CN101418304A - 一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性e2抗原的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，包括下述步骤：A.克隆E2基因抗原结构域部分；B.构建重组表达载体；C.在LB培养基中表达，获得可溶性的重组E2蛋白；D.亲和层析纯化重组E2蛋白；E.pGST－E2表达蛋白的鉴定，SDS－PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组E2蛋白；F.利用重组E2蛋白建立检测猪瘟血清抗体间接ELISA方法。本发明改良了传统的LB培养基，促进可溶性的E2蛋白表达；解决了猪瘟病毒E2抗原在大肠杆菌中主要以包涵体表达的难题，获得的可溶性E2蛋白与完整猪瘟病毒粒子具有相似的免疫学效果，可作为替代猪瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特异、安全和可靠的猪瘟病毒血清抗体的检测间接ELISA方法。

Description

一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法

技术领域

本发明涉及作为抗原的E2蛋白的制备方法，具体说是一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原蛋白的方法。

背景技术

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的是严重威胁养猪业，具有重要经济意义的烈性病毒性疾病之一，被国际兽疫局(OIE)列为A类15种传染病之一，在我国也被列为一类传染病，可导致各生长阶段猪的死亡，给养猪业造成了巨大经济损失。CSFV是有囊膜的RNA病毒，基因组长约12.3kb，含一个大的开放式阅读框架(ORF)，翻译成一条约含3898个氨基酸残基的多聚前体蛋白，其中C、Erns、E1、E2为结构蛋白。猪瘟病毒E2蛋白作为病毒粒子囊膜上的主要结构糖蛋白之一，是抗猪瘟中和抗体主要诱发者，是猪瘟病毒的主要保护性抗原。近年来，证实了E2分子存在4个独特的抗原结构域A、B、C、D，位于E2N末端的690位～866位氨基酸处。A区位于766位～866位氨基酸处，A区又分为三个功能区A1、A2和A3，A1、A2亚区相连，位于A区C端的795位～851位之间，是E2蛋白的中心部位，为一段保守区，A1亚区能诱导产生中和抗体；A3亚区靠近B、C区，位于766～813位之间，无保守性，也不诱导产生中和抗体；B区位于690～773位之间，C区位于690位～800位之间，两者均为非保守区，是诱导产生中和抗体的主要部位；D区位于766～800位之间，既不保守也不诱导产生中和抗体。功能上，A1亚区、B区与C区与CSFV的中和过程有关，是中和性抗原域，A2、A3亚区、D区不参与病毒的中和，是非中和抗原域。由于大肠杆菌表达的外源性蛋白常以无活性的包涵体的形式存在，需要通过变性、复性等过程才能部分恢复重组蛋白的生物学活性，更重要的是这个过程根本不可能使重组蛋白达到与天然蛋白相一致的生物学功能。这就严重限制了重组蛋白在科学研究中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是利用带有GST标记原核表达载体，通过改善诱导表达条件获得可溶性的重组E2蛋白，纯化后的E2蛋白作为抗原建立检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法，而提供一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法。

本发明的技术问题通过下述技术方案解决：

一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，包括下述步骤：

1、一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，其特征在于，包括下述步骤：

A.克隆E2基因抗原结构域部分：

A.1、设计1对特异性寡核苷酸引物uE和dE；

A.2、提取总RNA，从猪瘟兔化弱毒疫苗中提取核糖核酸-RNA；

A.3、反转录合成cDNA，以提取的核糖核酸RNA为模板，反转录合成cDNA；

A.4、PCR扩增E2基因，用所述的1对特异性寡核苷酸引物，进行聚合酶链式扩增反应扩增；

B.构建重组表达载体；

C.在改良的LB培养基中表达，获得可溶性的重组E2蛋白；

D.亲和层析纯化重组E2蛋白；

E.pGST-E2表达蛋白的鉴定，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE和免疫印迹法Western Blotting鉴定表达的重组E2蛋白；

