보여준 것이다.
도 6은 펩티드에 의해 MT4 세포에서 HIV-1 복제를 억제하는 것을 나타낸 것이다. A) 세포는 24시간 동안 펩티드(peptide)와 함께 배양하였고, 추가로 0.05 감염의 다중성(m.o.i.)에서 HXB1 HIV-1 균체(strain)를 테스트하였다. 바이러스 복제는 높은 퍼센트에서 억제 되었으며, 또한 펩티드 농도와 함께 증가 증가되었다. 에러 바(error bars)는 표준 편차를 나타낸 것이다. B) 세포는 24시간 동안 펩티드(peptide)와 함께 배양하였고, 추가로 0.01 감염의 다중성(m.o.i.)에서 HIV 브루(Bru) 균체를 배양하였다. 저기농도 50(inhibitory concentration 50; IC50)는 모든 펩티드(peptide)에 대해 10－9몰(nanomolar) 수준이였다.
도 7은 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMCs)의 다른 펩티드에 의한 HIV-1 복제를 억제한 것을 나타낸 것이다. 이러한 세포는 사전에 유도되었고, 펩티드(peptide)를 다른 농도로 치료하였고, 추가로 HIV-1 브루(Bru) 균체(strain)에 감염되었다. 펩티드는 복용 종속적인 방식으로 HIV 복제를 억제하였다.
도 8은 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 식별된 펩티드(peptide)에 의한 HIV-2 복제의 억제를 나타낸 것이다. PBMCs은 사전에 유도하였고, 펩티드(peptide)를 다른 농도로 치료하였고, 추가로 HIV-2 CBL-20 균체에 감염되었다. 펩티드는 복용 종속적인 방식으로 HIV-2 복제를 억제하였다.
도 9는 SEQ ID No. 1, 4, 5, 7, 8 및 9로 식별된 펩티드(peptide)의 존재로 감소된 비멘틴(vimentin)을 나타낸 것이다. MT4 세포 라인은 각각 24시간 동안 50mM에서 상기 펩티드(peptide)를 배양하였다. 비멘틴(vimentin)은 웨스턴흡입법(western blot)에 의해 감지되었다. 비멘틴 밴드(vimentin bands)는 펩티드로 치료된 배양에 대해 감소된 강도를 보여 주었다.
도 10은 SEQ ID No. 1 (A)와 MT4 세포 라인에 SEQ ID No. 3 (B)로 식별된 펩티드의 내면화의 평가를 나타낸 것이다. 그래프는 5, 10, 20 및 40mM 농도와 MT4 세포 라인에 다른 시점에서 펩티드 침투에 상응하는 형광세포(fluorescent cells)의 비율을 나타낸 것이다. 참조: 치료도지 않은 세포. 에러 바(error bars)는 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 11은 지질 파생세포(lipidic derivative)에 의한 HIV-1 복제를 억제하는 것을 나타낸 것이다. MT4 세포는 프로스타글란딘의 사이클로펜테인(prostaglandin cyclopentane) 15-디옥스(deoxy)-△-12,14-PGJ2(15d-PGJ2), 및 추가로 0.01의 감염 다중성(m.o.i.)에서 HIV-1 (Bru 균체)를 테스트하였다. 15d-PGJ2 프로스타글란딘(prostaglandin)은 HIV-1 복제를 억제하였다. 에러 바(error bars)는 표준 편차를 나타낸 것이다.
본 발명은 위에서 언급한 문제점들을 해결하고, 세포골격(cytoskeleton), 더 정확하게는 세포골격 중간섬유(cytoskeletal IFs)를 형성하는 단백질을 방해하여 HIV 복제를 억제할 수 있는 방법을 설명한다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 중간섬유(IFs)는 산성 케라틴(acidic keratin), 베이직 케라틴(basic keratin), 비멘틴(vimentin), 데스민(desmin), 신경교섬유질산성요소(glial fibrillary acidic factor), 퍼리퍼린(peripherin), 신경미세섬유(neurofilament; NF) 단백질, 인터넥신(internexin), 파이렌신(filensin), 파키닌(phakinin), 및 라민(lamin)으로 구성될 수 있다.
본 발명의 실시 예로, 상기 중간섬유(IF)는 비멘틴(vimentin)과 케라틴(keratin) 단백질에 의해 구성될 수 있다. 특히, 상기 중간섬유는 비멘틴(vimentin)과 케라틴(keratin)-10 단백질에 의해 형성될 수 있다. 변경된 세포골격(cytoskeletal)은 인간의 세포에서 HIV 바이러스 복제를 억제한다.
세포골격 중간섬유(cytoskeletal IFs)를 방해함으로써 상기 중간섬유는 짧은 서브유닛(subunits)으로 세포골격 중간섬유의 구조적 파괴 및/또는 세포골격 중간섬유를 형성하는 단백질을 낮게 조절하는 방식으로 수정되거나 변경되고, 또는 세포골격 망(cytoskeletal network)의 구조 형성을 바꾸고, 또한 중간섬유는 분해된다. 여기서 설명된 세포골격은 세포질(cytoplasm) 내에 포함된 세포의 '골격(scaffolding)' 또는 '스켈톤(skeleton)'을 말하고, 단백질로 구성된다. 세포골격은 모든 세포에 존재하며, 세포내 수송(intracellular transport) 및 세포 분열(cellular division) 부분 모두에서 중요한 역할을 수행한다. 이러한 세포골격은 세 가지 주요 구조로 형성되며, 그것은 미세소관(microtubules), 미세섬유(microfilaments) 및 중간섬유(intermediate filaments; IFs)이다. 세포골격은 구조와 모양으로 세포를 제공한다. 세포골격 요소는 세포막(cellular membranes)과 함께 직접적으로 광범위하게 상호 작용한다.
본 발명에서 정의된 중간섬유(IFs)는 일반적인 구조와 배열순서의 특성을 공유하는 관련된 단백질 군(family)이다. 중간섬유는 10 나노미터(nanometers)의 평균 직경을 가지며, 액틴(actin : 미세섬유) 및 미세소관의 사이에 존재한다. 중간섬유 대부분의 유형은 세포골격이지만, 하나의 타입이고, 라민(lamin)이며, 핵(nuclear)이다. 다양한 중간섬유 단백질을 코딩하는 것은 약 70가지 유전자가 있으며, 각각의 셀 유형을 구체화하며, 그 중 비멘틴(vimentin) 및 케라틴(keratin)-10 단백질이 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '비멘틴(vimentin)'는 NCBI 레퍼런스 시퀀스(Reference Sequence): SEQ ID No. 11에서 주어진 서열을 가지는 NP_003371.2에 의해 식별된 단백질의 중간섬유군 요소를 의미한다 비멘틴 단백질은 전체 섬유를 형성하는 길이로 결집되는 단위 길이 필라멘트(ULF)를 형성하여 역평행(antiparallels), 반 지그재그 더블 디머(half-staggered double dimmers)(또는 사량체(tetramers))로부터 시작하여 결합 단계에서 일련의 사상 중합체(filamentous polymer)를 형성한다.
본 발명에서 사용된 용어 '카라틴(karatin)'는, 섬유구조단백질 또는 중간섬유의 군(family)을 의미한다 카라틴 단백질은 이합체화 반응(dimerization): 사량체(tetramers) 또는 옥타머(octamers) 그리고 결국 긴 필라멘트(filaments)로 말단간(end-to-end) 복원법(annealing)을 수용할 수 있는 ULF로 결합한 디머(dimmers)와 함께 시작하여 결합 단계에서 일련의 사상 중합체(filamentous polymer)를 형성한다.
각 유형 I 카라틴(karatin)은 특정 유형 II 카라틴(karatin) 파트너와 함께 표현되며, 구체적인 선호하고 미리 결정된 쌍(pairs)은 상피세포(epithelial cell)의 특정 타입의 분화(differentiation) 및 특수화(specialization)를 나타내는 특징이 있는 것을 결합(coassembly)하여 형성된다.
본 발명에서 사용된 용어 '케라틴(keratin)-10'은 케라틴(keratin)을 말하며, 타입 I 세포골격 10을 말하며, SEQ ID No. 12에 주어진 서열을 갖는, 스위스-프로트 엑세션넘버(Swiss-Prot accession number): Q6EIZ0.1에 의해 식별된 단백질의 중간섬유군을 의미한다
본 발명에서 사용되는 용어 "유전자(gene)"는 폴리펩티드 사슬(polypeptide chain)로 변환할 수 있는 mRNA로 전사(transcribed)될 수 있는 DNA 염기순서에 국한되는 것은 아니지만 이를 포함하는 DNA 염기순서를 말하며, DNA복제, 전사(transcription) 및 조절(regulation)에 관련된 다른 단백질 및 효소(enzymes)에 대한 인식부위(recognition sites), 해독되지 않은 5' 영역(5' UTR), 코딩 영역(coding region)(이것은 단백질에 대해 암호화 되거나 될 수 없을 것이다), 그리고 아데닐산중합반응 부위(polyadenylation site)를 포함하는 해독되지 않은 3' 영역(3' UTR)과 같이 제공하거나 rRNA 또는 tRNA로 전사될 수 있다. 용어는 프로모터 영역(promoter region)과 같은 몇 가지 실시할 수 있게 연쇄된 DNA 조각(fragments)을 의미한다 일반적으로 5'UTR, 코딩 영역(coding region) 및 3'UTR은 RNA로 변환되며, 단백질 인코딩 유전자의 경우, 코딩 영역은 단백질로 해독된다. 유전자는 일반적으로 비구조부위(introns)와 구조부위(exons)를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 '비멘틴(vimentin)'은 단백질 비멘틴 또는 그것의 유사체(homologue)를 암호화한 유전자를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 '케라틴(keratin)-10 유전자'는 단백질 케라틴-10 또는 그것의 유사체(homologue)를 암호화한 유전자를 의미한다.
본 발명에서 설명된 중간섬유(intermediate filaments)와 관련하여 여기서 사용된 용어 '파괴(disrupting)'는 기능 또는 구조 조직을 방해하는 것을 의미한다. 특히, 파괴(disruption)는 단백질삼차구조(tertiary protein structures) 및 1차, 2차의 형성을 억제하는 것을 포함하여 구조 파손, 중합반응(polymerization)의 억제, 형성(formation) 및 생합성(biosynthesis)을 억제와 관련한다.
