CN102884075A - 用于抑制在哺乳动物细胞中和在人中的hiv复制的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于通过负调节或扰乱细胞骨架，特别是构成细胞骨架的中间丝的一部分的蛋白质，更特别地波形蛋白和/或角蛋白-10，来抑制人免疫缺陷病毒（HIV）复制的方法。对于这些蛋白质的结构的干扰造成在人细胞中所述病毒的复制的抑制。本发明还涉及试剂用于预防或治疗HIV感染的用途，所述试剂包括肽和/或干扰RNA和/或脂质化合物，并且引起细胞的细胞骨架的负调节或扰乱。本发明提供了用于扰乱细胞的细胞骨架/纤丝的结构的工具和方法，这干扰HIV对于人细胞的感染并且甚至可以完全抑制之。细胞骨架通过下列方式而被扰乱：通过减少波形蛋白和/或角蛋白-10的量（例如，通过使用干扰RNA来进行的转录控制）或者经由使用扰乱细胞骨架的肽。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，更具体而言涉及针对感染（尤其是针对人免疫缺陷病毒（HIV）感染）的疗法。本发明描述了用于通过扰乱细胞的细胞骨架，特别是构成细胞骨架的中间丝的一部分的蛋白质，来抑制HIV复制的方法。本发明还涉及负调节或扰乱细胞的细胞骨架的试剂在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途。
现有技术
HIV大流行病/获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的出现是最近30年中记录的最重要的世界性卫生事件之一，并由此导致能够阻止感染进展和降低死亡率的抗逆转录病毒治疗的开发（De Cock K,Crowley SP,Lo YR,Granich RM,Williams BG.Boletín de la OrganizaciónMundial de la Salud 2009;87:488-488）。
2008年的UNAIDS报告估计，有3300万人被HIV感染，其中270万是当年出现的新病例。据计算，67%的感染属于撒哈拉沙漠以南非洲地区（Report on the global AIDS epidemic 2008.Geneva,UNAIDS）。根据2009年世界卫生组织发布的公报，提出在世界范围内存在两个大的趋势。一方面，撒哈拉沙漠以南非洲地区的全部人口普遍患病；和另一方面，在世界其余地区，感染集中在特殊风险群体中（De Cock K,Crowley SP,Lo YR,Granich RM,Williams BG 2009.Boletín de laOrganizaci ón Mundial de la Salud 87:488-489）。
HIV感染的年发生率在九十年代中期达到最大值（Bongaarts J,Buettner T,Heilig G,Pelletier F.Popul Dev Rev 2008;34:199-224）。然而，由于持续高的发生率和人口增长的速度，被该病毒感染的人员的绝对数目在非洲继续增加（De Cock K,Crowley SP,LoYR,Granich RM,Williams BG 2009.Boletín de la OrganizaciónMundial de la Salud 87:488-489）。
对于目前可得的抗-HIV药物的HIV抗性的出现以及对治疗的差的坚持仍然是该疗法失败的主要原因。自开始采用用抗逆转录病毒药的单一疗法起，就观察到了病毒抗性，这导致出现采用两种或更多种通常具有不同作用方式的抗-HIV试剂的组合疗法。随着高活性抗逆转录病毒疗法（HAART）的引入，实现了在经治疗的患者中发病率和死亡率的显著下降。该疗法组合了核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。然而，该多药物疗法并未彻底去除HIV，并且长期的治疗通常导致对于各种药物的抗性。一半接受抗-HIV组合疗法的患者对于该治疗并不完全地应答，这主要是由于对于所使用的一种或多种药物的病毒抗性。在近期被感染的个体中也观察到了病毒抗性，这大大地限制了用于那些患者的疗法的选择。
组合疗法的成功导致考虑根除该病毒的可能性，然而，知道在潜在被感染的细胞中和还有在其中该病毒不顾该疗法而持续存在的组织中存在有病毒储库。据估计，需要超过70年的连续治疗来根除病毒储库，这是不可能的，因为该疗法牵涉许多继发效应，和偶尔地，致命的代谢并发症例如乳酸酸中毒、糖尿病、脂肪营养不良、胰腺炎等（Iglesias E 2009.Biotecnología Aplicada 26:189-194）。
对治疗的坚持是关于高活性抗逆转录病毒疗法（特别是关于蛋白酶抑制剂）的最具争论性的话题之一，这是由于如果不规律地服用药物或中断其施用而可能出现抗性的快速性。影响对治疗的不坚持的因素是各种各样的，其中包括对于药物不耐受、施用制度不方便、治疗失败、药物的相互作用、社会经济问题，等等。
组合疗法延缓了AIDS的进展，然而并没有治愈被感染的患者（Marsden MD,Zack JA 2009.J Antimicrob Chemoth 63:7-10）。虽然该疗法已实现将HIV感染转变为慢性问题，而不再是死亡问题，并且患者的寿命预期与普通人群的类似，但仍存在着严重的问题，由此必不可少的是寻求用于减少抗逆转录病毒药的使用的策略，和因此通过获得新的治疗变化方案而带来的益处。
可得的抗逆转录病毒疗法的缺点支持了对于在其作用的机制和/或靶标方面不同的新的抗逆转录病毒药物的需要。本发明的一个目标是提供用于抑制HIV复制和/或感染的方法。本发明的另外一个目标是提供用于抑制HIV复制和/或感染的方法，其具有与抑制HIV的聚合酶或抑制HIV的蛋白酶不同的机制。本发明的另一目标是提供用于以宿主细胞而非病毒作为靶标来抑制HIV复制和/或感染的方法。具体而言，本发明的目标是使用宿主细胞的细胞骨架，更特别地中间丝（IF）作为靶标。特别地，本发明的另一目标是使用宿主的波形蛋白和/或角蛋白-10作为靶标。通过使用宿主细胞作为靶标，据信对于HIV来说应当更难以产生逃逸突变体。波形蛋白和角蛋白-10对于IF的结构是重要的，并且本发明证明它们是用于抑制HIV的重要靶标。本发明的另一目标是提供扰乱细胞的IF或减少宿主细胞的波形蛋白和/或角蛋白-10的量的试剂和药物组合物。
通过本发明实现了至少一个上面提及的目标。
发明概述
本发明涉及细胞骨架的扰乱，其作为用于抑制HIV复制和/或感染的方法。细胞骨架是有助于细胞的完整性并实现不同的细胞功能的三维网状物。其由三种类型的结构形成：微管、微丝和中间丝（IF）。中间丝（IF）由一系列对于每种细胞类型特异的蛋白质形成，其中包括波形蛋白和角蛋白-10。
波形蛋白是分子量（MW）为58kDa的蛋白质，其形成所谓的IF并且通常在血管内皮细胞中、在一些上皮细胞中和在间充质细胞中表达（Alberts B,Johnson A,Lewis J,Raff M,Roberts K,WalterP 2002.Molecular Biology of the Cell,第4版,GarlandPublishing,New York）。已知波形蛋白是HIV的蛋白酶（PR）的底物，并且已提出PR对于该蛋白质和对于其他组成成分的作用可以影响细胞骨架的结构（Blanco R,Carrasco L,Ventoso I 2003.J BiolChem 278:1086-1093)。还已证明，通过波形蛋白的蛋白水解切割而获得的N-末端肽能够改造细胞核的构造，这正是在被HIV感染的细胞中所看到的现象（Shoeman RL,Hüttermann C,Hartig R,Traub P 2001.Mol Biol Cell 12:143-154）。先前的证据暗示，HIV在其生活周期中需要对波形蛋白进行分割。
角蛋白是一组MW范围为10-68kDa的IF蛋白质（具有大约30个成员）。已基于其MW和其电泳行为将它们分类和编号为：酸性的（pKi=4-6；I型）和中性-碱性的（pKi=6-8；II型）。角蛋白-10是大约60kDa的I型角蛋白，其主要存在于完全分化的表皮细胞的IF中（Zhou XM 1988.J Biol Chem 263:15584-9）。
本发明描述了用于抑制在哺乳动物细胞中的HIV复制和/或感染的方法，这通过调节或扰乱所述哺乳动物细胞中细胞骨架的IF的结构来进行。此外，本发明还旨在扰乱细胞骨架的IF以预防或治疗HIV感染的试剂。
在第一个方面中，本发明提供了用于抑制在哺乳动物细胞中的HIV复制的方法，所述方法包括扰乱或负调节哺乳动物细胞中细胞骨架的IF的结构。特别地，所述哺乳动物细胞是HIV感染的靶细胞。
在所述方法的一个优选的实施方案中，所述IF包含波形蛋白和/或角蛋白-10。