F.利用重组E2蛋白建立检测猪瘟血清抗体间接ELISA方法。

上述步骤C所述改良的LB培养基成分中含有蛋白胨0.8％；氯化钠0.9％；酵母提取物0.6％，葡萄糖0.1％g加无离子水，调pH＝7.4

所述步骤C在改良的LB培养基中表达E2蛋白的诱导温度为20-14℃，诱导时间12-20小时，诱导剂IPTG浓度为0.10mmol/ml。

所述步骤C在改良的LB培养基中表达E2蛋白的诱导温度为16℃，诱导时间16小时。

血清学检测CSFV抗体是猪抗体水平监测的主要手段，也是诊断猪瘟的重要工具。猪瘟病毒E2基因抗原结构域编码的蛋白与完整的CSF粒子相比，具有无感染性、易于大量生产和纯化等明显的优势。而改善诱导表达条件获得的可溶性的E2蛋白，亲和层析纯化后的E2抗原可与猪瘟阳性血清发生反应特异性很强，纯化后的重组E2蛋白可直接作为检测用抗原建立ELISA方法，应用在临床的猪瘟病毒血清抗体的检测试验中。

本发明制备的可溶性的E2蛋白具有良好生物学活性，将其与高效的大肠杆菌表达系统及ELISA技术相结合，能建立检测猪瘟病毒血清抗体的间接ELISA方法，具有与国外同类产品相当的敏感性和特异性，其单份样品的成本仅为进口试剂盒的1/5，采用本方法纯化的可溶性E2抗原与完整CSFV病毒粒子具有相同的特异性，完全可以替代其作为血清抗体检测用抗原；在血清样品稀释液中添加的空载体重组菌裂解液，可以有效地阻断因样品血清中存在大肠杆菌抗体而产生的非特异性反应，克服了因大肠杆菌污染而导致的假阳性；检测猪瘟病毒血清抗体的间接ELISA方法适合检测猪体内抗猪瘟病毒血清抗体水平，效果良好。本发明检测猪瘟病毒血清抗体的间接ELISA方法为临床猪瘟的科学免疫提供可靠的参考依据。

1、本发明改良了传统的LB培养基，在减少LB相应成分的基础上增加了葡萄糖，配制了iLB液体培养基，在与低温诱导条件共同作用下，有效减少包涵体的形成，促进可溶性的E2蛋白表达；

2、本发明解决了猪瘟病毒E2抗原在大肠杆菌中主要以包涵体表达的难题，获得的可溶性E2蛋白与完整猪瘟病毒粒子具有相似的免疫学效果，可作为替代猪瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特异、安全和可靠的猪瘟病毒血清抗体的检测间接ELISA方法。

具体实施方式

反转录合成cDNA后，采用聚合酶链式反应(PCR)技术和用上、下游引物(uE、dE)扩增抗原蛋白基因E2主要抗原区。PCR产物经纯化、回收后、酶切，与pGEX4T-1表达载体连接，BL21(Star)感受态细胞，重组质粒命名为pGST-E2。IPTG诱导表达和亲和层析纯化重组E2蛋白，建立间接ELISA血清抗体诊断方法，用于猪瘟病毒血清抗体检测。具体步骤为：

1.克隆E2基因抗原结构域部分

1)设计表达引物

设计1对特异性寡核苷酸表达引物uE和dE，同时在5端分别增加限制性内切酶位点，序列为：

uE：5’-GCGAATTC GGACTCACCACTACATGC-3’EcoR I

dE：5’-GCCTCGAGTAGCCATCTGTGCTGATTC-3’Xhol I

2)提取总RNA：使用组织裂解液(TRIZOL试剂)从感染了猪瘟兔化病毒疫苗株的兔脾脏组织毒提取总RNA。

3)反转录合成cDNA：取所提取的RNA5~10μl，加入20μl反转录体系中，内含1×RT buffer(50mM Tris-HCl(pH8.3)，75nM KCl，8mMMgCl₂，10mMDTT)，dNTP(each 10mM)，引物dE50pmol，AMV RTase 10U，RNase inhibitor 20U。在42℃下水浴1h，然后煮沸5min，置-20℃备用。

