CN101421407A - 植物代谢物输出基因启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了植物基因启动子，和必需的启动子元件，其是根部特异性的和/或通过寄生性线虫诱导的。本发明的启动子对于在植物根部中控制感兴趣的核酸的表达是有用的。

Description

植物代谢物输出基因启动子
本发明涉及调节类似于蒺藜苜蓿(Medicgo truncatula)结瘤素21(MtN21)的基因转录的启动子序列。本发明的MtN 21-样基因的启动子用于控制在植物根部中任何感兴趣的核酸的转录。特别地，本发明的启动子可用于控制那些抑制植物寄生性线虫繁殖的核酸的转录。
发明背景
植物寄生性线虫是微小的蠕虫样动物，其以超过2,000种农作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶和茎为食，导致全世界估计1000亿美元的农作物损失。一种线虫的常见类型是根结线虫(RKN)，其觅食引起根部特征性的虫瘿。其它觅食根部的线虫是孢囊和斑(lesion)-类型，其更具有宿主特异性。
目前线虫遍及美国，但是在西部和南部的温暖潮湿地区和在砂质土中成为主要问题。大豆孢囊线虫(SCN)，大豆异皮线虫(Heterodera glycine)，是1954年在美国北卡罗来纳州第一个被发现的。它是大豆植物最严重的害虫。一些地区被SCN重度侵染，以至于在没有控制手段情况下，大豆生产在经济上不再可能。虽然大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，但SCN寄生于总共大约五十种宿主，包括农田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。
线虫损害的症状包括矮化和叶的黄化，以及在炎热时期期间的植物萎蔫。然而，包括SCN的线虫在没有明显的上述地面征状情况下可以引起重大的产量损失。此外，受SCN感染的根部变得矮小或者矮化。线虫侵染可以减少根部上的固氮瘤数量，且可能使得根部更容易受其它土传植物病原体的侵袭。
线虫的生活周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。生活周期在线虫种类之间不同。例如，SCN的生活周期在适宜条件下可以在24至30天内完成，而其它物种可用一年或更长的时间来完成生活周期。在春天当温度和湿度水平变得充足时，蠕虫形状的幼体从土壤里的卵中孵化而来。这些幼体是线虫可以感染大豆根部的唯一的生活阶段。
SCN的生活周期已成为许多研究的课题，因此可被用作了解线虫生活周期的例子。在穿透大豆根部之后，SCN幼体移动穿过根部直到它们接触维管组织，它们停在那里并开始觅食。线虫注入分泌物以修饰某些根细胞且将它们转变成专门的觅食部位。根细胞在形态上被转变成大的多核合胞体(或者在RKN情况下的巨大细胞)，其用作线虫的营养物来源。活跃觅食的线虫因此从植物中窃取必需的营养物导致产量损失。当线虫觅食时，它们膨胀，最后雌性线虫变得如此之大以至于它们突破根部组织且暴露于根部的表面上。
在一段时期觅食之后，不是膨胀为成体的雄性SCN线虫从根部移出进入土壤中，并使柠檬状的成体雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍附着于根系且继续觅食。在膨胀的雌性内的卵开始发育，最初在体外的一团或者卵囊中，然后随后在体腔内。最后成体雌性的整个体腔充满了卵，雌性线虫死亡。充满了卵的死亡的雌性躯体被称为胞囊。最后胞囊移出，在土壤中游离地被发现。胞囊的壁变得很坚韧，为内含的大约200至400个卵提供极好的保护。SCN的卵生存在胞囊内直到合适的孵化条件发生。虽然许多卵可能在第一年内孵化，但也有许多在胞囊内要生存好几年。
线虫自身每年可以通过土壤移动仅几英寸。然而，线虫侵染可以用各种方式遍布相当大的距离。可以移动受侵染土壤的任何物质都能够传播该侵染，包括农业机械、交通工具和工具、风、水、动物和农场工人。种子大小的土壤颗粒经常污染收获的种子。因此，当将受侵染田地中的受污染的种子种植在未受侵染的田地时，线虫侵染可被传播。甚至有证据表明某些线虫种类可以通过鸟类传播。不幸的是，在这些因素中仅有一些可被阻止。
管理线虫侵染的传统实践包括：在线虫侵染的土地中保持合适的土壤养分和土壤pH水平；控制其它的植物病害，像昆虫和杂草害虫；使用卫生设施实践例如对SCN侵染的田地的耕作、种植和栽培只在非侵染田地工作之后；在侵染的田地中工作之后用高压水或者蒸汽彻底清洗设备；不使用在受侵染的土地上生长的种子种植非侵染的田地，除非该种子已经被适当地清洗；翻转受侵染的田地并用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和种植抗性植物品种。
已经提出了方法用植物的遗传转化以赋予增强对植物寄生性线虫的抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及在植物被线虫附着后，在觅食部位或靠近觅食部位中特异表达的植物基因的鉴定。美国专利号5,589,622和5,824,876公开了八个分离自感染马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)的马铃薯根部的启动子：没有公开源自其它植物物种的线虫诱导性启动子。这些启动子声称对指导毒性蛋白质或酶的特异性表达、或者靶基因或一般细胞基因的反义RNA的表达有用。
美国专利号5,023,179公开了被称为ASF-1的启动子增强子元件，分离自CaMV启动子，其声称可增强植物在根部的基因表达。
美国专利号5,750,386公开了烟草(Nicotiana tabacum)的RB7根部特异启动子的缺失片段，其声称是线虫应答的。
美国专利号5,837,876公开了从烟草中分离的根部皮层特异基因的启动子并称为TobRD2。
美国专利号5,866,777公开了一种双基因方法来阻碍线虫觅食结构的形成。第一个基因，芽孢杆菌RNA酶，受到至少在觅食结构中驱动表达的启动子的控制。第二个基因，芽孢杆菌RNA酶抑制剂，受到在除了觅食结构外的所有植物细胞中驱动表达的启动子的控制。觅食部位特异性启动子在美国专利号5,866,777中公开了，包括Δ0.3TobRB7和rolC启动子的截短形式。
美国专利号5,955,646公开了基于源自根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的甘露碱合酶和章鱼碱合酶基因的启动子的嵌合调节区，其声称是线虫可诱导的。
美国专利号6,005,092公开了烟草内切-1，4-β-葡聚糖酶(Ntce17)启动子。
美国专利号6,262,344和6,395,963公开了分离自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的启动子，其声称是线虫可诱导的。
美国专利号6,448,471公开了源自拟南芥的启动子，其对于线虫的觅食部位是特异性的。
美国专利号6,593,513公开了在拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(cell)的启动子控制下用芽孢杆菌RNA酶转化植物，以产生能破坏线虫攻击的植物。
美国专利号6,906,241公开了Ntce17启动子与编码杀线虫的或者杀虫的蛋白质的异源核酸结合的用途。
美国专利号7,078,589公开了大豆Pyk20基因和启动子的克隆和分离，其声称是被SCN感染诱导的并在维管组织中显示出强的活性。
美国专利申请公开号2003/0167507公开了大豆异黄酮合酶I的启动子，其声称是根部特异性的且在营养组织中可被寄生虫攻击诱导。
美国专利申请公开号2004/0078841公开了拟南芥的TUB-1、RPL16A和ARSK1启动子的启动子区域，和豌豆(Pisum sativum)的PSMTA启动子，其声称都是根部特异的。
美国专利申请公开号No.2004/0248304公开了大豆Pyk20基因和启动子的克隆和分离，其声称是被SCN感染诱导的并在维管组织中显示出强的活性。
美国专利申请公开号2004/0029167公开来自烟草的II类咖啡酸O-甲基转移酶基因的启动子序列，其声称在应答机械的或化学的损伤或者病原物质的攻击时是可被诱导的。
美国专利申请公开号2005/0262585公开一个源自大豆磷酸核糖基甲酰甘氨脒核糖核苷酸合酶的启动子和其缺失片段，其声称是对线虫感染应答。
WO94/10320公开了源自烟草的Δ0.3TobRB7启动子片段和它与各种线虫觅食细胞特异性表达的基因结合的用途。
WO03/033651公开了被称为SCP1、UCP3和SUP的合成的线虫调节启动子序列。
WO2004/029222和其美国的副本即美国专利申请公开号2005/0070697公开了源自大豆腺苷-5′-磷酸脱氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的调节区，用于改进植物的抗线虫性。
上述提到的根部或觅食部位特异的启动子目前都没有应用于包含抗线虫转基因的市售种子。虽然这种产品的需求已经长期被公认，但迄今没有人成功通过重组DNA技术开发出线虫抗性植物。对与编码对植物寄生性线虫有毒的物质的转基因组合的、根部特异性和/或线虫觅食部位特异性的启动子的需求持续存在。
发明概述
本发明人已经发现当植物基因启动子包含以相互特定的方向的某些已知的调控元件时，这些启动子共同具有可被线虫诱导的特性。因此，本发明提供了适用于在植物根中驱动另一个核酸表达的启动子，其对线虫侵袭是敏感的。本发明的启动子特别用于使农作物植物抵抗线虫的侵染。
在一个实施方案中，本发明提供了启动子构型1的分离的核酸，其中该核酸具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$MADS类元件、负链上的P$MYBS类元件和正链上的P$DOFF类元件，其中P$MADS类元件在P$MYBS类元件的约50个核苷酸之内，P$MYBS类元件在P$DOFF类元件的约50个核苷酸之内，P$MADS类元件在P$DOFF类元件的约100个核苷酸之内。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种启动子构型2的分离的核酸，其中该核酸具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$OPAQ类元件、负链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件，正链上的第二P$AHPB类元件和正链上的P$TBPF类元件，其中P$OPAQ类元件在第一P$AHPB类元件的约60个核苷酸之内，第一P$AHPB类元件在P$MADS类元件的约60个核苷酸之内，P$MADS类元件在第二P$AHPB类元件的约60个核苷酸之内，第二P$AHPB类元件在P$TBPF类元件的约60个核苷酸内，以及P$OPAQ类元件在P$TBPF类元件的约240个核苷酸内。
在另一个实施方案中，本发明提供了启动子构型3的分离的核酸，其中该核酸具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$TBPF类元件、正链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件、正链上的第一P$DOFF类元件、负链上的第二P$DOFF类元件，以及正链上的第二P$AHPB类元件，其中P$TBPF类元件在第一P$AHPB类元件的约60个核苷酸内，第一P$AHPB类元件在P$MADS类元件的约60个核苷酸内，P$MADS类元件在第一P$DOFF类元件的约60个核苷酸内、第一P$DOFF类元件在第二P$DOFF类元件的约60个核苷酸内，第二P$DOFF类元件在第二P$AHPB类元件的约60个核苷酸内，以及P$TBPF类元件在第二P$AHPB类元件的约300个核苷酸内。
在另一个实施方案中，本发明提供了启动子，其包含选自以下的分离的核酸：具有如SEQ ID NO：1所示序列的核酸；在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1所示序列的核酸杂交的核酸；包含如SEQ ID NO：1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸；在严格条件下与包含如SEQ IDNO：1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸杂交的核酸；具有如SEQID NO：2所示序列的核酸；在严格条件下与具有如SEQ ID NO：2所示序列的核酸杂交的核酸；包含如SEQ ID NO：2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸；在严格条件下与包含如SEQ ID NO：2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸杂交的核酸；具有如SEQ ID NO：3所示序列的核酸；在严格条件下与具有如SEQ ID NO：3所示序列的核酸杂交的核酸；包含如SEQ ID NO：3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸；和在严格条件下与包含如SEQ ID NO：3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸杂交的核酸。
