CN104140979A - 水稻OsMADS25基因在促进直根系植物侧根生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻OsMADS25基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，所述水稻OsMADS25基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。所述应用包括：将水稻OsMADS25基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；将重组表达载体转化受体植物。本发明通过克隆水稻OsMADS25基因，并利用该基因对拟南芥等直根系植物进行遗传转化，使之过表达外源水稻OsMADS25基因，从而能够促进植物侧根的发生和生长，试验结果显示，外源NO₃ ^-与OsMADS25基因对受体植物的生长促进作用是协同的。本发明有助于研究与水稻侧根发育相关的氮素关键调控基因，对能够高效吸收养分的植物品种的筛选和选育具有重要意义。

Description

水稻OsMADS25基因在促进直根系植物侧根生长中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及水稻OsMADS25基因在促进直根系植物侧根生长中的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，我国是世界上最大的水稻生产和消费国。杂种优势的成功利用使得水稻产量得到了极大的提高，为解决世界范围内的粮食危机做出了巨大的贡献。但是，自20世纪80年代以来，杂交水稻的产量就处于徘徊不前的局面。氮肥在水稻生产中的投入正成为增产的有力措施之一，但是大量氮肥的投入，不仅降低了氮素利用效率，同时也带来了资源的浪费以及水体的富营养化等一系列环境问题。目前人们在两个方面进行调节来提高氮素利用效率，一是提高根质膜对NH₄ ⁺的吸收能力；二是改进对氮敏感性高的根部结构，即扩大根的吸收面积。因此，研究水稻根系响应氮素营养的分子机制，充分挖掘水稻自身吸收利用氮素的潜力以提高水稻氮素利用效率，不仅对于解释植物根系生长的可塑性具有重要的理论意义，而且对于提高水稻单位面积的产量具有重要的生产实践价值。

根系作为植物的一个重要的吸收、合成、固定和支持器官，在作物的生长发育过程中起着重要的作用，健壮的根系能够为植物生长提供充足的养分和水分，是植物高产的基础。目前，国际上己将根系研究作为进一步提高农作物生产力的一个极具潜力的基础性科研课题。

水稻根系既是吸收养分和水分的重要器官，也是很多物质同化、转化或合成的场所，还是与地上部进行物质交流的代谢器官。其生长情况与活力会直接影响整个水稻的生长发育、营养水平和产量水平。并且，在资源富集的条件下，根系分枝的增加与提高环境中的资源精确吸收利用密切相关，所以对于根系吸收营养机制的研究非常依赖于对于内在和外在的营养因子如何影响根系分枝的了解。

上述研究结果虽然为研究氮素对水稻根的形态建成及根系对氮素的吸收利用积累了非常有价值的原始资料，但是这些研究大多数都集中在现象的观察和物质含量的变化测定方面，而没有深刻解释变化的内因，因此离认识氮素与水稻根系的生长之间的关系的本质还存在很大的距离。因此，借鉴模式植物中养分吸收利用研究的思路和技术手段，分离和鉴定水稻中与氮素吸收相关的关键基因，对于阐明水稻的氮素吸收利用及其调节的分子机制具有重要的理论意义，同时也对利用现代生物技术手段培育氮素高效吸收利用的水稻新品种具有潜在的实践价值。

发明内容

本发明提供了水稻OsMADS25基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，在拟南芥等直根系植物中外源表达水稻OsMADS25基因能够促进侧根的发生和生长。

水稻OsMADS25基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，所述水稻OsMADS25基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

所述应用包括：

(1)将所述水稻OsMADS25基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体转化受体植物。

重组表达载体的构建可采用常规方法，如可采用Gateway系统(Invitrogen公司)将水稻OsMADS25基因连入植物表达载体中。

所述植物表达载体可选用pH2GW7或pK2GW7。

转化受体植物时，可采用农杆菌介导转化的方法，所述农杆菌具体可以为农杆菌GV3101、EHA105等。

本发明中，所述受体植物为拟南芥等直根系植物；所述拟南芥为Columbia型。

利用所述水稻OsMADS25基因对拟南芥等直根系植物进行遗传转化，经测试发现，转基因植株第一侧根的发生时间较野生型提前了，主根和侧根的生长速度比野生型要快，从而能够促进直根系植物幼苗的早期生长发育。

本发明还提供了一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基因，所述目的基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。所述重组表达载体的构建方法同上。

所述重组表达载体中，启动所述水稻基因OsMADS25表达的启动子为强启动子。作为优选，所述强启动子为35S。强启动子能够有效提高外缘基因的表达水稻，启动水稻OsMADS25基因过表达，可促进侧根的发生和生长。

