CN101405285A - 作为mdm2和p53间相互作用的抑制剂的环状-烷基胺衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供式(I)的化合物、其作为p53－MDM2相互作用的抑制剂的用途以及包含所述式(I)的化合物的药物组合物。其中n、m、p、t、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、Q、Y和Z具有定义的含义。
Description
发明领域
本发明涉及作为MDM2和p53之间相互作用抑制剂的化合物及包含所述化合物的组合物。而且，本发明提供制备所公开的抑制剂的方法、包含所述抑制剂的组合物及使用其的方法，例如作为药物。
p53为肿瘤抑制蛋白质，其在调节介于细胞增殖和细胞生长停滞/细胞凋亡之间的平衡方面起重要作用。在正常情况下，p53半衰期很短，因此在细胞中p53的水平很低。然而，在响应细胞DNA破坏或细胞应激(例如致癌基因活化、端粒侵蚀、缺氧)时，p53的水平增加。这种p53水平增加导致许多基因的转录活化，这会驱动细胞生长停滞或者进入细胞凋亡过程。因此，p53的一个重要功能是防止受损细胞不受控制的增殖，并因此保护有机体免于癌症的发展。
MDM2是一种p53功能的关键负向调节剂。其通过结合至p53的氨基末端反式激活区而形成一种负向自动调节回路，因此，MDM2同时抑制p53活化转录的能力和靶向p53进行蛋白水解降解。在正常情况下，该调节回路负责维持p53的低水平。然而，在具有野生型p53的肿瘤中，活性p53的平衡浓度可通过拮抗MDM2和p53间的相互作用而增加。这将导致这样的肿瘤细胞中p53-介导的前细胞凋亡和抗增殖作用的恢复。
MDM2是一种细胞原癌基因。MDM2的过度表达已经在大量癌症中被观察到。MDM2在各种肿瘤中被过度表达是由于基因扩增或增加的转录或翻译。MDM2扩增促进肿瘤发生的机制至少部分与其和p53的相互作用有关。在过度表达MDM2的细胞中，p53的保护功能受阻，因此细胞无法通过增加p53水平而响应DNA破坏或细胞应激，导致细胞生长停滞和/或细胞凋亡。因此，在DNA破坏和/或细胞应激后，过度表达MDM2的细胞自由地持续增殖并采取肿瘤发生显型。在这些情况下，破坏p53和MDM2的相互作用将释放p53并因此使生长停滞和/或细胞凋亡的正常信号发生作用。
MDM2除了抑制p53之外，也可具有不同的功能。例如，已经证实，MDM2直接与pRb-调节的转录因子E2F1/DP1相互作用。该相互作用对MDM2的p53非依赖性致癌活性很重要。E2F1区域显示对p53的MDM2-结合域有显著的类似性。因为MDM2与p53和E2F1的相互作用均位于MDM2的相同结合位点，可预期MDM2/p53拮抗剂将不仅活化细胞的p53，而且也调节E2F1的活性，其在肿瘤细胞中通常是不受调节的。
而且，目前所使用的DNA破坏剂(化疗和放疗)的疗效可能经由MDM2对p53的负调节而受到限制。因此，如果p53的MDM2反馈抑制受阻，则功能性p53水平的增加将通过恢复导致细胞凋亡的野生型p53的功能和/或逆转与p53相关的药物抗性来增加这种药剂的疗效。经证实在体内联合MDM2抑制和DNA-破坏治疗可导致协同抗肿瘤效果(Vousden K.H.，Cell，第103卷，691-694，2000)。
因此，MDM2和p53相互作用的破坏提供一种以野生型p53治疗性介入肿瘤的方法，甚至在缺乏功能性p53的肿瘤细胞中可以显示出抗增殖效果，并且另外可以使致肿瘤细胞对化疗和放疗敏感。
发明背景
JP11130750，公开于1999年5月18日，特别描述了作为5-HT受体拮抗剂的取代的苯基氨基羰基吲哚基衍生物。
EP1129074，公开于2000年5月18日，描述了邻氨基苯甲酸酰胺，其作为血管内皮生长因子受体(VEGFR)的抑制剂，且可用于治疗血管生成病症。
EP1317443，公开于2002年3月21日，公开了三环叔胺衍生物，可用作趋化因子受体CXCR4或CCR5调节剂，用于治疗人类免疫缺陷性病毒和猫免疫缺陷病毒。
EP1379239，公开于2002年10月10日，公开了作为5-HT6受体拮抗剂的N-(2-芳基乙基)苄胺。
WO00/15357，公开于2000年3月23日，提供了作为MDM2和p53之间相互作用的抑制剂的哌嗪-4-苯基衍生物。EP1137418，公开于2000年6月8日，提供了用于恢复p53家族蛋白质的构象稳定性的三环化合物。
EP1443937，公开于2003年5月22日，描述了取代的1，4-苯并二氮杂及其作为MDM2-p53相互作用的抑制剂的用途。
EP1458380，公开于2003年6月26日，提供顺式-2，4，5-三苯基-咪唑酮，其抑制MDM2蛋白质与p53样肽之间的相互作用，且具有抗增殖活性。