本发明也体现在含有本发明启动子的表达盒和转基因植物，和控制农作物被寄生性线虫侵染的方法，其中该方法使用包含本发明启动子(与另一个编码对植物寄生性线虫有毒的物质的核酸有效连接)的重组核酸构建体。
附图简述
图1A：基因座At1g21890(SEQ ID NO：1)的拟南芥启动子区域的序列，在碱基1854-1860位的TATA框用小写、粗体和斜体表示；图1B是存在于包含在SEQ ID NO：1所示启动子内的启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3中的启动子元件类别的表格。
图2：基因座At4g08290(SEQ ID NO：2)的拟南芥启动子区域的序列，在碱基1869-1875位的TATA框用粗体表示。
图3：大豆(Glycine max)MtN21-3(SEQ ID NO：3)的启动子区域的序列，在碱基664-670位的TATA框部分是小写的，并且是粗体和下划线。图3中也包括存在于包含在SEQ ID NO：3所示启动子内的启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3中的启动子元件类别的表格。
图4：GmMtN21-2(GM50444087；SEQ ID NO：4)和GmMtN21-1(GM50862200，SEQ ID NO：5)的cDNA序列。
图5：GmMtN21-3(SEQ ID NO：6)的序列。
图6：包含基因座At1g21890(SEQ ID NO：1)的拟南芥启动子的二元载体pAW134qcz的图谱。
图7：包含基因座At4g08290(SEQ ID NO：2)的拟南芥启动子的二元载体pAW219qcz的图谱。
图8：包含GmMtN21-3启动子(SEQ ID NO：3)的二元载体pAW223qcz的图谱。
图9：在实施例3所示的大豆发根测定中二元载体pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。“DAI”是指用SCN接种后的天数。使用以下计分指标：“-”为没有GUS染色，“+”为GUS弱的染色，“++”为强的GUS染色。10个计数的大概平均值用于测定该品系合胞体中的GUS表达水平。此外，对于其它的根部组织比如愈伤组织、根尖、维管结构、皮层和原基(primordial)，在相同品系中的GUS表达水平也用相同的GUS计分指标记录即“-”为没有染色、“+”为弱的染色、“++”为强的染色。
图10：在基因座At1g21890(SEQ ID NO：1)的拟南芥启动子和大豆MtN21-3启动子(SEQ ID NO：3)中启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3的启动子元件类别的位置。
图11：在实施例7中用于获得SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3的启动子及SEQ ID NO：1的缺失的PCR引物。
图12A-12B：大豆cDNA GmMtN21-2(GM50444087；SEQ ID NO：4)和GmMtN21-1(GM50862200，SEQ ID NO：5)的序列比对。
图13A，13B，13C：基因组移行片段(walkingfragment)GmMtN21-3(SEQ ID NO：6)和大豆cDNAGmMtN21-2(GM50444087；SEQ ID NO：4)的序列对比。GmMtN21-2(SEQ ID NO：4)的ATG起始密码子始于第74bp。一个推定的793bp的启动子区域由SEQ ID NO：3所示，且源自于GmMtN21-3(SEQID NO：6)的碱基第126至916位。
图14A，14B，14C：比较SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基(对应于At1g21890pr650bp的第1至650位碱基)、SEQ ID NO：2的第1298至1947位碱基(对应于At4g08290pr650bp的第1至650位碱基)和SEQ IDNO：3的第142至791位碱基(对应于Gm_MtN21pr650bp的第1至650位碱基)的Genomatix DiAlign结果。
图15：在启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3(非准确尺度)中发现的启动子元件类别的空间构型，包括启动子元件类别共有序列。在命名为“元件IUPAC串共有序列”的那栏中，使用以下缩写：A＝腺嘌呤，C＝胞嘧啶，G＝鸟嘌呤，T＝胸腺嘧啶，R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，K＝G或T，W＝A或T，S＝C或G，和N＝A、C、G或T。构型关键如下：
1：包含启动子构型1的SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基中包含的启动子元件类别的表示。
2：包含启动子构型2的SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基中包含的启动子元件类别的表示。
3：包含启动子构型3的SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基中包含的启动子元件类别的表示。
图16：在实施例9中所示的大豆发根测定中二元载体pAW134qcz、RTJ137、RTJ141、RTJ142、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135和RTJ136(见实施例7和8)的觅食部位β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。使用以下计分指标：“-“为没有染色，“+”为弱的染色，“++”为强的染色。此外，“+/-”表明在12个品系中的1个品系在少于或等于10个观察的觅食部位中的7个中显示出觅食部位中的GUS染色。因为只有1个品系在觅食部位中显示出活性，得分与真阳性表达模式不一致，可能是位置效应的结果。10个计数的大概平均值用于确定在每个品系的合胞体中GUS表达水平。
优选实施方案的详述
通过参考以下本发明优选实施方案和此处包括的实施例的详细说明可以更容易地了解本发明。除非另有说明，此处使用的术语是相关领域的普通技术人员根据常规用法理解的。除以下提供的术语定义之外，在分子生物学中通用术语的定义也可以在Rieger等，1991遗传学词汇：经典的和分子的，第5版(Glossary of genetics：classical and molecular)，Berlin：Springer-Verlag；和在分子生物学通用规程(Current Protocols inMolecular Biology)，F.M.Ausubel等，编著，通用规程(Current Protocols)，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates，Inc.)和约翰Wiley Sons公司(John Wiley &Sons，Inc.)合资(1998增刊)中找到。
可理解的是，如说明书和权利要求书中使用的，“一个/条/种”依据其使用的上下文可以表示一个或多个。因此，例如，涉及“一个细胞”可以表示至少可使用一个细胞。可以理解的是，本发明不限于特定的核酸、特定的细胞类型、特定的宿主细胞、特定条件或者特定方法等等，当然同样地，其中的改变、许多修饰和变异对于本领域的技术人员是显而易见的。也可以理解的是，此处使用的术语只为了描述特定实施方案的目的，并不是有意限制。
贯穿本申请，参考了许多出版物。为了更充分地描述本发明所属领域的技术水平，所有这些出版物的公开和那些出版物中引用的参考整体地在此通过参考并入到本申请中。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化、包括DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应的标准技术和多种分离技术是那些本领域的技术人员已知的且常规使用的。许多标准技术描述在Sambrook和Russell，2001年的分子克隆(MolecularCloning)，第三版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，Plainview，纽约；Sambrook等，1989年的分子克隆，第二版，冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)，Plainview，纽约；Maniatis等，1982年的分子克隆，冷泉港实验室，Plainview，纽约；Wu(编著.)1993年的Meth.Enzymol.218，第I部分；Wu(编著)1979年的Meth Enzymol.68；Wu等，(编著)1983年的Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编著)1980年的Meth.Enzymol.65；Miller(编著)1972年的分子遗传学实验(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Old和Primrose，1981年的基因操作原理(Principles of GeneManipulation)，加利福尼亚大学Press，伯克利；Schleif和Wensink，1982年的分子生物学中的实用方法(Practical Methods in MolecularBiology)；Glover(编著)1985年的DNA克隆(DNA Cloning)卷I和II，IRLPress，牛津，英国；Hames和Higgins(编著)1985年的核酸杂交(NucleicAcid Hybridization)，IRL Press，牛津，英国；和Setlow和Hollaender1979年的遗传工程：原理和方法(Genetic Engineering：Principles and Methods)，卷1-4，Plenum Press，纽约。
本发明的启动子是分离的核酸。此处使用的“分离的”核酸是当通过重组体技术产生时，基本上没有其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上没有化学前体。而且，本发明分离的核酸基本上没有所述核酸所来源生物的天然基因组中存在的侧翼(即位于其5′或3′的序列)。
根据本发明，为了多样化植物的表型，本发明的启动子可以被置于与另一核酸有效联结，用于在植物中对所述另一核酸的根-特异性的和/或线虫诱导的表达。如此处使用的，术语“有效联结”、“有效连接”和“相关联”是可互换的，且表示启动子和另一个核酸序列在单一核酸片段上的以下述方式功能性的连接，所述方式使得另一核酸转录是由该启动子起始和介导的。通常，有效联结的核酸是邻近的。
另一个核酸序列包括，例如，可读框、可读框的一部分、编码融合蛋白的核酸、反义序列、编码双链RNA序列的序列、转基因等等。例如，另一个核酸可以编码昆虫抗性基因、细菌病抗性基因、真菌病抗性基因、病毒病抗性基因、线虫病抗性基因、除草剂抗性基因、影响谷物组成或品质的基因、营养物利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、选择性标记基因、可筛选标记基因、负选择性标记基因、正选择性标记基因、影响植物农艺性状的基因(即产量)、环境胁迫抗性基因(例如赋予对干旱、热、寒冷、冷冻、过度湿润、盐胁迫或者氧化应激的抗性或耐受性的基因)、改善淀粉特性或数量、油数量和品质、氨基酸或蛋白质组成的基因等等。
