MX2012011424A - Metodo para inhibir la repilacion del virus de la inmunodeficiencia humana en celulas de mamiferos y en humanos. - Google Patents

Metodo para inhibir la repilacion del virus de la inmunodeficiencia humana en celulas de mamiferos y en humanos.

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Leyva Leonor Margarita Navea
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Abstract

La presente invención describe un método para inhibir la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) mediante la modulación negativa o alteración del citoesqueleto, específicamente de proteínas que forman parte de los filamentos intermedios del citoesqueleto, más específicamente de las proteínas vimentina y/o queratina-10; la intervención sobre la estructura de estas proteínas causa una inhibición de la replicación del virus en células humanas; la invención se relaciona además con el uso de agentes, que comprenden péptidos y/o ARN interferentes y/o compuestos lipídicos, y producen la modulación negativa o alteración del citoesqueleto celular, para prevenir o tratar la infección por el VIH; la invención proporciona medios y métodos para alterar la estructura del citoesqueleto/filamento de la célula, lo que interfiere con la infección por VIH de las células humanas y que puede incluso ser inhibida completamente; el citoesqueleto es alterado al reducir la cantidad de vimentina y/o queratina-10 (por ejemplo, por control transcripcional utilizando ARN interferentes) o mediante el uso de péptidos que alteran el citoesqueleto.

Description

METODO PARA INHIBIR LA REPLICACION DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS Y EN HUMANOS CAMPO DE LA TECNICA La presente invención está relacionada con el campo de la biomedicina, en particular con la terapéutica contra infecciones, y en especial contra la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Describe un método para inhibir la replicación del VIH mediante la alteración del citoesqueleto celular, específicamente proteínas que forman parte de los filamentos intermedios (Fl) del citoesqueleto. Se relaciona además con el uso de agentes que modulan negativamente o alteran el citoesqueleto celular para la fabricación de medicamentos para la prevención y el tratamiento de la infección por el VIH.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Entre los acontecimientos sanitarios mundiales más importantes que se han registrado en los últimos 30 años está la aparición de la pandemia de VIH/ síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), y con ella el desarrollo de tratamientos antirretrovíricos capaces de detener la progresión de la infección y de reducir la mortalidad (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG. Boletín de la Organización Mundial de la Salud 2009; 87: 488-488).
El reporte de Onusida para 2008 estimó que había 33 millones de personas infectadas por el VIH, de los cuales 2.7 millones eran nuevos casos surgidos ese mismo año. Se calcula que el 67% de las infecciones corresponden al África subsahariana (Report on the global AIDS epidemic 2008. Geneva, UNAIDS). Según un boletín emitido por la Organización Mundial de la Salud en el 2009, se sugiere la existencia de dos grandes tendencias a nivel mundial. Por una parte, la afectación general de toda la población en el África subsahariana, y por otra una concentración de la infección en grupos de riesgo específicos en el resto del mundo (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG 2009. Boletín de la Organización Mundial de la Salud 87: 488-489).
La incidencia anual de infección por VIH alcanzó su máximo a mediados de los años noventa (Bongaarts J, Buettner T, Heilig G, Pelletier F. Popul Dev Rev 2008; 34: 199-224). Sin embargo, el número absoluto de personas infectadas por el virus sigue aumentando en África, debido a una incidencia persistentemente elevada y al ritmo de crecimiento de la población (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG 2009. Boletín de la Organización Mundial de la Salud 87: 488-489).
La aparición de resistencia del VIH contra las drogas anti-VIH disponibles actualmente y la pobre adherencia al tratamiento continúan siendo las causas principales de fallo de la terapia. La resistencia viral se observó desde que comenzó a utilizarse la monoterapia con un antirretroviral, lo que llevó a la aparición de la terapia combinada que utiliza dos o más agentes anti-VIH, generalmente con diferente vía de acción. Con la introducción de la terapia antirretroviral de gran actividad (del inglés highiy active antiretroviral therapy, abreviado HAART) se logró una reducción significativa de la morbilidad y la mortalidad en los pacientes tratados. Esta terapia combina inhibidores nucleosídicos de la reverso transcriptasa, inhibidores no nucleosídicos de la reverso transcriptasa e inhibidores de la proteasa. Sin embargo, la terapia multi-fármaco no elimina completamente el VIH, y el tratamiento a largo plazo generalmente resulta en resistencia a varios fármacos. La mitad de los pacientes que reciben la terapia combinada anti-VIH no responden completamente al tratamiento, fundamentalmente debido a la resistencia viral a uno o más fármacos utilizados. También se ha observado resistencia viral en individuos recién infectados, lo que limita grandemente las opciones de terapia para estos pacientes.
Los éxitos de la terapia combinada llevaron a pensar en la posibilidad de erradicar el virus, sin embargo, se conoce que existen reservónos virales en células latentemente infectadas y también en tejidos donde el virus persiste a pesar de la terapia. Se estima que se necesitarían más de 70 años de tratamiento continuo para erradicar los reservónos virales, lo cual es improbable, ya que la terapia conlleva muchos efectos secundarios y en ocasiones, complicaciones metabólicas fatales, tales como acidosis láctica, diabetes mellitus, lipodistrofia, pancreatitis y otras (Iglesias E 2009.
Biotecnología Aplicada 26: 189-194).
La adherencia al tratamiento es uno de los temas más polémicos relacionados con la terapia antirretroviral de gran actividad, y específicamente con los inhibidores de proteasa, debido a la rapidez con que puede aparecer resistencia si los fármacos se toman irregularmente o se suspende su administración. Los factores que condicionan la no adherencia al tratamiento son varios, y van desde intolerancia a los medicamentos, incomodidad de los regímenes, fallo terapéutico, interacciones con medicamentos, problemas socioeconómicos, entre muchos otros.
La terapia combinada retarda la progresión a sida, sin embargo, no cura a los pacientes infectados (Marsden MD, Zack JA 2009. J Antimicrob Chemoth 63: 7-10). Aunque esta terapia ha conseguido que la infección por VIH se haya convertido en un problema crónico en vez de mortal y la esperanza de vida de los pacientes sea similar a la de la población general, presenta serios problemas, por lo que resulta imprescindible la búsqueda de estrategias para disminuir el empleo de los antirretrovirales, de ahí el interés en conseguir nuevas variantes terapéuticas.
Las desventajas de las terapias antirretrovirales disponibles apoyan la necesidad de nuevos fármacos antirretrovirales diferentes en sus mecanismos y/o blancos de acción. Un objeto de la invención es proporcionar un método para inhibir la replicación y/o infección del VIH. Es un objeto adicional de la invención proporcionar un método para inhibir la replicación y/o infección del VIH que tiene un mecanismo diferente al de la inhibición de la polimerasa del VIH o la inhibición de la proteasa del VIH. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para inhibir la replicación y/o infección del VIH teniendo como blanco la célula huésped y no el virus. Concretamente, un objeto de la invención es usar como blanco el citoesqueleto y más específicamente los filamentos intermedios (Fl) de la célula huésped. Específicamente otro objeto de la invención es usar como blanco las proteínas del huésped vímentina y/o queratina-10. Al usar como blanco a la célula huésped se cree que debe ser más difícil para el VIH producir mutantes de escape. La vimentina y la queratina-10 son importantes para la estructura de los IFs y la presente invención demostró que son un blanco importante para inhibir el VIH. Otro objeto de la invención es proporcionar agentes y composiciones farmacéuticas que alteran los Fl de una célula o disminuyen la cantidad de vimentina y/o queratina-10 de la célula huésped.
Al menos uno de los objetos mencionados anteriormente es alcanzado por la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la alteración del citoesqueleto como método para inhibir la replicación y/o infección del VIH. El citoesqueleto es una red tridimensional que contribuye a la integridad de la célula y realiza diferentes funciones celulares. Está formado por tres tipos de estructuras: Los microtúbulos, los microfilamentos y los filamentos intermedios (Fl). Estos últimos están formados por un conjunto de proteínas, específicas para cada tipo celular, entre las que se encuentran la vimentina y la queratína-10.
La vimentina es una proteína de 58 kDa de peso molecular (PM), que forma los llamados Fl y se expresa típicamente en células endoteliales de los vasos sanguíneos, en algunas células epiteliales y en células mesenquimales (Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P 2002. Molecular Biology of the Cell, 4th ed., Garland Publishing, New York). Se conoce que la vimentina es sustrato de la proteasa del VIH (PR), y se ha propuesto que la acción de la PR sobre esta proteína, y sobre otros elementos, puede afectar la estructura del citoesqueleto (Blanco R, Carrasco L, Ventoso I 2003. J Biol Chem 278: 1086-1093). También se ha demostrado que los péptidos del extremo N-terminal, obtenidos por cortes proteoliticos de la vimentina, son capaces de modificar la arquitectura del núcleo celular, fenómeno que se aprecia en células infectadas por el VIH (Shoeman RL, Hüttermann C, Hartig R, Traub P 2001. Mol Biol Cell 12:143-154). Las evidencias anteriores sugieren que el VIH requiere escindir a la proteína vimentina durante su ciclo de vida.
Las queratinas son un grupo de proteínas (de alrededor de 30 miembros) de los Fl, con un rango de PM de 10-68 kDa. Han sido clasificadas y enumeradas sobre la base de su PM y su comportamiento electroforético como: ácidas (pKi = 4-6; tipo I) y neutrobásicas (pKi = 6-8; tipo II). La queratina-10 es una queratina de tipo I, de aproximadamente 60 kDa, presente en los Fl de las células epidérmicas totalmente diferenciadas, fundamentalmente (Zhou XM 1988. J Biol Chem 263: 15584-9).
La presente invención describe un método para inhibir la replicación y/o infección del VIH en células de mamíferos mediante la modulación o alteración de la estructura de los Fl del citoesqueleto en dichas células de mamífero. Además la presente invención también está dirigida a un agente que altere los Fl del citoesqueleto para prevenir o tratar la infección por el VIH.
En un primer aspecto, presente la invención proporciona un método para inhibir la replicación del VIH en células de mamífero, dicho método consiste en alterar o modular negativamente la estructura de los Fl del citoesqueleto en células de mamífero. En particular, dichas células de mamífero son las células blanco de la infección por el VIH.
En una realización preferida de dicho método, los Fl comprenden las proteínas vimentina y/o queratina-10.
En otra realización preferida de dicho método, el método comprende la disminución de la cantidad de vimentina y/o queratina-10 de los Fl para alterar o modular negativamente los Fl del citoesqueleto (estructura) y/o disminuir la cantidad de vimentina y/o queratina-10 libre para formar nuevos Fl.