앞서 설명된 바와 같이 중간섬유를 부정적으로 변조(modulating)와 관련하여 여기서 사용된 용어 '부정적 변조(negatively modulating)'는 상기 섬유의 생물학적 기능을 감소시키거나 손실되는 결과로 기능 또는 구조 조직을 바꾸거나 변경하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 '세포골격 중간섬유(cytoskeletal intermediate filaments)'는 세포골격 요소의 타입과 같은 중간섬유를 의미하며, 그들의 크기는 액틴(actin) 및 미세소관(microtubules)과 비교하여 중간(intermediate)이다. 이들의 세 가지는 함께 구조적 완전성(structural integrity), 세포 모양, 세포 및 세포소기관 운동성(organelle motility)을 향상시킨다. 세포골격 중간섬유(cytoskeletal intermediate filaments)는 다섯 가지 유형: 타입 I 및 타입 II: 산성 케라틴(acidic keratin) 및 염기성 케라틴(Basic Keratin)으로 균형이 맞게 분할된다. 케라틴(keratins)은 또한 다른 상피세포(epithelial cell); 타입 III: 섬유아세포(fibroblasts)의 비멘틴(vimentin), 내피세포(endothelial cells) 및 백혈구(leukocytes); 근육의 데스민(desmin); 성상교세포(astrocytes) 및 글리아(glial)의 다른 타입의 신경교섬유징산성인자(glial fibrillary acidic factor), 그리고 말초신경섬유(peripheral nerve fibers)의 말초계(peripherin); 타입 IV 심경미세섬유(Neurofilament: NF) 단백질 H(heavy), M(medium), L(low), 인터넥신파이렌신(internexin filensin) 및 파키닌(phakinin); 및 타입 V: 라민(lamins)에 독특한 아형(subtypes)을 갖는다.
본 발명에서 사용된 용어 '세포골격 중간섬유(cytoskeletal intermediate filaments)'은 섬유(filaments) 사량체(tetramers)의 나선형 구조체(helical organization)를 의미한다. 각각의 중간섬유 단량체는 아미노산(머리)와 카복실기(꼬리) 말단(terminals)을 연결하는 알파 나선형 간상체 도메인(alpha helical rod domain)으로 구성된다. 간상체(rods)는 이량체(dimer)를 형성하는 또 다른 섬유 주변을 휘감는다. 각 섬유의 N과 C 말단(terminals)은 정렬된다. 일부 중간섬유는 호모다이머(homodimers)를 형성하며; 다른 것은 헤터로다이머(heterodimers)를 형성한다. 그런 다음 이량체(dimmers)는 헤드-테일(head-tail)을 배열한다. 지그재그 사량체(staggered tetramers)를 형성한다. 이러한 사량체는 중간섬유의 염기성 서브유닛(basic subunit) 으로 간주된다. 최종 중간섬유는 이들 사량체의 나선형 배열이다.
본 명세서의 맥락에서 사용된 용어 '치료(treatment)'와 '치료하는 것(treating)'은 질환(condition) 또는 질병(disease) 또는 그것의 증상에 대해 개선하는 어떤 및 모든 용도를 의미하며, 질환 또는 질병 또는 그것의 증상에 대한 체제를 방지하거나, 다른 방법으로 어떠한 방식으로든 질환 또는 질병 또는 바람직하지 않은 증상에 대한 진행을 방지하거나 저해하거나 반전시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 '치료상으로 효과적인 복용량(therapeutically effective dose)'은 예를 들면 치료하고, 개선하거나, 또는 바람직한 질병 또는 질환을 방지하거나, 또는 탐지 가능한 치료 또는 예방 효과를 보여주는, 바람직한 치료 효과를 제공하기에 충분한 치료제(therapeutic agent)의 무독성 양을 의미한다. 효과는 예를 들어 예를 들어, 화학적 마이커(chemical markers) 또는 항원 수준(antigen levels)에 의해 감지할 수 있다. 치료 효과는 신체 증상의 감소 등이 있다. 연구대상에 대한 정확한 효과적인 복용량은 연구대상의 크기와 건강 상태, 질환의 종류 및 정도, 그리고 관리를 위해 선택된 치료 또는 치료의 병용에 따라 달라질 것이다. 그러므로, 사전에 정확한 효과적인 양을 구체적으로 명시하는 것은 유용하지 않다. 그러나, 주어진 상황에서 효과적인 양은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있으며, 임상의의 판단하에 있다.
본 발명의 목적을 위해, 효과적인 복용량은 관리되는 개인의 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 또는 폴리펩티드(polypeptide) 조성물의 약 0.01mg/kg 내지 50mg/kg에서 0.05mg/kg 내지 약 10mg/kg가 될 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 '약제학적으로 허용 가능한 운반체(carrier) 또는 첨가제(excipient)'는 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드, 및 기타 치료제와 같은 치료제의 관리 대한 운반체(carrier)를 의미한다. 용어는 조성물을 받는 개인에게 해로운 항체의 생산을 스스로 유도하지 않는 어떤 약제학적 운반체를 의미하며, 지나친 독성 없이 관리할 수 있을 것이다. 적합한 운반체는 커지고, 단백질, 다당류(polysaccharides), 폴리유산(polylactic acids), 폴리글리콜산(polyglycolic acids), 동의아미노산(polymeric amino acids), 아미노산혼성중합체(amino acid copolymers), 및 활발하지 않은 바이러스입자(inactive virus particles)와 같은 거대분자(macromolecules)를 느리게 대사 작용할 것이다. 이러한 운반체(carries)는 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 약제학적 조성물에 있어서 약제학적으로 허용 가능한 운반체는 물, 염분, 글리세롤(glycerol) 및 에탄올(ethanol)과 같은 액체를 포함될 수 있다. 또한, 습윤제(wetting agents) 또는 유화제(emulsifying agents), pH 완충물질(buffering substances) 등과 같은 보조물질(auxiliary substances)은 수단(vehicles)에 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 첨가제(excipient)에 대한 논의는 레밍턴 약제학적 사이언스(Remington's Pharmaceutical Sciences)에서 찾아볼 수 있다 (Mack Pub. Co., N.J. 1991). 일반적으로 약제학적 조성물은 주사용, 액체용액 또는 현탁액(suspensions) 또는 솔리드 폼(solid forms)으로, 용액에 알맞은, 또는 현탁액에 알맞은, 또는 액체수단(liquid vehicles) 또는 직접적인 섭취량과 같이 준비될 수 있다. 리포솜(liposomes)은 아로솔(arsoles) 같은 약제학적으로 허용 가능한 운반체의 정의 내에서 포함된다.
펩티드(peptide)를 참조할 때 본 발명에서 사용된 용어 '유사체(homologue)'는 예를 들면, 블라스트(blast) 등, 바람직하게는 SEQ ID No. 1 내지 SEQ ID No. 10 서열에 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 97% 서열 상동성(sequence identity)을 나타내고, 파괴, 부정적으로 세포골격을 변화시키거나 변경시키는 능력을 갖는, 구체적으로 말하면 세포골격 중간섬유(IFs)를 형성하는 단백질, 더 정확하게 비멘틴(vimentin) 및 케라틴(keratin)-10 단백질을 갖는 서열 정렬에 의한 계통확립으로 적어도 70% 서열 상동성을 분할하여 아미노산 배열(amino acid sequence)을 포함하는 펩티드(petide)를 의미한다. 적합한 유사체는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)을 갖는 펩티드(petide)이다. 적합한 아미노산의 10%미만이 치환되며, 더 적합하게는 5%미만, 더욱 적합하게는 3%미만, 가장 바람직하게는 아미노산의 1%미만이 치환된다. 10미만인 적합한 아미노산 잔기(amino acid residues)가 치환되며, 더 적합하게는 5미만, 그리고 가장 적합하게는 2 미만인 아미노산이 치환된다. 보존적 치환(conservative substitution)은 아미노산이 다른 매우 유사한 아미노산에 의해 치환되며, 치환은 작거나 단백질의 활동에 영향이 없다. '보존적 치환(conservative substitution)'은 대략적으로 동일한 크기 및 모양 그리고 동일한 순 실제전하(net electronic charge)를 가진 다른 아미노산을 갖는 아미노산의 대체물(replacement)이다. 지방족 또는 대체 지방족 아미노산 측쇄(side chains)을 갖는 아미노산은 탄소 및 헤테로원자(heteroatoms)의 총 수가 약 4개 이상 다를 경우 대략적으로 동일한 크기를 갖는다. 그것들의 측쇄에 브랜치(branches)의 수가 하나 이상 다를 경우 대략적인 모양을 갖는다. 그것들의 측쇄(side chains)에서 페닐(phenyl) 또는 치환된 페닐 그룹을 갖는 아미노산은 대략적으로 같은 크기와 모양을 가진 것으로 간주된다. 아미노산의 다섯 그룹이 아래에 나열된다. 보존적 치환에 있어서 동일한 그룹 결과에서 다른 아미노산을 갖는 폴리펩티드에 아미노산을 대체한 것: 그룹 I: 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 및 비-자연적으로 발생하는 C1 C4 지방족 또는 C1 C4 히드록실(hydroxyl) 치환 지방족 측쇄(곧은 사슬 또는 모노브랜치(monobranched)) 을 갖는 아미노산. 그룹 II: 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid) 및 비-자연적으로 발생하는 C1 C4 지방족 측쇄(브랜치되지 않은(unbranched) 또는 하나의 분기점)로 치환된 카르복실산을 갖는 아미노산. 그룹 III: 리신(lysine), 오르니틴(ornithine), 아르기닌(arginine) 및 비-자연적으로 발생하는 C1 C4 지방족 측쇄(브랜치되지 않은(unbranched) 또는 하나의 분기점)로 치환된 아미노를 갖는 아미노산. 그룹 IV: 글루타민(glutamine), 아스파라긴(asparagine) 및 비-자연적으로 발생하는 C1 C4의 지방족 측쇄(브랜치되지 않은(unbranched) 또는 하나의 분기점)로 치환된 아미노를 갖는 아미노산. 그룹 V: 페닐알라닌(phenylalanine), 페닐글리신(phenylglycine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan).
본 발명에서 사용된 용어 '% 서열 상동성(% sequence identity)'은 최대비율로 서열 상동성을 달성하기 위해, 필요한 경우 서열을 정렬하고 선택적으로 격차를 도입 한 후에, 관심 핵산 서열대로 세포핵과 동일한 핵산 순서로 세포핵의 비율로 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 본 발명이 속한 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명에서 사용된 용어 '핵산 순서(nucleic acid sequence)'와 '뉴클레오티드 (nucleotides)'는 또한 예를 들면 인위적으로 수정된 핵산 시퀀스, 펩티드 핵산뿐만 아니라, 적어도 하나의 수정된 뉴클레오티드 및/또는 예를 들어 이노신(inosine) 같은 비-자연적 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 시퀀스 같은 핵산 시퀀스에 기초 및/또는 파생된 비-자연적 분자를 포함한다.
용어 'RNA 간섭(RNA interference)'은 간섭 RNA(iRNA)가 특정 mRNA의 세포내 분해를 초래하고 원하는 mRNA 표적의 해독을 방해하는 데 사용될 수 있는 프로세스를 의미한다.
용어 '간섭 RNA(interfering RNA)'는 RNA 간섭에 사용되는 작은 핵산 분자를 의미하는 것으로 일 배 또는 두 배의 표준 RNA(iRNA) 물질(agents)을 의미한다.