优选地，另一个核酸编码双链RNA或反义核酸，其整个或部分地与形成或维持觅食部位所需的植物基因充分同一或者同源。另一个核酸可选择性地编码破坏植物寄生性线虫生长、发育和/或繁殖的物质(“线虫毒性”)以减少农作物的破坏。根据本发明，可以使用任何编码对植物寄生性线虫的线虫毒性物质的核酸。例如，线虫毒性的另一个核酸可以编码双链RNA，其与与线虫的生存、变态或繁殖必要的寄生性植物线虫靶基因充分同一。如此处使用的，考虑到当比较RNA和DNA序列时尿嘧啶取代胸腺嘧啶，术语“充分同一”和“对应于”表示dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基因的20个或更多紧接的核苷酸具有至少大约80％-90％的同一，更优选地，与靶基因的20个或更多紧接的核苷酸具有至少大约90-95％的同一，最优选地，与靶基因的20个或更多紧接的核苷酸具有至少大约95-99％的同一或者完全同一。示例性的植物寄生性线虫靶基因是例如在共同转让未决的美国专利申请公开号2005/188438中所示的，在此引用作为参考。另一个核酸可选择地编码双链RNA，其与维持线虫觅食部位所需的植物基因具有充分同一。
可选择地，为了控制线虫，被置于与本发明的启动子有效联结的另一个核酸可以编码线虫毒性蛋白质。例如，编码微生物毒素或其片段、源自昆虫的毒素或其片段的核酸，比如描述在美国专利号5,457,178、5,695,954、5,763,568、5,959,182等等中的那些，用于本发明的实施方案中。
作物植物和相应的病原性线虫列于美国植物病害索引(美国农业部手册号165，1960年)(Index of Plant Diseases in the United States(U.S.Dept.ofAgriculture Handbook No.165，1960))、北美洲植物寄生性线虫种类的分布(线虫学家协会，1985年)(Distribution of Plant-Parasitic Nematode Speciesin North America(Society of Nematologists，1985))和美国植物和植物产品的真菌(美国植物病理学协会，1989年)(Fungi on Plants and Plant Productsin the United States(American Phytopathological Society，1989))中。例如，作为本发明目标的植物寄生性线虫包括，但不限于，孢囊线虫和根节线虫。作为本发明目标的特定的植物寄生性线虫包括，但不限于，大豆异皮线虫(Heterodera glycines)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、木豆孢囊线虫(Heterodera cajani)、三叶异皮线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、或烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫(Ditylenchus angustus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchusvulnus)、弯曲针线虫(Paratylenchus curvitatus)、玉米短体线虫(Paratylenchus zeae)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)、银莲花拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、较小拟毛刺线虫(Paratrichodorusminor)、克氏拟毛刺线虫(Paratrichodorus christiei)、麦粒鳗线虫(Anguinatritici)、Bidera avenae、小麦根瘿线虫(Subanguina radicicola)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、Hoplolaimus galeatus、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、椰子细杆刃线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)、长尾刺线虫(Belonolaimuslongicaudatus)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacoabbus aberrans)、贝氏滑刃线虫(Aphelenchiodes besseyi)、卡纳亚半轮线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、核桃固着线虫(Cacopaurus pestis)等等。
通过包含本发明启动子的核酸构建体保护的农作物包括，但不限于，大豆(G.max)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉(陆地棉(Gossypium hirsutum))、木薯(Manihot esculenta)、咖啡属(咖啡属物种(Cofea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑桔树(柑桔属物种(citrus spp.))、芭蕉属(芭蕉属物种(Musa spp.))、玉米(Zeamays)、油菜--包括卡诺拉油菜(芸苔属物种(Brassica spp.))、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、甜菜--包括糖萝卜、和蔬菜比如青豆(greenbean)(菜豆(Phaseolus vulgaris))、皇帝豆(Phaseolus limensis)和豌豆(香豌豆属物种(Lathyrus spp.))、烟草(Nicotiana tabacum)等等。
共同转让的美国专利申请题为“通过线虫诱导的MtN21-样基因”，USSN 60/743,340，与USSN 60/743,341在同一天提交，在此两者都被引用作为参考，公开和要求保护了命名为大豆MtN-21的大豆基因，其在线虫感染后形成的觅食细胞中被诱导(见SEQ ID NO：4-6)。本发明的拟南芥启动子(SEQ ID NO：1和2)代表大豆MtN-21编码序列的拟南芥直向同源物的启动子区域，且分离自如实施例1中公开的拟南芥基因组DNA。本发明的大豆MtN-21启动子(SEQ ID NO：3)是分离自如实施例2中公开的大豆基因组DNA。如实施例3中所证明的，当置于与GUS报道基因有效联结时，本发明的拟南芥和大豆启动子在线虫侵染的大豆发根中上调。
因此本发明具体涉及启动子，其包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的分离的核酸序列，或者SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的最小启动子片段，所述最小启动子片段能够驱动另一个核酸的根部特异性和/或线虫可诱导的表达。本发明特异性的最小启动子片段包括，但不限于，包含SEQ ID NO：1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸；包含SEQ ID NO：2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸；和包含SEQ ID NO：3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸。在此公开的方法可以用于分离SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3的额外的最小片段，其能够调节另一个核酸的根部特异性和/或线虫可诱导的表达。
可选择地，本发明的启动子包含分离的核酸，其在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所示序列的核酸杂交。如此处使用的严格杂交条件是众所周知的，包括，例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH6.4，1mM EDTA，60℃杂交12-16小时；接着在0.1SSC和0.1％SDS中在大约65℃下清洗大约15-60分钟。本发明进一步具体涉及在严格条件下与包含如SEQ ID NO：1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸杂交的分离的核酸；在严格条件下与包含如SEQ ID NO：2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸杂交的核酸；和在严格条件下与包含如SEQ ID NO：3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸杂交的核酸。
除包含SEQ ID NO：1-3中所示特定分离的序列的启动子和其中包含的最小启动子区域的启动子，以及在严格条件下与包含SEQ ID NO：1-3中所示特定序列的启动子杂交的启动子之外，本发明包含此处所述的启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3的任何分离的核酸。这里使用的术语“启动子构型”描述了在启动子序列内以5′至3′方向排列的多个启动子元件类别的特定结合，其中每个启动子元件类别相对于每个其他的启动子元件类别处于特定的空间方向。可用本领域的技术人员所熟知的许多方法鉴定启动子元件。一种此类方法是利用Genomatix CoreSearchTM算法(基因麦克软件公司(Genomatix Software GmbH)，慕尼黑，德国)。CoreSearch命名的规则利用“P”表示基于植物的启动子元件和“U”鉴定使用者定义的启动子元件。这些主要的识别符通过“$”从元件类型中分出来。元件类别在“$”之后；例如，“OPAQ”、“MADS”或“MYBS”。
如图15中所示，P$MADS启动子元件类别被称为“元件1”且通过元件描述符P$AGL2.01例证，其具有共有序列TNCCAWAWWTRGNAA(SEQ ID NO：17)，见Huang H.，等(1996)Plant Cell 8：81-94。如图15中“元件2”所示的P$MYBS启动子元件类别通过元件描述符P$OSMYBS.01例证，其具有共有序列SWSKTATCCATNYM(SEQ ID NO：18)，见Toyofuku K.，等(1998)FEBSLett.428：275-280；Morita A.，等(1998)FEBS Lett.423：81-85；GublerF.，等(1992)Plant Cell 4：1435-1441；Lanahan M.B.，等(1992)Plant Cell4：203-211；Huttly A.K.，等Mol.Gen.Genet.(1988)214：232-240；Isabel-LaMoneda I.，等(2003)Plant J.33：329-340；和Lu C.A.，等(2002)Plant Cell 14：1963-1980。P$DOFF启动子元件类别通过元件描述符P$PBF.01例证，其具有共有序列WNWAAAGNG(SEQ ID NO：19)且如图15中“元件3”所示，见Yanagisawa S.，等Plant J.17：209-214(1999)。P$OPAQ启动子元件类别通过元件描述符P$O2.02例证，其具有共有序列CCACGT(SEQ ID NO：20)且如图15中“元件4”所示，见Cord Neto G.，等(1995)Plant.Mol.Biol.27：1015-1029；Vincentz M.，等(1997)Plant.Mol.Biol.34：879-889；Hwang Y.S.，等(2004)Plant CellPhysiol 45：1509-1518。P$AHPB元件类别通过元件描述符P$WUS.01例证，其具有共有序列TTAATG(SEQ ID NO：21)，且如图15中“元件5”所示，见Hong R.L.，等(2003)Plant Cell 15：1296-1309；Lohmann J.U.，等(2001)Cell 105：793-803。P$MADS元件类别通过元件描述符P$MADSB.01例证，其具有共有序列WNCYAAAAATGSMAA(SEQ ID NO：22)，且如图15中“元件6”所示，见Riechmann J.L.，等(1996)Nucleic AcidsRes.24：3134-3141；Hill T.A.，等(1998)Development 125：1711-1721。P$AHPB元件类别通过元件描述符P$ATHB1.01例证，其具有共有序列CAATTATT(SEQ ID NO：23)，且如图15中“元件7”所示，见Sessa G.，等(1993)EMBO J.12：3507-3517。P$TBPF元件类别通过P$TATA.01元件描述符例证，其具有共有序列YNMTATAAATANA(SEQ ID NO：24)，且如图15中“元件8”所示，见Gidoni D.，等(1989)Mol.Gen.Genet.215：337-344；Yang H.，等(2000)Plant Mol.Biol.44：635-647；Chiron H.，等(2000)Plant Physiol 124：865-872；Guerineau F.，等(2003)J.Exp.Bot.54：1153-1162；Haralampidis K.，等(2002)Plant Physiol129：1138-1149；Ishizaka T.，等(2003)Genes Genet.Syst.78：191-194；Hasegawa K.，等(2003)Plant J.33：1063-1072。P$AHPB元件类别通过P$ATHB9.01元件描述符例证，其具有共有序列GTAATGATTRC(SEQID NO：25)，且如图15中“元件9”所示，见Sessa G.，等(1998)Plant Mol.Biol.38：609-622。如图15中“元件10”所示的P$DOFF元件类别通过元件描述符P$DOF2.01例证，其具有共有序列WAAAGC(SEQ ID NO：26)，见Yanagisawa S.，等(1999)Plant J.17：209-214。P$AHPB元件类别通过P$ATHB9.01元件描述符例证，其具有共有序列GTAATGATTRC(SEQID NO：27)，且如图15中“元件11”所示，见Sessa G.，等(1998)Plant Mol.Biol.38：609-622。