EP1519932，公开于2004年1月15日，公开了二芳基磺酰胺化合物，其结合MDM2且可用于癌症治疗。
仍需要抑制MDM2和p53之间相互作用的有效的且强力的小分子。
本发明的化合物在结构、其药理活性和/或药理功效方面不同于现有技术。
发明内容
本发明提供用于治疗癌症的抑制MDM2和p53之间相互作用的化合物、组合物及方法。而且，本发明的化合物和组合物可用于提高化疗和放疗的效果。
本发明涉及式(I)的化合物
其N-氧化物形式、加成盐或立体化学异构体形式，其中：
m为0、1或2，且当m为0时，则指直接键；
n为0、1、2或3，且当n为0时，则指直接键；
p为0或1，且当p为0时，则指直接键；
t为0或1，且当t为0时，则指直接键；
R8各自独立地为氢或C1-6烷基；
R1和R2各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、芳基C1-6烷氧基、杂芳基C1-6烷氧基、苯硫基、羟基C1-6烷基羰基、被选自氨基、芳基和杂芳基的取代基取代的C1-6烷基；或被选自氨基、芳基和杂芳基的取代基取代的C3-7环烷基；
R3和R4各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、多卤代C1-6烷基、氰基、氰基C1-6烷基、羟基、氨基或C1-6烷氧基；或
R4和R5可以一起任选地形成选自亚甲基二氧基或亚乙基二氧基的二价基团；
R5为氢、C1-6烷氧基羰基或C1-6烷基；
R6和R7各自独立地选自氢、C1-6烷氧基C1-6烷基或C1-6烷基；或
R6和R7可以一起任选地形成选自下述的二价基团
-(CH2)2-O-(CH2)2- (b-1)，
-(CH2)2-NR9-(CH2)2- (b-2)，
其中R9为氢、C1-6烷氧基C1-6烷基或C1-6烷基；
Z为选自下述的基团：
其中
R10和R11各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1-6烷基、硝基、多卤代C1-6烷基、氰基、氰基C1-6烷基、四唑并C1-6烷基、芳基、杂芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基C1-6烷基，芳基(羟基)C1-6烷基、杂芳基(羟基)C1-6烷基、芳基羰基、杂芳基羰基、C1-6烷基羰基、芳基C1-6烷基羰基、杂芳基C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基羰基、C3-7环烷基(羟基)C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷氧基C1-6烷基、羟基C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C2-6烯基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基氧基、氨基羰基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基C1-6烷基和-(CH2)v-(C(＝O)r)-(CHR17)u-NR13R14，其中
v为0、1、2、3、4、5或6，且当v为0时，则指直接键；
r为0或1，且当r为0时，则指直接键；
u为0、1、2、3、4、5或6，且当u为0时，则指直接键；
R17为氢或C1-6烷基；
R12为氢，C1-6烷基，C3-7环烷基，被选自羟基、氨基、C1-6烷氧基和芳基的取代基取代的C1-6烷基，或被选自羟基、氨基、芳基和C1-6烷氧基的取代基取代的C3-7环烷基；
R13和R14各自独立地选自氢，C1-12烷基，C1-6烷基羰基，C1-6烷基磺酰基，芳基C1-6烷基羰基，C3-7环烷基，C3-7环烷基羰基，-(CH2)k-NR15R16，被选自羟基、羟基羰基、氰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷氧基、芳基或杂芳基的取代基取代的C1-12烷基，或被选自羟基、C1-6烷氧基、芳基、氨基、芳基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基的取代基取代的C3-7环烷基；或
R13和R14与其所连接的氮一起可以任选地形成吗啉基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、或被选自C1-6烷基、芳基C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基羰基、杂芳基C1-6烷基、C3-7环烷基和C3-7环烷基C1-6烷基的取代基取代的哌嗪基；其中