在所述方法的另一个优选的实施方案中，所述方法包括降低IF的波形蛋白和/或角蛋白-10的量以扰乱或负调节细胞骨架的IF（结构）和/或降低用于形成新的IF的游离波形蛋白和/或角蛋白-10的量。
在所述方法的另一个优选的实施方案中，所述方法包括降低（或抑制）编码波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的表达，以扰乱或负调节细胞骨架的IF。
在所述方法的另一个优选的实施方案中，IF的扰乱通过向所述哺乳动物细胞施用治疗有效剂量的选自多肽、肽、核酸和化学化合物的试剂来实现。在一个优选的实施方案中，所述试剂为肽，该肽选自标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽以及其同源物。在另一个优选的实施方案中，所述试剂为针对波形蛋白和/或角蛋白-10的基因或其转录物的干扰RNA或反义寡核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述试剂为化学化合物或脂质衍生物。
在另一个方面中，本发明提供了扰乱或负调节细胞骨架的IF以预防或治疗HIV感染的试剂。在所述方面的一个优选的实施方案中，所述IF包含波形蛋白和/或角蛋白-10。
在根据本发明的试剂的另一个优选的实施方案中，所述试剂诱导所述I F中波形蛋白和/或角蛋白-10的量的降低。在此类试剂的另一个优选的实施方案中，所述试剂降低编码波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的表达。
在根据本发明的试剂的另一个优选的实施方案中，所述试剂选自多肽、肽、核酸和化学化合物。
在根据本发明的试剂的另一个优选的实施方案中，所述试剂包括肽，该肽选自标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽以及其同源物。
在根据本发明的试剂的另一个优选的实施方案中，所述试剂为针对波形蛋白和/或角蛋白-10的基因或其转录物的干扰RNA或反义寡核苷酸。
在根据本发明的试剂的另一个优选的实施方案中，所述试剂为选自siRNA、shRNA和miRNA的干扰RNA。优选地，所述干扰RNA包含与波形蛋白和/或角蛋白-10的信使RNA的区域互补的15至50个核苷酸，优选地18至25个核苷酸的序列。
在根据本发明的试剂的另一个优选的实施方案中，所述试剂为化学化合物，并且所述化合物为脂质化合物或脂质衍生物。优选地，所述脂质化合物为环戊烷前列腺素15-脱氧-Δ-12,14-PGJ2（15d-PGJ2）。
在另一个方面中，本发明提供了用于预防或治疗HIV感染的药物组合物，其包含如上面所描述的根据本发明的扰乱或负调节细胞骨架的IF的试剂，和药学上合适的赋形剂。
在根据本发明的组合物的一个优选的实施方案中，所述试剂选自多肽、肽、核酸和化学化合物，其扰乱由波形蛋白和/或角蛋白-10构成的IF。
在根据本发明的组合物的一个优选的实施方案中，所述试剂为肽，该肽选自标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽以及其同源物。
优选地，所述试剂为针对波形蛋白和/或角蛋白-10的基因或其转录物的干扰RNA或反义寡核苷酸。
在根据本发明的试剂的一个更优选的实施方案中，所述试剂用于在治疗或预防HIV感染中使用，或者用于其在制备用于治疗或预防HIV感染的药物中的使用。HIV感染的治疗或预防包括抑制或阻断病毒的复制。
在所述药物组合物的一个优选的实施方案中，所述干扰RNA选自siRNA、shRNA或miRNA。
在所述药物组合物的一个优选的实施方案中，所述化学化合物为脂质化合物或脂质衍生物。优选地，所述脂质化合物为环戊烷前列腺素15-脱氧-Δ-12,14-PGJ2。
在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含与在本发明中所描述的那种相符的扰乱细胞骨架的IF的试剂以及至少一种抗-HIV药物。用于在本发明的各方面中使用的抗-HIV药物的实例包括，H IV的蛋白酶的抑制剂，更优选地，选自下列的蛋白酶抑制剂：阿扎那韦（ReyatazTM），安普那韦（AgeneraseTM），达芦那韦（PrezistaTM），奈非那韦（ViraceptTM），沙奎那韦（InviraseTM或FortovaseTM），茚地那韦（CrixivanTM），呋山那韦（LexivaTM或TelzirTM），洛匹那韦（AluviaTM），利托那韦（NorvirTM），替拉那韦（AptivusTM），这些药物的功能性衍生物，以及其组合例如：洛匹那韦+利托那韦（KaletraTM）。可以用于本发明的其他抗逆转录病毒药物为非核苷逆转录酶抑制剂（NNRTI），例如：依法韦仑（StocrinTM）和奈韦拉平（ViramuneTM），依曲韦林（IntelenceTM），利匹韦林（TMC-278），洛韦胺（R89439），地拉韦啶（RescriptorTM），这些药物的功能性衍生物，以及其组合。可以在本发明的各方面中使用的其他抗逆转录病毒药物为核苷逆转录酶抑制剂（NRTI）或者核苷类似物逆转录酶抑制剂（NARTI），例如：拉米夫定（3TC或EpivirTM），阿巴卡韦（ZiagenTM），齐多夫定（AZT或Retrovir AZTTM），司他夫定（d4T或ZeritTM），扎西他滨（ddC或HividTM），去羟肌苷（ddl或VidexTM），恩曲他滨（FTC或EmtrivaTM），替诺福韦（VireadTM），阿立他滨（apricitabine）（AVX754），stampidine，艾夫西他滨（L-Fd4C），racivir，氨多索韦，这些药物的功能性衍生物，以及其组合例如：恩曲他滨+替诺福韦（TruvadaTM）、齐多夫定+拉米夫定（CombivirTM）和阿巴卡韦+拉米夫定+齐多夫定（TrizivirTM）。
除了上面提及的抗逆转录病毒药物之外，本发明的药物组合还可以包含上面列举的不同类别的抗逆转录病毒药物的组合，例如下列组合：依法韦仑+齐多夫定+拉米夫定，依法韦仑+替诺福韦+恩曲他滨，用利托那韦加强的洛匹那韦+齐多夫定+拉米夫定，和用利托那韦加强的洛匹那韦+替诺福韦+恩曲他滨。
在根据本发明的药物组合的一个优选的实施方案中，所述试剂和所述药物，作为按剂量给药制度的一部分，同时地、分开地或顺次地进行施用。
在另一个方面中，本发明提供了用于在有此需要的个体中治疗或预防HIV感染的方法，其包括向所述个体施用治疗有效剂量的根据权利要求20-26的药物组合物或者根据权利要求27-28的药物组合。
附图简述
图1.通过比较蛋白质组学而鉴定出的人波形蛋白和角蛋白-10的相对强度。图版A显示了在用具有抗-HIV活性的提取物进行处理的培养物中波形蛋白的减少。图版B显示了在用具有抗-HIV活性的提取物进行处理的培养物中角蛋白-10的减少。误差条表示标准偏差。
图2.在关于每一个这些蛋白质的经稳定地沉默的培养物中波形蛋白和角蛋白-10的检测。通过在MT4、MT4vim(s)和MT4K-10(s)细胞系中的Western印迹来进行波形蛋白（A）和角蛋白-10（B）的评价。经沉默的培养物显示出所述蛋白质的表达相对于MT4的培养物而言降低。β-肌动蛋白用于使Western印迹标准化。每种变化形式占据两个泳道。在该图中，K-10是角蛋白-10的缩写。
图3.通过抗原p24进行评价的在MT4vim(s)中和在MT4K-10(s)中HIV-1复制的抑制。以0.01的感染复数（moi），用HIV-1的Bru株攻击MT4、MT4vim(s)和MT4K-10(s)细胞的培养物。在MT4vim(s)和MT4K-10(s)细胞中，抑制了超过90%的病毒复制。误差条表示标准偏差。
图4.在MT4、MT4vim(s)和MT4K-10(s)中用慢病毒载体pLGW进行的攻击测试。用模拟在进入后的HIV-1复制循环的初始阶段并且携带编码GFP的报道基因的慢病毒载体转导细胞培养物。（A）相对于MT4细胞的培养物而言，当用慢病毒进行转导时，MT4vim(s)和MT4K-10(s)的培养物显示出荧光细胞的百分比的降低。误差条表示标准偏差。（B）从通过流式细胞术来进行的培养物分析获得的直方图。
图5.在MT-4的培养物中IF的结构分析。通过透射电子显微术来分析MT4、MT4vim(s)和MT4K-10(s)的细胞培养物。经沉默的培养物（B、C）显示出纤丝的缩短，这不同于在用作对照的MT4的培养物（A）中变长的纤丝的存在。在图版D中，通过标识为SEQ ID No.1的肽对于MT4细胞的作用，IF出现片段化。
图6.在MT4细胞系中所述肽对于HIV-1复制的抑制。（A）使细胞与该肽接触24小时，并且以0.05的moi用HXB1株进行攻击。观察到高百分比的病毒复制的抑制，其随着肽的浓度而增加。误差条表示标准偏差。（B）使细胞与所述肽接触24小时，并且以0.01的moi用Bru株进行攻击。所得到的所述肽的抑制浓度50（IC50）处于nM的水平。