启动子构型1的启动子是分离的核酸，其具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$MADS类元件、负链上的P$MYBS类元件和正链上的P$DOFF类元件，其中P$MADS类元件在P$MYBS类元件的约50个核苷酸之内，P$MYBS类元件在P$DOFF类元件的约50个核苷酸之内，P$MADS类元件在P$DOFF类元件的约100个核苷酸之内。
在另一个实施方案中，本发明提供植物启动子，其包含具有正链和负链的核酸，该核酸组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$MADS类元件、负链上的P$MYBS类元件和正链上的P$DOFF类元件，其中通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。
启动子构型2的启动子是分离的核酸，其具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$OPAQ类元件、负链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件，正链上的第二P$AHPB类元件和正链上的P$TBPF类元件，其中P$OPAQ类元件在第一P$AHPB类元件的约60个核苷酸之内，第一P$AHPB类元件在P$MADS类元件的约60个核苷酸之内，P$MADS类元件在第二P$AHPB类元件的约60个核苷酸之内，第二P$AHPB类元件在P$TBPF类元件的约60个核苷酸内，以及P$OPAQ类元件在P$TBPF类元件的约240个核苷酸内。
在另一个实施方案中，本发明提供植物启动子，其包含具有正链和负链的核酸，该核酸组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$OPAQ类元件、负链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件、正链上的第二P$AHPB类元件和正链上的P$TBPF类元件，其中通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。
启动子构型3的启动子是分离的核酸，其具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$TBPF类元件、正链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件、正链上的第一P$DOFF类元件、负链上的第二P$DOFF类元件，以及正链上的第二P$AHPB类元件，其中P$TBPF类元件在第一P$AHPB类元件的约60个核苷酸内，第一P$AHPB类元件在P$MADS类元件的约60个核苷酸内，P$MADS类元件在第一P$DOFF类元件的约60个核苷酸内、第一P$DOFF类元件在第二P$DOFF类元件的约60个核苷酸内，第二P$DOFF类元件在第二P$AHPB类元件的约60个核苷酸内，以及P$TBPF类元件在第二P$AHPB类元件的约300个核苷酸内。
在另一个实施方案中，本发明提供植物启动子，其包含具有正链和负链的核酸，该核酸组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$TBPF类元件、正链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件、正链上的第一P$DOFF类元件、负链上的第二P$DOFF类元件和正链上的第二P$AHPB类元件，其中通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。
在另一个实施方案中，本发明提供包含具有正链和负链的核酸的植物启动子，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含一个或多个P$MADS类元件和至少一个P$TBPF类元件，其中通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。在另一个实施方案中，本发明提供包含具有正链和负链的核酸的植物启动子，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含P$MADS类元件，接着是P$TBPF类元件，接着是第二P$MADS类元件，其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。在还有另一个实施方案中，本发明提供包含具有正链和负链的核酸的植物启动子，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含第一P$MADS类元件，接着在约100个核苷酸之内是P$TBPF类元件，接着在约200个核苷酸之内是第二P$MADS类元件，第一P$MADS类元件是在第二P$MADS类元件的约300个核苷酸之内，并且其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。
在另一个实施方案中，本发明提供包含具有正链和负链的核酸的植物启动子，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含具有元件描述符P$MADSB.01的第一P$MADS类元件、具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF类元件和具有元件描述符P$AGL2.01的第二P$MADS类元件，其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。在还有另一个实施方案中，本发明提供包含具有正链和负链的核酸的植物启动子，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含具有元件描述符P$MADSB.01的第一P$MADS类元件，接着在约100个核苷酸之内是具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF类元件，且接着在约200个核苷酸之内是具有元件描述符P$AGL2.01的第二P$MADS类元件，第一P$MADS类元件在第二P$MADS类元件的约300个核苷酸之内，且其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。
本发明也具体涉及包含本发明启动子的表达盒。“表达盒”在本文中概括地理解为包含该盒中含有的所有序列，其可以影响感兴趣的核酸的转录，以及若适当的话，其翻译。除本发明的启动子之外，本发明的表达盒还可以包含改善启动子功能的调控元件、允许在原核和/或真核生物中转录和/或翻译的遗传元件，和下游的(在3′-方向)调控元件比如转录终止序列和聚腺苷酸化序列。本发明表达盒的各种元件是顺序地且有效地连接在一起。
因此，本发明的表达盒可以包含选自以下的分离的核酸：具有如SEQ ID NO：1中所示序列的核酸；在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1中所示序列的核酸杂交的核酸；包含如SEQ ID NO：1中所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸；在严格条件下与包含如SEQ ID NO：1中所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸杂交的核酸；具有如SEQ IDNO：2中所示序列的核酸；在严格条件下与具有如SEQ ID NO：2中所示序列的核酸杂交的核酸；包含如SEQ ID NO：2中所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸；在严格条件下与包含如SEQ ID NO：2中所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸杂交的核酸；具有如SEQ ID NO：3中所示序列的核酸；在严格条件下与具有如SEQ ID NO：3中所示序列的核酸杂交的核酸；包含如SEQ ID NO：3中所示序列的第364至697位核苷酸的核酸；在严格条件下与包含如SEQ ID NO：3中所示序列的第364至697位核苷酸的核酸杂交的核酸；启动子构型1的核酸；启动子构型2的核酸和启动子构型3的核酸。可选择地，本发明的表达盒包含选自以下的启动子：(a)具有正链和负链的分离的核酸，该核酸组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$MADS类元件、负链上的P$MYBS类元件和正链上的P$DOFF类元件；(b)具有正链和负链的分离的核酸，该核酸组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$OPAQ类元件、负链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件，正链上的第二P$AHPB类元件和正链上的P$TBPF类元件；和(c)具有正链和负链的分离的植物启动子，该启动子组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$TBPF类元件、正链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件、正链上的第一P$DOFF类元件、负链上的第二P$DOFF类元件，以及正链上的第二P$AHPB类元件；其中通过植物寄生性线虫在植物的根部诱导该启动子。
可选择地，本发明的表达盒包含启动子，其包含具有正链和负链的分离的核酸，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含一个或多个P$MADS类元件和至少一个P$TBPF类元件，其中通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。在另一个实施方案中，本发明的表达盒包含启动子，其包含具有正链和负链的分离的核酸，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含P$MADS类元件，接着是P$TBPF类元件，接着是第二P$MADS类元件，其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。在还有另一个实施方案中，本发明的表达盒包含启动子，其包含具有正链和负链的分离的核酸，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含第一P$MADS类元件，接着在约100个核苷酸之内是P$TBPF类元件，接着在约200个核苷酸之内是第二P$MADS类元件，第一P$MADS类元件是在第二P$MADS类元件的约300个核苷酸之内，并且其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。