4)PCR扩增E2基因：取5μl反转录产物加入50μl PCR反应体系中，内含1×PCR buffer(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂pH8.3)0.2mMdATP，dCTP，dGTP，0.19mMdTTP，0.01mM，250nM特异性引物uE/dE。PCR循环参数为94℃40秒，55℃30秒，72℃50秒，第一循环94℃5分钟，最后一循环72℃延伸10分钟。35个循环完成扩增反应。

2.重组表达载体的构建和鉴定：LB液体和固体培养基，抗性及浓度均为Amp+100μg/mL。PCR扩增的E2片段用DNA片段回收Kit纯化回收。限制性内切酶EcoRI和XhoI过夜双酶切PGEX4T-1载体和E2片段，纯化回收酶切后的产物。按照载体和目的片段的合适摩尔比(载体∶目的片段≈1∶3)混合后用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5a感受态细胞，在LB平板培养12～18h。挑取单克隆，增菌后提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，鉴定得到的阳性重组质粒转化表达菌株BL21(Star)感受态细胞，重组质粒命名为pGST-E2。

3.pGST-E2在LB培养基中的试表达：挑取5个单克隆菌株，接种到5个5mLLB液体培养基试管中，220r/min，37℃过夜振荡培养；然后分别从5管中取50μL菌液到新的5个LB液体培养基试管中，250r/min3～4h至OD₆₀₀≈0.5～0.6，在其中的4个管中加入IPTG的终浓度分别为0.1mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L，剩余1管作为阴性对照，37℃ 200r/min振荡培养4～6h。

4.pGST-E2表达蛋白的鉴定：

1)SDS-PAGE鉴定重组E2蛋白：取1mL重组菌到Ep管中，10000r/min离心1min，弃掉上清，加入100μL Tris pH6.8，100℃煮5min，10000r/min离心15min。配制15％的SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶，每个样品加10μL上清，加入标准蛋白Marker 5μL，80v浓缩胶，120v分离胶，胶块考马斯亮蓝染色，脱色后观察到了E2蛋白成功表达。

2)Western Blotting：结果表明，重组E2蛋白可以被猪瘟阳性血清识别，具有良好的特异性。

3)重组E2抗原与完整猪瘟病毒抗原生物学活性的比较

间接ELISA法：分别将纯化的重组E2抗原和充分灭活的猪瘟病毒抗原以适当浓度包被96孔ELISA平板。

按照标准的间接ELISA操作程序，利用事先制备的2份已知猪瘟抗体阳性血清(P)和已知无猪瘟特异性抗体的2份阴性血清(N)作为第一抗体，分别作1∶20稀释，与两种抗原作用，每份血清作2孔，以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG作为第二抗体，TMB作为底物，酶标仪OD450波段读结果，见表一。

表一：重组E2抗原和猪瘟全病毒抗原活性比较

根据间接ELISA常用的结果判断公式：

阳性血清OD值/阴性血清OD值>2.1(即P/N>2.1)，可知重组E2抗原和全病毒抗原具有几乎相同的与猪瘟病毒抗体阳性血清反应原性，重组E2抗原完全可以替代全病毒抗原用于猪瘟病毒血清抗体的检测。

5.pGST-E2表达蛋白的大量表达及纯化

1)重组菌的大量表达：LB培养基成分中含蛋白胨8.0g；氯化钠9.0g；酵母提取物6g，葡萄糖1g加无离子水至1L，调pH＝7.4，将重组菌1％的接种量接到1L LB，37℃震荡增菌至OD₆₀₀＝0.5～0.6，然后分别在37℃诱导4h、30℃诱导8h、20℃诱导12h、16℃诱导16h和14℃诱导24h；5000r/min，离心10min，用缓冲液1×PBS收集菌体，振荡混匀；分别超声破菌，冰浴条件下，工作4s，间歇6s，50cycles，超声三次；4℃，15000r/min离心30min。保留上清样品和沉淀样品，进行15％的SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶鉴定重组E2蛋白的表达形式，见表二。