所述原始载体即为上述的植物表达载体，可选用pH2GW7或pK2GW7。

本发明还提供了一种包含所述重组表达载体的转化子。所述转化子的宿主菌可以为农杆菌，具体可以为农杆菌GV3101或EHA105。

利用所述转化子侵染受体植物，即可实现重组表达载体向受体植物的转化。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过克隆水稻OsMADS25基因，并利用该基因对拟南芥等直根系植物进行遗传转化，使之过表达外源水稻OsMADS25基因，从而能够促进直根系植物侧根的发生和生长，促进直根系植物幼苗的早期生长发育，在外源NO₃ ^-存在的情况下，促生长效果更为显著，试验结果显示，外源NO₃ ^-与OsMADS25基因对受体植物侧根的生长促进作用是协同的。

本发明有助于研究与水稻侧根发育相关的氮素关键调控基因，对能够高效吸收养分的植物品种的筛选和选育具有重要意义，同时也可为解释水稻氮素利用的生理机制、提高水稻的氮素利用效率及其品种遗传改良提供理论依据和技术支撑，具有重要的理论意义及潜在的应用价值。

附图说明

图1为不同浓度KNO₃和OsMADS25基因过量表达对转基因拟南芥的生长促进作用效果图；

其中，first LRs表示第一侧根，PR表示主根，PR≥2cm表示主根长度大于等于2cm，Advancement(％)表示生长促进率(％)；“**”表示与野生型拟南芥相比差异显著，“***”表示与野生型拟南芥相比差异极为显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1制备转基因拟南芥

(1)取水稻幼苗的根，液氮研磨，加入TRIzol试剂(Invitrogen公司)，提取RNA。取0.5μg RNA进行反转录反应得到cDNA。

(2)根据Genbank上的OsMADS25基因序列设计特异引物，分别在引物5’端加上SalⅠ和NotⅠ限制性酶切位点，序列如下：

上游引物：5’-GCGTCGACATGGGGAGAGGGAAGATTG-3’(SEQID No.2)；

下游引物：5’-TTGCGGCCGCTGTAGTAGGCGTGATGCTG-3’(SEQ ID No.3)。

(3)以全长cDNA为模板进行PCR扩增。

采用高保真酶HS DNA Polymerase(TaKaRa Code：DR010A)体系：

5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺plus)10μl，

dNTP Mixture(各2.5mM)4μl，

上游引物(10μM)1μl，

下游引物(10μM)1μl，

模板cDNA1μl，

HS DNA Polymerase0.5μl，

灭菌蒸馏水加至总体积50μl。

PCR循环条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸90秒，扩增30个循环，最后72℃延伸10分钟，结束反应。

(4)将PCR产物回收后通过酶切连接到Gateway克隆系统入门载体pENTR1A，转化大肠杆菌DH5α，测序并分析，OsMADS25基因序列如SEQ ID No.1所示。

(5)将测序正确的含OsMADS25全长CDS的pENTR1A质粒与过量表达载体pH2GW7进行LR交换反应。

使用Gateway LR Clonase TM Enzyme Mix(Invitrogen公司，Cat.No.11791-019)，体系如下：

Entry clone(入门载体)50-150ng，

Destination vector(目的载体)150ng，

5×LR Clonase Reaction Buffer2μl，

ddH₂O up to8μl，

加入2μl LR Clonase enzyme mix，短暂涡旋两次混匀，轻微离心，于25℃水浴8h，然后加入1μl Proteinase K solution(蛋白酶K溶液)混匀，37℃放置10分钟结束反应。

取5μl反应产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落经PCR验证阳性克隆，阳性克隆培养后提取质粒进行双酶切验证，获得重组表达质粒。

(6)转化农杆菌

从-80℃冰箱中取出EHA105感受态细胞，置于冰上解冻，取2μl左右的重组表达质粒加到感受态细胞中，混匀后置于冰上30min，再将离心管内的所有混合物加到预冷的电击杯内，冰上放置。打开伯乐电转仪，程序调至Agr，吸取1ml的LB液体营养基，将电击杯凸点朝内推入电转仪，按一下plus键，听到蜂鸣声，迅速拿出电击杯，并向电击杯中加入1ml的LB液体营养基，重悬细胞，转移至1.5ml的离心管内，放在eppendorf混合仪内28℃，700rpm摇2.5h以上，涂布于抗性YEP平板上(Rif(利福平)50mg/L，Spec(盐酸大观霉素)100mg/L)，28℃倒置培养2个晚上以至长出单菌落。