길이 약 15 내지 30 세포핵에 있는 짧은 iRNA 물질은 '작은 간섭 RNA(small-interfering RNA)' 또는 'siRNA'를 의미한다. 긴 iRNA 물질은 일반적으로 '이중가닥 RNA(double-stranded RNA)' 또는 'dsRNA,'는 iRNA 물질의 다른 기포(forms)는 마이크로RNA (miRNA)와 짧은 헤어핀(hairpin) RNA (shRNA) 분자이다.
iRNA 물질(agents)는 수정되지 않은 또는 핵산 분자를 화학적-수정할 수 있다. iRNA 물질은 화학적으로 합성하거나 벡터에서 표현하거나, 효소 합성할 수 있다. 화학적으로 수정된 iRNA 물질의 사용은 분해로 증가한 저항, 타겟 반(moieties)에 특성, 개선된 세포의 활용 등을 통해 iRNA 물질 중 하나 이상의 속성을 향상시킬 수 있다.
dsRNA 또는 siRNA (예를 들면, 이중 헤어핀 등)을 해독하는 DNA 분자는 RNA 간섭을 제공한다. dsRNA 해독을 위한 DNA 분자는 미국특허번호제 6,573,099 호, 미국특허공개번호제 2002-0160393호 및 제 2003-0027783호 에 공개되어 있다.
siRNA 해독하기 위한 DNA 분자는 Tuschl 및 Borkhardt, Molecular Interventions, 2:158 (2002)에서 검토되었다.
본 발명에서 사용된 용어 '안티센스 RNA(antisense RNA)'는 mRNA에서 해독된 단백질의 양을 감소하기에 충분한 친화력과 mRNA에 바인딩하는 RNA를 의미한다. mRNA에서 해독된 단백질의 양은 바람직하게는 20% 이상 감소하고, 더 바람직하게는 50% 이상, 70%, 및 80% 감소하고, 가장 바람직하게는 90% 이상 감소한다. 안티센스 RNA 재료와 방법은 본 발명이 속한 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '발현(expression)'은 본 발명의 핵산 조각에서 파생 된 센스의 전사(transcription) 및 안정적인 축적(mRNA) 또는 안티센스 RNA을 의미한다. 발현은 또한 폴리펩티드로 mRNA의 해독을 의미한다. '안티센스 억제(Antisense inhibition)'는 대상 단백질의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 RNA 전사물의 생산을 의미한다.
용어 '발현 억제(inhibiting the expression)'는 대상 핵산 시퀀스, 즉, 간섭 RNA 기타 핵산 스퀀스의 결함으로 표준과 비교하여 단백질 및 감지된 대상 시퀀스의 양 및 활동의 감소 또는 iRNA에 의해 표적된 시퀀스의 해독 및/또는 전사의 감지할 수 있는 감소를 의미하는 유전자 또는 핵산의 침묵(silencing) 또는 하향조절(down regulation)을 의미한다. 탐지할 수 있는 감소는 작게는 약 5% 또는 10%이고, 크게는 약 80%, 90% 또는 100%이다. 보다 일반적으로 탐지할 수 있는 감소는 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70%이다.
본 발명에서 사용된 용어 '지질 화합물(lipidic compound)'은 예를 들면 단가불포화지방산(monounsaturated fatty acids), 다가불포화지방산(polyunsaturated fatty acids) 및 1-6 삼중결합을 포함하는 지질에서 파생된 지방산 유사체(analogues)를 의미한다.
'HIV'는 레트로바이러스 인간 면역결핍 바이러스(retrovirus Human Immunodeficiency Virus)이며, 인체에 CD4+ 세포를 공격하여 면역 결핍의 원인이 되는 바이러스이다. 본 발명에서 사용된 용어 'HIV'는 HIV-1 및 HIV-2의 모든 그룹 및 서브타입(clades)를 포함하여 어느 HIV를 포함하며, 예를 들면 HIV-1 M과 HIV-1 O 그룹; 본 발명은 알려진 각각의 클레이드(clades)를 수용하고, HIV-1을 사용하는 것이 좋다.
본 발명에서 사용된 용어 '복제(replication)'는 핵산 분자의 삼보적 사슬(complementary strand)이 폴리메라아제 효소(polymerase enzyme)에 의해 합성되는 과정을 의미한다. 본 발명에서의 특정 맥락에 있어서, 바이러스를 참조하여 사용된 바와 같이 용어 '복제(replication)'는 완벽한 또는 전체의 바이러스 생활주기(viral life cycle)를 의미하며, 전염성 바이러스 입자는 숙주세포(host cell)의 표면에 부여한다 (일반적으로 전염의 특이성을 설명하는 특정 세포 표면분자에 바인딩 된다). 일단 세포 내부에, 비리온(virions)은 탈외피(uncoated)되고 바이러스 유전자가 후대 전염성 바이러스 입자의 조립을 선도하는 핵(core)과 새로운 캡시드(capsids)를 발전시킬 수 있는 새로운 단백질의 게놈(genome) 및 합성(synthesis)의 복제에 필요한 단백질을 발현하기 시작하며, 그들 자신은 새로운 숙주세포(host cell)에 감염 및 복제하는 능력이 있다. 따라서, 바이러스 생활주기는 단일 세포 안에 있을 경우에만, 하나 이상의 바이러스 입자 또는 비리온(virions)이 완전하게 전염성 후대 바이러스 입자를 생산할 때까지 진행하여 완료된다.
레트로바이러스(retroviruses)의 특정한 경우, 완벽한 바이러스 생활주기는 세포로 들어가는 바이러스성 RNA, DNA로 역 해독되는 RNA, 프로바이러스(provirus)로 호스트 염색체(host chromosome)로 통합되는 DNA, 및 비리온(virions)단백질을 생산하고 새로이 전체 길이 바이러스 게놈의 RNA와 함께 조립하는 감염된 세포를 포함하는 감염 바이러스 입자와 관련한다.
본 발명에서 사용된 용어 '숙주세포(host cell)'은 바이러스 게놈, 또는 벡터 또는 바이러스의 증식의 발현에 사용되는 세포를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 'CD4+ 세포(cells)'는 CD4 항원을 운반하는 그것들을 참조하여 T 림프구(lymphocytes)의 주요 분류를 의미한다.
특히, 본 발명은 세포골격 중간섬유(cytoskeletal IFS)를 수정하거나 파괴, 부정적으로 변조하는 방법을 말한다. 선호하는 중간섬유(IFs)는 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 단백질이 포함된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 방법은 중간섬유에서 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10의 양을 감소시키는 것을 포함한다. 비멘틴 혹은 케라틴-10의 감소는 여러 가지 방법으로 영향을 받을 수 있다. 바람직한 실시 예는 비멘틴 혹은 케라틴-10에 대한 유전자 발현을 암호화하는 단계를 감소하거나 억제하는 것이다. 더 바람직하게는, 중간섬유에서 비멘틴 혹은 케라틴-10의 발현 수준을 감소시키거나, 세포골격 비멘틴 혹은 케라틴-10의 구조를 변경시키는 것이다. 세포골격 중간섬유의 구조는 중간섬유 단백질의 구조, 예를 들어 난할(cleavage) 또는 미스폴딩(misfolding), 바람직하게는 비멘틴 혹은 케라틴-10의 구조에 의해 수정하여 변경하는 것이다.
기술 문헌에 언급된 증거는 HIV가 수명주기 동안 비멘틴의 절제(excision)가 요구되는 것을 제안한다. 놀랍게도, 본 발명에서, 바이러스 복제는 바이러스 감염 시 현재 자연 메커니즘으로 보이는 것을 통해 억제된다. 세포골격을 방해하려는 것을 시도 및/또는 HIV 감염을 억제 할 수 있는 수단으로 비멘틴을 제거하려는 것을 시도하는지 알 수가 없다. 사실상 한가지 세포골격의 파괴는 일반 감염 시 발생으로 감염이 훨씬 더 빨리 될 것이라고 기대할 것이다.
출원인은 안티-HIV 활동을 보여주는 인간 백혈구 추출물의 분획(fraction)과 함께 치료된 MT4 세포를 비교 프로테오믹스(proteomics) 분석에 의해 비멘틴(vimentin)과 케라틴(keratin)-10 세포골격 단백질을 식별하였다. 그것은 안티 HIV 활동을 가진 백혈구 추출물이 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 및/또는 중간섬유(IFs)의 감소 및/또는 불안정화를 보여줬다는 것을 발견했다. 이전, 토마스(Thomas) 외 발명자는 안티-비멘틴 항체는 바이러스의 세포 엔트리(entry)를 방지하여 세포 표면 비멘틴에 HIV-1 gp120 당단백질(glycoprotein)의 바인딩을 차단 할 수 있었다고 입증하였다 (Thomas EK, Connelly RJ, Pennathur S, Dubrousky L, Haffar OK, Bukrinsky MI 1996. Viral Immunol 9: 73-87). 놀랍게도, 바이러스 복제의 매우 낮은 억제 수준은 비멘틴(HIV 감염을 감소하기 위한)에 대한 항체를 사용하여, 본 발명에 대해서만 테스트된 실험 조건 하에서 발견되었다. 토마스는 비멘틴(vimentin)에 대한 항체를 사용하여 항체에 액세스 할 수 있는 비멘틴(vimentin)을 차단하였다. 이것은 본 발명에서 제안된 작용(action)과는 매우 다르다. 본 발명에 있어서, 비멘틴(vimentin)은 변경 및/또는 감소되고 그래서 중간섬유(IFs)를 파괴한다. 토마스 가 완료한 비멘틴 차단에 의한 중간섬유는 변경되지 않았다. 실험 데이터는 또한 본 발명의 방법에 액션의 다른 형태를 확인한다. 토마스(Thomas)의 실험에서 억제의 47%가 최대인 것으로 관찰되었고, 본 발명에서는 바이러스 복제에 대한 억제의 높은 백분율(percent)은, 실시 예 2, 도 3 및 4에서 관찰된 바와 같이, 비멘틴(vimentin) 수준이 감소하는 경우 및/또는 비멘틴(vimentin) 구조가 대상 셀에 불안정화되는 경우 최대 100%를 얻게 되었다.
또한, 바이러스 gp120 단백질에 케라틴(keratin)-10을 바인딩 하는 것은 아무런 보고가 없고, 정확하게 HIV 복제도 실시 예 2, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 억제하는 및/또는 불안정한 케라틴-10에 의해 억제 되었다.
HIV 복제 억제의 메커니즘의 통찰력을 얻으려면 추가로, 실험 시스템은 세포 측정(cellular entry)이 gp120 바이러스 단백질에 의해 중재되지 않은 것으로 사용되었다. 그 시스템이 gp120이 전혀 없는 HIV-1 기반의 자기복제를 하지 않는 렌티바이러스(lentiviral) 벡터를 포함하며, 또한 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현한다. 예 2에 도시된 바와 같이, 이러한 렌티바이러스(lentiviral)로 MT4 세포의 효율적인 '감염(infection)'이었고, 배양은 렌티바이러스(lentiviral) 벡터의 세포 게놈에 셀로 통합 및 세포의 효율적인 침투(efficient penetration)를 나타내는 GFP 발현의 높은 퍼센트를 보여 주었다.