En otra realización preferida de dicho método, el método comprende la disminución (o inhibición) de la expresión de los genes que codifican las vimentina y/o queratina-10 para alterar o modular negativamente los Fl del citoesqueleto.
En otra realización preferida de dicho método, la alteración de los Fl se logra mediante la administración de una dosis terapéutica efectiva de un agente seleccionado de un grupo conformado por polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos a dichas células de mamífero. En una realización preferida, dicho agente es un péptido seleccionado del grupo de "péptidos identificado como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10 y sus homólogos. En otra realización preferida, dicho agente es un ARN interferente o un oligonucleótido antisentido dirigidos a los genes de vimentina y/o queratina-10 o sus transcriptos. En otra realización preferida, dicho agente es un compuesto químico o un derivado lipídico.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un agente que altere o module negativamente los IFs del citoesqueleto para prevenir o tratar la infección por VIH. En una realización preferida de este aspecto, dichos IFs comprenden vimentina y/o queratina-10.
En otra realización preferida de un agente de acuerdo a la invención, dicho agente induce una disminución en la cantidad de vimentina y/o queratina-10 en dichos IFs. En otra realización preferida de tal agente, el agente disminuye la expresión de los genes que codifican vimentina y/o queratina-10.
En otra realización preferida del agente de acuerdo a la invención, dicho agente se selecciona de un grupo que consiste de polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos.
En otra realización preferida del agente de acuerdo a la invención, dicho agente comprende un péptido seleccionado del grupo de péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10 y sus homólogos.
En otra realización preferida del agente de acuerdo a la invención, dicho agente es un ARN interferente o un oligonucleótido antisentido, dirigido a los genes de vimentina y/o queratina-10 o sus transcriptos.
En otra realización preferida del agente de acuerdo a la presente invención, dicho agente es un ARN interferente seleccionado de un grupo conformado por un siRNA, shRNA y miRNA. Preferiblemente, dicho ARN interferente consta de una secuencia de 15 a 50 nucleótidos complementarios a una región de un ARN mensajero de las proteínas vimentina y/o queratina-1 0, preferentemente de 18 a 25 nucleótidos.
En otra realización preferida del agente de acuerdo a la invención, dicho agente es un compuesto químico y dicho compuesto es un compuesto lipídico o un derivado lipídico. Preferentemente dicho compuesto lipídico es prostaglandina ciclopentano 15 deoxy-?-1 1 -PGJ2 (15d-PGJ2).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la infección por el VIH que comprende al agente que altera o modula negativamente los IF del citoesqueleto de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente, y un excipiente adecuado farmacéuticamente.
En una realización preferida de una composición de acuerdo con la invención, dicho agente se selecciona de un grupo que consiste de polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos que alteren los IF conformados por la vimentina y/o la queratina- 0.
En una realización preferida de una composición de acuerdo con la invención, dicho agente es un péptido seleccionado del grupo que consiste de los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10 y sus homólogos.
Preferiblemente, dicho agente es un ARN interferente o un oligonucleótido antisentido, dirigido a los genes de la vimentina y/o queratina-10 o sus transcriptos.
En una realización muy preferida de un agente de acuerdo a la invención, dicho agente es para uso en el tratamiento o la prevención de la infección por el VIH, o para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección por el VIH. El tratamiento o la prevención de la infección por el VIH incluyen la inhibición o el bloqueo de la replicación viral.
En una realización preferida de dicha composición farmacéutica el ARN interferente es seleccionado de un grupo conformado por siRNA, shRNA o miRNA.
En una realización preferida de dicha composición farmacéutica el compuesto químico es un compuesto Iipídico o un derivado Iipídico. Preferiblemente, dicho compuesto Iipídico es prostaglandina ciclopentano 15 deoxy-A-12J4-PGJ2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una combinación farmacéutica que comprende a un agente que altera los Fls del citoesqueleto de conformidad con lo descrito en la presente invención y al menos un fármaco anti-VIH. Ejemplos de fármacos anti-VIH para uso en aspectos de la presente invención incluyen inhibidores de la proteasa del VIH, más preferentemente el inhibidor de la proteasa que se selecciona del grupo que consiste de: atazanavir (Reyataz™), amprenavir (Agenerase™), darunavir (Prezista™), nelfinavir (Viracept™), saquinavir (Invirase™ o Fortovase™), indinavir (Crixivan™), fosamprenavir (Lexiva™ o Telzir™), lopinavir (Aluvia™), ritonavir (Norvir™), tipranavir (Aptivus™), derivados funcionales de estos fármacos y combinaciones de ellos tales como: lopinavir + ritonavir (Kaletra™). Otros medicamentos antirretrovirales que pueden utilizarse en la presente invención son inhibidores de la transcriptasa reversa (INNTR) tales como: efavirenz (Stocrin™) y nevirapine (Viramune™), etravirine (Intelence™), rilpivirine (TMC-278), loviride (R89439), delavirdine (Rescriptor™), derivados funcionales de estos fármacos y combinaciones de ellos. Otros medicamentos antirretrovirales que pueden utilizarse en los aspectos de la presente invención son inhibidores de la transcriptasa reversa nucleósidos (INTRs) o inhibidores análogos de nucleósidos de la transcriptasa reversa (lANTRs) como: lamivudine (3TC o Epivir™), abacavir (Ziagen™), zidovudine (AZT o Retrovir AZT™), stavudine (d4T o Zerit™), zalcitabine (ddC o Hivid™), didanosine (ddl o Videx™), emtricitabine (FTC o Emtriva™), tenofovir (Viread™), apricitabine (AVX754), stampidine, elvucitabine (L-Fd4C), racivir, amdoxovir, derivados funcionales de estos fármacos y combinaciones de ellos tales como: emtricitabine + tenofovir (Truvada™), zidovudine + lamivudine (Combivir™), y abacavir + lamivudine + zidovudine (Trizivir™).
Además de los medicamentos antirretrovirales antes mencionadas, la combinación farmacéutica de la presente invención puede comprender combinaciones de las distintas clases de medicamentos antirretrovirales enumerados anteriormente, tales como las combinaciones: efavirenz + zidovudine + lamivudine, efavirenz + tenofovir + emtricitabine, lopinavir con pulso de ritonavir + zidovudine + lamivudine, y lopinavir con pulso de ritonavir + tenofovir + emtricitabine.
En una realización preferida de una combinación farmacéutica según la invención los agentes y los medicamentos se administran simultáneamente, por separado o en forma secuencial, como parte de un régimen de dosificación.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir la infección del VIH en un individuo que lo necesite, que comprende la administración a dicho individuo de una dosis terapéutica efectiva de una composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 20-26 o una combinación farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 27-28.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1 B. Intensidad relativa de las proteínas vimentina y queratina-10 humanas identificadas por proteómica comparativa. La figura 1A muestra la disminución de la proteína vimentina en los cultivos tratados con un extracto con actividad anti-VIH. La figura 1 B muestra la disminución de la proteína queratina-10 en los cultivos tratados con el extracto con actividad anti-VIH. Las barras de error significan desviación estándar.
Figuras 2A-2B. Detección de las proteínas vimentina y queratina-10 en cultivos establemente silenciados de cada una de estas proteínas. La evaluación de vimentina (Figura 2A) y queratina-10 (Figura 2B) se realizó mediante western blot en la línea celular MT4, en MT4v¡m(s) y en MT4K-io(S)- Los cultivos silenciados mostraron disminución de la expresión de las proteínas con relación al cultivo de MT4. La proteína S-actina se utilizó como normalizadora del western blot. Cada variante ocupa dos carrileras. En esta figura K-10 es una abreviatura de queratina-10.
Figura 3. Inhibición de la replicación del VIH-1 en MT4v¡m(5) y en MT4K-IO(S), evaluada a través del antígeno p24. Los cultivos de células MT4, de MT4v¡m(S) y de MT4K-io(s) se retaron con la cepa Bru del VIH-1 , a una multiplicidad de infección (del inglés multiplicity of infection, abreviado moi) de 0.01. En las células MT4Vim(s) y MT4K-IO(S) se inhibió la replicación viral más de un 90%. Las barras de error significan desviación estándar.
Figuras 4A-4B. Ensayo de reto con el vector lentiviral pLGW en MT4, MT4v¡m(S) y en MT4K-io(S)- Los cultivos celulares se transdujeron con un vector lentiviral que mimetiza las primeras etapas del ciclo replicativo del VIH-1 después de la entrada y porta el gen reportero que codifica la GFP. (Figura 4A) Los cultivos de MT4v¡m(s) y en MT4K-io(S) mostraron una disminución del por ciento de células fluorescentes cuando se transdujeron con el lentivirus, con relación a los cultivos de células MT4. Las barras de error significan desviación estándar. (Figura 4B) Histogramas obtenidos del análisis de los cultivos por citometría de flujo.
Figuras 5A-5D. Análisis estructural de los Fl en cultivos de MT-4. Cultivos celulares de MT4, MT4v¡m(S) y en MT4K-IO(S) se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión. Los cultivos silenciados (Figuras 5B, 5C) mostraron un acortamiento de los filamentos a diferencia de la presencia de filamentos alargados en los cultivos de MT4 que se utilizaron como control (Figura 5A). En la figura 5D los Fl aparecen fragmentados por la acción del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 sobre las células MT4.
Figuras 6A-6B. Inhibición de la replicación del VIH-1 , por los péptidos, en la línea celular MT4. (Figura 6A) Las células estuvieron en contacto con el péptido 24 horas y se retaron con la cepa HXB1 a una moi de 0.05. Se observaron altos por cientos de inhibición de la replicación viral que aumentaron con la concentración peptídica. Las barras de error significan desviación estándar. (Figura 6B) Las células estuvieron en contacto con los péptidos 24 horas y se retaron con la cepa Bru a una moi de 0.01 . La concentración inhibitoria 50 (IC50) de los péptidos resultó estar a nivel nanomolar.
Figura 7. Inhibición de la replicación del VIH-1 , por los péptidos, en células mononucleares de sangre periférica (del inglés Peripheral Blood Mononuclear Cells, abreviado PBMC). Las PBMC se preestimularon, se trataron con diferentes concentraciones de los péptidos y se infectaron con la cepa Bru del VIH-1. Los péptidos inhibieron la replicación del VIH-1 de manera dependiente de la dosis.