k为0、1、2、3、4、5或6，且当k为0时，则指直接键；
R15和R16各自独立地选自氢、C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基羰基、C3-7环烷基、被选自羟基、C1-6烷氧基、芳基和杂芳基的取代基取代的C1-12烷基；被选自羟基、C1-6烷氧基、芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基和杂芳基C1-6烷基的取代基取代的C3-7环烷基；或者
R15和R16与其所连接的氮一起可以任选地形成吗啉基、哌嗪基或被C1-6烷氧基羰基取代的哌嗪基；
芳基为苯基或萘基；
每个苯基或萘基可以任选地被一个、两个或三个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基、氨基、多卤代C1-6烷基和C1-6烷氧基；和
每个苯基或萘基可以任选地被选自亚甲基二氧基和亚乙基二氧基的二价基团取代；
杂芳基为吡啶基、吲哚基、喹啉基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、四唑基、苯并呋喃基或四氢呋喃基；
每个吡啶基、吲哚基、喹啉基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、四唑基、苯并呋喃基或四氢呋喃基可以任选地被一个、两个或三个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基、氨基、多卤代C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基或C1-6烷氧基；和
每个吡啶基、吲哚基、喹啉基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、苯并呋喃基或四氢呋喃基可以任选地被选自亚甲基二氧基或亚乙基二氧基的二价基团取代。
式(I)的化合物也可以其互变异构体形式存在。这种形式虽然未明确显示在上式中，但包括在本发明的范围内。
许多用于前述定义及下文中的术语在下文中解释。这些术语有时原样使用有时以复合术语使用。
如在上述定义和下文使用的，卤素一般指氟、氯、溴和碘；C1-6烷基定义具有1至6个碳原子的直链和支链饱和烃基，比如例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、2-甲基-丁基、2-甲基戊基等；羟基C1-6烷基定义在具有1至6个碳原子的直链和支链饱和烃基上的羟基取代基；三卤甲基定义包含三个相同的或不同的卤素取代基的甲基，例如三氟甲基；C3-7环烷基包括具有3至10个碳的环烃基，比如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基等。
术语“加成盐”包括式(I)的化合物能与有机碱或无机碱比如胺、碱金属碱和碱土金属碱或季铵碱；或与有机酸或无机酸比如矿物酸、磺酸、羧酸或含磷酸形成的盐类。
术语“加成盐”进一步包括式(I)的化合物能形成的可药用盐、金属络合物及其溶剂合物和盐类。
术语“可药用盐”指可药用酸或碱加成盐。如上文提及的可药用酸或碱加成盐指包括式(I)的化合物能形成的治疗活性的非毒性酸和非毒性碱加成盐形式。具有碱性特性的式(I)的化合物可以通过用合适的酸处理所述碱而转变成其可药用酸加成盐。适当的酸包括例如无机酸比如氢卤酸，例如氢氯酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸及类似的酸；或有机酸比如，例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸及类似的酸。
具有酸式特性的式(I)的化合物可以通过用合适的有机碱或无机碱处理所述酸形式而转变成其可药用碱加成盐。适当的碱盐形式包括，例如铵盐、碱金属盐和碱土金属盐，例如锂、钠、钾、镁、钙盐等，与有机碱的盐，例如苄星(benzathine)、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺(hydrabamine)盐、和与氨基酸比如例如精氨酸、赖氨酸等的盐。
术语酸加成盐或碱加成盐也包括的式(I)的化合物能形成的水合物和溶剂加成形式。这种形式的实例为例如水合物、醇合物等。
术语“金属络合物”指式(I)的化合物和一种或多种有机或无机金属盐之间形成的络合物。所述有机盐或无机盐的实例包括周期表的第二主族金属例如镁或钙、第三或第四主族金属例如铝、锡、铅以及周期表第一至第八过渡族的金属比如例如铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌等的卤化物、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、磺酸盐例如甲基磺酸盐、4-甲基苯基磺酸盐、水杨酸盐、苯甲酸盐等盐。