비멘틴의 감소는 실시 예 2와 같이 이러한 HIV-1 기반 렌티바이러스 '감염' 시스템에서 극적인 감소를 생성한다. 이것은 HIV-1 감염을 억제하기 위해 본 발명에서 사용된 방법은 토마스에 의해 제안한 비멘틴에 gp120의 바인딩에 관련되지 않다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명은 HIV 감염을 억제하기 위한 이전에 보고되지 않은 방법에 관한 것이다.
아울러, 우리는 중간섬유(IFs)는 비멘틴에 대해 침묵된(silenced) MT4 세포 (MT4vim (s)) 뿐만 아니라, 케라틴-10에 대한 침묵된 세포 (MT4K -10(s))에 대해 침묵 셀에 MT4 셀에서 불안정한 투과전자현미경(TEM)의 도움으로 입증하였으며, 그 결과 HIV-1 기반 렌티바이러스(lentiviral) 벡터의 억제된 '감염(infection)'을 확인하였다 (실시 예 3). MT4vim (s) 및 MT4K-10(s) 세포는 단백질 코딩 유전자 각각에 대한 특정 RNA의 헤어핀(hairpins)을 도입하는 것을 통해 획득 하였다.
IFs의 파괴는 폴리펩티드(polypeptides), 펩티드(peptide), 핵산, 화학 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질(agent)에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 실시 예에서 물질(agent)은 펩티드이고, 더 바람직하게는 펩티드는 SEQ ID No. 1 내지 SEQ ID No. 10로 식별된 펩티드로 구성하는 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드, 및 그것의 유사체(homologues) 이다.
다른 바람직한 실시 예에서 물질(agent)은 간섭 RNA 또는 비멘틴 및/또는 케라틴-10 유전자를 표적으로 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)이다.
다른 바람직한 실시 예에서 물질(agent)은 화학 화합물 또는 지질 파생세포(lipidic derivative)이다. 적합한 지질 화합물은 상기 지질 화합물이 프로스타글란딘(prostaglandin)의 사이클로펜테인(cyclopentane) 15 디옥시(deoxy)-△-12,14-PGJ2인 것이다.
본 발명은 HIV에 의해 인간의 세포의 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 설명한다. 이러한 방법은 HIV 감염을 예방하거나 치료하기 위해 중간섬유(IFs)의 파괴 및 특히 세포에 있어서 비멘틴 및/또는 케라틴-10의 파괴에 관련한다.
음성조절(negative regulation)은 연구대상(subject)의 숙주세포의 효과적인 감염을 방지하거나 억제하는 수단으로 주어진 연구대상(subject)의 HIV 숙주세포(host cells) 내에서 발생한다. 따라서, 본 발명은 유사하게 HIV를 가진 연구대상의 감염을 방지 및 치료하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명에서 설명된 방법을 사용하여 HIV 감염의 억제는 세포 수준에서 그리고 전체 유기체에 모두 적용된다. 용어 억제는 감염의 전체 또는 일부를 억제한다는 것을 의미한다.
본 발명은 HIV 복제를 억제하도록 중간섬유(IFs) 및 특히 비멘틴 및/또는 케라틴-10 세포골격 단백질의 조작을 설명한다. 이러한 전략은 단백질이 바이러스 보다는 오히려 내생적 세포 단백질(endogenous cellular proteins)이기 때문에 현재 사용할 수 있는 항레트로바이러스 약제(antiretroviral drugs)를 통해 최소의 또는 존재하지 않는 바이러스 저항의 장점을 제공한다.
본 발명의 약물의 행동(action) 메커니즘은 이미 설명 및 보여준 바와 같이 높은 억제 능력을 보여주는 그들에게 다른 경로를 통해 작동한다. 따라서 HIV 감염에 대한 현재 사용할 수 있는 약물과의 조합은 안티-HIV 치료의 효과를 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 치료 물질(agent)의 사용은 수정 내생 유전자를 베어링하는 줄기 세포의 이식으로 이미 기존에 제안된 신규한 치료 전략과 결합할 수 있다. 본 발명의 치료 양상은 현재 치료로 치료 환자들 사이에서 높은 비율로 대표하는 여러 약물 저항을 보여주는 환자를 위해 새로운 옵션을 제공한다.
독성에 이르는 IFs 구조의 가능한 손상 또는 세포 사망에도, 본 발명의 놀라운 주요성과는 세포 생존에 영향을 주지 않고 HIV 감염을 억제하는 것을 포함한다. 이 모든 HIV에 감염된 환자의 치료를 위해 더 많은 노벨티(novelty)을 추가할 수도 있다.
본 발명은 또한, 부정적인 변조, 수정, 또는 세포 골격 더 정확하게 세포골격 중간섬유를 형성하는 단백질의 파괴, 그리고 구체적으로 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10는 HIV 감염을 예방 또는 치료 또는 방지하기 위해 의약품을 생산하도록 물질(agent)의 용도를 포함한다. 이러한 물질(agent)은 펩티드 같은 화합물, 간섭 RNA 및 부정적인 변조를 생산하는 지질 화합물(lipidic compounds) 또는 세포골격, 중간섬유(IFs)을 수정하고, 그리고 특히 비멘틴 및/또는 케라틴-10을 부정적으로 변조시키는 그러한 물질(agents)을 포함한다.
비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10은 비멘틴 및/또는 케라틴-10을 부정적으로 변조하는 물질(agent)와 접촉하여 세포를 삽입하여 부정적으로 변조될 수 있다. 물질(agent)는 필요에 따라 세포 침투에 대한 역량을 높이기 위해 책정될 수 있다. 부정적인 변조는 연구대상(subject)의 세포에 비멘틴 및/또는 케라틴-10을 부정적으로 변조하는 물질(agent) 같이, 연구대상(subject)에 물질(agent)를 관리함으로써 달성될 수 있다. 이 물질(agent)은 이미 HIV에 감염되었거나 잠재적으로 감염 될 수 있는 연구대상의 세포와 접촉하는 방식으로 관리한다. 이러한 세포는 본 발명에서 HIV 숙주세포로 말한다. 물질(agent)의 관리는 숙주세포에 접촉에 들어가는 물질(agent)을 포함한다. 관리 경로는 비경구령로(parenteral route)를 포함하며, 물질(agent)이 연구대상(subject)의 점막(mucosae)을 통해 전달되는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 실시 예에 따른 양상은 숙주 세포가 CD4+ 세포인 것이다.
본 발명의 실시 예에서, 부정적인 변조 또는 수정은 비멘틴 및/또는 케라틴-10에 직접적인 영향에 의해, 유전자 또는 단백질 합성의 발현의 감소에 의해, 단백질에 의해 형성된 섬유(filaments)의 구조 수정에 의해, 섬유 구조 불안정 또는 그것의 활동/기능 감소에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 맥락 내에서, 부정적 변조 (또는 수정)은 세포에서 비멘틴 및/또는 케라틴-10 단백질 수준의 억제, 또는 수정, 불안정, 비조립 또는 세포 내에 이들의 단백질을 포함하는 중간섬유(IFs)의 구조를 해체를 포함한다.
중간섬유, 특히 비멘틴 및/또는 케라틴을 부정적으로 변조하거나 억제하는 것으로 알려진 어떠한 물질(agent)는 본 발명에서 설명한 방법에 따라 HIV 감염을 억제하는데 사용할 수 있다.
마찬가지로, HIV 감염은 또한 중간섬유, 특히 비멘틴 및/또는 케라틴-10을 부정적으로 변조하거나 억제하는 펩티드 또는 폴리펩티드 같은 물질(agent)을 이용하여 억제할 수 있다. 이러한 물질(agent)은 내생 단백질 또는 숙주세포 내에서 일반적으로 존재하지 않는 단백질을 포함한다. 그들은 예를 들어, 변이된 단백질, 유전적으로 변형된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라(chimeric) 단백질, 항체 조각, 인간화 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 수정 단백질 그 중 ??모든 조각이 될 수 있다.
본 발명에서, 중간섬유(IFs), 특히 비멘틴 및/또는 케라틴-10의 구조를 방해할 수 있는 펩티드의 사용은 강력하게 HIV와 MT4 세포의 감염을 억제하기 위해 발견되었고, MT4vim (s) 및 MT4K -10(s)에서 얻어진 결과로 입증된다. 이는 본 발명의 일환으로 HIV 감염을 예방하거나 치료하기 위해 이러한 펩티드의 사용을 지원한다.
본 발명의 양상에 따른 바람직한 실시 예에서, 펩티드는 SEQ ID No. 1 내지 SEQ ID No. 10으로 서열 목록에서 확인할 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 펩티드의 유사체유사체ues)의 사용을 포함한다. 펩티드가 다른 분자에 융합 할 수 있는데, 예를 들어, 침투 펩티드(penetrating peptide)에 융합할 수 있다.
본 발명에 따르면, HIV 예방 또는 치료를 위해 유용한 물질(agent)은 물질(agent)이 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 유전자의 발현을 억제할 수 있어야 하거나, 그것의 단백질 합성, 또는 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10을 포함하는 IFs의 구조를 억제할 수 있다. 본 발명에 따르면, 바람직한 물질(agent)은 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10을 침묵하게 하거나, 작은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 또는 마이크로 RNA (miRNA)와 같은 iRNA를 이용하여 전사(transcripts)하는 물질(agent)을 포함한다.
RNA 간섭은 mRNA 처리를 바인딩하고 억제하는 분자에 의해 특정 메신저 RNA (mRNA)를 파괴하는 선택적 전사 후 유전자 침묵 과정(selective posttranscriptional gene silencing process)의 유형을 의미한다. 예를 들어, mRNA의 해독을 억제하거나 저하될 수 있다. 본 발명의 맥락 내에서, iRNA는 제한하는 것은 아니지만 siRNA, shRNA, 내생 miRNA 및 인공 miRNA를 포함하는 간섭 RNA의 모든 종류를 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 siRNA는 비멘틴 및/또는 케라틴-10 유전자의 발현을 줄이거나 억제할 수 있는 RNA의 이중가닥(double strand)을 형성하는 핵산을 의미한다. siRNA 서열은 비멘틴 및/또는 케라틴-10 유전자의 전체 서열에 해당 할 수 있다. 일반적인 siRNA는 적어도 15 내지 50 긴 뉴클에오티드(nucleotides long), 우선적으로 19 내지 30 긴 뉴클에오티드(nucleotides long)이다. siRNA는 화학적으로 시험관내 전사(in vitro transcription)에 의해 생성, 합성될 수 있거나 특별히 생산하여 사용되는 세포 내에서 생산 될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 shRNA는 siRNA의 유형을 말한다. 이러한 shRNA는 예를 들어, 19 내지 25 뉴클에오티드(nucleotides) 및 19 내지 25 뉴클에오티드 및 상사전사가닥(analogous sense strand)의 루프에 의해 따르는 짧은 안티센스 가닥(antisense strand)으로 만들어진다. 그 대신에, 전사가닥(sense strand)은 다음과 같은 안티센스 가닥 및 뉴클에오티드 루프(nucleotide loop)에 선행한다. siRNA 및/또는 siRNA 종과 같은 shRNAs 기능은 하지만 그 shRNAs는 증가된 안정성을 위해 특정 헤어핀과 같은 구조를 보여준다는 점에서 다르다.