在另一个实施方案中，本发明的表达盒包含启动子，其包含具有正链和负链的分离的核酸，该核酸在相同链上组合地以5′至3′顺序包含具有元件描述符P$MADSB.01的P$MADS类元件、具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF类元件和具有元件描述符P$AGL2.01的P$MADS类元件，其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。在还有另一个实施方案中，本发明的表达盒包含启动子，其包含分离的核酸，其在相同链上组合地以5′至3′顺序包含具有元件描述符P$MADSB.01的P$MADS类元件，接着在约100个核苷酸之内是具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF类元件，且接着在约200个核苷酸之内是具有元件描述符P$AGL2.01的P$MADS类元件，第一个P$MADS类元件在第二个P$MADS类元件的约300个核苷酸之内，其中可能有其它元件插入且通过植物寄生性线虫在植物根部中诱导该启动子。
本发明的表达盒中可任选包括的特定的遗传元件包括，但不限于，容许在细菌中复制的复制起点，例如，源自pBR322或P15A ori的ORI区域；或者土壤杆菌(Agrobacterium)TDNA转移所需的元件，比如，例如，T-DNA的左边界和/或右边界。本发明的表达盒的其它组分可以包括，但不限于，额外的调控元件比如，例如，增强子、内含子、多聚接头、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等等。示例性的的增强子包括源自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等人，1987)、水稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis 1987)、玉米皱缩I基因(Vasil 1989)、TMV Omega元件(Gallie 1989)的元件和源自非植物的真核生物(例如酵母；Ma 1988)的启动子。示例性的植物内含子序列包括源自Adh1、bronze1、肌动蛋白1、肌动蛋白2(WO 00/760067)的内含子或蔗糖合酶内含子；见Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot，编著，Springer，纽约(1994)。
病毒的前导序列也可以通过本发明的表达盒增强感兴趣的核酸的转录。例如，源自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已经证明在增强表达方面是有效的。本领域已知的其它前导序列包括但不限于：小RNA病毒前导序列，例如，脑心肌炎病毒(EMCV)前导序列；马铃薯Y病毒前导序列，烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列；MDMV前导序列(玉米矮缩花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列，源自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4)。
本发明的表达盒也可以包含转录终止元件或聚腺苷酸化信号。示例性的转录终止元件包括源自根癌土壤杆菌的胭脂碱合酶基因(Bevan 1983)的那些、用于根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子，和马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3′末端。
待被转录成RNA且任选地表达成蛋白质的另一核酸被插入到本发明的表达盒中用于转化生物。根据本发明，另一核酸序列以与之共价连接地被置于本发明启动子的下游(即以3′方向)和转录终止元件的上游。优选地，本发明的另一核酸序列和启动子之间的距离不多于200个碱基对，更优选地不多于100个碱基对，最优选地不多于50个碱基对。
本发明的表达盒也可以通过将本发明的启动子插入到植物基因组中进行装配。这样的插入将导致与对于基因组而言天然的感兴趣的核酸序列的有效连接。由于本发明启动子的转录调节特性，通过线虫诱导后，这样的插入使得感兴趣的核酸优先在根组织中表达或过量表达。该插入可以是被指导的或偶然的。优选地该插入是被指导的且通过例如同源重组实现。通过这种方法，天然的启动子可以被本发明的启动子替代，由此修饰内源基因的表达模式。该启动子也可以以表达内源基因的反义mRNA的方式被插入，由此诱导基因沉默。
本发明的表达盒可被插入到重组载体、质粒、黏粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或者适于转化入宿主细胞的任何其它载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞和植物细胞。当宿主细胞是植物细胞时，该表达盒或载体可被插入到转化的植物细胞的基因组中。可选择地，该表达盒或载体可在染色体外维持。本发明的表达盒或载体可以存在于植物细胞的细胞核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入到植物细胞的细胞核的染色体DNA中。
本发明的表达盒可被转化入植物中以提供转基因植物，其包含与本发明植物启动子有效联结的另一核酸。该实施方案的转基因植物包含启动子，其包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的核酸序列，SEQ ID NO：1的最小启动子片段、SEQ ID NO：2的最小启动子片段或SEQID NO：3的最小启动子片段。可选择地，本发明的转基因植物包含核酸，其在严格条件下与包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示核酸序列，SEQ ID NO：1的最小启动子片段、SEQ ID NO：2的最小启动子片段或SEQ ID NO：3的最小启动子片段的启动子杂交。在另一个实施方案中，该转基因植物包含启动子构型1、启动子构型2或启动子构型3的启动子。
本发明的转基因植物是利用植物生物工程领域的技术人员已知的转化方法制造的。任何方法都可以用来将重组表达载体转化入植物细胞中以生产本发明的转基因植物。用于转化或转染包括植物细胞的宿主细胞的适当的方法可在例如Sambrook等，见上、和其它实验室手册比如分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，1995，44卷、土壤杆菌规程(Agrobacterium protocols)，编著：Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，新泽西州中找到。
用于转化双子叶植物的一般方法也公开了，例如在美国专利号4,940，838、5,464,763中等等。用于转化特定的双子叶植物例如棉的方法在美国专利号5,004,863、5,159,135和5,846,797中提出了。大豆转化方法在美国专利号4,992,375、5,416,011、5,569,834、5,824，877、6,384,301和在EP 0301749B1中提出了。其它的植物转化方法在例如美国专利号4,945,050、5,188,958、5,596,131、5,981,840等中公开了。
利用已知的植物育种方法，本发明的转基因植物可以与相似的转基因植物或与缺乏本发明的启动子和另一核酸的植物杂交，以制备种子。然后种植该种子以获得包含感兴趣的核酸和本发明启动子的杂交的能育的转基因植物。该植物可以是单子叶植物或双子叶植物。该杂交的能育的转基因植物可具有通过母本或通过父本遗传的特定的表达盒。第二种植物可以是近交植物。该杂交的能育的转基因可以是杂种。任何这些杂交的可繁殖的转基因植物的种子也包括在本发明之内。
本发明还具体涉及包含大多数本发明的转基因植物(一起种植在农田中)的农作物。
本发明的转基因植物可以用于控制由植物寄生性线虫侵袭农作物的方法，其包含从种子生长成所述农作物的步骤，该种子包含表达盒，所述表达盒包含本发明的植物启动子与另一核酸有效联结，所述另一核酸编码破坏所述植物寄生性线虫的生长、发育和/或繁殖的物质，其中该表达盒稳定地整合到该种子的基因组中。这样的线虫毒性的破坏物质包括，但不限于，与寄生性植物线虫的靶基因(对于线虫的生长、变态或繁殖至关重要)充分同一的双链RNA；与维持线虫觅食部位所需的植物基因充分同一的双链RNA；微生物毒素；源自昆虫的毒素等等。
以下实施例不是想要限制本发明权利要求的范围，而是意指某些实施方案的示例。在该举例说明的方法中任何对于熟练的技术人员来说能够想到的变化都属于本发明的范围内。
实施例1：源自拟南芥的植物药物/代谢物输出基因启动子的克隆
利用Qiagen DNAeasy Plant Minikit(强基因公司(Qiagen))提取拟南芥(Columbia生态型)基因组DNA。利用标准的PCR扩增方案克隆1,967bp(SEQ ID NO：1)和1,950bp(SEQ ID NO：2)基因组DNA区域(推定的启动子序列)，其正好位于ATG密码子的上游，包括5′-非翻译区，分别对应于具有基因座识别符At1g21890和At4g08290的拟南芥植物代谢物输出基因。为此，在PCR反应中将大约0.1μg拟南芥基因组DNA用作DNA模板。用于拟南芥启动子序列的PCR扩增的引物示于图11，且是根据拟南芥基因组序列数据库(TAIR)设计的。由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9所述的引物序列包含PstI限制性位点以便于克隆。由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所述的引物序列包含AscI位点以便于克隆。由SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所述的引物序列用于扩增拟南芥基因座At1g21890的启动子区域。由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所述的引物序列用于扩增拟南芥基因座At4g08290的启动子区域。
扩增反应混合物包含如下：2.5μl10×Hot Start缓冲液；0.15μl HotStart Taq DNA聚合酶；0.5μl 10mM dNTP；0.5μl 10μM引物A；0.5μl10μM引物B；1.0μl拟南芥基因组DNA(大约100ng)；19.85μl水。热循环仪：T3 Thermocycler Biometra，德国，用于扩增，利用以下设置：以94℃900秒进行1个循环；以94℃30秒、52℃30秒和72℃120秒进行5个循环；以94℃30秒、62℃30秒和72℃120秒进行30个循环；以72℃300秒进行1个循环。
每个PCR产物的扩增的DNA片段大小，通过标准的琼脂糖凝胶电泳和通过Qiagen凝胶提取试剂盒(强基因公司(Qiagen)，Hilden，德国)从凝胶中提取的DNA来检验。将纯化的片段按照厂商说明(英杰生命技术公司(Invitrogen))利用TOPO TA克隆试剂盒TOPO克隆入pCR2.1中。将该克隆片段利用Applied Biosystem 373A(ABI)自动测序仪进行测序，并通过利用来自序列分析工具Vector NTI的序列比对clustalW来检验预期的序列。对应于At1g21890和At4g08290的启动子区域的1,967bp和1,950bp DNA片段如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。为利于克隆而在引物中引入的限制性位点不包括在该序列中。
实施例2：源自大豆的MtN21-样代谢物输出基因启动子的克隆如在此处以其整体引入本文作为参考的共同转让的美国专利申请USSN 60/743,340中更加充分的描述的，利用生物信息学方法，两种编码大豆MtN21同源物即GmMtN21-1(GM50862200，SEQ ID NO：5)和GmMtN21-2(GM50444087，SEQ ID NO：4)的多核苷酸在SCN感染的大豆根部的合胞体中被鉴定为上调。图4描述了GmMtN21-1和GmMtN21-2的序列。GmMtN21-2cDNA序列(SEQ ID NO：4)被确定为全长，因为有一个起始于bp59上游的TAG终止密码子，以及在相同的读框中开始于碱基对74的编码的Mtn21可读框的ATG起始密码子。GmMtN21-2(被称为GM50444087，SEQ ID NO：4)和GmMtN21-1(被称为GM50862200，SEQID NO：5)的序列比对示于图12，表明GmMtN21-1可能是在N-末端缺失大约200个氨基酸的部分序列。