图7.在外周血单核细胞（PBMC）中所述肽对于HIV-1复制的抑制。对PBMC进行预刺激，用不同浓度的所述肽进行处理，并且用HIV-1的Bru株进行感染。所述肽以依赖于剂量的方式抑制HIV-1的复制。
图8.标识为SEQ ID No.1的肽对于HIV-2复制的抑制。对PBMC进行预刺激，用不同浓度的所述肽进行处理，并且用HIV-2的CBL-20株进行感染。所述肽以依赖于剂量的方式抑制HIV-2的复制。
图9.在标识为SEQ ID No.1、4、5、7、8和9的肽存在下波形蛋白的减少。将MT4细胞系与50uM的所述肽一起温育24小时。通过Western印迹技术来进行波形蛋白的检测。在用肽进行处理的培养物中，波形蛋白的条带出现减弱。
图10.在MT4细胞系中，标识为SEQ ID No.1（A）和3（B）的肽的内化的评价。柱状图描绘了荧光细胞的百分比，其表明以5、10、20和40uM的浓度和在不同的时间所述肽向MT4细胞系中的穿透。Cc：未处理的细胞。误差条表示标准偏差。
图11.脂质衍生物对于HIV-1复制的抑制。将MT4细胞与不同浓度的环戊烷前列腺素15-脱氧-Δ-12,14-PGJ2（15d-PGJ2）一起进行温育，然后以0.01的moi用HIV-1（Bru株）进行攻击。前列腺素15d-PGJ2抑制了HIV-1的复制。误差条表示标准偏差。
发明详述
通过描述用于通过负调节或扰乱细胞的细胞骨架，特别是构成细胞骨架的IF的一部分的蛋白质，来抑制HIV复制的方法，本发明解决了上面提及的问题。
为了本发明的目的，所述IF可以由酸性和碱性角蛋白、波形蛋白、结蛋白、胶质细胞原纤维酸性因子、外周蛋白、神经丝（NF）蛋白、丝联蛋白、晶状体纤维蛋白、晶蛋白和核纤层蛋白形成。
在本发明的一个实施方案中，所述IF由波形蛋白和/或角蛋白形成。更特别地，所述IF可以由波形蛋白和/或角蛋白-10形成。对于这些蛋白质的结构的干扰造成在人细胞中所述病毒的复制的抑制。
打断或扰乱细胞骨架的IF是指，修饰或扰乱其结构，这是由于形成细胞骨架的IF的蛋白质被负调节，和/或细胞骨架的IF的结构被断裂成更短的亚单位，和/或细胞骨架网状物的结构形式发生变换，和/或IF被解装配。
如在本文中所描述的，细胞骨架是指包含在细胞质中并且由蛋白质构成的细胞的支架或骨架。细胞骨架存在于所有细胞中；其在细胞分裂和细胞内运输中起着重要作用。它由三种主要结构形成：微管、微丝和IF。细胞骨架向细胞提供了结构和形状。细胞骨架的组成成分与细胞膜广泛且密切地相互作用。
如在本文中所定义的，IF是共享共同的结构和序列特征的相关蛋白质的家族。IF具有10纳米的平均直径，其介于肌动蛋白（微丝）和微管之间。大多数类型的IF是细胞质的，但一种类型（即核纤层蛋白）是细胞核的。存在有大约70个对于每种细胞类型特异的、编码各种IF蛋白质的不同基因。其中包括波形蛋白和角蛋白-10。
在本文中，术语“波形蛋白”是指由NCBI参考序列：NP_003371.2所鉴定的IF蛋白质家族的成员，其标识为SEQ ID No.11。
波形蛋白在一系列装配步骤中形成丝状聚合物，所述一系列装配步骤由反向平行的双二聚体（或四聚体）开始从而形成单位长度纤丝（ULF），其纵向地装配直至形成完整的纤丝。
在本文中，术语“角蛋白”是指IF的纤维状结构蛋白质家族的成员。角蛋白在以二聚化开始的一系列装配步骤中形成丝状聚合物；二聚体形成四聚体和八聚体，和可能地，形成能够通过末端进行连接从而形成长的纤丝的ULF。
每种I型角蛋白与特定的II型角蛋白共表达，并且所形成的每个角蛋白对对于特定类型的上皮细胞的分化和特化来说是特征性的和指示性的。
在本文中，术语“角蛋白-10”是指细胞骨架的I型角蛋白-10，其是在Swiss-Prot中以编号：Q6EIZ0.1进行标识的IF蛋白质家族的成员，具有在SEQ ID No.12中给出的序列。
在本文中，术语“基因”是指DNA序列，包括但不限于这样的DNA序列，其可以转录为被翻译成多肽链的mRNA，转录为rRNA或tRNA，或者用作牵涉DNA复制、转录和调控的酶和其他蛋白质的识别位点。该术语是指任何包含各种功能性地相连接的DNA片段的DNA序列，所述DNA片段例如为启动子区、5'非翻译区（5'UTR）、编码区（其能够或不能编码蛋白质）和包含多腺苷酸化位点的3'非翻译区（3'UTR）。通常，5'UTR、编码区和3'UTR被转录成RNA，所述RNA在编码蛋白质的基因的情况下被翻译成蛋白质。基因通常包含内含子和外显子。
在本文中，术语“波形蛋白基因”是指编码波形蛋白的基因或其同源物。
在本文中，术语“角蛋白-10基因”是指编码角蛋白-10的基因或其同源物。
如在本文中所指出的，在此关于IF的扰乱而使用的术语“扰乱”是指对于功能或结构组构的干扰。特别地，所述打断或扰乱可以涉及结构断裂，多聚化的抑制，形成和生物合成的抑制，包括蛋白质的一级结构、二级结构和三级结构等的形成的抑制。
在本文中关于IF的负调节而使用的术语“负调节”是指变换或改变功能或结构组构从而导致所述纤丝的生物学功能丧失或降低。
在本文中，术语“细胞骨架的中间丝（IF）”是指作为细胞骨架的一种类型的组成成分的中间纤丝，其具有相比于微丝和微管而言处于中间的大小。这三种组成成分有助于结构的完整性、细胞的形状以及细胞和细胞器的运动性。
细胞骨架的IF分为五种类型：I和II型：酸性和碱性角蛋白，所述角蛋白还具有对于不同的上皮细胞来说独特的亚型；III型：在成纤维细胞、内皮细胞和白细胞中存在的波形蛋白，在肌细胞中的结蛋白，在星形胶质细胞和其他类型的胶质细胞中的胶质细胞原纤维酸性因子，和在外周神经纤维中的外周蛋白；IV型：神经丝（NF）蛋白H（重）、M（中等）和L（轻），丝联蛋白，晶状体纤维蛋白，和晶蛋白；和V型：核纤层蛋白。
在本文中，术语“细胞骨架的中间丝（IF）的结构”是指纤丝的四聚体的螺旋状组构。中间丝的每个单体由连接氨基末端（头）和羧基末端（尾）的α螺旋棒结构域构成。所述棒围绕另一纤丝进行缠绕从而形成二聚体。每个纤丝的N末端和C末端对齐。有些I F形成同源二聚体；另一些形成异源二聚体。然后，所述二聚体形成头-尾对齐的错列的四聚体。该四聚体被认为是中间丝的基本亚单位。最终的中间丝是这些四聚体的螺旋状阵列。
在本说明书的背景下，术语“治疗”是指用于医治病痛或疾病或其症状，或者阻止疾患或疾病或症状的建立，或者阻止、阻碍或逆转疾患或疾病或其不希望的症状的进展的任何应用。
在本文中，术语“治疗有效量”是指足以提供所希望的治疗效果（例如，治疗、缓解或预防所希望的疾病或病状，或者展示出可检测的治疗或预防效果）的治疗试剂的非毒性量。所述效果可以通过例如化学标记物或抗原水平来进行检测。治疗效果还包括身体症状的减轻。对于个体来说精确且有效的量取决于该个体的体重和其健康状态，病状的性质和范围，以及被选择用于进行施用的疗法或疗法组合。因此，预先指定准确的有效量是无用的。然而，可以通过常规实验来确定关于给定情形的有效量，并且这在临床医生的判断力之内。
为了本发明的目的，有效剂量将为大约0.01mg/kg至50mg/kg或0.05mg/kg至10mg/kg的多核苷酸或多肽组合物，在向其进行施用的人中。
在本文中所使用的术语“药学上可接受的赋形剂或载体”是指用于施用治疗试剂（例如，多肽、多核苷酸和其他治疗试剂）的赋形剂。该术语是指不引起对于接受该组合物的人有害的抗体的产生并且可以无过度毒性地进行施用的任何药学赋形剂。合适的载体可以是缓慢地代谢的大的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒颗粒。此类载体是本领域技术人员熟知的。所述治疗组合物的药学上可接受的载体可以包括液体，例如水、盐水溶液、甘油和乙醇。此外，在此类载体中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，缓冲物质等。关于药学上可接受的赋形剂的详细讨论在Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub.Co.,N.J.1991）中可得。通常，将治疗组合物制备为注射剂，要么作为液体溶液要么以悬浮液，或者以适合于在液体载体中的溶液或悬浮液或适合于直接服用的固体形式。脂质体包括于在药学上可接受的赋形剂或载体的定义之中，如气溶胶那样。