본 발명에서 사용된 다른 물질(agents)로써 이러한 shRNAs는 플라스미드(plasmids), 레트로바이러스(retroviruses) 및 렌키바이러스(lentiviruses)로 제공할 수 있으며, U6의 폴리머라세(polymerase) III 프로모터 또는 기타와 같은 프로모터에서 발현될 수 있다. 대상 세포에 방해 RNA 유형 물질(agents)에 대한 전달방법은 예를 들어, 물질(agent)를 포함하는 조성물의 주입, 또는 세포와 직접적으로 접촉에 들어가는 상기 조성물, 예를 들어 간섭 RNA를 포함하는 조성물과 접촉하여 들어가는 조혈세포(hematopoietic cell)가 있다.
또 다른 경우, 간섭 RNA 타입 물질(agent)은 예로 유체 주입(hydrodynamic injection) 또는 카테터법(catheterization)에 의해 정맥 또는 동맥 경로로 혈류에 직접 접종에 대한 경로로 직접적으로 주입될 수 있다. 어떤 경우에는 간섭 RNA 물질(agent)은 특정 기관(organs)에 체계적으로 전달될 수 있다. 콜로이드 분산 시스템(colloidal dispersion systems)은 물질(agents)의 생체 안정성이 증가할 전달 수단으로 사용할 수 있다.
물질(agents)은 예를 들어 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 또는 핵산 유사체(nucleic acid analogue)에 의해 사용된 것들과 유사한 메커니즘을 통해 비멘틴 및/또는 케라틴-10 유전자의 발현을 억제 할 수 있다. 그들은 예를 들어 펩타이드-핵산(PNA), 유사 보완 PNA (pseudo complementary PNA: pc-PNA)는 잠긴 핵산 (LNA) 및 파생상품을 포함한다. 전사 리프레서(repressors), 안티센스 분자, 리보자임(ribozymes), RNA, shRNA, siRNA, miRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 방해하는 것과 같이 작은 억제 핵산 서열 같이 활동하는 단백질에 대한 핵산 시퀀스 번호이다.
물질(agents)은 세포 또는 유기체에 투여되는 수준에서 일반적으로 존재하거나 존재하지 않은 개체의 모양과 유사할 수 있다. 이러한 화학 물질 등의 에이전트는, 작은 분자, 앱타머(aptamers)는 중간섬유 및 특히 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10을 부정적으로 변조하여 생성하고 식별할 수 있다. 본 발명의 맥락 내에서, 앱타머(aptamers)는 항체의 그것과 개념적으로 유사한 방식으로 대상 분자로의 바인딩을 촉진하도록 잘 정의된 삼방향(tridimensional) 구조를 보여주는 외가닥 핵산(single-stranded nucleic acids)이다.
앱타머(aptamers)는 높은 특이성과 친화, 화학적 안정성, 낮은 면역원성(immunogenicity) 및 단백질-단백질 상호작용을 공격할 수 있는 능력을 포함한 작은 분자와 항체 모두 최적의 속성을 결합한다. 물질(agents)은 직접적으로 관리기능을 할 수 있지만, 또한 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10의 부정적인 변조를 생성하도록 세포 내에서 사용되고 수정될 수 있다. 예를 들어, 핵산 및/또는 세포 내에 IFs의 단백질과 특히 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10 을 억제하는 단백질 또는 핵산의 생산에 있는 세포 및 세포 전사 결과에 핵산 시퀀스의 소개(introduction).
물질(agents)은 벡터를 포함 할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 몰로니설치류육종바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), HIV-1, 조류백혈병바이러스(avian leukosis virus) 등과 같은 레트로바이러스(retroviruses)에서 파생된 벡터 같은 표적 세포(target cells)의 게놈을 통합할 수 있거나, 사이토메가로바이러스(cytomegaloviruses), 아데노바이러스(adenoviruses) 등과 같은 바이러스로부터 파생된 플라스미드(plasmid), 벡터와 같은 에피솜유사(episomal)가 될 수 있다.
HIV 또는 고양이 백혈병 바이러스(Feline Leukemia Virus)를 토대로 한 벡터는 비-세포분열을 세포로 감염시키는데 사용할 수 있다. 다른 레트로바이러스 (retroviruses)를 결합하는 벡터가 사용될 수 있다.
바이러스 및 다양한 바이러스와 관련한 벡터는 기존의 상태로 설명된다. 이러한 벡터는 세포에 핵산 구성을 전송하는 운반체(carries)로 사용할 수 있다. 구조는 세포에 감염 또는 형질도입(transducer) 하도록 레트로바이러스 (retroviral)와 렌티바이러스(lentiviral) 벡터를 포함하여 아데노바이러스(adenoviruses; adeno-관련 바이러스, AAV), 헤르페스 바이러스(herpes simplex viruses) 또는 기타에 유사한 비-복제 바이러스 게놈(non-replicative viral genomes)에 통합할 수 있다. HIV 기반 벡터는 HIV 숙주세포에 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 예는 본 발명에 따른 물질(agent)을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 상기 조성물 내에 함유하고 본 발명에서 언급된 물질(agents)은 국한되지는 않지만 이미 잘 알려진 안티-HIV 약물 (예로, 지도부딘(zidovudine: AZT)와 같은 기타 치료제와 제휴하거나 서로 결합할 수 있다.
바람직한 실시 예로, IFs, 특히 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10의 부정적인 변조는 세포에 HIV의 감염을 줄이거나 예방하는 목적으로, HIV에 감염 될 수 있는 세포에 본 발명에서 적용하였다. 바람직한 실시 예에서, 인간의 세포는 CD4+ 세포이다. 전체 유기체, 인간이나 영장류에 대한 이러한 부정적인 변조와 같은 애플리케이션은 HIV 감염에 저항하여 유기체에 대한 효과적인 치료요법이 될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 예는 본 발명과 안티-HIV 약물에 따라 물질(agents)를 포함하는 약제학적 조합이다. 약제학적 조합에서 그것의 일부가 되는 물질(agents) 및 약물은 별도로 또는 순차적으로 동시에 관리 할 수 있다.
본 발명의 장점
바이러스 저항을 방지하거나 최소한으로 발생에 대한 확률을 줄일 수 있기 때문에 본 발명은 현재 사용 가능한 항레트로바이러스(antiretroviral) 약물보다 그 이상 장점이 있다. 이것은 중간섬유(IFs) 및 특히 비멘틴(vimentin) 및/또는 케라틴(keratin)-10의 바이러스 유래 보다는 세포 내생(cellular endogenous)에 기반을 두고 있다.
본 발명의 약물은 이미 종래 기술에서 설명된 것과 다른 메커니즘을 통해 높은 억제 용량에 영향을 미친다. 따라서 HIV 감염에 대한 구체적인 현재 사용 가능한 치료 약물과의 조합은 안티-HIV 치료의 효과를 향상시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 치료 물질(agents)의 사용은 이러한 내생 수정 유전자를 베어링하여 줄기세포 이식과 같이 종래기술의 상태에서 제안된 신규한 치료 대안과 결합 될 수 있다.
본 발명은 현재 사용 가능한 치료요법으로 치료된 환자들 사이에서 높은 퍼센트(percent)를 차지하는 다양한 약물에 대해 내성이 있는 환자에게 새로운 치료를 제공한다.
전달 방법
일단 책정되면, 본 발명의 제약 조성물은 (1) 관리대상(subject)에게 직접 투여 할 수 있다; (2) 관리대상(subject)에서 파생된 세포로, 탈체(ex vivo)를 전달; 또는 (3) 재조합 단백질의 발현에 대해 체외로 전달된다.
조성물(compositions)의 직접적인 전달은 일반적으로 주사(injection)로 수행될 수 있으며, 피하적으로(subcutaneously), 복강내로(intraperitoneally), 정맥내로(intravenously) 또는 근육조직내에(intramuscularly), 또는 조직의 간극공간(interstitial space)으로 전달된다. 조성물(compositions)은 또한 신경계로 관리 할 수 있다. 관리의 다른 방식은 국부(topical), 경구(oral), 좌약(suppositories), 그리고 경피성의 애플이케이션(transdermal applications), 바늘(needles), 그리고 입자총(particle guns) 또는 하이포스프레이(hyposprays)를 포함한다. 투여 치료(dosage treatment)는 단일 복용 일정 또는 다수 복용 일정으로 투여할 수 있다.
관리대상(subject)으로 탈체(ex vivo) 전달 및 형질전환세포(transformed cells)의 재착상(re-implantation)을 위한 방법은 본 발명이 속한 기술 분야에서 알려진 것으로, 예를 들면, 국제특허공개번호 WO 93/14778호에 개시되어 있다. 탈체(ex vivo) 애플리케이션에서 유용한 세포으 실시 예는 예를 들어, 줄기 세포, 특히 조혈(hematopoietic), 림프세포(lymph cells), 대식세포(macrophages), 수지상세포(dendritic cells), 또는 종양세포(tumor cells)를 포함한다.
일반적으로, 탈체(ex vivo) 및 인비트로(in vitro) 애플리케이션 모두를 위해 핵산의 전달은 예를 들어 본 발명이 속한 기술 분야에서 알려져 있는 DNA의 리포솜(liposomes) 및 직접적인 미세주입법(direct microinjection)으로 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)의 덱스트란-메디에이티드 트랜스펙션(dextran-mediated transfection), 인산 칼슘 침전(calcium phosphate precipitation), 폴리브렌-메디에이티드 드랜스펙션(polybrene mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 의 피포(encapsulation)에 의해 수행될 수 있다. 세포에 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)(예: siRNAs 등)를 도입하기 위한 방법은 본 발명이 속한 기술 분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 핵산을 도입하기 위한 방법은 인산 칼슘 침전(calcium phosphate precipitation), DEAE-덱스트란(dextran), 전기천공법(electroporation) 또는 리포솜 메디에이티드 트랜스펙션(liposome-mediated transfection)을 포함한다. 그 대신에, 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)의 직접적인 미세주입법(direct microinjection)가 사용된다. 바람직하게는 그러나, 핵산 시퀀스(nucleic acid sequence)는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터(viral vector)에 의해 세포에 도입된다. 상기 벡터는 바람직하게 레트로바이러스(retroviral), 아데노바이러스(adenoviral), 아데노와 제휴된 바이러스(adeno-associated viral: AAV), 또는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 포함한다.
다양한 방법은 직접적으로 몸의 특정 사이트에 치료 조성물(therapeutic composition)을 관리하는 데 사용된다. 특정 조직에 안티센스 폴리뉴클레오티드(antisense polynucleotide), 서브게놈 폴리뉴클레오티드(subgenomic polynucleotides), 또는 항체를 포함하는 치료 조성물의 수용체-메디케이티드 대상 전달(Receptor-mediated targeted delivery)도 사용된다. 수용체-메디케이티드 DNA 전달 기술(Receptor-mediated DNA delivery techniques)은 예를 들어, Findeis 외, Trends in Biotechnol. (1993) 11:202-205; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542-46에 개시되어 있다.
폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 포함하는 약제학적 조성물은 바람직하게는 유전자 치료 프로토콜의 국소적용(local administration)을 위한 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)의 약 100ng 내지 약 200mg의 범위에서 관리된다. 또한, 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)의 약 500ng 내지 약 50mg의 농도 범위, 약 1㎍ 내지 약 2mg, 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 및 약 20㎍ 내지 약 100㎍가 유전자 치료를 계획(gene therapy protocol)하는 동안 사용될 수 있다. 이러한 형질전환(transformation)과 발현의 행동과 효능의 방식 등과 같은 인자(factors)는 폴리뉴클레오티드의 궁극적인 효능을 위해 필요한 복용량에 영향을 미치는 것을 고려해야 할 사항이다. 더욱 많은 발현(expression)은 조직(tissue)의 많은 양, 폴리뉴클레오티드의 많은 양 또는 관리의 성공적인 치료계획에 있어서 다시 관리되는 동일한 양을 통해 요구되며, 또는 예를 들어, 신경 말단 또는 연구소결(synaps)의 다른 인접한 또는 가까운 조직부분에 몇 가지 관리는 긍정적인 치료 결과에 영향을 줄 수 있는 것이 요구될 것이다. 모든 경우에, 임상 시험에서 정규적인 실험은 최적의 치료 효과에 대한 구체적인 범위를 결정한다. 유전자 치료 벡터의 더 자세한 설명, 특히 레트로바이러스(retroviral) 벡터는 WO 98/00542에 포함되어 개시하고 있다.
실시 예
실시 예 1. MT4 안티 - HIV 활동을 보여주는 백혈구 추출물로 치료된 세포의 비교 단백질 체학( proteomics ).
MT4 세포주(cell line)는 안티-HIV의 활동을 보여주는 백혈구 추출물로 치료되었으며 (Fernandez-Ortega C; Dubed M; Ruibal I; Vilarrubia OL; Menendez JC; Navea L et al. 1996, Biotherapy 9: 33-40), 그 결과 단백질 발현 프로필은 치료되지 않은 세포의 표준과 비교되었다. 세포는 20분 동안에 12000rpm으로 용해(lysed) 및 원심분리(centrifuged) 하였다. 상층액(supernatant)은 수집되었고, 펠릿(pellet)은 두 번째 용해 절차를 받게 하였다. 동일한 조건 하에서 두 번째 원심 분리 단계 후, 두 번째 상층액(supernatant)은 추가로 에틸 알코올과 탈지화(delipidated) 및 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)와 알킬레이트화(alkylated)되는 첫 번째 상층액과 함께 수집되었다. 그 후, 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid: DNA)은 침전시켰고(precipitated) 시료 중 비드멘션널(bidimensional) 전기영동(electrophoresis)은 4°C에서 12.5 내지 3%의 트리스-트리신 폴리아크릴아미드 겔(Tris-Tricine polyacrylamide gel)를 사용하여 실시하였다.
분석 젤의 이미지는 멜라니 5 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 식별될 반점(spots)은 예비 젤에서 잘랐고, 추가로 트립신(trysin)과 소화되었다. 단백질 분해성 펩티드(proteolytic peptide)는 질량 분광법 분석을 위해 추출되었고, 질량 스펙트럼은 QTOF-2 직교 기하학과 하이브리드 질량 분석기를 사용하여 수득하였고, 나노스프레이(nanospray) 이온화 소스가 장착되었다.
ESI-MS/MS 스펙트럼이 분석되었고, 각각의 검색은 미국의 생명공학 정보를 위한 국립 센터의 비-다중복 단백질 시퀀스 데이터베이스에서, 그리고 독일의 유럽 분자 생물학 연구소 데이터베이스에서 단백질 식별을 위해 수행되었다. 세포골격(cytoskeletal) 단백질의 감소는 안티-HIV 백혈구 추출물로 치료된 샘플에서 발견되었고, 특히 중간섬유(비멘틴 및 케라틴-10)를 형성하는 것에서 발견되었다 (도 1).
실시 예 2. 비멘틴(vimentin)과 케라틴( keratin )-10에 대한 간섭 RNA 를 방해하는 것은 HIV 감염을 억제한다.
MT4 세포주는 각각 비멘틴과 케라틴 단백질의 발현을 침묵(silences)하는 RNA의 헤어핀을 암호화하는 순서를 갖는 pLenti-shRNAvim 또는 pLenti-shRNAK-10 렌티바이러스 벡터(lentiviral vectors)를 이용하여 형질 도입하였다. 이러한 렌티바이러스 벡터는 네 가지 플라스미드(plasmids)와 형질 도입된 293T 세포주에 포장하여 조립되었다. 상기 플라스미드(plasmids)는 pLP1, pLP2, pLP/VSVG 및 p-shRNA이였고, 비멘틴(vimentin) 또는 케라틴(keratin)-10 중 하나를 마지막으로 특정하였다. pLP1 벡터는 HIV-1의 갭(gap)/폴(pol) 서열의 유전자 제품에 대한 코드이다. 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 및 p-shRNA의 표면 단백질에 대한 pLP/VSVG 코드(codes)는 비멘틴(vimentin) 또는 케라틴(keratin)-10-특정 RNA 헤어핀에 대한 암호화하여 서열을 갖는 렌티바이러스(lentiviral) 벡터의 게놈을 포함한다 (Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T et al., 2004 Nucleic Acids Research 32: 936-948; Santa Cruz Biotechnology). 모든 플라스미드(plasmids)은 암피실린(ampicillin) 선택에 따라 대장균 XL-1 변형(Escherichia coli XL-1 strain)에서 증폭되었다. 네 가지 플라스미드 벡터는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정화된 형질주입(transfection)-품질이였고 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)의 존재에 세포주를 포장하였고 293T와 접촉으로 만들었다. 세포는 5% CO2 분위기(atmosphere) 에 따라 37°C에서 48시간 동안 잠복하였고, 바이러스(virions)는 또한 20000 x g에서 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 추가로 정화되었다.
일단 렌티바이러스 벡터를 정화하였고, MT4 세포는 형질 도입하었으며, 재조합체(recombinants)는 단백질합성억제제(blasticidin) 저항에 선택하였다. 재조합 클론은 제한 희석 분석에 의해 격리하였고 및 수확하기까지 37℃에서 95% 상대습도 및 5% CO2 분위기 하에 소태아혈청(FBS)과 10%로 보충된 RPMI 배지(medium)에 재배되었다. 총 단백질은 배양에서 추출하였고, 비멘틴이 침묵하는 것은 MT4vim (s) 세포뿐만 아니라 케라틴-10에 대해 침묵된 MT4K -10(s) 세포에서 케라틴-10에 대해서도 단백질흡입법(western blot)에 의해 입증되었다. 형질도입배양(Transduced cultures)는 각각 MT4 형질도입 되지 않은 제어(untransduced control) MT4에 비해 비멘틴(vimentin) 또는 케라틴(keratin)-10의 감소한 발현을 보여 주었다 (도 2).
안티-HIV 활동은 두 개의 대항량 시스템(challenge systems)에서 평가되었다:
시스템 A: 안정적 비멘틴 (MT4vim (s)) 또는 케라틴-10 (MT4K -10(s)) 단백질에 대한 안정적인 침묵 세포는 37℃에서 95% 상대습도 및 5% CO2 분위기 하에 10% FBS에서 보충된 RPMI 배지에 배양되었다. 총 바이러스와 함께 대항량(challenge)는 MT4vim (s)), 또는 MT4K -10(s) 및 MT4 세포 배양에서 실시되었다. 브루(Bru) 바이러스 변형은 0.01의 다중성(m.o.i.)에서 사용되었고, 그리고 복제는 ELISA의 방법으로 배양에 p24 항원농도(antigen concentration)를 결정하여 평가하였다. MT4vim (s) 및 MT4K-10(s) 세포는 이러한 단백질의 각각에 대해 침묵하지 않는 MT4 세포 배양에 비해 바이러스 복제의 약 90% 억제를 보여 주었다.
시스템 B: MT4vim (s)), MT4K -10(s) 및 MT4 세포 배양은 감염 및 항목 (pLGW)에 관련된 유전자를 부족하여, HIV-1 게놈(genome)의 부분을 베어링(bearing)하여 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)와 함께 대항량을 투여하였다. 이러한 벡터는 293T 세포주(cell line)에 네 가지 플라스미드(plasmids)의 제품을 포장하여 구성하였다. 상기 플라스미드(plasmids)는 pLP1, pLP2, pLP/VSVG 및 pLGFP 였고, GFP에 대해 마지막으로 코딩(coding)되었다. pLP1 플라스미드(plasmid)는 HIV-1gag/pol 시퀀스의 유전자 제품에 대한 코드이다. pLP2 플라스미드는 수포성 구내염바이러스(vesicular stomatitis virus)의 표면 단백질에 대한 HIV-1 Rev 단백질과 pLP/VSVG 코드의 유전적 서열을 맺는다. pLGFP 플라스미드는 GFP에 대해 코드화하고, 또한 패키징 서열을 베어링, HIV Rev-반응 요소 시퀀스(RRE) 그리고 또한 3'-삭제 HIV-1 긴말단반복순서(long terminal repeat: LTRs), 렌티바이러스 벡터 게놈(lentiviral vector genome)을 구성에 대해 암호화한다. GFP 발현은 엔트리(entry)한 후 그리고 통합될 때까지 바이러스 복제주기를 완료하여 표지로 뒤를 이었다. 결과는 형광 현미경(fluorescence microscopy)에 의해 수행되었고, MT4 세포 배양에 비해, 형광 세포의 수는 MT4vim (s)) 및 MT4K -10(s)에서 감소하였다(데이터 미 게재). 샘플(samples)은 침묵하지 않은 MT4 세포 배양에 비해 거의 70% 감소된 GFP 발현으로 인해 유동세포계수법(flow cytometry) 및 형광 세포의 수에 의해 분석되었다.
실시 예 3. MT4 세포의 중간섬유( intermediate filaments )의 구조의 변화
첫째, MT4vim (s)), MT4K -10(s) 및 MT4 세포는 4℃에서 1시간 동안 3.2%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 고정한 다음. 4℃에서 1시간 동안 2%의 4산화오스뮴(osmium tetroxide)에서 고정하였다. 이들은 이후 0.1 M 인산완충액(phosphate buffered saline; PBS), pH 7.2로 세척하였고, 4℃에서 10분 동안 증가하는 에탄올 농도(30, 50, 70 및 100%)에서 건조하였다.