表二：E2蛋白诱导的表达条件

从表一可知，E2重组蛋白的最佳表达条件为：iLB，16℃，IPTG浓度为0.10mmol/ml

2)亲和层析纯化融合蛋白：将离心后的上清样品上样到谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B柱上，在4℃条件下，重复3～4次，用1×PBS(150mmol/LNaCl，32mmol/LNa₂HPO₄，4mmol/LNaH₂PO₄，pH7.3)洗杂蛋白，然后用含有15mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)的50mmol/L Tris.Cl pH8.0洗融合蛋白，整个洗脱过程中用蛋白指示剂监测洗脱情况，并且预留穿透的样品和洗脱后融合蛋白通过SDS-PAGE蛋白质电泳观察结果。

3)蛋白质浓缩

洗脱后的E2重组蛋白在浓缩管3200r/min，离心浓缩，4℃条件下浓缩至体积为1mL，取样留做鉴定，其余的样品液氮速冻后，保存在-70℃低温冰箱。

6.猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立

6.1 抗原包被

用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L NaCO3/NaHCO3，pH9.6)将抗原稀释至工作浓度(13.75μg/ml)，每孔50μl，4℃过夜。以洗涤缓冲液1×PBST(0.01mol/L PBS加0.05％Tween20，pH7.4)洗涤4次，每孔230μl，最后一次弃净孔内液体，每孔加入50μl封闭液(0.5％明胶，5％蔗糖，10％马血清的PBST)37℃封闭40分钟，洗涤4次，拍干。风机吹干或真空干燥后，每块立即与4袋1g用干燥剂一起放入铝箔真空袋内，包装机真空包装，4℃保存。

6.2加入待检和标准阴、阳性对照血清：

用血清稀释液对阳性和阴性对照血清做1:20稀释，每孔加入50μL，阴阳性对照血清各做两孔；同时待检血清样品用血清稀释液做1:20稀释，密封，37℃结合45分钟。同时设两孔不加任何血清样品的空白对照；

6.3 洗板：

弃去孔内液体，然后将25×PBST洗涤液用灭菌水或超纯水稀释成1×PBST，每孔加入220～300μL洗板，重复4次，最后一次弃净孔内液体。

6.4 加入酶结合物：

浓缩酶标记抗体用酶结合物稀释液做1:100稀释，每孔加入50μL，密封，37℃结合45分钟。注意：(从加入第一孔时开始计时间；并且现用现配，配置好的工作溶液不易储存超过6小时)。

6.5 重复步骤6.3洗板。

6.6 加入底物：

将底物溶液A和B以1：50的体积比混匀，每孔加入50μL，轻轻震荡混匀，密封，37℃或室温避光作用15分钟。

6.7 终止反应：

每孔加入50μL终止液，轻摇混匀，测定吸光度OD450nm。

6.8 结果计算：

试验成立条件：阳性对照、阴性对照血清孔各有两个值，需计算平均吸光度值，阳性标准血清OD450≥0.60，阴性标准血清OD450≤0.25，且阳性对照血清OD450/阴性对照血清OD450≥2.10判定为试验成立。

计算公式：比值＝血清样品OD450/阴性对照血清OD450≥2.10

6.8.2 结果判定

比值≥2.10血清样品猪瘟病毒抗体判定为阳性；

比值〈2.10血清样品猪瘟病毒抗体判定为阴性。

本实施方式所用试材等来源：

1、毒株和血清样品：由中国农业科学院兰州兽医研究所采集保存。

2、引物合成和测序：由Takara公司合成。

3、Sigma公司：酶标仪、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG、底物TMB、诱导剂IPTG、核酸电泳和蛋白电泳所用试剂。