在本文中，当涉及肽时，术语“同源物”是指这样的肽，其具有与标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的序列共享至少70%，优选地至少75%，更优选地至少85%、90%或甚至95%，最优选地至少97%的序列同一性（其通过采用例如Blast等的序列比对而建立）的氨基酸序列，并且具有扰乱、负调节和/或修饰细胞骨架，特别是形成细胞骨架的IF的蛋白质，更精确地波形蛋白和角蛋白-10的能力。合适的同源物为具有保守氨基酸置换的肽，优选地少于10%的氨基酸的置换，更优选地少于5%，低于3%，和更加优选地少于1%的氨基酸置换。优选地，少于10个氨基酸被置换，更优选地，少于5个氨基酸被置换，和更加优选地，少于2个氨基酸被置换。保守置换是其中氨基酸被另一个非常相似的氨基酸替代的置换，该置换对于肽的活性具有很小的影响或没有影响。“保守置换”为氨基酸被另一个具有相同的净电荷和大约相同的大小和形状的氨基酸置换。具有脂族氨基酸侧链或经取代的脂族氨基酸侧链的氨基酸，当其侧链中的碳和杂原子的总数目相差不超过大约四个时，具有大约相同的大小。当其侧链中的分枝的数目相差不超过一个时，它们具有大约相同的形状。认为在其侧链中具有苯基或经取代的苯基的氨基酸具有相同的大小和形状。下面列举了五个氨基酸组。在多肽中氨基酸被相同组的另一个氨基酸置换导致保守置换：组I：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和具有C1-C4脂族侧链或经羟基取代的C1-C4脂族侧链（其具有线性或单支化的链）的非天然氨基酸。组II：谷氨酸、天冬氨酸和具有经羧酸取代的C1-C4脂族侧链（其是非支化的或在一个点支化的）的非天然氨基酸。组III：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和具有经胺或胍取代的C1-C4脂族侧链（其是非支化的或在一个点支化的）的非天然氨基酸。组IV：谷氨酰胺、天冬酰胺和具有经酰胺取代的C1-C4脂族侧链（其是非支化的或在一个点支化的）的非天然氨基酸。组V：苯丙氨酸、苯甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。
在此，术语“序列同一性%”被定义为在核酸序列中与目标核酸序列中的核苷酸同一的核苷酸的百分比，在比对所述序列和任选地引入缺口（如果必要）以达到最大序列同一性百分比之后。用于进行比对的方法和计算机程序是本领域中熟知的。
在本文中，术语“核酸序列”和“核苷酸”还包括基于和/或衍生自核酸序列的非天然分子，例如经人工修饰的核酸序列、肽核酸以及包含至少一个经修饰的核苷酸和/或非天然核苷酸（例如肌苷）的核酸序列。
术语“RNA干扰”是指其中干扰RNA（iRNA）引起特定mRNA的细胞内降解的过程，并且可以用于干扰所希望的靶mRNA转录物的翻译。
术语“干扰RNA”是指双链或单链的RNA试剂（iRNA），其意指用于RNA干扰的小核酸分子。长度为大约15-30个核苷酸的短iRNA试剂被称为“小干扰RNA”或siRNA。更长的iRNA试剂通常被称为“双链RNA”或dsRNA，iRNA试剂的其他形式为微小RNA（miRNA）和短发夹RNA（shRNA）分子。iRNA试剂可以是未修饰的或经化学修饰的核酸分子。iRNA试剂可以是化学合成的，或者是在载体中表达的，或者是酶促合成的。经化学修饰的iRNA试剂的使用可以通过对于降解的抗性的增加、对于靶标或靶的特异性的提高、经改善的细胞吸收等来改善iRNA试剂的一种或多种特性。
转录成双链RNA或siRNA（例如，作为双链体发夹）的DNA分子也提供了RNA干扰。用于转录双链RNA的DNA分子描述在U.S.专利号6,573,099这一专利以及美国专利公开号20020160393和20030027783中。用于转录siRNA的DNA分子在Tuschl和Borkhardt,Molecular Interventions,2:158(2002)中作了综述。
在本文中，术语“反义RNA”是指以足够的亲和力与mRNA相结合以降低从mRNA翻译出的蛋白质的量的任何RNA。从mRNA翻译出的蛋白质的量优选地降低超过20%；更优选地，降低超过50%、70%和80%；和最优选地，降低超过90%。关于反义RNA的方法和材料是本领域中熟知的。
在本文中，术语“表达”是指源自本发明的核酸片段的有义RNA（mRNA）或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以是指mRNA翻译成多肽。“反义抑制”是指能够取消靶蛋白表达的反义RNA转录物的产生。
术语“表达的抑制”意指基因或核酸的沉默或调控，其是指相比于在iRNA或其他核酸序列不存在下检测的正常水平而言，靶核酸序列（即iRNA的靶序列）的转录和/或翻译的可检测的减少，或者靶序列或靶蛋白的量或活性的降低。可检测的减少可以如5%或10%那样小，或者如大约80%、90%或100%那样大。更通常地，可检测的减少为大约20%、30%、40%、50%、60%或70%。
在本文中，术语“脂质化合物”是指衍生自例如单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和包含1-6个三键的脂质的脂肪酸类似物。
“HIV”为人免疫缺陷病毒，其是一种通过攻击身体的CD4+细胞而引起免疫缺陷的逆转录病毒。在本文中，术语“HIV”包括任何HIV，其中包括HIV-1和HIV-2的所有组和亚型（进化枝），例如HIV-1的M组和O组；本发明包括每一个已知的亚型；优选地，HIV-1。
在本文中，术语“复制”是指其中通过聚合酶来合成核酸分子的互补链的过程。在本发明的特定背景下，在此关于病毒而使用的术语“复制”是指完整的病毒生活周期的实现，其中感染性病毒颗粒或病毒粒子附着至宿主细胞的表面（通常结合至给予感染特异性的特定的细胞表面分子）。一旦在细胞中，病毒粒子就脱壳，并且病毒基因开始表达对于基因组的复制和新蛋白质的合成来说必需的蛋白质，以制备新的衣壳和核，这导致子代感染性病毒颗粒的装配，所述子代感染性病毒颗粒能够在新的宿主细胞中进行感染和复制。因此，如果在被一个或多个病毒颗粒或病毒粒子感染的单个细胞内发生了用于产生完全感染性的病毒颗粒子代的所有步骤，那么就完成了单个病毒生活周期。在逆转录病毒的特定情况下，完整的病毒生活周期包括：包含病毒RNA的感染性病毒颗粒进入细胞，该RNA被反转录成DNA，该DNA作为原病毒整合到宿主细胞的染色体中，以及被感染的细胞产生病毒粒子的蛋白质，并且携带完整病毒基因组RNA的病毒粒子装配成感染性颗粒。
在本文中，术语“宿主细胞”是指用于表达病毒基因组或用于增殖病毒或载体的细胞。
在本文中，术语“CD4+细胞”是指T淋巴细胞的通常分类，其指携带CD4抗原的那些。还包括其他CD4+细胞，例如单核细胞和巨噬细胞。
特别地，本发明涉及负调节、修饰或扰乱细胞骨架的IF，优选地由波形蛋白和/或角蛋白-10形成的IF的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法包括降低IF中波形蛋白和/或角蛋白-10的量。可以以各种不同的形式影响波形蛋白和/或角蛋白-10的降低。一个优选的实施方案为降低或抑制编码波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的表达。更优选地，降低波形蛋白和/或角蛋白-10的IF的表达水平，或者扰乱细胞骨架的波形蛋白和/或角蛋白-10的结构。细胞骨架的IF的结构可以通过下述方式来扰乱：修饰IF蛋白质的结构，例如通过三级结构中的破裂或变换，优选地波形蛋白和/或角蛋白-10的结构。
专业文献中存在的证据暗示，HIV在其生活周期中需要对波形蛋白进行分割。令人惊讶地，在本发明中实现了通过看起来为病毒感染过程中的天然机制的那种来抑制病毒复制。非显而易见的是，扰乱细胞骨架或波形蛋白会是用于抑制HIV感染的手段；事实上，预期感染将会强烈得多，因为在正常的感染过程中也发生细胞骨架的打断。
在本发明中，通过对用具有抗-HIV活性的级分（其从人白细胞提取物获得）进行处理的MT4细胞施行的比较蛋白质组学研究而鉴定出波形蛋白和角蛋白-10这些细胞骨架蛋白质。首次证明了，通过波形蛋白和/或角蛋白-10和/或包含这些蛋白质的纤丝的减少和/或去稳定化而引起HIV感染的减少。以前，Thomas等人提出，用针对波形蛋白的抗体可以阻断HIV-1的gp120蛋白与表面的波形蛋白的结合，并且用它可以阻止病毒进入细胞（Thomas EK,Connelly RJ,PennathurS,Dubrousky L,Haffar OK,Bukrinsky MI 1996.Viral Immunol 9:73-87）。于在本发明中所使用的实验条件下，当使用针对波形蛋白的抗体时（其目的在于减少HIV-1感染），令人惊讶地检测到非常低的病毒复制的抑制水平。Thomas等人使用针对波形蛋白的抗体，从而阻断易受所述抗体影响的波形蛋白。这与本发明的提议是非常不同的。在本发明中，扰乱或减少波形蛋白以便扰乱IF。如Thomas等人所做的那样，通过阻断波形蛋白，IF并不被修饰。实验数据还证实，本发明的方法具有不同的作用方式。当降低靶细胞的波形蛋白的水平或者使靶细胞的波形蛋白的结构去稳定化时，获得了非常高的病毒复制的抑制百分比（高至100%），如在实施例2，图3和4中所观察到的那样；而在Thomas等人中，观察到47%的抑制最大值。