봉입체(inclusion)이 수행되었으며, 40 내지 50nm의 초박절편(ultrathin sections)은 초박편제작기(ultramicrotome; NOVA, LKB)로 절편 하였으며, 초박절편은 400-오리피스 니켈 트레이(400-orifices nickel trays)에 배치하였다. 초박절편(ultrathin)의 컷은 트레이(trays)에 절편하여 배치된 후, 그들은 포화 아세트산 우라닐(saturated uranyl acetate) 및 리드 구연산염(lead citrate)과 대조되었고, 그리고 추가로 JEOL JEM 2000 EX (JEOL) 현미경으로 검사하였다. 다섯 개의 현미경 사진은 여러 배율(magnifications)로 분석하였다. MT4 세포의 무결(intact) 중간섬유(IFs)는 도 5a에서 나타낸 바와 같고, 한편 이러한 구조는 MT4vim (s)) 및 MT4K-10(s) 세포로 단축되어 표시하였다 (각각 도 5b 및 도 5c). 섹션 D는 MT4 세포에서 비멘틴(vimentin)의 구조를 분해하는 펩티드(SEQ ID No. 1으로 식별된 펩티드)의 활동에 의한 발생으로 중간섬유(IFs)에 효과를 보여준다. 바이러스 복제의 억제는 이러한 조건 하에서 관찰되었다. 비멘틴(vimentin) 또는 케라틴(keratin)-10 단백질은 면역관찰현미경(immunomicroscopy)으로 중간섬유(IFs)에서 확인되었다.
실시 예 4. MT4 세포에서 HIV 복제를 억제하는 합성 펩티드( synthetic peptides )
인간의 케라틴-10, 인간 케라틴 1 및 인간 비멘틴의 아미노산 시퀀스에 상응하는 펩티드(peptide)에 해당하는 합성되었다 (Goldman RD, Khuon S, Hao Chou Y, Opal P, Steinert PM 1996, J Cell Biol 134: 971-983; Steinert PM, Yang JM, Bale SJ, Compton JG 1993, BBRC 197: 840-848). 펩티드 중 하나는 그것의 C 말단(C terminus)에서 복합의 세포 관통 펩티드를 가진다 (Vallespi MG, Fernandez JR, Torrens I, Garcia I, Garay H, Mendoza O et al. 2009. J Peptide Science 16: 40-47). 상기 펩티드의 안티-HIV 활동은 기타 바이러스 변종의 존재: HXB1 (HIV-1 IIIB 클론) 및 브루(Bru)에서 총 바이러스 대항량 시스템을 이용하여 평가하였다. MT4 세포주는 바이러스 대항량을 투여하기 이전에 24시간 동안 펩티드를 배양하였다. 측정(assays)은 각 실험 변형에 대해 아홉 개의 레플리카(replicas)를 포함하여, 0.01 및 0.05의 다중성(m.o.i.) 값에서 수행되었다. p24 바이러스 항원의 값은 ELISA 타입 측정법을 사용하여 세포 배양에 결정되었고, 결과는 펩티드 농도에 비해 모두 바이러스 억제의 비율이나 감염의 비율로 발현하였다. 바이러스 복제의 중요한 억제는 배양이 높은 바이러스 농도 (SEQ ID No. 1, 도 6a) 및 0.01의 다중성(m.o.i.)(도 6b)에서 대항량으로 투여 시 모두 펩티드가 있는 데서 관찰되었다. 펩티드의 IC50은 미량원소(nanomolar) 범위에서 있었다.
실시 예 5. 말초혈 단핵세포( peripheral blood mononuclear cells )에 HIV 복제를 억제하는 합성 펩티드( synthetic peptides )
PBMCs는 세슘 염화물 피콜 밀도 기울기(cesium chloride Ficoll density gradients)에 의해 건강한 개인의 전체 혈액에서 분리하였다. 세포는 20% FBS, 100U/mL 인터루킨 2 (IL-2) 및 5㎍/mL 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin: PHA)에 보충된 RPMI 배지와 함께 2일 동안 사전에 자극하였다. 그 후, 세포는 96-well plates에 웰(well) 당 150,000 세포에서 PHA-프리(free) 배지 및 시디드(seeded)를 보관하였다. 24시간 후, 펩티드는 다른 농도에서 추가되었고, 배양(cultures)은 0.01의 다중성(m.o.i.)에서 HIV-1 Bru 변형(strain)에 감염되었다. 배양(cultures)은 3일 마다 추가된 펩티드(petides)와 변경되는 배지(medium)와 함께 7일 동안 유지하였다. 배양(cultures)은 수확되었고, 상청액(supernatants)이 p24 바이러스 단백질의 존재를 평가하기 위해 수집되었다. 펩티드는 복용량 의존적인 방식(dose-dependent manner)으로 HIV-1 복제를 억제하였다 (도 7). 미량원소 범위로 비슷한 IC50 결과는 HIV-1 BaL1 변형에 감염된 배양에서 얻게 되었다.
실시 예 6. 합성 펩티드( synthetic peptides )에 의한 HIV -2의 억제
PBMCs는 피콜 밀도 기울기(Ficoll density gradients)를 사용하여 건강한 개인의 전체 혈액에서 분리하였다. 세포는 20% FBS, 100U/mL 인터루킨 2 (IL-2) 및 5㎍/mL 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin: PHA)에 보충된 RPMI 배지와 함께 2일 동안 사전에 자극하였다. 그 후, 세포는 96-well plates에 웰(well) 당 150,000 세포에서 PHA-프리(free) 배지 및 시디드(seeded)를 보관하였다. 24시간 후, 펩티드는 다른 농도에서 추가되었고, 배양(cultures)은 CBL-20 HIV-2 변형(strain)에 감염되었다. 배양(cultures)은 3일 마다 추가된 펩티드(petides)와 변경되는 배지(medium)와 함께 7일 동안 유지하였다. 배양(cultures)은 수확되었고, 상청액(supernatants)이 p24 바이러스 단백질의 존재를 평가하기 위해 수집되었다. 펩티드는 복용량 의존적인 방식(dose-dependent manner)으로 HIV-2 복제를 억제 하였다 (도 8).
실시 예 7. SEQ ID No . 1, 4, 5, 7, 8, 및 9로 식별된 펩티드가 있는 곳에서 비멘틴( vimentin)의 감소
MT4 세포주는 24시간 동안 각 펩디드(peptide)의 50㎛에 배양하였다. 비멘틴(vimentin) 단백질은 웨스턴 흡입법(western blot)에 의해 발견되었다. 세포 추출물은 1%의 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate: SDS)에 재차 현탁(resuspended) 하였고, 10%의 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)에 적용하였고, 추가로 Hybond-P 셀룰로오스 막(cellulose membrane)에 전송되었다. 면역식별(immunoidentification)의 목적을 위해, 안티-비멘틴(vimentin) 및 안티-β 액틴(actin)(control과 같은) 항체가 사용되었다. 안티-마우스 IgG 항체-페르옥시다아제(peroxidase) 짝지음(conjugate)는 2차 항체로 사용되었다. 페르옥시다아제(peroxidase) 효소의 활동은 과산화수소와 PBS가 있는 데서 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 사용하여 시각화하였다. 비멘틴 단백질은 펩티드로 치료된 MT4 세포에서 감소하였다.
실시 예 8. SEQ ID No . 1 및 SEQ ID No . 3으로 식별된 펩티드의 세포 침투( cellular penetration )
헬라(HeLa) CD4+ 세포는 10% FBS에서 보충된 RPMI에 시이드(seeded)되었고, 및 단층(monolayer)의 60% 융합(confluence)에 도달할 때까지 배양하였다. MT4 세포는 10% FBS에서 RPMI 배지에 웰(well) 당 50,000 세포에 시이드(seeded)하였다. SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 3로 식별된 펩티드는 주입 물(injection water)에 재차 현탁(resuspended)하였고, 5, 10, 20, 및 40 ㎛ 농도에서 평가되었다. 펩티드는 5% CO2 분위기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 침투(penetration)는 15, 30 및 60분 후에 평가되었다. 각 평가를 마친 시간 후에, 세포는 수확되었고, 유동 세포 계수법(flow cytometry)에 의해 즉시 분석하였다. 세 가지 복제는 실험 변형될 때마다 분석하였다. 펩티드는 도 10에서 보여준 바와 같이 MT4 세포로 그들 자신에 의해 침투할 수 있었다.
실시 예 9. 비멘틴에 연결되고 HIV -1 복제를 억제하는 지질유도체( lipidic derivative )
프로스타글란딘 사이클로펜테인(prostaglandin cyclopentane) 15 디옥시(deoxy)-△-12,14-PGJ2 (15d-PGJ2)는 비멘틴(vimentin) 단백질에 연결되는 것은 잘 알려져 있다 (Stamatakis K, Sanchez-Gomez FJ, Perez-Sala D 2006, J Am Soc Nephrol 17: 89-98). 본 발명에 있어서, 15d-PGJ2는 체외(in vitro)에서 HIV 복제를 억제하는 것이 증명되었다. 바이러스 활동 분석은 HIV-1 (브루(Bru) 변형)에 투여된(challenged) MT4 세포에서 수행되었다. 세포는 15d-PGJ2의 다른 농도에서 배양(incubated)하였고, 그리고 추가로 0.01의 다중성(m.o.i.)에서 HIV-1과 함께 투여 (challenged)되었다. 5일 잠복기(incubation period) 후, 세포 배양은 수확되었으며 p24 단백질은 상청액(supernatants)으로 평가되었다.
실시 예 10. HIV -1에 감염된 환자의 PBMC ㎛s에 합성 펩티드 및 15d- PGJ2 의 효과
PBMCs는 피콜(Ficoll) 밀도 기울기에 의해 HIV-1에 감염된 개인의 전체 혈액에서 분리하였다. 세포는 펩티드와 함께 사전에 자극하였고 처리되었고, 비슷하게 실시 예 5에서 설명된 바와 같이, 또는 15d-PGJ2의 5㎛와 함께 치료되었다. 복제는 ELISA 방법으로 배양 상층액(supernatants)에서 p24 항원 농도를 결정하는 것을 평가하였다. p24 값은 크게 치료되지 않은 세포에 비해 펩티드 또는 지질 유도체(lipidic derivative)와 함께 치료된 PBMCs에서 감소하였다 (표 1). 이것은 이들의 화합물과의 치료로 인한 HIV-1 복제의 억제를 나타내었다.
하기 표 1은 펩티드 또는 15d- PGJ2 와 탈체(ex vivo)를 치료되었던 감염된 개인의 PBMCs 에서 HIV -1 억제 비율이다.
화합물 HIV -1 억제 비율(%)
펩티드(Peptide) 1 (SEQ ID No. 1) 89.3
펩티드(Peptide) 2 (SEQ ID No. 2) 81.1
펩티드(Peptide) 3 (SEQ ID No. 3) 85.3
펩티드(Peptide) 4 (SEQ ID No. 4) 84.9
펩티드(Peptide) 5 (SEQ ID No. 5) 82.1
펩티드(Peptide)6 (SEQ ID No. 6) 80.5
펩티드(Peptide)7 (SEQ ID No. 7) 83.7
펩티드(Peptide)8 (SEQ ID No. 8) 86.7
펩티드(Peptide)9 (SEQ ID No. 9) 81.3
펩티드(Peptide)10 (SEQ ID No. 10) 83.4
15d-PGJ2 80.1
중간섬유(IFs) 구조는 실시 예 3에서 설명된 방법론에 따라, 투과 전자현미경(transmission electron microscopy)으로 분석하였다. 이것은 중간섬유(IFs)는 치료되μ지 않은 세포에 비해 펩티드 또는 지질 유도체(lipidic derivative)와 함께 치료되었던 감염된 개인으로부터 그들의 PBMCs에서 매우 짧다는 것을 보여준다.