Figura 8. Inhibición de la replicación del VIH-2 por el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 . Las PBMC se preestimularon, se trataron con diferentes concentraciones de los péptidos y se infectaron con la cepa CBL-20 del VIH-2. Los péptidos inhibieron la replicación del VIH-2 de manera dependiente de la dosis.
Figura 9. Disminución de vimentina en presencia de los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 , 4, 5, 7, 8 y 9. La línea celular MT4 se incubó con los péptidos, a 50 uM, durante 24 horas. La detección de la proteína vimentina se realizó mediante la técnica de western blot. Las bandas de vimentina aparecen disminuidas en los cultivos tratados con péptido.
Figuras 10A-10B. Evaluación de la internalización de los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 (Figura 10A) y 3 (Figura 10B) en la línea celular MT4. Gráfico de barras que representa el porciento de células fluorescentes indicativo de la penetración del péptido a las concentraciones de 5, 10, 20 y 40 uM y diferentes tiempos en la línea celular MT4. Ce: células no tratadas. Las barras de error significan desviación estándar.
Figura 11. Inhibición de la replicación del VIH-1 por un derivado lipídico. Las células MT4 se incubaron con diferentes concentraciones de prostaglandina ciclopentano 15 deoxy-A-12 14-PGJ2 (15d-PGJ2), y posteriormente se retaron con el VIH-1 (cepa Bru) a una moi de 0.01. La prostaglandina 15d-PGJ2 inhibió la replicación del VIH-1. Las barras de error representan la desviación estándar.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención resuelve el problema antes mencionado, al describir un método para inhibir la replicación del VIH mediante la modulación negativa o alteración del citoesqueleto celular, específicamente de proteínas que forman parte de los Fl del citoesqueleto.
A los propósitos de la invención dichos Fl pueden estar formados por queratinas ácidas y básicas; vimentina; desmina; factor ácido fibrilar glial; periferina; proteína del neurofilamento (NF); internexina; filensina; faquinina; y lamininas.
En una realización de la invención, dichos Fl están formados por las proteínas vimentina y/o queratinas. Más particularmente, los Fl pueden estar formados por vimentina y/o queratina-10. La intervención sobre la estructura de estas proteínas causa una inhibición de la replicación del virus en células humanas.
Se entiende por interrumpir o alterar los Fl del citoesqueleto que la estructura de los mismos se modifique o altere, debido a que se modulen negativamente las proteínas que forman los Fl del citoesqueleto y/o que se rompa la estructura de los Fl del citoesqueleto en subunidades más cortas y/o que se cambie la forma estructural de la red del citoesqueleto y/o que se desensamblen los Fl.
El citoesqueleto como se describe en este documento se refiere al andamio o esqueleto celular contenido en el citoplasma y que está hecho de proteínas. El citoesqueleto está presente en todas las células; juega un papel importante en la división celular y el transporte intracelular. Está formado por tres estructuras principales: microtúbulos, microfilamentos y los Fl. El citoesqueleto proporciona la estructura y la forma a la célula. Los elementos del citoesqueleto interactúan extensamente e íntimamente con las membranas celulares.
Los Fl tal como se define en el presente documento son una familia de proteínas relacionadas que comparten características comunes, estructurales y de secuencia. Los Fl tienen un diámetro promedio de 10 nanómetros, que está entre actina (microfilamentos) y microtúbulos. Las mayoría de los tipos de Fl son citoplasmáticos, pero un tipo, el laminas, son nucleares. Hay cerca de 70 genes diferentes que codifican para diversas proteínas de Fl, específicos para cada tipo de célula. Las proteínas vimentina y queratina-10 están entre ellos.
El término "vimentina", en este documento se refiere al miembro de la familia de las proteínas de los Fl identificada por la secuencia de referencia NCBI: NP_003371.2, identificada como SEQ ID NO:11.
La vimentina forma polímeros filamentosos en una serie de pasos de ensamblaje que comienza por dímeros dobles antiparalelos (o tetrámeros) para formar filamentos de longitud unitaria (en inglés, ULF) que se ensamblan longitudinalmente hasta formar el filamento completo.
El término "queratina", en este documento, se refiere a los miembros de la familia de proteínas estructurales fibrosas de los Fl. Las queratinas forman polímeros filamentosos en una serie de pasos de ensamblaje que comienza con dimerización; los dímeros forman tetrámeros y octámeros y, eventualmente, ULF capaces de unirse por los extremos para formar los filamentos largos.
Cada queratina tipo I es coexpresada con una queratina de tipo II específica y cada par de queratina que se forma es característico e indicativo de la diferenciación y la especialización de un tipo particular de célula epitelial.
El término "queratina-10", en este documento, se refiere a la queratina-10 de tipo I del citoesqueleto, es el miembro de la familia de proteínas de los Fl identificada en Swiss-Prot con el número: Q6EIZ0.1 , con la secuencia dada en SEQ ID NO: 12.
El término "gen", en este documento se refiere a una secuencia de ADN, incluyendo pero no limitándose a una secuencia de ADN que puede ser transcritas en ARNm que se traduce en cadenas de polipéptidos; transcritas en ARNr o ARNt o servir como sitio de reconocimiento para las enzimas y otras proteínas involucradas en la replicación de ADN, transcripción y regulación. El término se refiere a cualquier secuencia de ADN que comprende varios fragmentos de ADN unidos funcionalmente como una región promotora, una región 5' no traducida (del ingles 5' UTR), una región codificante (que puede o no puede codificar una proteína) y una región 3' no traducida (del inglés 3' UTR) que comprenda un sitio de poliadenilación.
Normalmente, los 5'UTR, la región codificante y la 3'UTR se transcriben en un ARN que, en el caso de un gen que codifica una proteína, se traduce en una proteína. El gen generalmente comprende intrones y exones.
El término "gen de la vimentina", en este documento se refiere al gen que codifica la proteína vimentina o a un homólogo.
El término "gen de queratina-10", en este documento se refiere al gen que codifica la proteína queratina-10 o un homólogo.
El término "alterar" usado aquí para hacer referencia a la alteración de los Fl, como se indica en el presente documento se refiere a la interferencia con la función o la organización estructural. En particular, la interrupción o alteración puede implicar rotura estructural, la inhibición de polimerización, la inhibición de formación y biosíntesis, incluida la inhibición de la formación de las estructuras primaria, secundaria y terciaria, etc. de las proteínas.
El término "modular negativamente" que se utiliza en el presente documento para hacer referencia a la modulación negativa de los Fl, se refiere a cambiar o alterar la función o la organización estructural de manera que resulta en la pérdida o disminución de la función biológica de dichos filamentos.
El término "filamentos intermedios del citoesqueleto (Fl)" en este documento, alude a los filamentos intermedios como un tipo de elemento del citoesqueleto, de tamaño intermedio en comparación con los microfilamentos y los microtúbulos. Estos tres elementos contribuyen a la integridad estructural, la forma de la célula y la motilidad celular y de los orgánulos.
Los Fl del citoesqueleto se dividen en cinco tipos: Tipo I y II: queratinas ácidas y básicas; las queratinas también tienen subtipos que son únicos para células epiteliales diferentes; tipo III: Vimentina presente en fibroblastos, células endoteliales y leucocitos; desmina en células musculares; factor ácido fibrilar glial en astrocitos y otros tipos de glía y periferina en las fibras nerviosas periféricas; tipo IV: las proteínas Neurofilamento (NF) H (pesado), M (medio) y L (bajo), internexina filensina y fakinina; y tipo V: laminínas.
El término "estructura de filamentos intermedios del citoesqueleto (IFs)" en este documento, se refiere a la organización helicoidal de tetrámeros de los filamentos. Cada monómero de filamento intermedio consta de un dominio de varilla helicoidal alfa que conecta los terminales amino (cabeza) y carboxilo (cola). La varilla se enrolla alrededor de otro filamento para formar un dímero. Se alinean los terminales N y C de cada filamento. Algunos Fl forman homodímeros; otros heterodímeros. Los dímeros entonces forman tetrámeros escalonados que se alinean cabeza-cola. Este tetrámero se considera la subunidad básica del filamento intermedio. El filamento intermedio final es una matriz helicoidal de estos tetrámeros.
En el contexto de esta especificación, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a cualquier uso para remediar un padecimiento o enfermedad o sus síntomas, o impedir el establecimiento de una afección o enfermedad o los síntomas, o impedir, dificultar o revertir la progresión d una afección o enfermedad o sus síntomas indeseables.
El término "dosis terapéutica efectiva", en este documento se refiere a una cantidad no tóxica del agente terapéutico suficiente para proporcionar el efecto terapéutico deseado, por ejemplo, para tratar, mitigar o prevenir una enfermedad deseada o condición, o exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede detectarse mediante, por ejemplo, marcadores químicos o niveles de antígeno. El efecto terapéutico también incluye la reducción en los síntomas físicos. La cantidad precisa y eficaz para un individuo dependerá del peso del mismo y de su estado de salud, de la naturaleza y el alcance de la condición y de la terapéutica o la combinación terapéutica seleccionada para la administración. Por lo tanto, no es útil especificar una cantidad exacta efectiva por adelantado. Sin embargo, la cantidad efectiva para una situación dada puede determinarse por la experimentación de rutina y está dentro del criterio del clínico.
A efectos de la presente invención, una dosis efectiva será de alrededor de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg o 0.05 mg/kg a 10 mg/kg de las composiciones de polinucleótido o polipéptido en la persona a la que se administra.
El término "excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable" que se utiliza en el presente documento se refiere a un excipiente para la administración de un agente terapéutico, tales como un polipéptido, polinucleótido y otros agentes terapéuticos. El término se refiere a cualquier excipiente farmacéutico que no induce la producción de anticuerpos perjudiciales para la persona que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad excesiva. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, poliméricos de aminoácidos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Dichos vehículos son bien conocidos que de ordinario habilidad en el arte. Los vehículos farmacéuticamente aceptables de las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además pueden estar presentes en dichos vehículos, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tampones y similares. Una discusión detallada de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Ciencias farmacéuticas. Remington (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Normalmente, las composiciones terapéuticas están dispuestas como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o en suspensiones o en formas sólidas, adecuadas tanto para la solución o suspensión en vehículos líquidos o para el consumo directo. Los liposomas están incluidos en la definición de un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, ya que son aerosoles.