此外，未曾报道过，角蛋白-10与病毒蛋白质gp120相结合，然而，通过抑制该角蛋白或使其去稳定化，也抑制了HIV复制，如在实施例2，图3和4中所观察到的那样。
为了获得更多关于HIV复制的抑制机制的信息，使用了其细胞进入途径不经由病毒蛋白质gp120的实验系统。所述系统包括基于HIV-1的非复制性慢病毒载体，其不包含gp120蛋白并且表达绿色荧光蛋白（GFP）。在实施例2中，可以看出，在MT4细胞中有着有效的慢病毒“感染”，并且培养物显示出高的GFP表达百分比，这表明该慢病毒载体毫无困难地穿透入细胞中并且整合到细胞基因组中。在该相同的基于HIV-1的慢病毒“感染”系统中，当减少波形蛋白时，慢病毒的“感染”显著地降低，如在实施例2中所观察到的那样。这证明，本发明的抑制HIV-1感染的方法与由Thomas等人提出的波形蛋白与gp120蛋白的结合无关。因此，本发明涉及迄今尚未描述过的抑制HIV感染的方法。
此外，在本发明中，通过使用透射电子显微术（TEM）而证明了，在就波形蛋白而言经沉默的MT4细胞（MT4vim(s)）中以及在就角蛋白-10而言经沉默的细胞（MT4K-10(s)）中，IF去稳定化，从而产生对于基于HIV-1的慢病毒的“感染”的抑制（实施例3）。MT4vim(s)细胞和MT4K-10(s)细胞通过引入对于编码每种蛋白质的基因特异的RNA发夹来获得。
IF的扰乱可以通过选自多肽、肽、核酸和化学化合物的试剂来实现。在一个优选的实施方案中，所述试剂为肽，更优选地，所述肽选自标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽以及其同源物。
在另一个优选的实施方案中，所述试剂为针对波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的干扰RNA或反义寡核苷酸。
在另一个优选的实施方案中，所述试剂为化学化合物或脂质衍生物。合适的脂质化合物为所提及的环戊烷前列腺素15d-PGJ2。
本发明揭示了用于治疗和/或预防在人细胞中的HIV感染的方法。所述方法包括：负调节细胞中的波形蛋白和/或角蛋白-10，以此预防或治疗在所述细胞中的HIV感染。
负调节发生在个体的HIV宿主细胞中，以此防止或抑制该个体的宿主细胞的有效感染。因此，本发明同样地还考虑了治疗和/或预防在受试者中的HIV感染的方法。
通过在本发明中所描述的方法的对于HIV感染的抑制在细胞水平和整个生物体水平上均适用。术语“抑制”用于指感染的完全或部分的抑制。
本发明描述了操纵IF，特别是波形蛋白和角蛋白-10这些细胞骨架蛋白质，以便抑制HIV复制，这提供了相对于目前的抗逆转录病毒药物而言的优点，即不产生引起病毒抗性的可能性或者这种可能性是最小的，因为这些蛋白质不是病毒来源的而是细胞的内源蛋白质。本发明的药物的作用机制通过与迄今所描述的那些不同的途径以高的抑制能力而起作用，因此，其与目前的对于HIV感染特异的治疗药物的组合可以增强针对HIV的治疗的功效。另外，本发明的治疗试剂的使用可以与现有技术中提出的新的治疗备选方案（例如，具有经修饰的内源基因的干细胞的移植）相组合。本发明的疗法形式为对于多种药物具有抗性的患者提供了新的选择，所述对于多种药物具有抗性的患者在用目前可得的疗法进行治疗的患者之中占有高的百分比。
尽管对于该结构的影响可以导致毒性甚至细胞死亡，但是在本发明中令人惊讶地还实现了抑制HIV感染而不影响细胞生存力，这为被HIV感染的患者的治疗增加了更加多的创新。
此外，本发明还涉及试剂在生产用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途，所述试剂产生细胞的细胞骨架，特别是构成细胞骨架的IF的一部分的蛋白质，更特别地波形蛋白和角蛋白-10的负调节或扰乱。所述试剂可以与其他分子相融合和/或相缀合。此类试剂包括产生细胞的细胞骨架、IF的负调节或扰乱的肽类型的化合物、干扰RNA和脂质化合物，和特别是负调节波形蛋白和/或角蛋白-10的那些试剂。
波形蛋白和/或角蛋白-10的负调节可以通过使细胞与负调节波形蛋白或角蛋白-10的试剂相接触来实现。如果需要，可以对所述试剂进行配制，以便增加其进入细胞的能力。所述负调节可以通过向个体施用负调节受试者的细胞中的波形蛋白和/或角蛋白-10的试剂来实现。如此来进行施用，从而使得所述试剂与受试者的细胞相接触，所述细胞已被HIV感染或者可能会被感染。在此，此类细胞是指HIV的宿主细胞。所述试剂的施用涉及与宿主细胞相接触。此类施用途径的实例包括肠胃外途径以及其中试剂通过受试者的粘膜进行施用的途径。在本发明的一个特别的实施方案中，所述细胞为CD4+细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述负调节或扰乱可以通过下述方式来实现：直接影响波形蛋白和/或角蛋白-10，要么通过减少基因的表达或蛋白质的合成、修饰这些蛋白质所形成的纤丝的结构、使该结构去稳定化，要么通过降低其活性/功能。
在本发明的背景下，“负调节（或扰乱）”是指细胞中波形蛋白和/或角蛋白-10的水平的抑制，或者细胞内包含这些蛋白质的IF的结构的修饰、去稳定化、解装配或甚至破坏。
根据在本发明中所揭示的方法，抑制或负调节IF（特别是波形蛋白和/或角蛋白-10）的任何已知试剂都可以用于抑制HIV感染。
同样地，还可以通过使用负调节IF（特别是波形蛋白和/或角蛋白-10）或使其去稳定化的肽或多肽类型的试剂来抑制HIV感染。此类试剂包括内源蛋白质或通常在宿主细胞中不存在的蛋白质。例如，突变的蛋白质、基因工程蛋白质、肽、合成肽、重组蛋白质、嵌合蛋白质、抗体片段、人源化蛋白质、人源化抗体、嵌合抗体、经修饰的蛋白质以及其片段。
在本发明中，破坏IF（特别是包含波形蛋白或角蛋白-10的那些IF）的结构或使其去稳定化的肽的使用引起在MT4细胞中HIV感染的强烈抑制，从而确证了用MT4vim(s)细胞和MT4K-10(s)细胞所获得的结果。这支持了使用所述肽来预防或治疗HIV感染，其也构成了本发明的一部分。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述肽为在序列表中标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽。本发明还考虑了使用所述肽的同源物。
所述肽可以与其他分子相融合，例如可以与穿透肽相融合。
根据本发明，可用于预防或治疗HIV的试剂为这样的试剂，其抑制波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的表达，或者抑制蛋白质的合成，或者抑制包含波形蛋白或角蛋白-10的纤丝的结构。根据本发明的优选的试剂为这样的试剂，其用iRNA，例如siRNA（短干扰核糖核酸）、shRNA（短发夹核糖核酸）或miRNA（微小RNA），来产生波形蛋白和/或角蛋白-10的基因或其转录物的沉默。
“RNA干扰”是指选择性的转录后基因沉默的形式，其通过结合并抑制mRNA加工的分子来破坏特定的信使RNA（mRNA）。例如，可以抑制mRNA的翻译或使之降解。在本发明的背景下，术语“iRNA”是指任何类型的iRNA，包括但不限于siRNA、shRNA、内源miRNA和人工miRNA。
在此所使用的术语“siRNA”是指形成RNA双链的核酸，其具有减少或抑制波形蛋白和/或角蛋白-10的基因表达的能力。siRNA的序列可以相应于波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的完整序列。典型的siRNA具有至少15至50个核苷酸，优选地19至30个核苷酸的长度。siRNA可以是化学合成的，可以通过体外转录产生，或者可以在为了此类产生而特别使用的细胞中产生。
在此，术语“shRNA”作为siRNA的一种类型进行使用。这些shRNA由下列部分构成：短的（例如，19至25个核苷酸的）反义链，随后为5至9个核苷酸的环和类似的有义链。备选地，有义链可以在核苷酸环和其随后的反义链之面。shRNA作为iRNA和/或siRNA种类起作用，但不同之处在于shRNA是用于增加稳定性的与发夹类似的结构。这些shRNA，以及在此所描述的其他试剂，可以包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中，并且从例如U6聚合酶III启动子或其他启动子来进行表达。
向靶细胞施用（递送）iRNA类型的试剂的方法可以包括，例如注射包含该试剂的组合物，或者使细胞（例如，造血细胞）与包含iRNA的组合物直接接触。在另一种情况下，可以通过任何血液途径，例如静脉、动脉，例如通过流体动力学注射或导管插入术，来直接注射所述iRNA类型的试剂。在某些情况下，可以向特定的器官或者通过全身途径来施用所述iRNA试剂。可以将胶态分散体体系用作递送载体以便增加所述试剂的体内稳定性。