실시 예 11. 비멘틴(vimentin)과 케라틴( keratin )-10에 대한 RNA 를 방해하는 것은 감염된 개인의 PBMCs 에서 HIV 를 억제한다.
PBMCs는 피콜(Ficoll) 밀도 기울기에 의해 HIV-1에 감염된 개인의 전체 혈액에서 분리하였다. 세포는 20% FBS, 100 U/mL IL-2 및 5㎍/mL PHA 에서 RPMI 배지를 2일 동안 사전에 자극하였다. 그 후, 그들은 PHA가 없는 배지로 유지하였고, 추가로 각각 비멘틴 및 케라틴-10 단백질을 침묵하도록 RNA 헤어핀에 대해 코딩하여 서열을 가지는 렌티바이러스 벡터 pLenti-shRNAvim 또는 pLenti-shRNAK -10을 형질 도입하였다. 벡터(Vectors)는 실시 예2에서 설명한 바와 같이 얻었다. 복제는 ELISA 방법으로 배양 상청액(supernatants)에서 p24 항원의 농도를 결정하는 것에 의해 평가하였다. 비멘틴이나 케라틴-10 단백질에 대해 침묵된 PBMCs는 이러한 단백질의 각각에 대해 침묵하지 않는 배양에 비해 바이러스 복제의 높은 억제를 보여 주었다 (표 2).
하기 표 2는 비멘틴 ( vimentin ) 또는 케라틴( keratin )-10에 대한 특정 shRNA 와 형질 도입되어 감염된 개인으로부터 PBMCs 에서 HIV -1 억제의 비율( percent )이다.
감염된 개인으로부터의 PBMCs 억제의 비율
pLenti-shRNAvim 와 형질도입 된 PBMCs 89.5
pLenti-shRNAK -10 와 형질도입 된 PBMCs 75.6
중간섬유(IFs) 구조는 실시 예 3에서 설명된 방법론에 따라, 투과 전자현미경(transmission electron microscopy)으로 분석하였다. 이것은 중간섬유(IFs) 구조가 형질 도입되지 않은 세포에 비해 렌티바이러스 벡터(lentiviral vectors)와 형질 도입되어 감염된 개인으로부터 그것들의 PBMCs에 더 단축되었다는 것을 보여준다.
실시 예 12. SEQ ID No . 1과 2로 식별된 펩티드를 포함하는 제제와 HIV -1 감염된 환자의 치료
350 cells/mm3보다 높은 CD4+ T세포의 진단 및 값(value)은 1년 미만을 갖는 여덟 명의 HIV-1 혈청 반응 양성의(seropositive) 환자가 SEQ ID No. 1으로 식별된 펩티드를 포함하는 제제 또는 SEQ ID No. 2로 식별된 펩티드를 포함하는 제제로 치료하였다. 펩티드는 하루에 150mg을 투여하고, 환자들은 바이러스 부하와 CD4+ T세포 수에 참석 6 개월까지 추적 당하고 + T 세포 수를 처리하여 6개월 동안 추적하였다. 바이러스 부하는 치료 후 환자 중 2명에게서 감지되지 않았고, 다른 여섯 환자에게서 1.5 로그(log) 이상 감소하였다. 다른 한편으로는, 일곱 환자는 CD4+ T세포 수가 다른 환자에게서 감소되는 동안 50 cells/mm3 이상의 CD4+ T세포에서 증가를 등록하였다.
중간섬유(IFs) 구조는 SEQ ID No. 1으로 식별된 펩티드로 치료된 환자 중 2명 및 SEQ ID No. 2로 식별된 치료된 환자 중 3명에게 실시 예3에서 설명된 방법론에 따라 투과 전자현미경(transmission electron microscopy)으로 분석되었다. 중간섬유(IFs)는 모든 경우에 단축되는 것으로 나타났다.
<110> Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia <120> METHOD FOR INHIBITING HIV REPLICATION IN MAMMAL AND HUMAN CELLS <130> Method for HIV inhibition <150> CU 2010/0056 <151> 2010-04-01 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Val Thr Gln Met Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Leu Tyr Asp 1 5 10 15 Lys Val <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Met Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp 1 5 10 15 Lys Val Arg Phe 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Leu Asn Asp Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu 1 5 10 15 Glu Gln Gln Asn 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys 1 5 10 15 Ile Leu Leu Ala 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys Ile Leu Leu Ala Glu 1 5 10 15 Leu Glu Gln Leu 20 <210> 7 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp 1 5 10 15 Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu 20 25 30 Glu Gln Leu 35 <210> 8 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Val Thr Gln Met Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Leu Tyr Asp 1 5 10 15 Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Ser Asn Tyr Glu Leu Glu Gly Lys Ile 20 25 30 Lys Glu Trp 35 <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Val Thr Gln Met Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Leu Tyr Asp 1 5 10 15 Lys Val His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys 20 25 30 Tyr Lys Gly Lys Phe Trp 35 <210> 10 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Arg Leu Leu Cys Asp Tyr His Glu Leu Met Asn Thr Lys Leu Ala 1 5 10 15 Leu Asp Met Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Glu Gly Glu Glu 20 25 30 Ser Arg Met 35 <210> 11 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly 1 5 10 15 Gly Pro Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr 20 25 30 Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ala Leu Arg Pro Ser Thr 35 40 45 Ser Arg Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Pro Gly Gly Val Tyr Ala Thr Arg 50 55 60 Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Leu Leu 65 70 75 80 Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe 85 90 95 Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp 100 105 110 Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn 115 120 125 Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser 130 135 140 Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln 145 150 155 160 Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp 165 170 175 Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu 180 185 190 Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln 195 200 205 Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val 210 215 220 Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile 245 250 255 Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val 260 265 270 Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu 275 280 285 Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg 290 295 300 Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg 305 310 315 320 Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr 325 330 335 Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala 340 345 350 Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu 355 360 365 Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln 370 375 380 Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr 385 390 395 400 Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro 405 410 415 Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser Leu Pro 420 425 430 Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu 435 440 445 Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp 450 455 460 Leu Glu 465 <210> 12 <211> 568 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ser Val Arg Tyr Ser Ser Ser Lys Gln Tyr Ser Ser Ser Arg Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Phe Arg Ile Ser Ser 20 25 30 Ser Lys Gly Ser Ile Gly Gly Gly Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Gly 35 40 45 Gly Ser Phe Ser Arg Gly Ser Ser Gly Gly Gly Cys Phe Gly Gly Ser 50 55 60 Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asn Phe 65 70 75 80 Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Phe Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Val 85 90 95 Ser Phe Gly Gly Gly Ser Phe Gly Gly Gly Ser Phe Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Phe Ser Gly Gly Ser Phe Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Asp 115 120 125 Gly Gly Leu Leu Ser Gly Asn Glu Lys Val Thr Met Gln Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Ser 145 150 155 160 Asn Tyr Glu Leu Glu Gly Lys Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Lys His Gly 165 170 175 Asn Ser Ser Gln Arg Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Lys Tyr Tyr Gln Thr 180 185 190 Ile Glu Asp Leu Lys Asn Gln Ile Leu Asn Leu Thr Thr Asp Asn Ala 195 200 205 Asn Ile Leu Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe 210 215 220 Arg Leu Lys Tyr Glu Asn Glu Val Ala Leu Arg Gln Ser Val Glu Ala 225 230 235 240 Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg Val Leu Asp Glu Leu Thr Leu Thr Lys 245 250 255 Ala Asp Leu Glu Met Gln Ile Glu Ser Leu Thr Glu Glu Leu Ala Tyr 260 265 270 Leu Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Met Arg Asp Leu Gln Asn Val Ser 275 280 285 Thr Gly Asp Val Asn Val Glu Met Asn Ala Ala Pro Gly Val Asp Leu 290 295 300 Thr Glu Leu Leu Asn Asn Met Arg Asn Gln Tyr Glu Gln Leu Ala Glu 305 310 315 320 Gln Asn Arg Lys Asp Ala Glu Ala Trp Phe Asn Glu Lys Ser Lys Glu 325 330 335 Leu Thr Thr Glu Ile Asn Ser Asn Ile Glu Gln Met Ser Ser His Lys 340 345 350 Ser Glu Ile Thr Glu Leu Arg Arg Thr Val Gln Gly Leu Glu Ile Glu 355 360 365 Leu Gln Ser Gln Leu Ala Leu Lys Gln Ser Leu Glu Gly Ser Leu Ala 370 375 380 Glu Thr Glu Gly Arg Tyr Cys Val Gln Leu Ser Gln Ile Gln Ala Gln 385 390 395 400 Ile Ser Ser Leu Glu Glu Gln Leu Gln Gln Ile Arg Ala Glu Thr Glu 405 410 415 Cys Gln Asn Ala Glu Tyr Gln Gln Leu Leu Asp Ile Lys Ile Arg Leu 420 425 430 Glu Asn Glu Ile Gln Thr Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Gly Ser 435 440 445 Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ser Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Gly 465 470 475 480 Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Gly 485 490 495 Gly His Ser Gly Gly His Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Gly 500 505 510 Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 515 520 525 Gly Gly Ser His Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ser 530 535 540 Ser Ser Ser Gly Gly His Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Val Gly Glu 545 550 555 560 Ser Ser Ser Lys Gly Pro Arg Tyr 565

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  22. 중간섬유를 방해하는 물질과 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 첨가제를 포함하는 HIV 감염을 예방하거나 치료하는 약학 조성물에 있어서,
    상기 중간섬유를 방해하는 물질은 (ⅰ) 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 및 (ⅱ) 상기 펩티드 중 어느 하나와 최소 85%의 서열 상동성을 나타내고, 세포내에서 중간섬유를 방해하는 활성을 갖는 펩티드 유사체(homologues)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩티드인 것을 특징으로 하는 HIV 감염을 예방하거나 치료하는 약학 조성물.
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  29. 중간섬유를 방해하는 물질과 안티-HIV 약물을 포함하는, HIV 감염을 예방하거나 치료하는 약학 조성물에 있어서,
    상기 중간섬유를 방해하는 물질은 (ⅰ) 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 및 (ⅱ) 상기 펩티드 중 어느 하나와 최소 85%의 서열 상동성을 나타내고, 세포내에서 중간섬유를 방해하는 활성을 갖는 펩티드 유사체(homologues)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩티드인 것을 특징으로 하는 HIV 감염을 예방하거나 치료하는 약학 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 중간섬유를 방해하는 물질 및 상기 안티-HIV 약물은 동일한 치료 일정의 일환으로, 개별적으로, 또는 순차적으로 동시에 관리하는 것을 특징으로 하는 HIV 감염을 예방하거나 치료하는 약학 조성물.
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