CN101406697B - 一种绿脓杆菌疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种绿脓杆菌疫苗的制备方法，它涉及一种疫苗的制备方法。它解决了目前抗菌素难以治愈绿脓杆菌感染，以及单一价态的绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求的问题。疫苗由置于生理盐水中的绿脓杆菌P1的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P103的类毒素组成。制备方法：制备绿脓杆菌内毒素，制备绿脓杆菌类毒素，混合，即得到绿脓杆菌疫苗。本发明绿脓杆菌疫苗属于多价态疫苗，因采用了绿脓杆菌P1、P2和P6的内毒素，所以可以免疫已知的11型绿脓杆菌，而且由于加入了绿脓杆菌P103的类毒素，增强了疫苗对绿脓杆菌的免疫效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法。
背景技术
绿脓肝菌是一种条件致病菌，对外界环境适应能力很强，在潮湿环境下可长期存活。人正常皮肤尤其是潮湿部位(如腋下、会阴部、耳道、呼吸道和肠道等处)均有绿脓肝菌的存在，而完整的皮肤和粘膜作为屏障能够有效的抵御绿脓肝菌的入侵，但人体的正常防御机制下降或受到损伤(如皮肤粘膜损伤、粒细胞缺乏、低蛋白血症、肿瘤的放化疗、长期应用激素和抗生素、烧伤、婴幼儿皮肤、脐带、肠道，老年人泌尿系统)则容易引发绿脓肝菌感染。
据报道绿脓杆菌引起的院内感染占10％～31.5％，居病原菌之首，国内外烧伤中心对细菌感染的临床调查中发现绿脓杆菌感染占50％以上。目前对绿脓杆菌感染的治疗有抗菌素和免疫两种治疗方法。长期使用抗菌素治疗绿脓杆菌导致大量耐药菌株的产生，并破坏人体中正常菌群，引起继发感染，致使治疗失败；而且绿脓杆菌的耐药机理十分复杂，其中绿脓杆菌细胞外膜通透性低(仅为大肠杆菌的0.2％～1.0％)和外排各种物质的复杂主动排出系统(目前研究已发现绿脓杆菌细胞膜内存在着由3种蛋白质构成的“外排泵”，可以排出对自身有害的物质)在多重耐药中起着致关重要的作用。因此绿脓杆菌感染已到了无抗菌素可用的地步，目前患者一旦感染很难治愈，特别是败血症，死亡率极高。目前已检测出11型(分为I～Ⅺ型)绿脓杆菌，因此单一价态的绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前抗菌素难以治愈绿脓杆菌感染，以及单一价态的绿脓杆菌疫苗不能满足临床免疫的需求的问题，而提供的一种绿脓杆菌疫苗的制备方法。
本发明绿脓杆菌疫苗由置于生理盐水中的绿脓杆菌P1的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P103的类毒素组成；绿脓杆菌疫苗中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5～1mg/mL；其中绿脓杆菌P1保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10115；绿脓杆菌P2保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10116；绿脓杆菌P6保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10120；绿脓杆菌P103保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10103。
上述绿脓杆菌疫苗按以下步骤制备：一、将绿脓杆菌P1、P2和P6分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基在37～42℃条件下培养18～24h，然后用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗入摇瓶再在37～42℃、175～200r/min的条件下振荡培养24～30h，之后调节内毒素液体合成培养基pH值至6.5～8.5，再加入甲苯放于37～42℃到环境中静置48～72h，然后用1000K～3000K的滤板进行超滤，收集滤液；二、分别向滤液中加入浓度为30～50g/mL的ZnCl2溶液，然后搅拌、沉淀，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，弃去上清液，按饱和Na2HPO4溶液与沉淀物5∶1的体积比向沉淀物中加入饱和的Na2HPO4溶液，再在37～42℃的条件下电磁搅拌2h，然后置于0～4℃环境8～10h，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，取上清液分别得到绿脓杆菌P1、P2和P6的粗制内毒素；三、分别调节绿脓杆菌P1、P2和P6的粗制内毒素pH值至7.2，然后流水透析72～120h，再用电风扇浓缩透析袋内液体体积，之后将透析袋冰浴并按透析袋内液体与丙酮1∶2的体积比加入丙酮，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，取沉淀物置于37℃环境中干燥，得到绿脓杆菌P1、P2和P6内毒素；四、将绿脓杆菌P103接种于产毒培养基在32～40℃、120～150r/min条件下振荡培养22～28h，然后按1％(体积)的接种量接种于新鲜的产毒培养基中在32～40℃、120～150r/min条件下振荡培养22～28h，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，收集上清液并加入硫柳汞，硫柳汞终浓度为0.2～0.8mL/L，再在4℃环境中放置24～28h得到无菌粗毒素；五、将粗毒素流水透析24～72h，再加入浓度为1mol/L、透析液1/2体积乙酸然后在4℃、8000r/min条件下离心30min，再将离心沉淀物溶解于浓度为0.1～0.5mol/L的柠檬酸钠溶液中，再用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后加入固体硫酸铵至饱和，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，再在4℃条件下用浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后加入DE-52纤维素搅拌30min，再放入4℃环境中静置1h，将去除上清液的纤维素装柱，并依次用pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L、0.