4、Takara公司：组织总RNA提取试剂盒、扩增用单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真的Taq酶、限制性核酸内切酶(EcoRHI、XholI)、T4DNA连接酶。

5、安玛西亚：琼脂糖4B填料、还原型谷胱甘肽、超滤浓缩管和咪唑。

6、深圳金灿华有限公司：96孔板、血清管。

实施例1

1.克隆E2基因抗原结构域部分

1)设计表达引物

设计1对特异性寡核苷酸表达引物uE和dE，同时在5端分别增加限制性内切酶位点，序列为：

uE：5’-GCGAATTC GGACTCACCACTACATGC-3’EcoR I

dE：5’-GCCTCGAGTAGCCATCTGTGCTGATTC-3’Xhol I

2)提取总RNA：使用组织裂解液(TRIZOL试剂)从感染了猪瘟兔化病毒疫苗株的兔脾脏组织毒提取总RNA。

3)反转录合成cDNA：取所提取的RNA5~10μl，加入20ul反转录体系中，内含1×RT buffer(50mM Tris-HCl(pH8.3)，75nM KCl，8mMMgCl₂，10mMDTT)，dNTP(each10mM)，引物dE50pmol，AMV RTase 10U，RNase inhibitor 20U。在42℃下水浴1h，然后煮沸5min，置-20℃备用。

4)PCR扩增E2基因：取5μl反转录产物加入50μl PCR反应体系中，内含1×PCR buffer(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂pH8.3)0.2mMdATP，dCTP，dGTP，0.19mMdTTP，0.01mM，250nM特异性引物uE/dE。PCR循环参数为94℃40秒，55℃30秒，72℃50秒，第一循环94℃5分钟，最后一循环72℃延伸10分钟。35个循环完成扩增反应。

2.重组表达载体的构建和鉴定：LB液体和固体培养基，抗性及浓度均为Amp+100μg/mL。PCR扩增的E2片段用DNA片段回收Kit纯化回收。限制性内切酶EcoRI和XhoI过夜双酶切PGEX4T-1载体和E2片段，纯化回收酶切后的产物。按照载体和目的片段的合适摩尔比(载体∶目的片段≈1∶3)混合后用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5a感受态细胞，在LB平板培养12～18h。挑取单克隆，增菌后提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，鉴定得到的阳性重组质粒转化表达菌株BL21(Star)感受态细胞，重组质粒命名为pGST-E2。

3.pGST-E2在LB培养基中的试表达：挑取单克隆菌株，接种到5mLLB液体培养基试管中，220r/min，37℃过夜振荡培养；然后取50μL菌液到新的LB液体培养基试管中，250r/min 3～4h至OD₆₀₀≈0.5～0.6，在管中加入IPTG的终浓度为0.1mol/L，并留1管作为阴性对照，37℃ 200r/min振荡培养4～6h。

4.pGST-E2表达蛋白的鉴定：

1)SDS-PAGE鉴定重组E2蛋白：取1mL重组菌到Ep管中，10000r/min离心1min，弃掉上清，加入100μL Tris pH6.8，100℃煮5min，10000r/min离心15min。配制15％的SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶，每个样品加10μL上清，加入标准蛋白Marker 5μL，80v浓缩胶，120v分离胶，胶块考马斯亮蓝染色，脱色后观察到了E2蛋白成功表达。

2)Western Blotting：结果表明，重组E2蛋白可以被猪瘟阳性血清识别，具有良好的特异性。

3)重组E2抗原与完整猪瘟病毒抗原生物学活性的比较

间接ELISA法：分别将纯化的重组E2抗原和充分灭活的猪瘟病毒抗原以适当浓度包被96孔ELISA平板。

按照标准的间接ELISA操作程序，利用事先制备的2份已知猪瘟抗体阳性血清(P)和已知无猪瘟特异性抗体的2份阴性血清(N)作为第一抗体，分别作1∶20稀释，与两种抗原作用，每份血清作2孔，以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG作为第二抗体，TMB作为底物，酶标仪OD450波段读结果。