如前文使用的术语“式(I)的化合物的立体化学异构体形式”定义为式(I)的化合物可具有的由通过相同顺序的键键合的相同原子构成但具有不同的三维结构(其不可相互转变)的所有可能的化合物。除非另有提及或说明，化合物的化学名称包括所述化合物可具有的所有可能立体异构形式的混合物。所述混合物可包含所述化合物的基本分子结构的所有非对映异构体和/或对映异构体。纯形式的或彼此混合物形式的式(I)的化合物的所有立体异构形式都包含在本发明的范围内。
特别感兴趣的是立体化学纯的式(I)的那些化合物。
如本文提及的化合物和中间体的纯的立体异构形式定义为基本上不含所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其它对映体或非对映体形式的异构体。特别地，术语“立体异构纯的”涉及具有立体异构过量至少80％(即一种异构体最少量为90％，其它可能异构体的最大量为10％)至立体异构过量100％(即，一种异构体的100％且没有其它的)的化合物或中间体，更特别地，具有立体异构过量90％至100％，甚至更特别地具有立体异构过量94％至100％，且最特别地具有立体异构过量97％至100％的化合物或中间体。术语“对映异构体纯的”和“非对映异构体纯的”应当以相同的方式理解，但应当分别注意所述混合物的对映体过量、非对映体过量。
式(I)的化合物的互变异构形式指包括其中例如烯醇基转变成酮基(酮-烯醇互变异构)的式(I)的化合物。
式(I)的化合物的N-氧化物形式指包括式(I)的那些化合物，其中一个或多个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物，特别是那些其中一个或多个哌啶-、哌嗪或哒嗪基-氮被N-氧化的N-氧化物。
可以按照本领域已知用于将三价氮转化成其N-氧化物形式的方法将式(I)的化合物转化成相应N-氧化物形式。所述N-氧化反应通常可以通过式(I)的起始原料与适当的有机或无机过氧化物反应进行。适当的无机过氧化物包括例如过氧化氢、碱金属或碱土金属过氧化物，例如过氧化钠、过氧化钾；适当的有机过氧化物可以包括过氧酸，比如例如过氧苯甲酸或卤素取代的过氧苯甲酸，例如3-氯过氧苯甲酸、过氧链烷酸例如过氧乙酸、烷基氢过氧酸，例如叔丁基氢过氧化物。适当的溶剂为例如水、低级醇例如乙醇等、烃例如甲苯、酮例如2-丁酮、卤化烃例如二氯甲烷，及这样的溶剂的混合物。
本发明也意味着包括在本发明的化合物中存在的原子的任何同位素。例如氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括C-13和C-14。
当在下文中使用时，术语“式(I)的化合物”意味着也包括N-氧化物形式、可药用酸或碱加成盐及所有立体异构形式。
第一组令人感兴趣的化合物包括适用一种或多种下述限制的那些式(I)的化合物：
a)m为0；
b)n为2；
c)p为1；
d)t为0；
f)R1和R2各自独立地为氢；
g)R3和R4各自独立地为氢；
h)R5为氢；
i)R6和R7各自独立地为氢或C1-6烷基；
j)Z为选自(a-1)、(a-2)或(a-4)的基团；或
k)R10和R11各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基羰基或羟基C1-6烷基。
第二组令人感兴趣的化合物包括适用一种或多种下述限制的那些式(I)的化合物和第一组令人感兴趣的那些化合物：
a)m为0；
b)n为2；
c)p为1；
d)t为0；
f)R1和R2各自独立地为氢；
g)R3和R4各自独立地为氢；
h)R5为氢；
i)R6和R7各自独立地为氢；
j)Z为选自(a-2)或(a-4)的基团；或
k)R10和R11各自独立地选自氢、羟基或羟基C1-6烷基。
一组优选的化合物包括式(I)的那些化合物及其任何亚组，其中m为0；n为0；p为1；t为0；R1和R2各自独立地为氢；R3和R4各自独立地为氢；R5为氢；R6和R7各自独立地为氢或C1-6烷基；Z为选自(a-1)、(a-2)或(a-4)的基团；或R10和R11各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基羰基或羟基C1-6烷基。
一组更优选的化合物包括式(I)的那些化合物及其任何亚组，其中m为0；n为0；p为1；t为0；R1和R2各自独立地为氢；R3和R4各自独立地为氢；R5为氢；R6和R7各自独立地为氢；Z为选自(a-2)或(a-4)的基团；或者R10和R11各自独立地选自氢、羟基或羟基C1-6烷基。