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱，收集NaCl浓度为0.13mol/L阶段的洗脱液并加入固体硫酸铵至硫酸铵30％饱和度，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，取离心上清液加入固体硫酸铵至硫酸铵70％饱和度，再4℃静止30min后在4℃、7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解；六、用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤DE-52纤维素柱，再把步骤五溶解了离心沉淀物的Tris-HCl缓冲液加入DE-52纤维素柱，然后用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05～0.30mol/L的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集洗脱液用聚乙二醇-6000浓缩，得到绿脓杆菌P103的类毒素；七、将绿脓杆菌P1的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P103的类毒素置于生理盐水中，其中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5～1mg/mL，即得到绿脓杆菌疫苗；步骤一中甲苯纯度为分析纯，甲苯与内毒素液体合成培养的体积比为0.21～0.52∶1；步骤一内毒素液体合成培养基中含有2.0％(质量)的谷氨酸钠、0.75％(质量)的葡萄糖、0.2％(质量)的MgSO4·7H2O、0.01％(质量)的Ca(NO3)2、0.000005％(质量)的FeSO4·7H2O、0.0252％(质量)的KH2PO4和0.563％(质量)的Na2HPO4·12H2O，pH值为7.6；步骤二中每100mL滤液中加入ZnCl2溶液3.2mL；步骤三中丙酮纯度为分析纯；步骤五Tris-HCl缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷为分析纯。
本发明绿脓杆菌P1、P2、P6和P103保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)，中国医学微生物菌种保藏管理中心负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应。本发明菌种(绿脓杆菌P1、P2、P6和P103)从中国医学微生物菌种保藏管理中心购买得到。
本发明绿脓杆菌疫苗属于多价态疫苗，因采用了绿脓杆菌P1、P2和P6的内毒素，所以可以免疫已知的11型(分为I～XI型)绿脓杆菌，而且由于加入了绿脓杆菌P103的类毒素，增强了疫苗对绿脓杆菌的免疫效果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式绿脓杆菌疫苗由置于生理盐水中的绿脓杆菌P1的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P103的类毒素组成；绿脓杆菌疫苗中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5～1mg/mL；其中绿脓杆菌P1保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10115；绿脓杆菌P2保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10116；绿脓杆菌P6保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10120；绿脓杆菌P103保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10103。
本实施方式中所选用的绿脓杆菌P1、P2、P6和P103菌株为La型菌株。
具体实施方式二：本实施方式绿脓杆菌疫苗按以下步骤制备：一、将绿脓杆菌P1、P2和P6分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基在37～42℃条件下培养18～24h，然后用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗入摇瓶再在37～42℃、175～200r/min的条件下振荡培养24～30h，之后调节内毒素液体合成培养基pH值至6.5～8.5，再加入甲苯放于37～42℃到环境中静置48～72h，然后用1000K～3000K的滤板进行超滤，收集滤液；二、分别向滤液中加入浓度为30～50g/mL的ZnCl2溶液，然后搅拌、沉淀，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，弃去上清液，按饱和Na2HPO4溶液与沉淀物5∶1的体积比向沉淀物中加入饱和的Na2HPO4溶液，再在37～42℃的条件下电磁搅拌2h，然后置于0～4℃环境8～10