克隆GmMtN21的启动子序列，根据厂商说明使用Universal GenomeWalking Kit(克隆技术实验室公司(Clontech Laboratories Inc.)，PaloAlto，加利福尼亚州)。为此，利用Qiagen DNAeasy Plant Minikit(强基因公司(Qiagen))提取大豆(大豆，Resnik)基因组DNA。该方法由两个PCR扩增组成，利用衔接引物和基因的引物用于每一个扩增反应。用于分离本发明启动子的引物序列示于图11。靶向GmMtN21-2(SEQ ID NO：4)的基因特异性引物是初级引物GmMtN21-2GW(SEQ ID NO：11)和嵌套引物GmMtN21-2 GWnest(SEQ ID NO：12)。使用的衔接引物是GmMtN21-2GW AP1(SEQ ID NO：13)和GmMtN21-2GW AP2(SEQ IDNO：14)。利用这个方案，分离和测序一些克隆。
最长的克隆产物被鉴定为pAW121(SEQ ID NO：6)。PAW121与GmMtN21-2的序列比对表明该克隆与如图5所示的GmMtN21-2(SEQ IDNO：4)高度同源但不是一致的。因此，pAW121序列可能源自于GmMtN21-2的同源物，因而命名为GmMtN21-3。该比对也显示了pAW121包含编码区中第1101至1223位核苷酸的122个碱基对的内含子和ATG的上游第126至916位核苷酸的791bp的启动子序列(参见图13)。该启动子区域是利用标准PCR技术和引物GmMtN21-3promFor(SEQ IDNO：15)和GmMtN21-3promRev(SEQ ID NO：16)从pAW121中克隆的。GmMtN21-3promFor和GmMtN21-3promRev分别携带有PstI和AscI的限制性酶切位点以便于定向克隆。不带有用于克隆的限制性位点的GmMtN21-3启动子和5′UTR序列如SEQ ID NO：3所示。核苷酸序列1-697代表整个启动子序列，其具有跨度为第364-697位核苷酸的核心启动子区域。TATA信号跨越第664-670位核苷酸并且mRNA的5’未翻译前导序列是从核苷酸697-791。
实施例3：用于转化和产生转基因发根的二元载体的构建
为评价该克隆的启动子的表达活性，在GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游，克隆了对应于SEQ ID NO：1的第1-1967位核苷酸、SEQ ID NO：2的第1-1947位核苷酸和SEQ ID NO：3的第1-791位核苷酸的基因片段，以分别产生二元载体pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz，如图6至8所示。二元载体中植物选择标记是源自拟南芥的突变的AHAS基因，其赋予针对除草剂ARSENAL(灭草烟，BASF公司，Florham Park，NJ)的耐受性。该选择性标记——突变的AHAS是由拟南芥AHAS启动子驱动的。
大豆胞囊线虫可以在正常的大豆根部外植体上繁殖。然而，该技术要求持续建立根部外植体，因为这些器官在培养中具有限定性的生长期。相反，通过用发根土壤杆菌(A.rhizogenes)侵染大豆子叶而产生的大豆发根显示出在组织培养中无限生长，这给用于单种繁殖和大豆胞囊线虫的研究的正常根部外植体提供了替代(Cho等，(1998)Plant Sci.138，53-65)。发根土壤杆菌可以反向转移二元载体的T-DNA，由此能产生包含在T-DNA质粒中插入的外源基因的转基因发根。该方法已经被用于生产一些植物种中的转基因根部(Christey，(1997)Doran，P.M.(编著)发根：培养和应用(Hairyroots：culture and application)，Harwood，阿姆斯特丹，第99-111页)。然后转基因发根可以用于研究转基因表达对于任何给定的表型的影响。
在本实施例中，通过电穿孔将二元载体pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz转化到发根土壤杆菌K599株中(Cho等，见上)。转化的土壤杆菌利用以下方案用于诱导大豆发根形成。在发根土壤杆菌接种前约五天，将大豆栽培种Williams 82(SCN易感染的)的种子用10％漂白剂灭菌10分钟，并在1％琼脂上在25℃每天16小时光照下发芽。在发根土壤杆菌接种前约三天，将包含二元载体的发根土壤杆菌菌株K599的冷冻原种在LB+卡那霉素(50μg/ml)平板上划线并在28℃下在黑暗中培养。在发根土壤杆菌接种前约一天，从平板中挑取菌落并接种到液体LB+卡那霉素(50μg/ml)中。在28℃下摇动培养物约16小时。将液体培养物中发根土壤杆菌的浓度调至OD600＝1.0。
从大豆幼苗中切除子叶并将近轴侧用解剖刀割几次。将15μl发根土壤杆菌悬液接种在创伤的表面上，并将子叶以近轴侧向上放在1％琼脂平板上3天(在25℃每天16小时光照下)。然后将子叶转移到包含500μg/ml羧苄青霉素(以抑制发根土壤杆菌)和1μM ARSENAL的MS平板上。在选择培养基上培养子叶2星期之后，发根从创伤部位被诱导。收获抗ARSENAL且在选择培养基上生长的根部并将其转移到新鲜的同样成分的选择培养基上，并在25℃下在黑暗中培养。在收获发根并在选择培养基上培养它们两周后，将发根在包含羧苄青霉素500μg/ml而没有ARSENAL的MS培养基上传代培养。
实施例4：在大豆发根中启动子活性的检测
如实施例3中所示，将本发明的启动子与GUS报道基因有效联结以测定它们的表达活性。在植物中借助于显色物质比如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性染色反应中，可以检测GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性(Jefferson，见上)。
为研究在存在和缺少线虫感染中SEQ ID NO：1-3的启动子活性，从用pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz转化中产生了一些独立的转基因品系。在传代培养约三周后，将MS上的转基因发根品系用表面净化的SCN品种3的J2以每平板2000个J2水平接种。在接种后7和12天(DAI)，通过从琼脂平板中移除来收获根部，并将其在水中随着变化温和清洗，并在包含X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中在37℃下染色16小时。在接种后每一时间点，每个品系的非接种的对照平板也在GUS染色溶液中染色。在GUS染色之后，在酸性品红中染色根部，然后脱色以显现线虫，其被染成红色。然后在显微镜下观察根部以检测GUS表达。
对于每个转基因品系，在感染后7和12天(DAI)观察10个随机挑取的合胞体并对GUS表达的强度计分。使用以下计分指标：“-”为没有GUS染色，“+”为弱的GUS染色，和“++”为强的GUS染色。10个计数的大概平均值用于测定该品系的合胞体中的GUS表达水平。此外，在相同品系中对于其它的根部组织比如愈伤组织、根尖、维管结构、皮层和原基，GUS表达水平也用相同的GUS计分指标记录即“-”、“+”和“++”。用pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz转化的品系的结果显示于图9中。
为了更精确地定义At1g21890(SEQ ID NO：1)的启动子区域，测试上游序列的更短片段。约1000bp和500bp的序列都能在合胞体中赋予线虫诱导的表达，表明在起始密码子的上游500bp区域内发现了所有需要的调控元件。这些结果与利用实施例6中所示的Genomatix分析启动子的结果是一致的。
GUS染色的结果表明对于测试的大多数品系，pAW134中的启动子片段在7DAI和12DAI的合胞体中显示出中间到强的GUS表达。相反，在其它根部部分比如根尖和根部皮层中，GUS表达未被检测到或是非常弱的。然而，在线虫接种的和对照非接种样品中，在维管组织中都存在一些启动子的表达。
实施例5：启动子的PLACE分析
PLACE分析结果表明TATA框位于如图1所示的SEQ ID NO：1的第1854位碱基对至第1860位碱基对。结果，5′非翻译区开始于约第1887位碱基对。TAIR网址也预测5′非翻译区开始于第1887位碱基对。由SEQ IDNO：1描述的序列终止于ATG起始密码子之前的第0个碱基对。由SEQID NO：1描述的启动子的潜在核心区域是从第1554位至1887位碱基。
PLACE分析结果表明TATA框位于如图2所示的SEQ ID NO：2的第1869位碱基对至第1875位碱基对。结果，5′非翻译区开始于约第1902位碱基对。TAIR网址预测5′非翻译区开始于第1766位碱基对。由SEQ IDNO：2描述的序列终止于ATG起始密码子之前的第0个碱基对。由SEQID NO：2描述的启动子的潜在核心区域是从第1569位至1902位碱基。
PLACE结果表明TATA框位于如图3所示的SEQ ID NO：3的第664位碱基对至第670位碱基对。结果，5′非翻译区开始于约第697位碱基对。由SEQ ID NO：3描述的启动子的潜在核心区域是从第364至697位碱基。
实施例6：启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3的鉴定
Genomatix是包含DiAlign和FrameWorker(基诺麦替克斯公司(Genomatrix)，慕尼黑，德国)算法的启动子序列分析软件应用。DiAlign是多重序列对比工具，而FrameWorker可以针对方向和距离相关的转录因子结合位点(启动子元件类别)扫描一组DNA序列。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的3′端的650bp用于两次上述Genomatix分析。这对应于SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基、SEQ ID NO：2的第1298至1947位碱基和SEQ ID NO：3的第142至791位碱基。
使用Genomatix DiAlign程序以测定SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基、SEQ ID NO：2的第1298至1947位碱基和SEQ ID NO：3的第142至791位碱基之间是否存在序列同源性。该分析的结果显示于图14中。该分析显示了SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基与SEQ ID NO：3的第142至791位碱基最类似(24％序列同一性)。因此，利用GenomatixFrameWorker算法将SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基与SEQ IDNO：3的第142至791位碱基相比较，以利用默认参数确定植物启动子元件类别的共同结构。在该分析中鉴定了多个启动子构型模型。
进行额外的分析，将启动子元件之间的距离从50bp(默认)扩展到60bp。这一第二种分析也产生多个启动子构型模型。如图10中所总结的，产生了启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3，其分别包含3个、5个和6个启动子元件。包含3个启动子元件类别的模型被指定为启动子构型1。包含5个启动子元件类别的模型被指定为启动子构型2。包含6个启动子元件类别的模型被指定为启动子构型3。包含在SEQ ID NO：1和SEQID NO：3的启动子序列中的启动子元件类别的位置分别显示在图1和图3中。此外，图15显示了在所有三个启动子构型中启动子元件类别的共同空间定向。
实施例7：克隆At1g21890(SEQ ID NO：1)启动子的缺失