最优选的化合物为化合物No.1、化合物No.4和化合物No.5。
式(I)的化合物、其可药用盐及N-氧化物及其立体异构形式可以按常规方式制备。起始原料及一些中间体为已知化合物且可市售获得的或可以根据本领域已知的常规反应方法制备。
许多这种制备方法将更详细地描述在下文中。用于获得最终式(I)化合物的其它方法描述在实施例中。
式(I)的化合物可以通过式(II)的中间体与式(III)的中间体反应制备，其中W为适当的离去基团，比如例如卤素，例如氟、氯、溴或碘，或磺酰氧基比如甲基磺酰氧基、4-甲基苯基磺酰氧基等。反应可以在反应-惰性溶剂中进行，所述惰性溶剂比如例如醇，例如甲醇、乙醇、2-甲氧基乙醇、丙醇、丁醇等；醚，例如4，4-二噁烷、1，1’-氧双丙烷等；酮，例如4-甲基-2-戊酮；或N，N二甲基甲酰胺、硝基苯、乙腈、乙酸等。加入适当的碱比如，例如碱金属或碱土金属碳酸盐或碳酸氢盐例如三乙胺或碳酸钠可用于吸收在反应过程中所释放的酸。可以加入少量适当的金属碘化物，例如碘化钠或碘化钾以促进反应。搅拌可以提高反应速率。所述反应可以方便地在室温至反应混合物的回流温度范围内的温度下进行，如果想要，反应可以在增压下进行。
其中p为1的式(I)的化合物，在本文中称为式(I-a)的化合物，可以在适当的溶剂比如四氢呋喃中通过用氢化铝锂转化式(IV)的中间体来制备。
式(I-a)的化合物也可以通过在适当的试剂比如硼氢化钠例如四氢硼酸钠或聚合物负载的氰基三氢硼酸盐的存在下，在适当的溶剂比如醇例如甲醇中，使适当的式(VI)的甲醛与式(V)的中间体反应制备。
按相同的方式，其中t为1的式(I)的化合物，在本文中称为式(I-b)的化合物，可以通过式(II)的中间体与式(VII)的适当的甲醛反应制备。
式(I)的化合物也可通过本领域已知的反应或功能基转换互相转变。许多这种转换已经描述在上文中。其它实例为羧酸酯水解成相应的羧酸或醇；酰胺水解成相应羧酸或胺；腈水解成相应酰胺；在咪唑或苯基上的氨基可以通过本领域已知的重氮化反应及随后以氢置换重氮基而被氢取代；醇可以转变成酯和醚；伯胺可以被转化成仲胺或叔胺；双键可被氢化成相应单键；在苯基上的碘基可通过在合适的钯催化剂的存在下插入一氧化碳而转变成酯基。
其中m为0的式(V)的中间体，在本文中称为式(V-a)的中间体，可以通过在适当的溶剂比如甲醇中用水合肼转化式(VIII)的中间体来制备。
式(V-a)的中间体，也可以通过在适当的溶剂比如甲醇或乙醇中，在金属催化剂比如拉尼镍和适当的还原剂比如氢的存在下，以式(XVI)的中间体开始由硝基还原成胺的反应制备。
式(X)的中间体可以通过在适当的试剂比如N′-(乙基羰亚胺酰基(ethylcarbonimidoyl))-N，N-二甲基-1，3-丙二胺、一氢氯化物(EDC)及1-羟基-1H-苯并三唑(HOBT)的存在下，使式(XI)的中间体与式(XII)的中间体反应制备。所述反应可以在碱比如三乙胺的存在下，在适当的溶剂比如二氯甲烷与四氢呋喃的混合物中进行。
式(VI)的中间体可以在适当的溶剂比如四氢呋喃中，通过式(XIII)的中间体与氢化铝锂反应制备。
式(VIII)的中间体(同上对于式(XVI)的中间体)，其中t为0，在本文中称为式(VIII-a)的中间体，可以通过在反应惰性溶剂比如N，N-二甲基甲酰胺中，在氯化氢的2-丙醇溶液的存在下，使式(IX)的中间体与式(XIV)的中间体反应制备，其中L为适当的离去基团比如例如卤素，例如氟、氯、溴或碘，或C1-6烷氧基例如甲氧基。
其中R6和R7都为氢的式(IX)的中间体，在本文中称为式(IX-a)的中间体，可以通过在氰基硼氢化钠的存在下，转化式(XV)的中间体来制备。所述反应可以在反应-惰性溶剂比如例如乙酸中进行。
式(I)的化合物及一些中间体可在其结构中具有至少一个立体生成中心。这样的立体生成中心可存在于R或S构型中。
在本发明中的式(I)的一些化合物和一些中间体可以包含不对称的碳原子。所述化合物和所述中间体的纯的立体异构形式可以通过使用本领域已知的方法获得。例如，非对映异构体可以通过物理方法比如选择结晶或色谱技术，例如逆流分布、液相色谱等方法分离。对映异构体可以通过如下方法制备：首先用合适的拆分试剂将所述外消旋混合物转化成非对映体盐的混合物或化合物，所述拆分试剂比如例如手性酸；然后，通过例如选择结晶、超临界流体色谱或色谱技术例如液相色谱等方法物理分离所述非对映体盐的混合物或化合物；和最后将所述分离的非对映体盐或化合物转化成相应的对映异构体。纯的立体异构形式也可以从中间体和起始原料的纯的立体异构形式获得，条件是反应立体定向地发生。
式(I)的化合物、其可药用酸加成盐和立体异构形式在抑制p53和MDM2之间相互作用上具有有价值的药理性质。