El término "homólogo" en este documento, y al referirse a un péptido, se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos una identidad de secuencia del 70% establecida por la alineación de secuencias con, por ejemplo, Blast, etc., preferentemente al menos 75%, más preferentemente al menos el 85%, 90% o incluso un 95%, más preferentemente al menos el 97%, con las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10 y la capacidad de alterar, modular negativamente y/o modificar el citoesqueleto, específicamente las proteínas que forman los Fl del citoesqueleto y más precisamente las proteínas vimentina y queratina-10. Los homólogos apropiados son péptidos con sustituciones conservadoras de aminoácidos, preferentemente sustituciones de menos del 10% de los aminoácidos, más preferentemente menos del 5%, inferior al 3% y más preferentemente aun con menos de 1 % de los aminoácidos sustituidos. Preferentemente que se sustituyan menos de 10 aminoácidos, más preferentemente que se sustituyan menos de 5 y más preferentemente aún menos de 2 aminoácidos. Una sustitución conservadora es aquella en que un aminoácido es reemplazado por otro aminoácido muy similar, cuya sustitución tiene poco o ningún efecto sobre la actividad del péptido. Una "sustitución conservadora" es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene la misma carga neta electrónica y aproximadamente el mismo tamaño y forma. Los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticos sustituidos o alifáticos tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbono y heteroátomos en sus cadenas laterales difiere por no más de cuatro aproximadamente. Ellos tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramificaciones en sus cadenas laterales difiere por no más de uno. Se considera que los aminoácidos con grupos fenilos o fenilos sustituidos en sus cadenas laterales tienen el mismo tamaño y forma. A continuación se enumeran cinco grupos de aminoácidos. La sustitución de un aminoácido en un polipéptido con otro aminoácido del mismo grupo resulta en una sustitución conservadora: Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteina y aminoácidos no naturales con cadenas laterales C1 C4 alifáticas o C1 C4 alifáticas sustituidas hidroxilo (de cadena lineal o monoramificada). Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos no naturales con cadenas laterales alifáticas C1 C4 sustituido ácido carboxílico (no ramificadas o ramificadas en un punto). Grupo III: lisina, ornitina, arginina y aminoácidos no naturales con cadenas laterales alifáticas C1 C4 sustituidas amina o guanidino (no ramificadas o ramificadas en un punto). Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos no naturales con cadenas laterales alifáticas con C1 C4 sustituidas amida (no ramificadas o ramificadas en un punto). Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptófano.
El término "% de identidad de secuencia" se define aquí como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico que es idéntico a los nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico de interés, después de alinear las secuencias y opcionalmente introducir brecha, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Los métodos y programas de computación para alineamientos son bien conocidos en el estado del arte.
Los términos "secuencia de ácido nucleico" y "nucleotidos" en el presente documento también comprenden moléculas no naturales basadas y/o derivadas de secuencias de ácido nucleico, como por ejemplo secuencias de ácidos nucleicos artificialmente modificadas, los ácidos nucleicos-péptido, así como secuencias de ácido nucleico, que comprenden al menos un nucleótido modificado y/o nucleótido no natural, como por ejemplo la inosina.
El término "interferencia por ARN", se refiere al proceso donde un ARN ¡nterferente (iRNA) provoca la degradación intracelular de ARNm específico y puede utilizarse para interferir la traducción de un transcripto de ARNm diana deseado.
El termino ARN ¡nterferente se refiere a un agente ARN de doble o de simple cadena (iRNA), por el cual se entiende una molécula pequeña de acido nucleico usada para la interferencia por ARN. Los agentes iRNA cortos que tienen aproximadamente 15-30 nucleotidos de largo son referidos como "small-interfering RNA" o siRNA. Los agentes ¡RNA más largos son generalmente referidos como "ARN de doble cadena" o dsRNA, otras formas de agentes iRNA son mícroRNA (miRNA) y moléculas de ARN de horquilla corta (shRNA). Los agentes de iRNA pueden ser moléculas de ácido nucleico sin modificar o modificadas químicamente. Los agentes de iRNA pueden ser sintetizados químicamente o ser expresados en un vector o ser sintetizados enzimáticamente. El uso de un agente de iRNA modificado químicamente puede mejorar una o más propiedades de un agente iRNA a través del aumento de la resistencia a la degradación, del incremento de la especificidad al blanco o diana, absorción celular mejorada y similares.
Una molécula de ADN que se transcribe a ARN de doble cadena o siRNA (por ejemplo, como una horquilla dúplex) también proporciona interferencia por ARN. Moléculas de ADN para transcribir ARN de doble cadena se describen en la patente U.S. Pat. N° 6,573,099 y en las publicaciones de patentes de Estados Unidos No. 20020160393 y 20030027783. Las moléculas de ADN para transcribir siRNA se revisan en Tuschl y Borkhardt, Molecular Interventions, 2:158 (2002).
El término "ARN antisentido" en este documento, se refiere a cualquier ARN que enlaza a ARNm con suficiente afinidad para disminuir la cantidad de proteína traducida a partir del ARNm. La cantidad de proteína traducida desde el ARNm preferentemente es disminuida en más del 20%; más preferentemente disminuyó más del 50%, 70% y 80%; y más preferentemente disminución por más del 90%. Los métodos y materiales referidos a los ARN antisentidos son bien conocidos en el estado del arte.
El término "expresión", en este documento, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de sentido (ARNm) o ARN antisentido derivada del fragmento de ácido nucleico de la invención. Expresión también puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcriptos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana.
El término "inhibición de la expresión" se entiende por silenciamiento o regulación de un gen o ácido nucleico, que se refiere a una disminución detectable de la transcripción y/o la traducción de una secuencia de ácido nucleico diana, es decir, la secuencia diana del ¡RNA, o una disminución en la cantidad o la actividad de la secuencia o proteína diana en comparación con el nivel normal que se detecta en la ausencia del ¡RNA u otra secuencia de ácido nucleico. Una disminución detectable puede ser tan pequeña como un 5% o 10%, o tan grande como alrededor del 80%, 90% o 100%. Más generalmente, una disminución detectable es de aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70%.
El término "compuesto lipídico" en este documento, se refiere a ácidos grasos análogos derivados de, por ejemplo, ácidos grasos monoinsaturados, ácidos grasos poliinsaturados y lípidos que comprenden de enlaces triples 1 -6.
"VIH" es el virus de inmunodeficiencia humana, un retrovirus que causa inmunodeficiencia atacando células CD4+ del cuerpo. El término "VIH", en este documento, incluye cualquier VIH, incluidos todos los grupos y subtipos (clades) de VIH-1 y VIH-2, por ejemplo los grupos M y O del VIH-1 ; la invención abarca cada uno de los subtipos conocidos; preferentemente del VIH-1 .
El término "replicación" en este documento, se refiere al proceso en el que se sintetiza una cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico por una enzima polimerasa. En el contexto particular de la presente invención, el término replicación se utiliza aquí en referencia a un virus, refiere a la realización de un ciclo de vida viral completo, en donde las partículas virales infecciosas o viriones se unen a la superficie de la célula hospedera (generalmente enlazándose a una molécula de superficie específica de la célula que da la especificidad de la infección). Una vez dentro de la célula, los viriones son desnudados y los genes virales comienzan a expresar las proteínas necesarias para la replicación del genoma y la síntesis de nuevas proteínas para hacer cápsidas y núcleos nuevos que conducen al ensamblaje de partículas virales infecciosas de la progenie que son capaces de infectar y replicarse en nuevas células hospederas. Así, un ciclo de vida viral solo se completa si dentro de una sola célula infectada por una o más partículas virales o viriones ocurren todas las etapas para la producción de la progenie de partículas virales completamente infecciosas En el caso particular de los retrovirus, un ciclo de vida viral completo consiste en que partículas virales infecciosas que contienen el ARN viral entran a una célula, el ARN se transcribe en ADN, el ADN se integra en el cromosoma de la célula hospedera como un provirus y la célula infectada produce las proteínas del virión y se ensamblan los viriones portando el ARN genómico viral completo en las partículas infecciosas.
El término "célula hospedera" de este documento, se refiere a una célula que se utiliza para la expresión de un genoma viral o para la propagación de un virus o un vector.
El término "células CD4+" en este documento, se refiere a una clasificación general de los linfocitos T, refiriéndose a los que portan el antígeno CD4. Se incluyen también otras células CD4+ como monocitos y macrófagos.
En particular, la presente invención se refiere a métodos que modulan negativamente, modifican o alteran los IF del citoesqueleto, preferentemente los Fl formados por las proteínas vimentina y/o queratina-10. En una realización preferida, el método comprende disminuir la cantidad de vimentina y/o queratina-10 en los Fl.
La disminución de vimentina y/o queratina-10 puede verse afectada en varias formas. Una realización preferida es disminuir o inhibir la expresión de los genes que codifican a la vimentina y/o la queratina-10. Más preferentemente, disminuir los niveles de expresión de los IF de vimentina y/o queratina-10 o alterar la estructura de la vimentina y/o queratina-10 del citoesqueleto. La estructura de los IF del citoesqueleto puede alterarse modificando la estructura de las proteínas de los IF, por ejemplo por ruptura o cambios en la estructura terciaria, preferiblemente la estructura de vimentina y/o queratina-10.
Las evidencias presentes en la literatura especializada sugieren que el VIH requiere escindir a la proteína vimentina durante su ciclo de vida. Sorprendentemente, en la presente invención se logra inhibir la replicación del virus a través de lo que parece ser un mecanismo natural durante la infección viral. No es obvio que la alteración del citoesqueleto o la vimentina sea un medio para inhibir la infección de VIH; de hecho uno esperaría que la infección sea mucho más intensa, ya que la interrupción de la citoesqueleto también ocurre durante la infección normal.
En la presente invención, las proteínas del citoesqueleto vimentina y queratina-10 se identificaron mediante un estudio de proteómica comparativa sobre células MT4 tratadas con una fracción con actividad anti-VIH, que se obtuvo de un extracto leucocitario humano. Por primera vez, se demostró que la disminución de la infección del VIH es provocada por la disminución y/o desestabilización de la vimentina y/o la queratina-10 y/o los filamentos que contienen estas proteínas. Con anterioridad, Thomas y colaboradores plantearon que con un anticuerpo contra la vimentina se bloqueaba la unión de la proteína gp120 del VIH-1 a la vimentina de superficie, y que con ello se impedía la entrada del virus a la célula (Thomas EK, Connelly RJ, Pennathur S, Dubrousky L, Haffar OK, Bukrinsky MI 1996. Viral Immunol 9: 73-87). En las condiciones experimentales utilizadas en la presente invención, cuando se utilizó un anticuerpo contra la vimentina (con el objetivo de disminuir la infección del VIH-1 ) sorprendentemente se detectaron niveles muy bajos de inhibición de la replicación viral. Thomas et al. utilizaron un anticuerpo contra vimentina bloqueando la vimentina que está accesible a los anticuerpos. Esto es muy diferente a la propuesta de la presente invención. En la presente invención, la vimentina es alterada o disminuida de manera que se alteran los Fl. Bloqueando la vimentina como lo hicieron Thomas et al, los Fl no se modifican. Los datos experimentales también confirman que los métodos de la presente invención tienen un modo de acción diferente. Muy alto porcentaje de inhibición de la replicación viral, hasta un 100%, se obtuvieron cuando disminuyeron los niveles de vimentina o se desestabilizó la estructura de la vimentina de la célula diana, como se observa en el Ejemplo 2, Figuras 3 y 4A-4B, mientras que en Thomas et al. se observó un máximo de 47% de la inhibición.