(7)挑取长出的农杆菌单克隆至含有相应抗生素的5mL YEP液体培养基中(相应抗生素为Rif50mg/L spec100mg/L)，28℃150rpm振荡培养48小时。将新鲜菌液接种至200ml的含有相应抗生素的YEP液体培养液内，28℃，160rpm扩培养至OD₆₀₀为1.2-1.6，4℃下以4000rpm离心15min后收集菌块，将菌块重悬于渗透缓冲液内(MgCl₂10mM，蔗糖5％，Silwet0.05％)，使菌液的OD₆₀₀为0.6-0.8，放置在冰上。

(8)用拟南芥花浸法转化拟南芥

1)将果荚去除干净、仅剩下花序的拟南芥整株与穴盘一起倒扣于已转化农杆菌的菌液里，浸苗5min，期间不断地摇晃菌液；

2)侵染完后，取出植株，侧放于托盘内，覆盖避光的黑色塑料布，放置在生长室内，24h后揭开；

3)将拟南芥植株置于自然光照的条件下进行培养，每周浇1-2次水，待种子成熟后，收获T₀代种子；

4)将收获的T₀代种子杀菌消毒后，种植在MS+50mg/L Hygromycin的固体培养基内，4℃黑暗春化3d后，将培养皿置于人工气候箱内培养，观察拟南芥植株的生长状况。具有潮霉素抗性的转基因种子将会在筛选培养基内生长，而非转基因的种子萌发后不久就白化死去。

实施例2转基因拟南芥的侧根生长观察统计

拟南芥是直根系植物，先长主根，待主根生长一段时间后再发侧根。对获得的转基因拟南芥(实施例1的T₀代种子种植后获得的T₃代纯合体)在含不同浓度KNO₃的B5改良培养基上的根系生长情况进行统计。

点有转基因拟南芥的板子先放于4℃冰箱两天，然后竖直放入生长室中，每天检查根系情况，标记第一侧根发生的时间及主根到达2cm的时间，计算转基因拟南芥相对于野生型拟南芥的第一侧根和主根生长促进率。

Advancement(生长促进率，％)的计算公式为：

Advancement(生长促进率，％)＝(m_control-d_n)/m_control×100％；

其中，m_control表示野生型拟南芥的第一侧根发生时间(天数)或主根到达2cm的时间(天数)，d_n表示转基因拟南芥的第一侧根发生时间(天数)或主根到达2cm的时间(天数)。

统计结果见表1和图1。

表1

由图1和表1可见，在不含KNO₃的B5改良培养基上，相对于野生型拟南芥，转基因拟南芥的第一侧根发生时间提前了约0.66天，第一侧根生长促进率达6.08％；主根到达2cm的时间提前了约0.36天，主根生长促进率达3.25％。

而且，随着B5改良培养基中KNO₃浓度的不断升高，转基因拟南芥的第一侧根发生时间也越来越早，主根到达2cm的时间越来越短。其中，在2mM的KNO₃浓度下，第一侧根生长促进率达11.40％，主根生长促进率达6.44％，在供试的各KNO₃浓度下均为最高。在10mM的KNO₃浓度下，第一侧根生长促进率和主根生长促进率的增幅下降，预示KNO₃浓度过高不利于根系生长。

并且，各KNO₃浓度对转基因拟南芥的生长促进率高于KNO₃单独作用与OsMADS25基因单独作用的总和。如在不含KNO₃的B5改良培养基上，转基因拟南芥相对于野生型拟南芥的第一侧根生长促进率为6.08％；与在不含KNO₃的B5改良培养基上生长的野生型拟南芥相比，在含0.1mMKNO₃的B5改良培养基上生长的野生型拟南芥的第一侧根生长促进率约为10.13％；而与在不含KNO₃的B5改良培养基上生长的野生型拟南芥相比，在0.1mMKNO₃的B5改良培养基上生长的转基因拟南芥的生长促进率达18.99％。

以上结果说明，OsMADS25基因过表达可以显著提高转基因拟南芥第一侧根和主根的生长发育，在一定浓度的外源KNO₃存在下这种生长促进现象更为显著，表明外源KNO₃与OsMADS25基因的生长促进作用是协同的。

Claims (9)

1.水稻OsMADS25基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，其特征在于，所述水稻OsMADS25基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：

(1)将所述水稻OsMADS25基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体转化受体植物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述受体植物为拟南芥。

4.一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基因，其特征在于，所述目的基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，启动所述水稻基因OsMADS25表达的启动子为强启动子。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述强启动子为35S。

7.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述原始载体为pH2GW7或pK2GW7。

8.一种包含如权利要求4～7任一所述重组表达载体的转化子。

9.如权利要求8所述的转化子，其特征在于，宿主菌为农杆菌GV3101或EHA105。