所述试剂可以抑制波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的表达，如例如寡核苷酸或核酸类似物所做的那样。在这些之中包括例如，肽核酸（PNA）、假互补PNA（pc-PNA）、锁定核酸（LNA）以及其衍生物。这些核酸序列编码作为转录阻遏蛋白起作用的蛋白质、反义分子、核酶、小抑制核酸序列（例如iRNA、shRNA、siRNA、miRNA）和反义寡核苷酸。
所述试剂可以采取通常在细胞或生物体中以所施用的水平存在或不存在的任何实体的形式。可以鉴定或产生诸如化学药剂、小分子、适体的试剂以用于负调节IF，特别是波形蛋白和/或角蛋白-10。在本发明的背景下，适体是这样的单链核酸，其具有经充分确定的三维形状，从而允许其以在概念上类似于抗体的形式结合至靶分子。所述适体组合了小分子和抗体的最佳特征，包括高的特异性和亲和力、化学稳定性、低的免疫原性和攻击蛋白质-蛋白质相互作用的能力。
所述试剂可以直接以其被施用的形式起作用，但也可以在细胞内进行修饰或利用以产生波形蛋白和/或角蛋白-10的负调节。例如，将核酸序列引入细胞中以及其转录导致在细胞中产生抑制IF（特别是波形蛋白和/或角蛋白-10）的核酸和/或蛋白质。
所述试剂可以包括载体。所述载体可以是附加型的，例如质粒、源自病毒（例如巨细胞病毒、腺病毒等）的载体，或者可以整合到靶细胞的基因组中，例如源自逆转录病毒（例如莫洛尼鼠白血病病毒、HIV-1、禽类白血病病毒等）的载体。可以使用基于HIV或猫免疫缺陷病毒的载体来转染不处于分裂状态中的细胞。可以使用逆转录病毒的组合。
在现有技术中知晓许多病毒载体或与病毒相关的载体。可以将此类载体用作核酸构建体至细胞的运送者。可以将所述构建体整合到与腺病毒类似的非复制性病毒基因组（AAV）或单纯疱疹病毒中，或者整合到其他（包括逆转录病毒载体和慢病毒载体）中，以用于细胞的感染或转导。基于HIV的载体在HIV的宿主细胞中可以是特别有用的。
本发明的另一个目标是包含根据本发明的试剂的药物组合物。在该组合物中，本发明中所提及的试剂可以相互组合或者可以与其他治疗试剂相联合地进行使用，所述其他治疗试剂可以为但不限于已知的抗-HIV药物，例如齐多夫定（称为AZT）。
在一个优选的实施方案中，在本发明中向HIV能够感染的细胞施加IF（特别是波形蛋白和/或角蛋白-10）的负调节，其目的在于防止或减少所述细胞中的HIV感染。在一个优选的实施方案中，所述人细胞为CD4+细胞。向整个生物体（人或灵长类）施加此类负调节可以构成对于所述生物体来说有效的针对HIV感染的治疗性治疗。
本发明的另一个实施方案为药物组合，其包含根据本发明的试剂和对于HIV感染的疗法特异的药物。在所述药物组合中，构成该药物组合的一部分的所述试剂和所述药物可以同时地、分开地或顺次地进行施用。
本发明的优点：
本发明提供了相对于目前的抗逆转录病毒药物而言的优点，即不产生病毒抗性或者引起病毒抗性的可能性是最小的，因为IF（特别是波形蛋白和角蛋白-10）不是病毒来源的，而是细胞的内源蛋白质。
本发明的药物通过与在现有技术中迄今所描述的那些不同的途径以高的抑制能力而起作用，因此，其与目前的对于HIV感染特异的治疗药物的组合可以增强针对HIV的治疗的功效。
另外，本发明的治疗试剂的使用可以与现有技术中提出的新的治疗备选方案（例如，具有经修饰的内源基因的干细胞的移植）相组合。
本发明为对于多种药物具有抗性的患者提供了新的疗法，所述对于多种药物具有抗性的患者在用目前可得的疗法进行治疗的患者之中占有高的百分比。
施用方法：
一旦配制完成，本发明的药物组合物可以：（1）直接施用给受试者；（2）离体施用给来自受试者的细胞；或（3）体外施用以表达重组蛋白质。
所述组合物的直接施用通常通过皮下注射，通过腹膜内途径，通过静脉内或肌内途径，或者在组织的胞间隙中进行。所述组合物也可以施用到神经系统中。其他施用方式包括局部施用、口服、栓剂和透皮应用、针和基因枪或压力注射器。治疗的剂量可以通过单剂量或多剂量。
用于离体施用和经转化的细胞的再植入的方法是本领域中已知的，并且描述在例如国际公开号WO 93/14778中。在离体应用中有用的细胞的实例包括，例如干细胞，特别是造血干细胞，淋巴样细胞，巨噬细胞，树突细胞，或肿瘤细胞。
通常，用于离体和体外应用的核酸的施用可以通过下列方式来进行：例如，由葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、由Polybrene介导的转染、电穿孔、将多核苷酸包囊在脂质体中和DNA的直接显微注射，它们是本领域中熟知的。用于将多核苷酸（例如siRNA）引入到细胞中的方法是本领域中已知的。用于引入核酸的方法包括例如用磷酸钙进行的转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔或由脂质体介导的转染。备选地，采用多核苷酸的直接注射。然而，优选地，通过载体（优选地病毒载体）来将核酸序列引入到细胞中。所述载体优选地包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒（AAV）载体或慢病毒载体。
使用各种不同的用于将治疗组合物直接施用至身体中的特定部位的方法。还使用治疗组合物的由受体介导的特异性施用，所述治疗组合物包含反义多核苷酸、亚基因组多核苷酸或针对特定组织的抗体。由受体介导的DNA施用技术描述在例如Findeis等人,Trends inBiotechnol.(1993)11:202-205；Wu等人,J.Biol.Chem.(1994)269:542-46中。
在基因疗法的治疗方案中，对于局部施用，优选地在大约100ng至大约200mg多核苷酸的范围内施用包含多核苷酸的药物组合物。在基因疗法的治疗方案期间，还可以采用大约500ng至大约50mg，大约1μg至大约2mg，大约5μg至大约500μg，和大约20μg至大约100μg多核苷酸的浓度范围。诸如作用方式以及转化和表达效率的因素是要考虑的事情，其影响对于多核苷酸的最大效力来说必需的剂量。当希望在更大的组织区域中的更大表达时，可能需要更大的量的多核苷酸或在连续的施用方案中再施用同样的量，或者向例如神经末梢或突触的邻近或附近的组织进行数次施用，以达到阳性的治疗结果。在所有情况下，在临床试验中的系统实验将决定对于最佳治疗效果来说特定的范围。关于基因疗法载体（特别是抗逆转录病毒载体）的更完整的说明描述在WO 98/00542中。
实施例
实施例1.用具有抗-HIV活性的白细胞提取物进行处理的MT4细胞的比较蛋白质组学。
用具有抗-HIV活性的白细胞提取物处理MT4细胞系（Fernández-Ortega C,Dubed M,Ruibal I,Vilarrubia OL,MenéndezJC,Navea L等人,1996,Biotherapy 9:33-40）,并将蛋白质表达谱与由未处理的细胞构成的对照条件进行比较。裂解细胞并且以12000rpm离心20分钟。分开上清液并使沉淀物经历第二次裂解。再次以12000rpm离心20分钟，并且收集第二次的上清液以与第一次的上清液相合并。用乙醇进行去脂质化，并且用聚丙烯酰胺使样品烷基化。然后，使脱氧核糖核酸（DNA）沉淀，并进行二维电泳，这在4℃下在12.5至3%的具有Tris-Tricine的凝胶中进行。
使用程序Melanie 5来进行分析凝胶的图像的分析。从制备型凝胶上切出待鉴定的斑点，并用胰蛋白酶进行消化。进行蛋白酶解肽的提取，以用于通过质谱法来对其进行分析。在配备有纳升喷雾（nanospray）电离源的具有正交几何的混合型质谱仪QTOF-2中获得质谱。
分析ESI-MS/MS谱，并且在美国国家生物技术信息中心（NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI）的非丰余蛋白质序列数据库中和在德国的欧洲分子生物学实验室（European MolecularBiology Laboratory，EMBL）数据库中进行搜索以鉴定蛋白质。在用具有抗-HIV活性的白细胞提取物进行处理后，观察到细胞骨架的蛋白质，特别是形成IF的蛋白质（波形蛋白和角蛋白-10）的减少（图1）。
实施例2.针对波形蛋白和角蛋白-10的干扰RNA抑制HIV感染。