本文使用的术语“MDM2”指因mdm2基因的表达结果所获得的蛋白质。在该术语的意义中，MDM2包含所有被mdm2编码的蛋白质、其突变体、其选择性的切断蛋白质，及其磷酸化蛋白质。另外，如本文使用的术语“MDM2”包括MDM2类似物，例如MDMX(也称为MDM4)和MDM2同系物及其它动物的类似物，例如人类同系物HDM2或人类类似物HDMX。
本文使用的术语“抑制相互作用”或“相互作用的抑制剂”指防止或降低一种或多种分子、肽、蛋白质、酶或受体的直接或间接结合；或者防止或降低一种或多种分子、肽、蛋白质、酶或受体的正常活性。
本文使用的术语“p53与MDM2的相互作用的抑制剂”或“p53-MDM2抑制剂”为描述在如C.1中所述的分析中增加p53表达的药剂。这种增加可由但不限于一种或多种下述作用机理所引起：
-抑制p53和MDM2之间的相互作用，
-与MDM2或者p53蛋白质直接结合，
-与上游或下游靶点，例如激酶或参与遍在蛋白化或SUMO修饰的酶活性的相互作用，
-MDM2和p53在不同细胞区间的隔离或传输，
-与MDM2结合的蛋白质的调节，例如(但不限于)p73、E2F-1、Rb、p21waf1或cip1，
-向下调节或干扰MDM2表达和/或MDM2活性，例如(但不限于)影响其细胞定位，翻译后修饰、核输出或泛素连接酶活性，
-p53蛋白质的直接或间接稳定化，例如通过保持其为其功能结构形式或通过防止错误折叠，
-增加p53表达或p53家族成员例如p63和p73的表达。
-增加p53活性，例如通过(但不限于)增强其转录活性和/或
-增加p53-信号通路的基因和蛋白质表达，例如(但不限于)p21waf1、cip1、MIC-1(GDF-15)、PIG-3和ATF-3。
因此，本发明公开了用作药物的式(I)的化合物。
而且，本发明还涉及用于制备用于治疗经由p53-MDM2相互作用介导的病症的药物的化合物的用途，其中所述化合物为式(I)的化合物。
如本文使用的术语“治疗”涵盖在动物特别是人类中的疾病和/或病症的任何治疗，包括：(i)防止疾病和/或病症在可能易感染所述疾病和/或病症但还没有诊断为患有其的受试者中出现；(ii)抑制所述疾病和/或病症，即阻止其发展；(iii)减轻疾病和/或病症，即引起疾病和/或病症逆转。
术语“经由p53-MDM2相互作用所介导的病症”指任何不希望的或有害的病症，其导致或来自MDM2蛋白质与p53或诱导细胞凋亡、诱导细胞死亡或调节细胞循环的其它细胞蛋白质间的相互作用的抑制。
本发明也提供一种通过给药需要这样的治疗的受试者例如哺乳动物(更特别是人类)有效量的本发明的化合物来治疗p53-MDM2相互作用介导的病症的方法。
本发明的化合物可以具有在肿瘤细胞中的抗增殖作用，即使这样的细胞没有功能性p53。更特别地，本发明的化合物可以在具有野生型p53的肿瘤中和/或过表达MDM2的肿瘤中具有抗增殖作用。
因此，本发明还提供一种通过给药需要这样的治疗的受试者例如哺乳动物(更特别是人类)有效量的本发明的化合物来抑制肿瘤生长的方法。
可以被抑制的肿瘤的实例为，但不限于肺癌(例如腺癌，且包括非-小细胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺癌比如，例如外分泌胰腺癌)、结肠癌(例如结肠直肠癌，比如例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、食道癌、口腔鳞癌、舌癌、胃癌、鼻咽癌、淋巴系的造血肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、Burkitt′s淋巴瘤)、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、骨髓性白血病(例如急性髓性白血病(AML))、甲状腺滤泡癌、骨髓异常增生综合征(MDS)、间充质来源的肿瘤(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、脑肿瘤、神经胶质瘤、皮肤的良性肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌包括末期疾病、睾丸癌、骨肉瘤、头和颈癌及表皮癌。
本发明的化合物也可用于治疗和预防炎性病症。
因此，本发明还提供通过给药需要这样的治疗的受试者例如哺乳动物(更特别是人类)有效量的本发明的化合物来治疗和预防炎性病症的方法。