Por otra parte, no hay reportes de que la queratina-10 se una a la proteína gp120 viral y, sin embargo, también se inhibe la replicación del VIH al inhibir o desestabilizar esta queratina, como se observa en el Ejemplo 2, Figuras 3 y 4A-4B.
Para obtener más información sobre el mecanismo de inhibición de la replicación del VIH, se utilizó un sistema experimental cuya vía de entrada celular no es mediada por la proteína viral gp120. Dicho sistema consiste en un vector lentiviral no replicativo, basado en el VIH-1 , que no contiene la proteína gp120 y que expresa la proteína verde fluorescente (del inglés Green Fluorescent Protein, abreviado GFP). En el Ejemplo 2, puede verse que hay una eficiente "infección" del lentivirus en las células MT4; y los cultivos mostraron altos por cientos de expresión de la GFP, indicando que el vector lentiviral penetró en las células sin dificultad y se integró en el genoma celular. En este mismo sistema de "infección" lentiviral basado en VIH-1 , cuando disminuye la vimentina disminuye dramáticamente la "infección" del lentivirus, lo que se observa en el Ejemplo 2. Esto demuestra que el método de la presente invención, de inhibir la infección del VIH-1 , no está vinculado al enlace de la vimentina a la proteína gp120 propuesto por Thomas y colaboradores. Esta invención está vinculada, por tanto, a un método de inhibición de la infección del VIH no descrito hasta el momento.
Además, en la presente invención se demuestra, utilizando microscopía electrónica de transmisión (MET), que los Fl se desestabilizan en células MT4 silenciadas para vimentina (MT4v¡m(s)), así como en células silenciadas para queratina-10 (MT4«-io(s)). produciendo una inhibición de la "infección" por el lentivirus basado en VIH-1 (Ejemplo 3). Las células MT4v¡m(S) y MT4K-io(S) se obtuvieron por introducción de horquillas de ARN específicas para el gen codificante para cada proteína.
La alteración de los Fl puede lograrse por un agente seleccionado de un grupo conformado por polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos. En una realización preferida el agente es un péptido, más preferentemente el péptido es un péptido seleccionado del grupo identificado como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10, y sus homólogos.
En otra realización preferida el agente es un ARN interferente o un oligonucleótido antisentido dirigido a los genes de vimentina y/o queratina-10.
En otra realización preferida el agente es un compuesto químico o un derivado lipídico. Un compuesto lipídico adecuado es la mencionada prostaglandina 15d-PGJ2.
La presente invención revela métodos para el tratamiento y/o prevención de la infección del VIH en las células humanas. Los métodos involucran, la modulación negativa de las proteínas vimentina y/o queratina-10 en la célula para, de esta manera, prevenir o tratar la infección del VIH en la célula.
La regulación negativa ocurre en la célula hospedera del VIH de un individuo, de esta manera se previene o inhibe la infección efectiva de las células hospederas del individuo. Así, la presente invención igualmente contempla métodos de tratamiento y/o prevención de la infección por VIH en un sujeto.
La inhibición de la infección del VIH por el método descrito en la presente invención se aplica a nivel celular y de organismo completo. El término inhibición se utiliza para referir inhibición completa o parcial de la infección.
La presente invención describe la manipulación de los Fl, en particular las proteínas del citoesqueleto vimentina y queratina-10 para inhibir la replicación del VIH, lo cual ofrece la ventaja frente a los fármacos antirretrovirales actuales de que no se produzca o sean mínimas las posibilidades de desatar resistencia viral, ya que estas proteínas no son de origen viral sino que son proteínas endógenas celulares. Los mecanismos de acción de los fármacos de la presente invención actúan con una alta capacidad de inhibición por vías diferentes a las descritas hasta el momento, por lo que la combinación de éstos con los fármacos terapéuticos actuales específicos para la infección del VIH podría potenciar la efectividad de los tratamientos contra el VIH. Por otra parte, el uso de los agentes terapéuticos de la presente invención podría combinarse con alternativas terapéuticas novedosas propuestas en el estado del arte, como por ejemplo, el trasplante de células madres con genes endógenos modificados. La forma de terapia de la presente invención ofrece una nueva opción a pacientes resistentes a múltiples fármacos, los cuales representan un alto porciento entre los pacientes tratados con la terapia disponible actualmente.
A pesar de que una afectación de esta estructura puede llevar a una toxicidad e incluso a la muerte celular, en esta invención sorprendentemente se logra, además, inhibir la infección del VIH sin afectar la viabilidad celular, lo que le añade aún más novedad, al tratamiento de pacientes infectados por el VIH.
La invención se relaciona, además, con el uso de agentes que producen la modulación negativa o alteración del citoesqueleto celular, específicamente de las proteínas que forman parte de los Fl del citoesqueleto, más específicamente de las proteínas vimentina y queratina-10 para la producción de un medicamento para la prevención o tratamiento de la infección por el VIH. Dichos agentes pueden estar fusionados y/o conjugados a otras moléculas. Tales agentes incluyen a compuestos tipo péptido, ARN interferentes y compuestos lipidíeos que produzcan la modulación negativa o alteración del citoesqueleto celular, de los Fl, y en particular de aquellos que modulen negativamente la vimentina y/o la queratina-10.
La modulación negativa de la vimentina y/o la queratina-10 puede lograrse a través del contacto de la célula con un agente que module negativamente vimentina o queratina-10. El agente puede formularse para incrementar su capacidad de entrada a la célula si fuera necesario. La modulación negativa puede lograrse por la administración a un individuo de un agente que module negativamente la vimentina y/o la queratina-10 en las células del sujeto. La administración se realiza de manera que el agente contacta las células del sujeto, las cuales están infectadas por el VIH o que podrían potencialmente infectarse. Tales células se refieren aquí como células hospederas del VIH. La administración del agente conlleva el contacto con la célula hospedera. Ejemplos de tales rutas de administración incluyen las rutas parenterales y las rutas donde el agente se administra a través de las mucosas del sujeto. En una realización especifica de la invención, la célula es una célula CD4 +.
En una realización de la invención, la modulación negativa o alteración puede lograrse afectando directamente la vimentina y/o la queratina-10, ya sea por reducción de la expresión del gen o de la síntesis de proteína, modificación de la estructura de los filamentos que estas proteínas forman, desestabílización de esta estructura o por reducción de su actividad/función.
En el contexto de la presente invención, se entiende por modulación negativa (o alteración) la inhibición del nivel de la proteína vimentina y/o queratina-10 en la célula, o la modificación, desestabilización, desensamblaje o incluso destrucción de la estructura de los Fl que contienen estas proteínas en el interior de la célula.
Cualquier agente conocido que inhiba o module negativamente los IF y en particular a la vimentina y/o la queratina-10 puede usarse para inhibir la infección del VIH, de acuerdo al método revelado en la presente invención.
De acuerdo a la misma, la infección del VIH puede inhibirse también mediante el uso de agentes tipo péptido o polipéptido que modulan negativamente o desestabilizan los Fl, y en particular a la vimentina y/o la queratina-10. Tales agentes comprenden proteínas endógenas o proteínas que no se encuentran normalmente en la célula hospedera. Por ejemplo, proteínas mutadas, proteínas ingenierizadas genéticamente, péptidos, péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, proteínas quiméricas, fragmentos de anticuerpos, proteínas humanizadas, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, proteínas modificas y fragmentos de ellos.
En esta invención, la utilización de péptidos que destruyen o desestabilizan la estructura de los Fl, en particular aquellos que contienen vimentina o queratina-10 indujo una fuerte inhibición de la infección del VIH en células MT4, corroborando los resultados obtenidos con las células MT4v¡m(S) y MT4K-io(s). Ello sustenta el uso de dichos péptidos para la prevención o tratamiento de la infección por el VIH, lo cual forma parte también de la presente invención.
En una realización preferida de la invención, los péptidos son los identificados en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10. La invención también contempla el uso de homólogos de dichos péptidos.
Los péptidos pueden estar fusionados a otra molécula, como por ejemplo, pueden estar fusionados a un péptido penetrador.
Un agente útil para la prevención o tratamiento del VIH, de acuerdo a la presente invención, es aquel que inhiba la expresión del gen de la vimentina y/o de la queratina-10, o la síntesis de proteína, o la estructura de los filamentos que contienen vimentina o queratina-10. Un agente preferido de acuerdo a la presente invención, es aquel que produce el silenciamiento del gen de la vimentina y/o de la queratina-10 o sus transcriptos con un iRNA, como por ejemplo siRNA (del inglés short interfering ribonucleic acid), shRNA (del inglés short hairpin ribonucleic acid) o miARN (micro ARN).
Interferencia por ARN se refiere a una forma de silenciamiento génico post transcripcional selectivo, que destruye el ARN mensajero (ARNm) específico, mediante una molécula que se enlaza e inhibe el procesamiento del ARNm. Por ejemplo, puede inhibir la traducción del ARNm o degradarlo. En el contexto de esta invención el término iRNA se refiere a cualquier tipo de iRNA, incluyendo pero no limitándose a siRNA, shRNA, miARN endógeno y miARN artificial.
El término siRNA utilizado aquí se refiere a un ácido nucleico que forma una doble cadena de ARN, que tiene la habilidad de reducir o inhibir la expresión del gen de la vimentina y/o de la queratina-10. La secuencia del siRNA puede corresponder a la secuencia completa del gen de la vimentina y/o de la queratina-10. El siRNA típico tiene al menos entre 15 y 50 nucleótidos de largo, preferentemente entre 19 y, 30. nucleótidos.. l)n siRNA ; ' ' ' ? · i ' i . i puede ser químicamente sintetizado, puede ser producido por transcripción in vitro o puede ser producido dentro de una célula específicamente utilizada para tal producción.