h，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，取上清液分别得到绿脓杆菌P1、P2和P6的粗制内毒素；三、分别调节绿脓杆菌P1、P2和P6的粗制内毒素pH值至7.2，然后流水透析72～120h，再用电风扇浓缩透析袋内液体体积，之后将透析袋冰浴并按透析袋内液体与丙酮1∶2的体积比加入丙酮，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，取沉淀物置于37℃环境中干燥，得到绿脓杆菌P1、P2和P6内毒素；四、将绿脓杆菌P103接种于产毒培养基在32～40℃、120～150r/min条件下振荡培养22～28h，然后按1％(体积)的接种量接种于新鲜的产毒培养基中在32～40℃、120～150r/min条件下振荡培养22～28h，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，收集上清液并加入硫柳汞，硫柳汞终浓度为0.2～0.8mL/L，再在4℃环境中放置24～28h得到无菌粗毒素；五、将粗毒素流水透析24～72h，再加入浓度为1mol/L、透析液1/2体积乙酸，然后在4℃、8000r/min条件下离心30min，再将离心沉淀物溶解于浓度为0.1～0.5mol/L的柠檬酸钠溶液中，再用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后加入固体硫酸铵至饱和，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，再在4℃条件下用浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液透析过夜(去除甲醛)，然后加入DE-52纤维素搅拌30min，再放入4℃环境中静置1h，将去除上清液的纤维素装柱，并依次用pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L、0.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱，收集NaCl浓度为0.13mol/L阶段的洗脱液并加入固体硫酸铵至硫酸铵30％饱和度，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，取离心上清液加入固体硫酸铵至硫酸铵70％饱和度，再4℃静止30min后在4℃、7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解；六、用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤DE-52纤维素柱，再把步骤五溶解了离心沉淀物的Tris-HCl缓冲液加入DE-52纤维素柱，然后用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05～0.30mol/L的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集洗脱液用聚乙二醇-6000浓缩，得到绿脓杆菌P103的类毒素；七、将绿脓杆菌P1的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P103的类毒素置于生理盐水中，其中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5～1mg/mL，即得到绿脓杆菌疫苗；步骤一中甲苯纯度为分析纯，甲苯与内毒素液体合成培养的体积比为0.21～0.52∶1；步骤一内毒素液体合成培养基中含有2.0％(质量)的谷氨酸钠、0.75％(质量)的葡萄糖、0.2％(质量)的MgSO4·7H2O、0.001％(质量)的Ca(NO3)2、0.000005％(质量)的FeSO4·7H2O、0.0252％(质量)的KH2PO4和0.563％(质量)的Na2HPO4·12H2O，pH值为7.6；步骤二中每100mL滤液中加入ZnCl2溶液3.2mL；步骤三中丙酮纯度为分析纯；步骤五Tris-HCl缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷为分析纯。本实施方式设施与生产质量管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。本实施方式原料及辅料符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求，未纳入上述标准的化学试剂，纯度应不低于分析纯。本实施方式生产用水源水符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。本实施方式直接用于生产的器具均为不锈钢或玻璃器具，都经过严格清洗、去热原质处理及无菌化处理。
本实施方式中采用硫柳汞对绿脓杆菌P103的外毒素进行类素化。本家施方式制备的绿脓杆菌疫苗中硫柳汞含量不高于0.1g/L。
本实施方式绿脓杆菌疫苗可用于防治绿脓杆菌感染，如烧伤、手术、截瘫等所致的急、慢性及耐药性绿脓杆菌感染性疾病。
本实施方式绿脓杆菌疫苗用于预防绿脓杆菌感染：受伤后或术后6天内第一次注射绿脓杆菌疫苗(效果最好)，第一次免疫后第一周内进行第2～3次免疫注射，之后每周免疫注射1次，共10次。
本实施方式绿脓杆菌疫苗用于治疗绿脓杆菌感染：隔日免疫注射1次，7次为1疗程，间隔1周，可进行第二疗程，直至痊愈为止。
本实施方式绿脓杆菌疫苗采用肌肉注射，成人每次注射0.5mL，小儿可酌减。本实施方式绿脓杆菌疫苗可以有效的预防和治疗已知的11型绿脓杆菌。
本实施方式绿脓杆菌疫苗使用时个别人(不到0.1～1.0％)可能产生疫苗反应即局部红肿、压痛或全身不舒服等症状，若红肿面积超过7cm，或发烧38℃以上，应立即停药。若发生休克要立即注射0.1％肾上腺素进行急救。