本发明的化合物也可用于治疗自身免疫性疾病和病症。术语“自身免疫性疾病”指其中动物的免疫系统对自身抗原有不利反应的任何疾病。术语“自身抗原”指在动物体内正常发现的任何抗原。代表性的自身免疫性疾病包括，但不限于：桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、多发性硬化、恶性贫血、阿狄森氏病、胰岛素依赖性糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)、皮肌炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、韦格纳(氏)肉芽肿病、抗肾小球基膜病、抗磷脂综合征、25疱疹样皮炎、变应性脑脊髓炎、肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、Lambert-Eaton、肌无力综合征、重症肌无力、大疱性类天疱疮、多内分泌腺病、莱特尔氏病(Reiter’s Disease)和僵体综合征。
因此，本发明还提供一种通过向需要这样的治疗的受试者例如哺乳动物(更特别是人类)给予有效量的本发明的化合物来治疗自身免疫性疾病和病症和治疗与构象上不稳定的或错折叠的蛋白质相关的疾病的方法。
本发明的化合物也可以用于治疗与构象不稳定的或错折叠的蛋白质相关的疾病。与构象不稳定的或错折叠的蛋白质相关的疾病的实例包括，但不限于：囊性纤维化病(CFTR)、马方综合征(微纤维蛋白)、肌萎缩性侧索硬化症(超氧化物歧化酶)、坏血病(胶原蛋白)、枫糖尿症(α-酮酸脱氢酶络合物)、成骨不全症(1型前α前胶原)、克-雅病(朊病毒)、阿尔茨海默氏病(β-淀粉状蛋白)、家族性淀粉样变(溶菌酶)、白内障(晶体蛋白)、家族性高胆固醇血症(LDL受体)、αI-抗胰蛋白酶缺乏、泰-萨病(β-己糖胺酶)、色素性视网膜炎(视紫质)和矮妖精貌综合征(胰岛素受体)。
因此，本发明还提供一种通过向需要这样的治疗的受试者例如哺乳动物(更特别是人类)给予有效量的本发明的化合物来治疗与构象上不稳定的或错折叠的蛋白质相关的疾病的方法。
鉴于有用的药理特性，目标化合物可以被配制成各种用于给药目的的药物形式。
为了制备本发明的药物组合物，将有效量的作为活性成分的具体的化合物以碱或酸加成盐形式与可药用载体混合成均质混合物，其中载体可以采取广泛的形式，取决于用于给药所需的制剂形式。这些药物组合物期望地为优选地适合用于口服、直肠、经皮或通过肠胃外注射给药的单一剂型。例如，在制备口服剂型的组合物中，可以使用任何通常的药物介质，比如例如在口服液体制剂比如混悬剂、糖浆剂、酏剂和溶液的情况下，为水、二醇类、油类、醇类等；或在粉末剂、丸剂、胶囊和片剂的情况下，为淀粉、糖、高岭土、润滑剂、结合剂、崩解剂等。
因为其易于给药，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下，显然采用固体药物载体。对于肠胃外组合物，所述载体通常包含无菌水(至少大部分)以帮助溶解，虽然可以包含其它成分。例如，可以制备其中载体包括盐溶液、葡萄糖溶液或生理盐水和葡萄糖溶液的混合物的可注射的溶液。也可以制备可注射的混悬剂，在这种情况下，可以采用适当的液体载体、混悬剂等。在适于经皮给药的组合物中，载体任选地包括渗透促进剂和/或适当的润湿剂，任选地与小比例的任何性质的合适添加剂混合，所述添加剂不会对皮肤造成显著的有害影响。所述添加剂可以促进给药至皮肤和/或有助于制备所需的组合物。这些组合物可以以多种形式给药，例如作为透皮贴剂、作为滴剂(spot-on)、作为膏剂。特别有利地是以易于给药与剂量的均匀性的剂量单位形式配制前述药物组合物。如在本文的说明书和权利要求书中使用的剂量单位形式指适合作为单一剂量的物理分散单位，每个单位包含预定量的活性成分，其经计算以结合所需的药物载体产生期望的治疗效果。这样的剂量单位形式的实例为片剂(包括刻痕或包衣片剂)、胶囊、丸剂、粉末袋、糯米纸囊剂(wafer)、可注射的溶液或混悬剂、茶匙量(teaspoonful)、汤匙容量(tablespoonful)等及其分离的复合包(segregated multiple)。
特别有利地是以易于给药与剂量的均匀性的剂量单位形式配制前述药物组合物。如在本文的说明书和权利要求书中使用的剂量单位形式指适合作为单一剂量的物理分散单位，每个单位包含预定量的活性成分，其经计算以结合所需的药物载体产生期望的治疗效果。这样的剂量单位形式的实例为片剂(包括刻痕或包衣片剂)、胶囊、丸剂、粉末袋、糯米纸囊剂、可注射的溶液或混悬剂、茶匙量、汤匙容量等及其分离的复合包。
本发明的化合物以足够抑制MDM2和p53或诱导细胞凋亡、诱导细胞死亡或调节细胞周期的其它细胞蛋白质相互作用的量给药。
MDM2的致癌性潜能不仅通过其抑制p53的能力，也可通过其调节其它肿瘤抑制蛋白质的能力来确定，所述其它肿瘤抑制蛋白质例如成视网膜细胞瘤蛋白pRb和密切相关的E2F1转录因子。
因此，本发明的化合物以足以调节MDM2和E2F转录因子之间相互作用的量给药。