使用慢病毒载体pLenti-shRNAvim或pLenti-shRNAK-10转导MT4细胞系，所述慢病毒载体分别携带编码使波形蛋白和角蛋白-10沉默的RNA发夹的序列。为了构建所述慢病毒载体，在293FT细胞系中包装四种质粒，这四种质粒是pLP1、pLP2、pLP/VSVG和对于波形蛋白或对于角蛋白-10特异的p-shRNA。所述pLP1编码HIV-1的gag/pol序列的基因产物。所述pLP2携带HIV-1的REV蛋白的基因序列。所述pLP/VSVG编码水泡性口炎病毒的表面蛋白，和所述p-shRNA构成慢病毒载体的基因组，所述慢病毒载体携带编码对于波形蛋白（Ui-Tei K,Naito Y,Takahashi F,Haraguchi T等人,2004 Nucleic AcidsResearch 32:936-948）或对于角蛋白-10（Santa CruzBiotechnology）特异的RNA发夹的序列。所有质粒均在大肠杆菌（Escherichia coli）XL-1 blue株中进行扩增，并且在氨苄青霉素中进行选择。将所述四种载体以转染量通过柱进行纯化，并且使其在聚乙烯亚胺存在下与包装细胞系293FT相接触。将细胞在37℃下在5%CO2的气氛中温育48小时，并且通过在20000×g下超速离心来纯化病毒粒子。一旦纯化了所述慢病毒载体，就转导MT4细胞并通过对于杀稻瘟素的抗性来进行重组体的选择。通过有限稀释法来分离重组克隆，并且在37℃下，在5%CO2的气氛和95%的相对湿度中，在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中进行培养，直至收获。提取该培养物的总蛋白质，并且通过Western印迹证明了在MT4细胞（MT4vim(s)）中波形蛋白的沉默。在就角蛋白-10而言经沉默的MT4细胞（MT4K-10(s))中，也通过Western印迹证明了角蛋白-10的沉默。经转导的培养物显示出波形蛋白或角蛋白-10的表达的降低，相比于MT4培养物而言（图2）。
使用两种攻击系统来评价抗-HIV活性：
系统A：将就波形蛋白而言（MT4vim(s))或就角蛋白-10而言（MT4K-10(s)）经稳定地沉默的细胞在37℃下在5%CO2的气氛和95%的相对湿度中，在具有10%FBS的RPMI中进行培养。在MT4vim(s)、MT4K-10(s)和MT4的培养物中进行用总病毒来施行的攻击测试。以0.01的moi使用病毒株Bru，并且通过用ELISA方法测定培养物上清液中抗原p24的浓度来进行复制的评价。MT4vim(s)和MT4K-10(s)细胞显示出抑制了大约90%的病毒复制，相对于就该蛋白质而言未沉默的MT4培养物来说（图3）。
系统B：用包含HIV-1基因组的一部分（既不具有涉及感染力的基因，也不具有编码进入的基因）的慢病毒载体（pLGW）攻击MT4vim(s)、MT4K-10(s)和MT4的培养物。为了构建该载体，在293FT细胞系中包装四种质粒，这四种质粒是pLP1、pLP2、pLP/VSVG和编码蛋白质GFP的pLGFP。所述pLP1编码HIV-1的gag/pol序列的基因产物。所述pLP2携带HIV-1的REV蛋白的基因序列。所述pLP/VSVG编码水泡性口炎病毒的表面蛋白，和包含包装序列、RRE（Rev应答元件）序列和在HIV-1的3’末端处缺失的LTR（长末端重复序列）区的所述pLGFP构成慢病毒载体的基因组。追踪GFP的表达，作为在进入后并直至整合的复制循环阶段的完成的指示。通过荧光显微术来追踪结果，并且观察到在MT4vim(s)和MT4K-10(s)的培养物中荧光细胞的减少，相比于MT4细胞而言（数据未显示）。通过流式细胞术来分析样品，并且观察到，在MT4vim(s)中和在MT4K-10(s)中由于GFP的表达而引起的荧光细胞的百分比降低了大约70%，相对于未沉默的MT4的培养物来说（图4）。
实施例3.MT4细胞的中间丝的结构的变换。
首先，将MT4、MT4vim(s)和MT4K-10(s)细胞在4℃下用3.2%戊二醛固定1小时，随后在4℃下在2%四氧化锇中固定1小时。然后，用pH 7.2的0.1M磷酸缓冲盐水（PBS）进行洗涤，并且在浓度渐增的乙醇（30、50、70和100%）中进行脱水（每次10分钟），在4℃下。进行包埋，用超薄切片机（NOVA,LKB）制备40-50nm厚的超薄切片，并置于400目的镍网上。在进行超薄切片并将其置于网中之后，用饱和乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行对比染色，并且用JEOL JEM 2000EX显微镜（JEOL）进行检查。分析了具有不同放大倍数的总共五张显微照片。在图5中，在MT4细胞中（A）观察到完整的IF，而在MT4vim(s)细胞中（B）和在MT4K-10(s)细胞中（C）观察到缩短的这些结构。在图版D中，观察到由使MT4细胞中的波形蛋白的结构解装配的肽（标识为SEQ ID No.1的肽）所引起的对于IF的该效应。在这些条件下，观察到病毒复制的抑制。在IF中通过免疫显微术鉴定出波形蛋白或角蛋白-10。
实施例4.抑制在MT4细胞中的HIV复制的合成肽。
合成具有相应于人角蛋白-10、人角蛋白1和人波形蛋白的氨基酸序列的肽（Goldman RD,Khuon S,Hao Chou Y,Opal P,Steinert PM1996,J Cell Biol 134:971-983；Steinert PM,Yang JM,Bale SJ,Compton JG 1993,BBRC 197:840-848）。这些肽之一在其C末端缀合有穿透肽（Vallespi MG,Fernandez JR,Torrens I,Garcia I,Garay H,Mendoza O等人,2009,J Peptide Science 16:40-47）。在不同的病毒株（HXB1（HIV-1 IIIB）和Bru）存在下，通过采用使用总病毒的攻击系统来评价所述肽的抗-HIV活性。在病毒攻击前，将MT4细胞系与所述肽一起温育24小时。使用0.01和0.05的moi值来进行测试，并且对于每个实验变化方案设想了九次重复。通过ELISA类型的测定法来测定细胞培养物中病毒抗原p24的值，并且将结果表示为相关于肽浓度的病毒抑制百分比或感染百分比。在用高的病毒浓度（SEQ ID No.1，图6A）和以0.01的moi（图6B）攻击培养物时，在所述肽存在下均观察到病毒复制的重大抑制。所述肽的IC50处于nM的水平。
实施例5.在外周血单核细胞中肽对于HIV-1的抑制。
通过Ficoll密度梯度从健康个体的全血中获得PBMC。将所述细胞在含有20% FBS、100U/mL白介素2（IL-2）和5ug/mL植物凝集素（PHA）的RPMI培养基中预刺激2天。然后，在不含PHA的培养基中进行维持，并且在96孔平板中接种150000个细胞/孔。24小时后，添加不同浓度的肽，并且以0.01的moi用Bru株感染培养物。将培养物再维持7天，并且每3天更换培养基并重新添加肽。收获培养物，并收集上清液以用于评价病毒蛋白质p24的存在情况。所述肽以依赖于剂量的方式抑制HIV-1的复制（图7）。当用HIV-1的BaL1株感染培养物时，获得了类似的在nM范围内的IC50结果。
实施例6.合成肽对于HIV-2的抑制。
通过Ficoll密度梯度从健康个体的全血中获得PBMC。将所述细胞在含有20% FBS、100U/mL IL-2和5ug/mL PHA的RPMI培养基中预刺激2天。然后，在不含PHA的培养基中进行维持，并且在96孔平板中接种150000个细胞/孔。24小时后，添加不同浓度的肽，并且用HIV-2的CBL-20株感染培养物。将培养物再维持7天，并且每3天更换培养基并重新添加肽。收获培养物，并收集上清液以用于评价病毒蛋白质p24的存在情况。所述肽以依赖于剂量的方式抑制HIV-2的复制（图8）。
实施例7.在标识为SEQ ID No.1、4、5、7、8和9的肽存在下波形蛋白的减少。
将MT4细胞系与50uM的每种肽一起温育24小时。通过Western印迹技术来进行波形蛋白的检测。将重悬浮在1%十二烷基硫酸钠（SDS）中的细胞提取物施加在10%聚丙烯酰胺凝胶中，然后转移至Hybond-P纤维素膜。关于免疫鉴定，使用抗波形蛋白和抗β-肌动蛋白（作为对照）的单克隆抗体。使用与过氧化物酶相缀合的抗小鼠IgG的抗体作为二抗。过氧化物酶的活性通过在过氧化氢和PBS存在下使用二氨基联苯胺来显现。在用所述肽进行处理的MT4细胞中，波形蛋白减少（图9）。
实施例8.标识为SEQ ID No.1和3的肽的细胞穿透。
将HeLaCD4+细胞接种在含有10% FBS的RPMI中，并进行温育直至保证60%的单层汇合。以50000个细胞/孔，将MT4细胞接种在含有10%FBS的RPMI中。将标识为SEQ ID No.1和3的肽在注射用水中进行重构，并且以5、10、20和40uM的浓度进行评价。将所述肽在37℃下在5% CO2的气氛中温育24小时，并且在15、30和60分钟时对穿透进行评价。在每个时间段过后，收获细胞并立即在流式细胞仪中进行分析。每个实验变化形式包括三次重复。在图10中可以观察到，所述肽自发地穿透到MT4细胞系中。
实施例9.结合波形蛋白的脂质衍生物抑制HIV-1的复制。