为了进一步定义At1g21890(SEQ ID NO：1)的启动子区域，产生了总共八个包含拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的启动子缺失片段的构建体。所有启动子缺失构建体被包含在相同的载体主链中如图6中所示的pAW134qcz。这些构建体的结果被用于确定启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3中描述的元件(参见图15)是否对在SCN觅食部位中驱动表达是必需的。启动子缺失构建体的概述描述于图16中。产生了包含拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的第1318至1967位碱基的650bp的启动子片段(含有图15中描述的启动子元件1到11)，并通过构建体RTJ137来表示。利用Genomatix软件，该启动子区域用于产生图15中描述的启动子构型。产生了包括拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ IDNO：1)的第1318至1637位碱基和第1653至1967位碱基(包含启动子元件1、2、3、4、5、6、7、9、10和11)的635bp启动子片段，并通过构建体RTJ141表示。产生了包括拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的第1318至1713位碱基和第1735至1967位碱基(包含启动子元件2、3、4、5、6、7、8、9、10和11)的629bp启动子片段，并通过构建体RTJ142表示。产生了包括拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的第1526至1967位碱基和含有图15中描述的启动子元件1、2、3、5、6、7、8、9、10和11的442bp启动子片段，并通过构建体pAW329表示。通过构建体RTJ133表示了包括拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的第1556至1967位碱基和含有启动子元件1、2、3、6、7、8、9、10和11的412bp的启动子片段。通过构建体RTJ134表示了包括拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的第1603至1967位碱基和含有启动子元件1、2、3、8、9、10和11的365bp的启动子片段。通过构建体RTJ135表示了包括拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的第1653至1967位碱基和含有启动子元件1、2、3、9、10和11的315bp的启动子片段。通过构建体RTJ136表示了包括拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQID NO：1)的第1710至1967位碱基和含有启动子元件1、2、3、10和11的258bp的启动子片段。总之，构建体RTJ141和RTJ142中包含的两个启动子缺失片段是通过在每一构建体中除去单一元件而获得的，以确定任何一个元件对在SCN觅食部位中启动子的活性是否是必需的。六个启动子缺失构建体(RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135和RTJ136)是通过生成所述拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的5′截短而获得的。
利用DNA合成以产生包含在RTJ141和RTJ142中的两个启动子缺失片段。启动子缺失片段与RTJ137除了它们缺失如上所述的单一启动子元件外是相同的。将PstI和AscI引入到合成的片段中以便于克隆。
为产生六个拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的5′截短，利用Qiagen质粒miniprep试剂盒(强基因公司(Qiagen))从大肠杆菌(E.coli)中提取pAW134qcz的质粒DNA。利用标准PCR扩增方案扩增包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的启动子缺失片段。为此，在PCR反应中用约0.1μg的pAW134qcz质粒DNA(图6中描述的)作为DNA模板。用于PCR扩增拟南芥启动子序列的引物显示于图11中，且是基于包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子(SEQ ID NO：1)的启动子序列而设计的。由SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32和SEQ ID NO：33描述的引物序列包含PstI限制性位点以便于克隆。由SEQ ID NO：34描述的引物序列在pAW134qcz中AscI位点的下游退火，使得在扩增的片段中将包含AscI位点以便于克隆。由SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：34描述的引物序列用于扩增包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子的650bp的启动子缺失区域，用于产生RTJ137。由SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：34描述的引物序列用于扩增包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子的442bp的启动子缺失区域，用于产生pAW329。由SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：34描述的引物序列用于扩增包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子的412bp的启动子缺失区域，用于产生RTJ133。由SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34描述的引物序列用于扩增包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子的365bp的启动子缺失区域，用于产生RTJ134。由SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34描述的引物序列用于扩增包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子的315bp的启动子缺失区域，用于产生RTJ135。由SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34描述的引物序列用于扩增包含在pAW134qcz中的拟南芥基因座At1g21890启动子的258bp的启动子缺失区域，用于产生RTJ136。
扩增反应混合物包含如下：2.5μl10×Pfu Turbo缓冲液；0.5μl PfuTurbo DNA聚合酶；0.5μl10mM dNTP；0.5μl10μM引物A；0.5μl10μM引物B；1.0μl pAW134qcz质粒DNA(约100ng)；19.50μl水。热循环仪(Thermocycler)：T3 Thermocycler Biometra，德国，用于扩增，利用以下设置：在94℃下60秒循环1次；在94℃下30秒、在52℃下30秒和在72℃下120秒循环32次；在72℃下300秒循环1次。
针对每个PCR产物扩增的DNA片段大小，通过标准的琼脂糖凝胶电泳和通过Qiagen凝胶提取试剂盒(强基因公司(Qiagen)，Hilden，德国)从凝胶中提取的DNA来检验。根据厂商说明(新英格兰生物实验公司(NewEngland Biolabs))用PstI和AscI来消化纯化的片段。利用QiagenPCR纯化试剂盒(强基因公司(Qiagen))纯化消化的片段。利用引物SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：34扩增的At1g21890启动子的650bp的启动子缺失区域由SEQ ID NO：1的第1318至1967位碱基表示。利用引物SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：34扩增的At1g21890启动子的442bp的启动子缺失区域由SEQ ID NO：1的第1526至1967位碱基表示。利用引物SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：34扩增的At1g21890启动子的412bp的启动子缺失区域由SEQ ID NO：1的第1556至1967位碱基表示。利用引物SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34扩增的At1g21890启动子的365bp的启动子缺失区域由SEQ ID NO：1的第1603至1967位碱基表示。利用引物SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34扩增的At1g21890启动子的315bp的启动子缺失区域由SEQ ID NO：1的第1653至1967位碱基表示。利用引物SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34扩增的At1g21890启动子的258bp的启动子缺失区域由SEQ ID NO：1的第1710至1967位碱基表示。为利于克隆而在引物中引入的限制性位点不包括在该指定的序列中。
实施例8：用于转化和产生转基因发根的二元载体构建体At1g21890启动子缺失
为评价源自pAW134qcz的克隆的启动子缺失的表达活性，在GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游，克隆了对应于SEQ ID NO：1的第1318至1967位、第1526至1967位、第1556至1967位、第1603至1967位、第1653至1967位和第1710至1967位核苷酸的基因片段，以分别产生二元载体RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136。为评价源自pAW134qcz的克隆的启动子缺失的表达活性，在GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游，克隆了对应于SEQ ID NO：1的第1318至1637位核苷酸和第1653至1967位碱基的合成基因片段，以产生二元载体RTJ141。为评价源自pAW134qcz的克隆的启动子缺失的表达活性，在GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游，克隆了对应于SEQ ID NO：1的第1318至1713位核苷酸和第1735至1967位碱基的合成基因片段，以产生二元载体RTJ142。二元载体中植物选择标记是源自拟南芥的突变的AHAS基因，其赋予对除草剂ARSENAL(灭草烟，BASF公司，Florham Park，NJ)的耐受性。该选择性标记突变的AHAS是由拟南芥AHAS启动子驱动的。
大豆胞囊线虫可以在正常的大豆根部外植体上繁殖。然而，该技术要求持续建立根部外植体，因为这些器官在培养中具有限定性的生长期。相反，通过用发根土壤杆菌侵染大豆子叶而产生的大豆发根显示出在组织培养中无限生长，这给用于单种繁殖和大豆胞囊线虫的研究的正常根部外植体提供了替代(Cho等，(1998)Plant Sci.138，53-65)。发根土壤杆菌可以反向转移二元载体的T-DNA，由此能产生包含在T-DNA质粒中插入的外源基因的转基因发根。该方法已经被用于生产一些植物种中的转基因根部(Christey，(1997)Doran，P.M.(编著)发根：培养和应用(Hairy roots：cultureand application)，Harwood，阿姆斯特丹，第99-111页)。然后转基因发根可以用于研究转基因表达对于任何给定的表型的影响。
在本实施例中，通过电穿孔将二元载体RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136、RTJ141和RTJ142转化到发根土壤杆菌K599株中(Cho等，见上)。转化的土壤杆菌利用以下方案用于诱导大豆发根形成。在发根土壤杆菌接种前约五天，将大豆栽培种Williams 82(SCN易感染的)的种子用10％漂白剂灭菌10分钟，并在1％琼脂上在25℃每天16小时光照下发芽。在发根土壤杆菌接种前约三天，将包含二元载体的发根土壤杆菌菌株K599的冷冻原种在LB+卡那霉素(50μg/ml)平板上划线并在28℃下在黑暗中培养。在发根土壤杆菌接种前约一天，从平板中挑取菌落并接种到液体LB+卡那霉素(50μg/ml)中。在28℃下摇动培养物约16小时。将液体培养物中发根土壤杆菌的浓度调至OD600＝1.0。