El término shRNA se utiliza aquí como un tipo de1 siRNA. Estos shRNA están compuestos de una corta cadena antisentido, por ejemplo, de r entre 19 y 25 nucleótidos, seguida de un lazo de 5 a 9 nucleótidos y la cadena sentido análoga. Alternativamente, la cadena sentido puede preceder al lazo nucleotídico y la cadena antisentido a continuación del mismo. Los shRNA funcionan como iRNA y/o especies de siRNA, pero difieren en que los shRNA son estructuras semejantes a horquillas para incrementar la estabilidad. Estos shRNA, así como otros agentes descritos aquí, pueden estar contenidos en plásmidos, retrovirus y lentivirus y expresados a partir de, por ejemplo, el promotor de la polimerasa III U6 u otro promotor.
Los métodos de administración {delivery) de los agentes tipo iRNA a la célula blanco pueden incluir por ejemplo, la inyección de una composición que contenga el agente, o contactando la célula directamente, por ejemplo, una célula hematopoyética con una composición que contiene el iRNA. En otro caso, el agente tipo iRNA puede ser inyectado directamente por cualquier vía sanguínea como una vena, arteria, por ejemplo, por inyección hidrodinámica o cateterización. En algunos casos el agente iRNA puede ser administrado a órganos específicos o por vía sistémica. Los sistemas de dispersión coloidal pueden utilizarse como vehículos de entrega para aumentar la estabilidad in vivo de los agentes.
Los agentes pueden inhibir la expresión del gen de la vimentina y/o de la queratina-10 como, por ejemplo, lo hace un oligonucleótido o un análogo de ácido nucleico. Dentro de estos se encuentra, por ejemplo, un péptido-ácido nucleico (PNA), un pseudo-PNA complementario (pc-PNA), ácidos nucleicos "locked" (del inglés locked nucleic acid, abreviado LNA), y sus derivados. Las secuencias de ácidos nucleicos codifican proteínas que actúan como represores transcripcionales, moléculas antisentido, ribozimas, secuencias de ácidos nucleicos pequeñas inhibidoras como iRNA, shRNA, siRNA, miARN y oligonucléotidos antisentido.
El agente puede tomar la forma de cualquier entidad normalmente presente o no a los niveles que están siendo administrados en la célula u organismo. Agentes tales como químicos, pequeñas moléculas, aptámeros, pueden ser identificados o generados para modular negativamente los Fl y en particular a la vimentina y/o la queratina-10. En el contexto de esta invención, aptámeros son ácidos nucleicos de una sola cadena, que tienen formas tridimensionales bien definidas permitiéndoles unirse a las moléculas diana en una forma conceptualmente similar a los anticuerpos. Los aptámeros combinan las características óptimas de las moléculas pequeñas y de los anticuerpos, incluyendo alta especificidad y afinidad, estabilidad química, inmunogenicidad baja y la capacidad de atacar las interacciones proteína-proteína.
El agente puede funcionar directamente en la forma en que se administra, pero también puede ser modificado, o utilizado intracelularmente para producir la modulación negativa de la vimentina y/o la queratina-10. Por ejemplo, la introducción de una secuencia de ácido nucleico en la célula y su transcripción resulta en la producción del ácido nucleico y/o proteína que inhiba los Fl y en particular a la vimentina y/o la queratina-10 dentro de la célula.
El agente puede comprender un vector. Los vectores pueden ser episomales, por ejemplo, plásmidos, vectores derivados de virus como citomegalovirus, adenovirus, etc., o pueden integrarse en el genoma de la célula blanco, por ejemplo, vectores derivados de retrovirus, como el virus de la leucemia murina de Moloney, el VIH-1 , el virus de la leucosis aviar, etc. Vectores basados en VIH o virus de la inmunodeficiencia felina pueden usarse para transfectar células que no están en división. Pueden utilizarse combinaciones de retrovirus.
En el estado del arte se conocen muchos vectores virales o vectores asociados a virus. Tales vectores pueden ser utilizados como portadores de un constructo de ácido nucleico a la célula. Los constructos pueden estar integrados en genomas virales no replicativos semejantes a adenovirus (AAV), o herpes simple, u otros incluyendo vectores retroviraies y lentivirales para infección o transducción de las células. Un vector basado en VIH puede ser particularmente útil en células hospederas del VIH.
Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende al agente de acuerdo a la presente invención. En la composición los agentes referidos en la presente invención pueden ser combinados entre sí o pueden ser utilizados en asociación con otros agentes terapéuticos que pueden ser, pero no se limitan a, conocidos fármacos anti-VIH, como por ejemplo la zidovudina (conocido por AZT).
En una realización preferida la modulación negativa de los Fl y en particular de la vimentina y/ó la queratina-10 se aplica en la presente invención a células que el VIH es capaz de infectar, con el propósito de prevenir o reducir la infección del VIH a esa célula. En una realización preferida, la célula humana es una célula CD4+. La aplicación de tal modulación negativa a un organismo entero, humano o primate, puede constituir un tratamiento terapéutico efectivo para el organismo contra la infección por el VIH.
Otra realización de la presente invención es una combinación farmacéutica que comprende uno un agente y un fármaco específico para la terapia de la infección del VIH. En la combinación farmacéutica, los agentes y fármacos que forman parte de la misma pueden administrarse de forma simultánea, separada o secuencialmente.
Ventajas de la invención: La presente invención ofrece la ventaja frente a los fármacos antirretrovirales actuales de que no se produzca resistencia viral o sean mínimas las posibilidades de desatar la misma, ya que los Fl y en particular las proteínas vimentina y queratina-10 no son de origen viral, sino que son proteínas endógenas celulares.
Los fármacos de la presente invención actúan con una alta capacidad de inhibición por vías diferentes a las descritas hasta el momento en el estado del arte, por lo que la combinación de éstos con los fármacos terapéuticos actuales específicos para la infección del VIH podría potenciar la efectividad de los tratamientos contra el VIH.
Por otra parte, el uso de los agentes terapéuticos de la presente invención podría combinarse con alternativas terapéuticas novedosas propuestas en el estado del arte como por ejemplo, el trasplante de células madres con genes endógenos modificados.
La presente invención ofrece una nueva terapia a pacientes resistentes a múltiples fármacos, los cuales representan un alto porciento entre los pacientes tratados con la terapia disponible actualmente.
Métodos de administración Las composiciones farmacéuticas de la invención, una vez formuladas, pueden ser (1) administradas directamente al sujeto; (2) administradas ex vivo a las células derivadas del sujeto; o (3) administradas in vitro para la expresión de proteínas recombinantes.
La administración directa de las composiciones generalmente se realiza por inyección subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse en el sistema nervioso. Otros modos de administración incluyen la administración tópica, oral, supositorios y aplicaciones transdérmico, agujas y pistolas de partículas o inyector a presión. Las dosis de tratamiento pueden ser mediante dosis única o múltiples dosis.
Los métodos para la administración ex vivo y la re-implantación de las células transformadas son conocidos en el estado del arte y se describe en, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 93/14778. Ejemplos de células útiles en aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, las células madre, particularmente hematopoyéticas, células linfoides, macrófagos, células dendríticas o células tumorales.
Generalmente, la administración de ácidos nucleicos para ambas aplicaciones ex vivo e in vitro puede realizarse mediante, por ejemplo, transfección mediada por dextran, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, electroporación, encapsulación de los polynucleotide(s) en liposomas y por microinyección directa del ADN, bien conocidos en el estado del arte. Los métodos para introducir los polinucleótidos (como siRNAs) en una célula son conocidos en el estado del arte. Los métodos para la introducción de ácido nucleico incluyen por ejemplo transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextran, electroporación o transfección mediada por liposoma. Alternativamente, se emplea la inyección directa de los polinucleótidos. Preferiblemente sin embargo, una secuencia de ácido nucleico es introducida en una célula por un vector, preferiblemente un vector viral. Dicho vector preferentemente comprende un vector retroviral, adenoviral, adeno-asociado viral (AAV) o vector lentiviral.
Se utilizan diversos métodos para administrar la composición terapéutica directamente a un sitio específico en el cuerpo. La administración específica mediada por receptores de composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido antisentido, polinucleótidos subgenómícos o anticuerpos para tejidos específicos es también utilizada. Las técnicas de administración de ADN mediada por receptor se describen en, por ejemplo, Findeis et al., Trends in Biotechnol. (1993) 1 1 :202 -205; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542 -46.
Composiciones farmacéuticas que contengan polinucleótidos se administran preferentemente en un rango de alrededor de 100 ng a unos 200 mg de los polinucleótidos para la administración local en un protocolo de terapia génica. Rangos de concentración de aproximadamente 500 ng a alrededor de 50 mg, alrededor de 1 pg a unos 2 mg, unos 5 pg a alrededor de 500 pg y unos 20 pg a cerca de 100 pg de polinucleótidos también pueden utilizarse durante un protocolo de terapia génica. Factores tales como el modo de acción y la eficacia de la transformación y la expresión son consideraciones que afectarán la dosis necesaria para máxima eficacia de los polinucleótidos. Cuando se desea una mayor expresión en una mayor área de tejido, pueden ser necesarias mayores cantidades de polinucleótidos o las mismas cantidades re-administradas en un protocolo de administraciones sucesivas, o varias administraciones a tejidos adyacentes o cercanos de, por ejemplo, una terminación nerviosa o sinapsis, para lograr un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación sistemática en ensayos clínicos determinará los rangos específicos para el efecto terapéutico óptimo. Una descripción más completa de vectores de terapia génica, especialmente de vectores antirretrovirales, se describe en WO 98/00542.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Proteómica comparativa de células MT4 tratadas con un extracto leucocitario con actividad anti-VIH La línea celular MT4 se trató con un extracto leucocitario con actividad anti-VIH (Fernández-Ortega C; Dubed M; Ruibal I; Vilarrubia OL; enéndez JC; Navea L et al. 1996, Biotherapy 9: 33-40), y se comparó el perfil de expresión de proteínas contra una condición control constituida por células no tratadas. Las células se lisaron y se centrifugaron a 12 000 rpm por 20 min. Se separó el sobrenadante y el sedimento se sometió a una segunda lisis. Se centrifugó nuevamente a 12 000 rpm por 20 min. y se colectó el segundo sobrenadante para unirlo al primero. Se procedió a deslipidar con alcohol etílico y a alquilar con poliacrilamida la muestra. Posteriormente, se precipitó el ácido desoxlrribonucleico (ADN), y se procedió a realizar la electroforesis bidimensional, la cual se realizó en gel con Tris-Tricina de 12.5 a 3% a 4 °C.