已知环戊烷前列腺素15-脱氧-Δ-12,14-PGJ2（15d-PGJ2）结合波形蛋白（Stamatakis K,Sánchez-Gómez FJ,Pérez-Sala D 2006,J AmSoc Nephrol 17:89-98）。在本发明中证明，15d-PGJ2在体外抑制HIV的复制。在用HIV-1（Bru株）攻击的MT4细胞上进行抗病毒活性测试。将细胞与不同浓度的15d-PGJ2一起进行温育，然后以0.01的moi用HIV-1进行攻击。在5天的温育期后，收获培养物并评价上清液中的病毒蛋白质p24（图11）。
实施例10.合成肽和15d-PGJ2对于被HIV-1感染的患者的PBMC的效应。
通过Ficoll密度梯度从被HIV-1感染的个体的全血中获得PBMC。对所述细胞进行预刺激，并且用肽进行处理（以与实施例5中相同的形式），或者用5uM的15d-PGJ2进行处理。通过用ELISA方法测定培养物上清液中抗原p24的浓度来进行复制的评价。相对于未处理的细胞而言，在用所述肽或者用所述脂质衍生物进行处理的PBMC中p24值显著降低（表1），这是通过用这些化合物进行处理而引起的对于HIV复制的抑制的指示。
表1.在用所述肽或15d-PGJ2离体处理的被感染个体的PBMC中HIV-1抑制的百分比
| 化合物 | HIV-1抑制的% |
| 肽1（SEQ ID No.1） | 89.3 |
| 肽2（SEQ ID No.2） | 81.1 |
| 肽3（SEQ ID No.3） | 85.3 |
| 肽4（SEQ ID No.4） | 84.9 |
| 肽5（SEQ ID No.5） | 82.1 |
| 肽6（SEQ ID No.6） | 80.5 |
| 肽7（SEQ ID No.7） | 83.7 |
| 肽8（SEQ ID No.8） | 86.7 |
| 肽9（SEQ ID No.9） | 81.3 |
| 肽10（SEQ ID No.10） | 83.4 |
| 15d-PGJ2 | 80.1 |
根据在实施例3中所描述的方法，通过透射电子显微术来分析IF的结构，并且观察到，在用所述肽或者用所述脂质衍生物进行处理的个体的PBMC中，IF处于大大缩短的状态，相对于未处理的细胞而言。
实施例11.针对波形蛋白和角蛋白-10的干扰RNA抑制在被感染的患者的PBMC中的HIV。
通过Ficoll密度梯度从被HIV-1感染的个体的全血中获得PBMC。将所述细胞在含有20% FBS、100U/mL IL-2和5ug/mL PHA的RPMI培养基中预刺激2天。然后，在不含PHA的培养基中进行维持，并且用慢病毒载体pLenti-shRNAvim或pLenti-shRNAK-10（其分别携带编码使波形蛋白和角蛋白-10沉默的RNA发夹的序列）进行转导。根据在实施例2中所描述的来获得所述载体。通过用ELISA方法测定培养物上清液中抗原p24的浓度来进行复制的评价。就波形蛋白而言或者就角蛋白-10而言经沉默的PBMC显示出高的对于病毒复制的抑制，相对于就该蛋白质而言未沉默的培养物来说（表2）。
表2.在用对于波形蛋白或角蛋白-10特异的shRNA进行转导的被感染个体的PBMC中HIV-1抑制的百分比
| 被感染个体的PBMC | HIV-1抑制的% |
| 用pLenti-shRNAvim转导的PBMC | 89.5 |
| 用pLenti-shRNAK-10转导的PBMC | 75.6 |
根据在实施例3中所描述的方法，通过透射电子显微术来分析IF的结构，并且观察到，在用所述慢病毒载体进行转导的个体的PBMC中，IF处于缩短的状态，相对于未转导的细胞而言。
实施例12.用包含标识为SEQ ID No.1和2的肽的制剂来治疗被HIV-1感染的患者。
用包含标识为SEQ ID No.1的肽的制剂或者用包含标识为SEQ IDNo.2的肽的制剂来治疗八位HIV-1血清阳性的患者，这些患者具有少于一年的诊断以及大于350个细胞/mm3的CD4+T细胞的值。所述肽以150mg/天进行施用，并且在病毒载量和CD4+T细胞的计数方面追踪所述患者6个月。在治疗后，在所述患者的两位中病毒载量是不可检测的，并且在六位患者中降低超过1.5log。另外，七位患者显示出以大于50个细胞/mm3的数目的CD4+T细胞的增加，而在一位患者中CD4+T细胞的值降低。在用标识为SEQ ID No.1的肽进行治疗的患者的两位中和在用标识为SEQ ID No.2的肽进行治疗的患者的三位中，根据在实施例3中所描述的方法，通过透射电子显微术来分析PBMC的IF的结构。在所有情况下，在IF中均观察到缩短。
Claims (31)
1.抑制在哺乳动物细胞中的人免疫缺陷病毒（HIV）复制的方法，其包括扰乱或打断细胞骨架的中间丝（IF）的结构。
2.权利要求1的方法，其中所述IF包含波形蛋白和/或角蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述IF包含波形蛋白和/或角蛋白-10。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其包括降低所述IF中波形蛋白和/或角蛋白-10的量。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其包括降低编码波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的表达。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述IF的扰乱通过选自多肽、肽、核酸和化学化合物的试剂来达到。
7.权利要求6的方法，其中所述试剂为肽，该肽选自标识为SEQID No.1至SEQ ID No.10的肽以及其同源物。
8.权利要求6的方法，其中所述试剂为针对波形蛋白和/或角蛋白-10的基因或其转录物的干扰RNA（iRNA）或反义寡核苷酸。
9.权利要求6的方法，其中所述试剂为化学化合物或脂质衍生物。
10.扰乱细胞骨架的IF的试剂在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中所述IF包含波形蛋白和/或角蛋白。
12.根据权利要求11的用途，其中所述IF包含波形蛋白和/或角蛋白-10。
13.根据权利要求10-12中任一项的用途，其中所述试剂诱导所述IF中波形蛋白和/或角蛋白-10的量的降低。
14.根据权利要求10-13中任一项的用途，其中所述试剂实现编码波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的表达的降低。
15.根据权利要求10-14中任一项的用途，其中所述试剂选自多肽、肽、核酸和化学化合物。
16.根据权利要求15的用途，其中所述试剂包括肽，该肽选自标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽以及其同源物。
17.根据权利要求15的用途，其中所述试剂为针对波形蛋白和/或角蛋白-10的基因或其转录物的干扰RNA（iRNA）或反义寡核苷酸。
18.根据权利要求17的用途，其中所述iRNA选自siRNA、shRNA和miRNA。
19.根据权利要求18的用途，其中所述iRNA包含与波形蛋白和/或角蛋白-10的信使RNA的区域互补的15至50个核苷酸，优选地18至25个核苷酸的序列。
20.根据权利要求15的用途，其中所述化学化合物为脂质化合物或脂质衍生物。
21.根据权利要求20的用途，其中所述脂质化合物为环戊烷前列腺素15-脱氧-Δ-12,14-PGJ2。
22.用于预防或治疗HIV感染的药物组合物，其包含扰乱细胞骨架的IF的试剂和药学上可接受的载体或赋形剂。
23.根据权利要求22的组合物，其中所述试剂选自扰乱IF的多肽、肽、核酸和化学组合物。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述试剂为肽，该肽选自标识为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽以及其同源物。
25.根据权利要求23的组合物，其中所述试剂为针对波形蛋白和/或角蛋白-10的基因的干扰RNA（iRNA）或反义寡核苷酸。
26.根据权利要求25的组合物，其中所述iRNA选自siRNA、shRNA或miRNA。
27.根据权利要求23的组合物，其中所述化学化合物为脂质化合物或脂质衍生物。
28.根据权利要求27的组合物，其中所述脂质化合物为环戊烷前列腺素15-脱氧-Δ-12,14-PGJ2。
29.药物组合，其包含扰乱细胞骨架的IF的试剂，以及抗-HIV药物。
30.根据权利要求29的药物组合，其中所述试剂和所述药物在同一治疗过程中同时地、分开地或顺次地进行施用。
31.在有此需要的个体中治疗或预防HIV感染的方法，其包括向所述个体施用治疗有效剂量的根据权利要求22-28中任一项的药物组合物或者根据权利要求29-30中任一项的药物组合。
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