根据间接ELISA常用的结果判断公式：

阳性血清OD值/阴性血清OD值〉2.1(即P/N>2.1)，可知重组E2抗原和全病毒抗原具有几乎相同的与猪瘟病毒抗体阳性血清反应原性，重组E2抗原完全可以替代全病毒抗原用于猪瘟病毒血清抗体的检测。

5.pGST-E2表达蛋白的大量表达及纯化

1)重组菌的大量表达：LB培养基成分中含蛋白胨8.0g；氯化钠9.0g；酵母提取物6g，葡萄糖1g加无离子水至1L，调pH＝7.4，将重组菌1％的接种量接到1L LB，37℃震荡增菌至OD₆₀₀＝0.5～0.6，然后在16℃诱导16h；5000r/min，离心10min，用缓冲液1×PBS收集菌体，振荡混匀；超声破菌，冰浴条件下，工作4s，间歇6s，50cycles，超声三次；4℃，15000r/min离心30min。保留上清样品和沉淀样品，进行15％的SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶鉴定重组E2蛋白的表达形式。

2)亲和层析纯化融合蛋白：将离心后的上清样品上样到谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B柱上，在4℃条件下，重复3～4次，用1×PBS(150mmol/LNaCl，32mmol/LNa₂HPO₄，4mmol/LNaH₂PO₄，pH7.3)洗杂蛋白，然后用含有15mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)的50mmol/L Tris.Cl pH8.0洗融合蛋白，整个洗脱过程中用蛋白指示剂监测洗脱情况，并且预留穿透的样品和洗脱后融合蛋白通过SDS-PAGE蛋白质电泳观察结果。

3)蛋白质浓缩

洗脱后的E2重组蛋白在浓缩管3200r/min，离心浓缩，4℃条件下浓缩至体积为1mL，取样留做鉴定，其余的样品液氮速冻后，保存在-70℃低温冰箱。

6.猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立

6.1 抗原包被

用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L NaCO3/NaHCO3，pH9.6)将抗原稀释至工作浓度(13.75μg/ml)，每孔50μl，4℃过夜。以洗涤缓冲液1×PBST(0.01mol/L PBS加0.05％Tween20，pH7.4)洗涤4次，每孔230μl，最后一次弃净孔内液体，每孔加入50μl封闭液(0.5％明胶，5％蔗糖，10％马血清的PBST)37℃封闭40分钟，洗涤4次，拍干。风机吹干或真空干燥后，每块立即与4袋1g用干燥剂一起放入铝箔真空袋内，包装机真空包装，4℃保存。

6.2 加入待检和标准阴、阳性对照血清：

用血清稀释液对阳性和阴性对照血清做1:20稀释，每孔加入50μL，阴阳性对照血清各做两孔；同时待检血清样品用血清稀释液做1:20稀释，密封，37℃结合45分钟。同时设两孔不加任何血清样品的空白对照；

6.3 洗板：

弃去孔内液体，然后将25×PBST洗涤液用灭菌水或超纯水稀释成1×PBST，每孔加入220～300μL洗板，重复4次，最后一次弃净孔内液体。

6.4 加入酶结合物：

浓缩酶标记抗体用酶结合物稀释液做1:100稀释，每孔加入50μL，密封，37℃结合45分钟。注意：(从加入第一孔时开始计时间；并且现用现配，配置好的工作溶液不易储存超过6小时)。