本实施方式绿脓杆菌疫苗使用前应摇匀后使用。
有药物过敏史者，有活动性肺结核及高血压、冠心病者及孕妇慎用。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤三中电风扇的风温为25～50℃。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤一中将经过牛肉膏蛋白胨培养基培养的绿脓杆菌P1、P2和P6分别置于37～42℃的环境中扩大培养18h，然后再用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗。其它步骤及参数与实施方式二相同。
本实施方式中采用震荡扩大培养。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤五中纤维素装柱的尺寸为2.6cm×60cm。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤三中透析袋内液体体积浓缩至50％。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤四中产毒培养基按以下步骤制备：先将45.0g胰蛋白酶大豆肉汤干粉(TSB)溶于131.0mL水中，再置于4℃、体积为1500mL的水透析8～10h，然后向透析液内加入15mL甘油和9.36g谷氨酸钠并定容至1500.0mL，即得到产毒培养基。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤七中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5mg/mL。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤七中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/3mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为1mg/mL。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤七中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为0.25mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为0.25mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为0.25mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.8mg/mL。其它步骤及参数与实施方式二相同。
对具体实施方式八、九和十中制备得到的绿脓杆菌疫苗进行检测：
绿脓杆菌疫苗为无色或淡黄色澄明液体，澄明度符合药典要求；绿脓杆菌疫苗的pH值为6.0～7.5。
绿脓杆菌疫苗的效价均高于1∶64。用具体实施方式八、九和十中制备得到的绿脓杆菌疫苗免疫体重为1.7～2.0Kg的家兔(自然抗体效价为1∶10)，每隔3天免疫一次，共免疫3次(每次注射绿脓杆菌疫苗0.75～1.25mg)，末次免疫后第7天耳静脉采血，接受免疫的家兔效价均高于1∶64。
按《生物制品异常毒性试验规程》进行测试，实验小鼠随机分成3组，第一组每只小鼠注射具体实施方式八制备得到的绿脓杆菌疫苗0.5mL，第二组每只小鼠注射具体实施方式九制备得到的绿脓杆菌疫苗0.5mL，第三组每只小鼠注射具体实施方式十制备得到的绿脓杆菌疫苗0.5mL。免疫注射7天后实验小鼠全部存活，说明本发明绿脓杆菌疫苗无异常毒性。
具体实施方式八、九和十中制备得到的绿脓杆菌疫苗于2～8℃避光保存或运输有效期达2年。
选用体重为14～16g昆明种小鼠60只，随机分成6组(第1组每只小鼠注射具体实施方式八制备得到的绿脓杆菌疫苗，第2组每只小鼠注射具体实施方式九制备得到的绿脓杆菌疫苗，第3组每只小鼠注射具体实施方式十制备得到的绿脓杆菌疫苗)，第1至第3组每只小鼠皮下注射0.5mL绿脓杆菌疫苗，共免疫注射2次(间隔为7天)，末次免疫后第9～11天进行绿脓杆菌攻击。第1至第3组小鼠每只腹腔注射1MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)，第4组小鼠每只腹腔注射2MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)，第5组小鼠每只腹腔注射1MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)，第6组小鼠每只腹腔注射0.5MLD铜绿假单胞菌(含于0.5mL中)。观察3天，第4及第5组小鼠全部死亡，第6组小鼠部分死亡，第1、第2及第3组中存活的小鼠数量均大于7只(存活率＞70％)。
同样采用MLD(最小致死量)攻击法，攻击用菌为已知的11型绿脓杆菌，分别进行攻击；分别接种具体实施方式八、九和十中制备的绿脓杆菌疫苗的小鼠存活率都高于70％。
Claims (3)