Las imágenes de los geles analíticos se procesaron utilizando el programa Melanie 5. A partir de los geles preparativos se recortaron las manchas a identificar y se digirieron con tripsina. Se realizó la extracción de los péptidos proteolíticos para su análisis por espectrometría de masas. Los espectros de masa fueron adquiridos en un espectrómetro de masas híbrido con geometría ortogonal QTOF-2 equipado con una fuente de ionización "nanospray".
Los espectros ESI-MS/MS se analizaron, y se realizaron las búsquedas para la identificación de las proteínas en la base no redundante de secuencias de proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica (del inglés National Center for Biotechnology Information, abreviado NCBI) de Estados Unidos y en la base del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (del inglés European Molecular Biology Laboratory, abreviado EMBL) de Alemania. Tras el tratamiento con el extracto leucocitario que posee actividad anti-VIH se observó una disminución de proteínas del cítoesqueleto, en particular de las proteínas que forman Fl (vimentina y queratina-10) (Figuras 1 A-1 B).
EJEMPLO 2 ARN interferente contra vimentina y queratina-10 inhibe la infección del VIH La línea celular MT4 se transdujo utilizando los vectores lentivirales pLenti-shRNAv¡m o pLenti-shRNAK-io que portan una secuencia que codifica una horquilla de ARN que silencia la proteina vimentina y la proteína queratina-10, respectivamente. Para la construcción de los vectores lentivirales se realizó el empaquetamiento de cuatro plásmidos en la línea celular 293FT, estos son el pLP1 , pLP2, pLP/VSVG y el p-shRNA específico para vimentina o para queratina-10. El pLP1 codifica los productos génicos de las secuencias gag/pol del VIH-1 . El pLP2 porta la secuencia génica de la proteína REV del VIH-1. El pLPA/SVG codifica la proteína de superficie del virus de la estomatitis vesicular y el p-shRNA constituye el genoma del vector i lentiviral portando las secuencias que codifican las horquillas de ARN específicas para vimentina (Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T et al., 2004 Nucleic Acids Research 32: 936-948) o para queratina-10 (Santa Cruz Biotechnology). Todos los plásmidos se amplifican en la cepa de Escheríchia coli XL-1 blue y se seleccionan en ampicillina. Los cuatro vectores purificados por columna, con calidad de transfección, se ponen en contacto con la línea celular de empaquetamiento 293FT en presencia de polietilenimina. Las células se incuban 48 horas a 37 °C en atmósfera de CO2 al 5%, y los viriones se purifican por ultracentrifugación a 20 000 x g. Una vez purificado el vector lentiviral, se transdujeron las células MT4 y se realizó la selección de recombinantes mediante resistencia a blasticidina. Los clones recombinantes se aislaron por el método de dilución limitante y se cultivaron en medio RPMI al 10% de suero fetal bovino (SFB) a 37 °C en atmósfera de C02 al 5% y humedad relativa del 95%, hasta su cosecha. Se extrajeron las proteínas totales de los cultivos y se demostró el silenciamiento de la proteína vimentina en las células MT4 (MT4vim(S)) mediante western blot. En las células MT4 que se silenciaron para queratina-10 (MT4K-IO(S)) se demostró el silenciamiento de la queratina-10 también por western blot. Los cultivos transducidos mostraron una disminución de la expresión de la proteína vimentina o queratina-10 comparada con el cultivo de MT4 (Figuras 2A-2B).
La actividad anti-VIH se evaluó utilizando dos sistemas de reto: Sistema A: Las células establemente silenciadas para la proteína vimentina (MT4v¡m(s)) o para la proteína queratina-10 (MT4K-io(s)) se cultivaron en RPMI con 10% de SFB a 37 °C, en atmósfera de C02 al 5% y humedad relativa del 95%. El ensayo de reto con virus total se realizó en cultivos de MT4v¡m(s), MT4K.io(s) y de MT4. La cepa viral Bru se empleó a una moi de 0.01 , y la evaluación de la replicación se realizó mediante la determinación de la concentración del antígeno p24 en el sobrenadante de los cultivos, por el método ELISA. Las células MT4v¡m(S) y las MT4K-io(S) mostraron una inhibición de la replicación viral de alrededor del 90% respecto a los cultivos MT4 no si lenciados para esta proteína (Figura 3).
Sistema B: Los cultivos de MT4Vim(s), MT4K-io(s) y de MT4 se retaron con un vector lentiviral que contiene parte del genoma del VIH-1 , sin los genes que se relacionan con la infectividad ni los genes que codifican para la entrada (pLGW). Para la construcción de este vector se realizó el empaquetamiento de cuatro plásmidos en la línea celular 293FT, estos son el pLP1 , pLP2, pLP/VSVG, y el pLGFP que codifica la proteína GFP. El pLP1 codifica los productos génicos de las secuencias gag/pol del VIH-1. El pLP2 porta la secuencia génica de la proteína REV del VIH-1. El pLP/VSVG codifica la proteína de superficie del virus de la estomatitis vesicular, y el pLGFP que contiene la secuencia de empaquetamiento, la secuencia RRE (del inglés Rev responsive elemenf), y las regiones LTRs (del inglés long terminal repeats) delecionadas en el extremo 3' del VIH-1 constituyendo el genoma del vector lentiviral. Se siguió la expresión de GFP como indicador del completamiento de las etapas del ciclo replicativo después de la entrada hasta la integración. Los resultados se siguieron mediante microscopía de fluorescencia, y se observó una disminución de las células fluorescentes en los cultivos de MT4v¡m(s) y de MT4« -io(s). comparados con las células MT4 (datos no mostrados). Las muestras se analizaron por citometría de flujo, y se observó que el porciento de células fluorescentes debido a la expresión de GFP en MT4v¡m(S) y en MT4K-io(s) disminuyó cerca del 70% con respecto a los cultivos de MT4 no silenciados (Figuras 4A-4B).
EJEMPLO 3 Cambios en la estructura de los filamentos intermedios de células MT4.
Células MT4, MT4v¡m(S) y T4K-IO(S) se fijaron primeramente en glutaraldehído al 3.2%, durante 1 hora a 4°C, y después se fijaron al 2% en tetróxido de osmio, por 1 hora a 4 °C. Posteriormente, se lavaron con 0.1 M de tampón fosfato salino (PBS) a pH 7.2 y se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (30, 50, 70 y 100%), durante 10 minutos cada vez, a 4 °C. Se realizó la inclusión, se prepararon las secciones ultrafinas con un ultramicrótomo (NOVA, LKB), con un grosor de 40-50 nm, y se colocaron sobre rejillas de níquel de 400 orificios. Después de realizados los cortes ultrafinos y colocados los mismos en las rejillas se contrastaron con acetato de uranilo saturado y citrato de plomo, y se examinaron con un microscopio JEOL JE 2000 EX (JEOL). Se analizaron un total de cinco microfotografías a diferentes magnificaciones. En las Figuras 5A-5D se observan los Fl intactos en las células MT4 (Figura 5A), mientras que en células MT4v¡m(S) (Figura 5B), y en células MT4K-io(S) (Figura 5C) se observan estas estructuras acortadas. En la figura 5D se observa este efecto sobre los Fl causado por un péptido (péptido identificado como SEQ ID NO: 1) que desensambla la estructura de la vimentina en células MT4. En esas condiciones se observa una inhibición de la replicación viral. Las proteínas vimentina o queratina-10 se identificaron mediante inmunomicroscopía en los Fl.
EJEMPLO 4 Péptidos sintéticos que inhiben la replicación del VIH en células MT4.
Se sintetizaron péptidos con secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína querat¡na-10 humana, la queratina 1 humana y la vimentina humana (Goldman RD, Khuon S, Hao Chou Y, Opal P, Steinert PM 1996, J Cell Biol 134: 971 -983; Steinert PM, Yang JM, Bale SJ, Compton JG 1993, BBRC 197: 840-848). Uno de los péptidos, tiene conjugado en su extremo C terminal un péptido penetrador (Vallespi MG, Fernandez JR, Torrens I, García I, Garay H, Mendoza O et al. 2009. J Peptide Science 16: 40-47). Se evaluó la actividad anti-VIH de dichos péptidos utilizando un sistema de reto con virus total,_en presencia de distintas cepas virales: HXB1 (VIH-1 -II IB) y Bru. La línea celular MT4 se incubó con el péptido durante 24 horas antes del reto viral. Los ensayos se realizaron empleando valores de moi de 0.01 y 0.05, y se concibieron nueve réplicas por variante experimental. Se determinó el valor del antígeno viral p24 en los cultivos celulares mediante ensayo tipo ELISA, y los resultados se expresaron en términos de porciento de inhibición viral o porciento de infección en relación a la concentración peptídica. Se observó una importante inhibición de la replicación viral en presencia de los péptidos, tanto cuando los cultivos se retaron con alta concentración viral (SEQ ID NO: 1 , Figura 6A), como a una moi de 0.01 (Figura 6B). La IC50 de los péptidos se comportó a nivel nanomolar.
EJEMPLO 5 Inhibición del VIH-1 por péptidos en células mononucleares de sangre periférica.
Las PBMC se obtuvieron de sangre total de individuos sanos por gradiente de densidad con Ficoll. Las células se preestimularon durante dos días en medio RPMI con 20% de SFB, 100 U/mL de interleucina 2 (IL-2) y 5 ug/mL de fitohemaglutinina (PHA). Posteriormente, se mantuvieron en medio libre de PHA y se sembraron 50 000 células por pozo en placas de 96 pozos. Después de 24 horas, se añadieron los péptidos a diferentes concentraciones y los cultivos se infectaron con la cepa Bru a una moi de 0.01. Los cultivos se mantuvieron 7 días más, y cada 3 días se cambió el medio y se añadieron los péptidos nuevamente. Los cultivos se cosecharon, y se colectó el sobrenadante para evaluar la presencia de la proteína viral p24. Los péptidos inhibieron de manera dosis dependiente la replicación del VIH-1 (Figura 7). Resultados similares de IC50 en el rango nanomolar se obtuvieron cuando los cultivos se infectaron con la cepa BaL1 de VIH-1.
EJEMPLO 6 Inhibición del VIH -2 por péptidos sintéticos.