从大豆幼苗中切除子叶并将近轴侧用解剖刀割几次。将15μl发根土壤杆菌悬液接种在创伤的表面上，并将子叶以近轴侧向上放在1％琼脂平板上3天(在25℃每天16小时光照下)。然后将子叶转移到包含500μg/ml羧苄青霉素(以抑制发根土壤杆菌)和1μM ARSENAL的MS平板上。在选择培养基上培养子叶2星期之后，发根从创伤部位被诱导。收获抗ARSENAL且在选择培养基上生长的根部并将其转移到新鲜的同样成分的选择培养基上，并在25℃下在黑暗中培养。在收获发根并在选择培养基上培养它们两周后，将发根在包含羧苄青霉素500μg/ml而没有ARSENAL的MS培养基上传代培养。
实施例9：在大豆发根中启动子缺失活性的检测
如实施例8中所示，将本发明的启动子与GUS报道基因有效连接以确定它们的表达活性。在植物中借助于显色物质比如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性染色反应中，可以检测GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性(Jefferson，见上)。
为研究在存在和缺少线虫感染中SEQ ID NO：1的缺失的启动子活性，从用pAW134qcz、RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136、RTJ141和RTJ142转化中产生了一些独立的转基因品系。在传代培养约三周之后，将MS上的转基因发根品系用表面净化的SCN品种3的J2以每平板2000个J2水平接种。在接种后12天(DAI)，通过从琼脂平板中移除来收获根部，将其在水中随着变化温和清洗，并且在包含X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中在37℃下染色16小时。在接种后每一时间点，每个品系的非接种的对照平板也在GUS染色溶液中染色。然后在显微镜下观察根部以检测GUS表达。
对于每个转基因品系，在感染后12天(DAI)观察10个随机挑取的合胞体并对GUS表达的强度计分。使用以下计分指标：“-“为没有染色，“+”为弱的染色，“++”为强的染色。使用以下计分指标：“-“为没有染色，“+”为弱的染色，“++”为强的染色。此外，“+/-”表明在12个品系中的1个品系在少于或等于10个观察的觅食部位中的7个中显示出觅食部位中的GUS染色。因为只有1个品系在觅食部位中显示出活性，得分与真阳性表达模式不一致，可能是位置效应的结果。10个计数的大概平均值用于测定在合胞体中GUS表达水平。
此外，对于用pAW134qcz、RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136、RTJ141和RTJ142转化的品系，在相同品系中就其它的根部组织比如愈伤组织、根尖、维管结构、皮层和原基，也进行了GUS表达水平。在所有的启动子缺失构建体中，在根尖、维管和皮层组织中的表达与包含在pAW134qcz中且由SEQ ID NO：1表示的“全长”启动子是一致的。
在考虑合胞体表达方面，分别包含在RTJ137、pAW329和RTJ133中的650bp、442bp和412bp的启动子序列与包含在pAW134qcz中的1967bp的启动子相当，能在合胞体中赋予线虫诱导的表达。这表明包含在RTJ133中的412bp的启动子之内发现了所有需要的调控元件，包括如图16中所述的启动子元件1、2、3、6、7、8、9、10和11。特别地，分别包含在RTJ141和RTJ142中的635bp和639bp的启动子序列，不能在合胞体中赋予线虫诱导的表达，表明启动子元件8和启动子元件1对于在觅食部位中SCN诱导的表达是必需的。此外，分别包含在RTJ134、RTJ135和RTJ136中的365bp、315bp和258bp的启动子序列，与包含在RTJ133中的全功能的412bp的启动子相比较，显示出没有觅食部位的表达(RTJ134)或极其减少的觅食部位的表达(RTJ135和RTJ136)。这些结果表明启动子元件6对于启动子活性是必需的。总之，这些结果表明实施例6中所述的Genomatix分析鉴定了对于该启动子在觅食部位中驱动线虫诱导的转录所必需的多个元件。
序列表
<110>巴斯福植物科学有限公司(BASF Plant Science GmbH)
<120>植物代谢物输出基因启动子
<130>PF57655(15140)
<150>60/743341
<151>2006-02-23
<160>34
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1967
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
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<213>拟南芥
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<213>大豆(Glycine max)
<220>
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Claims (26)

1.启动子构型1的分离的核酸，其中该核酸具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$MADS类元件、负链上的P$MYBS类元件和正链上的P$DOFF类元件。
2.权利要求1的分离的核酸，其中P$MADS类元件在P$MYBS类元件的约50个核苷酸之内，P$MYBS类元件在P$DOFF类元件的约50个核苷酸之内，且P$MADS类元件在P$DOFF类元件的约100个核苷酸之内。
3.启动子构型2的分离的核酸，其中该核酸具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$OPAQ类元件、负链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件、正链上的第二P$AHPB类元件和正链上的P$TBPF类元件。
4.权利要求3的分离的核酸，其中P$OPAQ类元件在第一P$AHPB类元件的约60个核苷酸之内，第一P$AHPB类元件在P$MADS类元件的约60个核苷酸之内，P$MADS类元件在第二P$AHPB类元件的约60个核苷酸之内，第二P$AHPB类元件在P$TBPF类元件的约60个核苷酸内，以及P$OPAQ类元件在P$TBPF类元件的约240个核苷酸内。
5.启动子构型3的分离的核酸，其中该核酸具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的P$TBPF类元件、正链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$MADS类元件、正链上的第一P$DOFF类元件、负链上的第二P$DOFF类元件，以及正链上的第二P$AHPB类元件。
6.权利要求5的分离的核酸，其中P$TBPF类元件在第一P$AHPB类元件的约60个核苷酸内，第一P$AHPB类元件在P$MADS类元件的约60个核苷酸内，P$MADS类元件在第一P$DOFF类元件的约60个核苷酸内、第一P$DOFF类元件在第二P$DOFF类元件的约60个核苷酸内，第二P$DOFF类元件在第二P$AHPB类元件的约60个核苷酸内，以及P$TBPF类元件在第二P$AHPB类元件的约300个核苷酸内。
7.分离的核酸，其中该核酸，其中该核酸具有正链和负链，且在相同链上组合地以5′至3′顺序包含第一P$MADS类元件、P$TBPF类元件和第二P$MADS类元件。
8.权利要求7的分离的核酸，其中第一P$MADS类元件在P$TBPF类元件的约100个核苷酸之内，P$TBPF类元件在第二P$MADS类元件的约200个核苷酸之内，且第一P$MADS类元件在第二P$MADS类元件的约300个核苷酸之内。
9.分离的核酸，其中该核酸具有正链和负链，且组合地以5′至3′顺序包含正链上的第一P$MADS类元件、正链上的第一P$AHPB类元件、正链上的P$TBPF类元件、正链上的第二P$AHPB类元件、正链上的第二P$MADS类元件、负链上的P$MYBS类元件、正链上的第一P$DOFF类元件、负链上的第二P$DOFF类元件和正链上的第三P$AHPB类元件。
10.权利要求9的分离的核酸，其中每个类元件以5′至3′顺序在下一个类元件的约60个核苷酸之内，且第一P$MADS类元件在第三P$AHPB类元件的约500个核苷酸之内。
11.包含分离的核酸的启动子，该分离的核酸选自：
— 具有如SEQ ID NO：1所示序列的核酸；
— 在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1所示序列的核酸杂交的核酸；
— 包含如SEQ ID NO：1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸；
— 在严格条件下与包含如SEQ ID NO：1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸杂交的核酸；
— 具有如SEQ ID NO：2所示序列的核酸；
— 在严格条件下与具有如SEQ ID NO：2所示序列的核酸杂交的核酸；
— 包含如SEQ ID NO：2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸；
— 在严格条件下与包含如SEQ ID NO：2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸杂交的核酸；
— 具有如SEQ ID NO：3所示序列的核酸；
— 在严格条件下与具有如SEQ ID NO：3所示序列的核酸杂交的核酸；
— 包含如SEQ ID NO：3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸；和
— 在严格条件下与包含如SEQ ID NO：3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸杂交的核酸。
12.包含权利要求1、3、5、7、9和11中任一项的核酸的表达盒。
13.包含权利要求1、3、5、7、9和11中任一项的分离的核酸的载体。
14.包含权利要求1、3、5、7、9和11中任一项的分离的核酸的植物细胞。
15.包含权利要求12的表达盒的转基因植物。
16.权利要求15的转基因植物，其中该植物是单子叶植物。
17.权利要求15的转基因植物，其中该植物是双子叶植物。
18.权利要求15的转基因植物，其中该植物选自：大豆、马铃薯、番茄、落花生、棉、木薯、咖啡属、椰子、凤梨、柑桔树、芭蕉属、玉米、油菜、甜菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、青豆、皇帝豆、豌豆和烟草。
19.权利要求15的转基因植物，其中该植物是整株植物、植物细胞、植物部分或植物种子。
20.通过权利要求15的转基因植物生产的植物种子，其中该种子包含所述分离的核酸。
21.控制在植物中寄生性线虫侵染的方法，其包括从种子生长所述植物的步骤，所述种子包含表达盒，所述表达盒含有与另一核酸有效联结的权利要求1、3、5、7、9和11中任一项的分离的核酸，所述另一核酸编码这样的物质，所述物质破坏所述植物寄生性线虫的代谢、生长和/或繁殖，赋予或改善了植物对所述植物寄生性线虫的抗性，或对所述植物寄生性线虫是有毒的，其中所述表达盒被稳定地整合到所述种子的基因组中。
22.权利要求12的表达盒，其进一步包含编码这样的物质的核酸，所述物质破坏植物寄生性线虫的代谢、生长和/或繁殖，赋予或改善植物对植物寄生性线虫的抗性，或对植物寄生性线虫是有毒的。
23.包含权利要求12的表达盒的转基因植物。
24.在植物中赋予或改善抗线虫性的方法，其包括a)制备构建体，所述构建体包含与第二个核酸有效连接的含有权利要求1、3、5、7、9和11中任一项的核酸序列的第一个核酸，b)用a)的构建体转化植物细胞，其中在植物细胞中响应线虫刺激第一个核苷酸序列诱导第二个核苷酸序列的转录；和c)再生该转化的植物细胞以产生具有抗线虫性或改善抗性的转基因植物。
25.权利要求24的方法，其中第二个核酸编码这样的物质，所述物质破坏植物寄生性线虫的代谢、生长和/或繁殖，赋予或改善植物对植物寄生性线虫的抗性，或对植物寄生性线虫是有毒的。
26.权利要求24的方法，其中第一个核酸是根部特异性的和/或线虫觅食部位特异性的启动子。
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