1.一种绿脓杆菌疫苗的制备方法，其特征在于绿脓杆菌疫苗按以下步骤制备：一、将绿脓杆菌P1、P2和P6分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基在37～42℃条件下培养18～24h，然后用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗入摇瓶再在37～42℃、175～200r/min的条件下振荡培养24～30h，之后调节内毒素液体合成培养基pH值至6.5～8.5，再加入甲苯放于37～42℃到环境中静置48～72h，然后用1000K～3000K的滤板进行超滤，收集滤液；二、分别向滤液中加入浓度为30～50g/mL的ZnCl2溶液，然后搅拌、沉淀，再在4℃、4000r/min 的条件下离心20min，弃去上清液，按饱和Na2HPO4溶液与沉淀物5∶1的体积比向沉淀物中加入饱和的Na2HPO4溶液，再在37～42℃的条件下电磁搅拌2h，然后置于0～4℃环境8～10h，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，取上清液分别得到绿脓杆菌P1、P2和P6的粗制内毒素；三、分别调节绿脓杆菌P1、P2和P6的粗制内毒素pH值至7.2，然后流水透析72～120h，再用电风扇浓缩透析袋内液体体积，之后将透析袋冰浴并按透析袋内液体与丙酮1∶2的体积比加入丙酮，再在4℃、4000r/min的条件下离心20min，取沉淀物置于37℃环境中干燥，得到绿脓杆菌P1、P2和P6内毒素；四、将绿脓杆菌P103接种于产毒培养基在32～40℃、120～150r/min条件下振荡培养22～28h，然后按1％(体积)的接种量接种于新鲜的产毒培养基中在32～40℃、120～150r/min条件下振荡培养22～28h，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，收集上清液并加入硫柳汞，硫柳汞终浓度为0.2～0.8mL/L，再在4℃环境中放置24～28h得到无菌粗毒素；五、将粗毒素流水透析24～72h，再加入浓度为1mol/L、透析液1/2体积乙酸，然后在4℃、8000r/min条件下离心30min，再将离心沉淀物溶解于浓度为0.1～0.5mol/L的柠檬酸钠溶液中，再用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后加入固体硫酸铵至饱和，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，再在4℃条件下用浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后加入DE-52纤维素搅拌30min，再放入4℃环境中静置1～5h，将去除上清液的纤维素装柱，并依次用pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L、0.13mol/L和0.20mol/L的Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱，收集NaCl浓度为0.13mol/L阶段的洗脱液并加入固体硫酸铵至硫酸铵30％饱和度，再在4℃、7000r/min条件下离心30min，取离心上清液加入固体硫酸铵至硫酸铵70％饱和度，再4℃静止30min后在4℃、7000r/min条件下离心30min，离心沉淀物用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解；六、用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤DE-52纤维素柱，再把步骤五溶解了离心沉淀物的Tris-HCl缓冲液加入DE-52纤维素柱，然后用浓度为0.01mol/L、pH值为8.0、NaCl浓度为0.05～0.30mol/L的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集洗脱液用聚乙二醇-6000浓缩，得到绿脓杆菌P103的类毒素；七、将绿脓杆菌P1的内毒素、绿脓杆菌P2的内毒素、绿脓杆菌P6的内毒素和绿脓杆菌P103的类毒素置于生理盐水中，其中绿脓杆菌P1的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P2的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P6的内毒素的浓度以蛋白质质量计为1/6～1/3mg/mL、绿脓杆菌P103的类毒素的浓度以蛋白质质量计为0.5～1mg/mL，即得到绿脓杆菌疫苗；步骤一中甲苯纯度为分析纯，甲苯与内毒素液体合成培养的体积比为0.21～0.52∶1；步骤一内毒素液体合成培养基中含有2.0％(质量)的谷氨酸钠、0.75％(质量)的葡萄糖、0.2％(质量)的MgSO4·7H2O、0.001％(质量)的Ca(NO3)2、0.000005％(质量)的FeSO4·7H2O、0.0252％(质量)的KH2PO4和0.563％(质量)的Na2HPO4·12H2O，pH值为7.6；步骤二中每100mL滤液中加入ZnCl2溶液3.2mL；步骤三中丙酮纯度为分析纯；步骤五Tris-HCl缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷为分析纯；其中绿脓杆菌P1保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10115；绿脓杆菌P2保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10116；绿脓杆菌P6保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10120；绿脓杆菌P103保藏于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏号为10103。
2.根据权利要求1所述的绿脓杆菌疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中将经过牛肉膏蛋白胨培养基培养的绿脓杆菌P1、P2和P6分别置于37～42℃的环境中扩大培养18h，然后再用内毒素液体合成培养基将绿脓杆菌冲洗。
3.根据权利要求1所述的绿脓杆菌疫苗的制备方法，其特征在于步骤五中纤维素装柱的尺寸为2.6cm×60cm。
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