Las PBMC se obtuvieron de sangre total de individuos sanos por gradiente de densidad con Ficoll. Las células se preestimularon durante dos días en medio RPMI con 20% de SFB, 100 U/mL de IL-2 y 5 ug/mL de PHA. Posteriormente, se mantuvieron en medio libre de PHA y se sembraron 150 000 células por pozo en placas de 96 pozos. Después de 24 horas, se añadieron los péptidos a diferentes concentraciones y los cultivos se infectaron con la cepa CBL-20 de VIH-2. Los cultivos se mantuvieron 7 días más, y cada 3 días se cambió el medio y se añadieron los péptidos nuevamente. Los cultivos se cosecharon y el sobrenandante se colectó para evaluar la presencia de la proteína viral p24. Los péptidos inhibieron de manera dosis dependiente la replicación del VIH-2 (Figura 8).
EJEMPLO 7 Disminución de vimentina en presencia de los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1. 4, 5. 7. 8 v 9.
La línea celular MT4 se incubó con 50 u de cada péptido durante 24 horas. La detección de la proteína vimentina se realizó mediante la técnica de western blot. Los extractos celulares resuspendidos en dodecilo sulfato de sodio (SDS) al 1 % se aplicaron en un gel de poliacrilamida al 10%, y posteriormente se transfirieron a una membrana de celulosa Hybond-P. Para la inmunoidentificación, se utilizaron los anticuerpos mononoclonales anti-vimentina, y anti-ß actína (como control). Se empleó como anticuerpo secundario un anticuerpo anti-lgG de ratón conjugado a peroxidasa. La actividad de la enzima peroxidasa se visualizó mediante el empleo de diaminobenzidina en presencia de peróxido de hidrógeno y PBS. La proteína vimentina disminuyó en las células MT4 tratadas con los péptidos (Figura 9).
EJEMPLO 8 Penetración celular de ios péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 y 3.
Las células HeLaCD4+ se sembraron en RPMI con 10% SFB, y se incubaron hasta garantizar el 60% de confluencia en la monocapa. Las células MT4 se sembraron a 50 000 células por pozo en RPMI con 10% SFB. Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 y 3 se reconstituyeron en agua para inyección y se evaluaron a concentraciones de 5, 10, 20 y 40 uM. Los péptidos se incubaron durante 24 horas a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5%, y se evaluó la penetración a los 15, 30 y 60 min. Transcurrido cada período, se cosecharon las células y se analizaron inmediatamente en el citómetro de flujo. Se incluyeron tres réplicas por variante experimental. En las Figuras 1 0A-10B puede observarse que los péptidos penetran por sí solos en la línea celular MT4.
EJEMPLO 9 Derivado lipídico que se enlaza a vimentina inhibe la replicación del VIH- 1 Se conoce que la prostaglandina ciclopentano 15 deoxy-?-12,14- PGJ2 (15d-PGJ2), se une a la proteína vimentina (Stamatakis K, Sánchez-Gómez FJ, Pérez-Sala D 2006, J Am Soc Nephrol 17: 89-98). En esta invención se demostró que 15d-PGJ2 inhibe la replicación del VIH in vitro. El ensayo de actividad antiviral se realizó sobre células MT4 retadas con VIH-(cepa Bru). Las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de 15d-PGJ2, y posteriormente retadas con el VIH-1 a una moi de 0.01. Tras un período de incubación de 5 días, se cosecharon los cultivos y se evaluó la proteína viral p24 en los sobrenadantes (Figura 1 1 ).
EJEMPL0 10 Efecto de péptidos sintéticos y de 15d-PGJ2 sobre PBMC de pacientes infectados por VIH-1 Las PBMC se obtuvieron de sangre total de individuos infectados por VIH-1 por gradiente de densidad con Ficoll. Las células se preestimularon y se trataron con los péptidos, de igual forma que en el Ejemplo 5, o se trataron con 5 uM de 15d-PGJ2. La evaluación de la replicación se realizó mediante la determinación de la concentración del antígeno p24 en el sobrenadante de los cultivos, por el método ELISA. Los valores de p24 disminuyeron significativamente en las PBMC tratadas con los péptidos o con el derivado lipídico con relación a las células no tratadas (cuadro 1 ), lo cual es un indicativo de la inhibición de la replicación del VIH causada por el tratamiento con estos compuestos.
CUADRO 1 Porciento de inhibición del VIH-1 en PBMC de individuos infectados tratadas ex vivo con los péptidos o 15d-PGJ2 La estructura de los Fl se analizó por microscopía electrónica de transmisión, según la metodología que se describe en el Ejemplo 3, y se observó que los Fl se encuentran muy acortados en las PBMC de los individuos que fueron tratadas con los péptidos o con el derivado lipídico, en relación a las células no tratadas.
EJEMPLO 11 ARN interferente contra vimentina y queratina-10 inhibe el VIH en PBMC de pacientes infectados Las PBMC se obtuvieron de sangre total de individuos infectados por VIH-1 por gradiente de densidad con Ficoll. Las células se preestimularon durante dos días en medio RPMI con 20% de SFB, 100 U/mL de IL-2 y 5 ug/mL de PHA. Posteriormente, se mantuvieron en medio libre de PHA y se transdujeron con los vectores lentivirales pLenti-shRNAv¡m o pLenti-shRNAK-io, que portan una secuencia que codifica una horquilla de ARN que silencia la proteína vimentina y la proteína queratina-10, respectivamente. Los vectores se obtuvieron según se describe en el Ejemplo 2. La evaluación de la replicación se realizó mediante la determinación de la concentración del antígeno p24 en el sobrenadante de los cultivos, por el método ELISA. Las PBMC silenciadas para la proteína vimentina, o para la proteína queratina-10, mostraron una alta inhibición de la replicación viral respecto a los cultivos no silenciados para esta proteína (cuadro 2).
CUADRO 2 Porciento de inhibición del VIH-1 en PBMC de individuos infectados transducidas con shRNA específicos para vimentina o queratina-10 La estructura de los Fl se analizó por microscopía electrónica de transmisión, según la metodología que se describe en el Ejemplo 3, y se observó que los Fl se encuentran acortados en las PBMC de los individuos que fueron transducidas con los vectores lentivirales, en relación a las células no transducidas.
EJEMPLO 12 Tratamiento de pacientes infectados por VIH-1 con formulaciones que contienen los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 y 2 Ocho pacientes seropositivos al VIH-1 , con menos de un año de diagnóstico y valores de células T CD4+ superiores a 350 células/mm3, se trataron con una formulación que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 o con una formulación que comprende el identificado como SEQ ID NO: 2. Los péptidos se administraron a 150 mg por día, y los pacientes se siguieron durante 6 meses en cuanto a carga viral y conteo de células T CD4+. La carga viral después del tratamiento resultó indetectable en dos de los pacientes, y disminuyó más de 1 .5 log en seis pacientes. Por otro lado, siete pacientes mostraron un aumento de las células T CD4+ en un número superior a 50 células/mm3, mientras que en un paciente disminuyó el valor de células T CD4+. La estructura de los Fl de las PBMC se analizó por microscopía electrónica de transmisión, según la metodología que se describe en el Ejemplo 3, en dos de los pacientes tratados con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y en tres de los pacientes tratados con el péptido identificado como SEQ ID NO: 2. En todos los casos se observó acortamiento en los Fl.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un método de inhibición de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que comprende alterar o interrumpir la estructura de los filamentos intermedios (Fl) del citoesqueleto en una célula de mamíferos.
2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos Fl comprenden las proteínas vimentina y/o queratina.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dichos Fl comprenden las proteínas vimentina y/o queratina-10.
4 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque comprende disminuir la cantidad de la vimentina y/o la queratina-10 en dicho Fl.
5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado además porque comprende disminuir la expresión de los genes que codifican para la vimentina y/o la queratina-10.
6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque la alteración de dicho Fl se alcanza mediante un agente que se selecciona de un grupo compuesto por polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos.
7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho agente es un péptido que se selecciona dentro del grupo de los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10, y homólogos de los mismos.
8. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho agente es un ARN interferente (iRNA) o un oligonucleótido antisentido dirigido al gen de la vimentina y/o de la queratina-10, o sus transcriptos.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho agente es un compuesto químico o un derivado lipídico.
10.- El uso de un agente que altera los Fl del citoesqueleto en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar la infección por el VIH.
1.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde dicho Fl comprende vimentina y/o queratina.
12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde dicho Fl comprende vimentina y/o queratina-10.
13. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde el medicamento induce una disminución en la cantidad de vimentina y/o queratina-10 en dicho Fl.
14. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 10-13, en donde el medicamento logra una disminución en la expresión de los genes que codifican para vimentina y/o queratina-10.
15. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 10-14, en donde dicho agente se selecciona de un grupo que consiste en polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos.
16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde dicho agente comprende un péptido que se selecciona dentro del grupo de péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10, y homólogos de los mismos.
17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde dicho agente es un ARN interferente (iRNA) o un oligonucleótido antisentido dirigido al gen de la vimentina y/o de la queratina-10, o sus transcriptos.
18. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde dicho iRNA se selecciona del grupo compuesto por siRNA, shRNA, y miARN.
19. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde dicho iRNA comprende una secuencia de 15 a 50 nucleótidos complementarios a una región de un ARN mensajero de las proteínas vimentina y/o queratina-10, preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos.
20. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde dicho compuesto químico es un compuesto lipídico o un derivado lipídico.
21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho compuesto lipídico es la prostaglandina ciclopentano 15 deoxy-?-12 14-PGJ2.
22 - Una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la infección por el VIH, que comprende un agente que altera los Fl del citoesqueleto y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
23. - La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque dicho agente se selecciona del grupo compuesto por polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos que alteran los Fl.
24. - La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicho agente es un péptido que se selecciona del grupo de los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 10, y homólogos de los mismos.
25.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicho agente es un ARN interferente (iRNA) o un oligonucleótido antisentido dirigido a los genes de vimentina y/o de la queratina 10.
26. - La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dicho iRNA se selecciona del grupo compuesto por siRNA, shRNA o miARN.
27. - La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicho compuesto químico es un compuesto lipídico o derivado lipidico.
28.- La composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque dicho compuesto lipídico es la prostaglandina ciclopentano 15 deoxy-A-12,14-PGJ2. 29.- Una combinación farmacéutica, que comprende un agente que altera los Fl del citoesqueleto, y un fármaco anti-VIH. 30. - La combinación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dichos agentes y fármacos están adaptados para ser administrables de forma simultánea, separada o secuencial en el curso de un mismo tratamiento. 31. - El uso de una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 22-28, o una combinación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones
29-30, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por VIH en un individuo.
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