6.5 重复步骤6.3洗板。

6.6 加入底物：

将底物溶液A和B以1：50的体积比混匀，每孔加入50μL，轻轻震荡混匀，密封，37℃或室温避光作用15分钟。

6.7 终止反应：

每孔加入50μL终止液，轻摇混匀，测定吸光度OD450nm。

6.8 结果计算：

试验成立条件：阳性对照、阴性对照血清孔各有两个值，需计算平均吸光度值，阳性标准血清OD450≥0.60，阴性标准血清OD450≤0.25，且阳性对照血清OD450/阴性对照血清OD450≥2.10判定为试验成立。

计算公式：比值＝血清样品OD450/阴性对照血清OD450≥2.10

6.8.2 结果判定

比值≥2.10血清样品猪瘟病毒抗体判定为阳性；

比值〈2.10血清样品猪瘟病毒抗体判定为阴性。

实施例2

重复实施例1的方法，只是步骤5大量诱导表达的诱导温度为20℃，诱导时间12h。

CSFV 抗体检测方法E2核苷酸序列表

Organization Applicant

----------------------

    Street：徐家坪1，盐场路

    City：兰州

    State：甘肃

    Country：P.R.China

    PostalCode：730046

    PhoneNumber：0931—8342706

    FaxNumber：0931—8342052

    Emai lAddress：yinshuanghuikangri@163.com

<110>OrganizationName：中国农业科学院兰州兽医研究所

Application Project

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<120>Title：一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法

<130>AppFileReference：G.Swensvoort，1989.Topographical andFunctional Mapping of Epitopes on Hog CholeraVirus.J.Gen.Virol，70：2865-2876.

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Sequence

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<213>OrganismName：猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因

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gggaccaacc catcaactga ggaaatggga gatgacttca ggtccgggct gtgcccgttt

300

gatacgagtc ctgttgttaa gggaaagtac aatacgacct tgttgaacgg taatgctttc

360

tatcttgtct gcccaatagg gtggacgggt gtcatagagt gcacagcagt gagcccaaca

420

actctgagga cagaagtggt aaagaccttc aggagagaca agccctttcc gcacagaatg

480

gattgtgtga ccaccatagt ggaaaatgaa gatttattct attgtaagtt ggggggcaac

540

tggacatgtg                                                 tgaaaggc

558

<212>Type：DNA

<211>Length：558

     SequenceName：E2

     SequenceDescription：

Feature

-------

Sequence：E2：

<221>FeatureKey：CDS

<222>LocationFrom：1

<222>LocationTo：558

      OtherInformation：CSFV E2 gene

      CDSJoin：Yes

Claims (3)

1、一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，其特征在于，包括下述步骤：

A.克隆E2基因抗原结构域部分：

A.1、设计1对特异性寡核苷酸引物uE和dE；

A.2、提取总RNA，从猪瘟兔化弱毒疫苗中提取核糖核酸-RNA；

A.3、反转录合成cDNA，以提取的核糖核酸RNA为模板，反转录合成cDNA；

A.4、PCR扩增E2基因，用所述的1对特异性寡核苷酸引物，进行聚合酶链式扩增反应扩增；

B.构建重组表达载体；

C.在改良的LB培养基中表达，获得可溶性的重组E2蛋白；

D.亲和层析纯化重组E2蛋白；

E.pGST-E2表达蛋白的鉴定，SDS-PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组E2蛋白；

F.利用重组E2蛋白建立检测猪瘟血清抗体间接ELISA方法。

上述步骤C所述改良的LB培养基成分中含有蛋白胨0.8％；氯化钠0.9％；酵母提取物0.6％，葡萄糖0.1％g加无离子水，调pH＝7.4。

2、根据权利要求1所述的一制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，其特征在于所述步骤C在改良的LB培养基中表达E2蛋白的诱导温度为20-16℃，诱导时间12-16小时，诱导剂IPTG浓度为0.10mmol/ml。

3、根据权利要求1所述的一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，其特征在于所述步骤C在改良的LB培养基中表达E2蛋白的诱导温度为16℃，诱导时间16小时。