本领域技术人员可容易地从在下文中给出的试验结果测定有效量。通常认为治疗有效量为0.005mg/kg至100mg/kg体重，特别地为0.005mg/kg至10mg/kg体重。在一天中，在适当的间隔下，以一次、两次、三次、四次或更多次亚剂量给药所需的剂量可能是适当的。所述亚剂量可以配制成单位剂型，例如包含0.5至500mg，特别是每单位剂型包含10mg至500mg的活性成分。
作为本发明的另一方面，设想p53-MDM2抑制剂与另一种抗癌剂的组合，特别是用作药物，更特别是用于癌症或相关疾病的治疗。
为了治疗上述疾病，本发明的化合物可以有利地与一种或多种其它药剂，更特别地与其它抗癌剂组合使用。抗癌剂的实例包括，但不限于：
-铂配位化合物，例如顺铂、卡铂或奥沙利铂(oxalyplatin)；
-紫杉烷化合物，例如紫杉醇或多西他赛；
-拓扑异构酶I抑制剂，比如喜树碱化合物，例如伊立替康或托泊替康；
-拓扑异构酶II抑制剂，比如抗肿瘤表鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷；
-抗肿瘤长春花生物碱，例如长春花碱、长春新碱或长春瑞滨；
-抗肿瘤核苷衍生物，例如5-氟尿嘧啶、亚叶酸、吉西他滨或卡培他滨；
-烷化剂，比如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、塞替派、mephalan或洛莫司汀；
-抗肿瘤蒽环类衍生物，例如柔红霉素、多柔比星、盐酸多柔比星脂质体(doxil)、伊达比星或米托蒽醌；
-靶向IGF-1受体的分子，例如picropodophilin；
-tetracarcin衍生物，例如tetrocarcin A；
-糖皮质激素，例如泼尼松；
-抗体，例如曲妥单抗(HER2抗体)、利妥昔单抗(CD20抗体)、吉姆单抗、西妥昔单抗、pertuzumab或贝伐单抗；
-雌激素受体拮抗剂或选择性雌激素受体调节剂，例如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、屈洛昔芬、faslodex或雷洛昔芬；
-芳香酶抑制剂，比如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑(letrazole)和伏氯唑；
-分化药剂，比如类视色素、维生素D或视黄酸及视黄酸代谢阻断剂((RAMBA)例如异维生素A酸(accutane)；
-DNA甲基转移酶抑制剂，例如氮杂胞苷或地西他滨；
-抗叶酸物，例如premetrexed disodium；
-抗生素，例如放线霉素D、博来霉素、丝裂霉素C、更生霉素、洋红霉素或柔红霉素；
-抗代谢药，例如可乐定、氨基蝶呤、阿糖胞苷或甲氨蝶呤；
-细胞凋亡诱导剂和抗血管生成剂，比如Bcl-2抑制剂，例如YC 137、BH 312、ABT 737、棉酚、HA 14-1、TW 37或癸酸；
-微管蛋白(tubuline)-结合剂，例如combrestatin、秋水仙碱或诺考达唑；
-激酶抑制剂，例如黄酮吡立(flavoperidol)、甲磺酸伊马替尼、厄洛替尼或吉非替尼；
-法尼基转移酶(farnesyltransferase)抑制剂，例如tipifarnib；
-组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，例如丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、缩酚酸肽(FR 901228)、NVP-LAQ824、R306465、JNJ-26481585或曲古抑菌素A；
-泛素-蛋白酶体通路抑制剂，例如PS-341、MLN.41或bortezomib；
-Yondelis；
-端粒酶抑制剂，例如telomestatin；
-基质金属蛋白酶抑制剂，例如巴马司他、马立马司他、prinostat或metastat。
如上所述，本发明的化合物也在使肿瘤细胞对化疗和放疗敏感的治疗中具有治疗应用。
因此，本发明的化合物可用作“放射致敏剂”和/或“化学致敏剂”或者可以与另一种“放射致敏剂”和/或“化学致敏剂”组合使用。
如本文使用的术语“放射致敏剂”被定义为一种分子，优选低分子量分子，以治疗有效量给药于动物以增加细胞对电离辐射的敏感性和/或促进可用电离辐射治疗的疾病的治疗。
如本文使用的术语“化学致敏剂”被定义为一种分子，优选低分子量分子，以治疗有效量给药于动物以增加细胞对化疗的敏感性和/或促进可用化疗治疗的疾病的治疗。
放射致敏剂的作用方式的几种机制已在文献中提出，包括：缺氧细胞放射致敏剂(例如2-硝基咪唑化合物和苯并三嗪二氧化物化合物)模拟氧或在缺氧下具有类似于生物还原剂性质的另一种方式；非缺氧细胞放射致敏剂(例如卤代嘧啶)可以为DNA碱的类似物，且优选引入到癌细胞的DNA中，由此促进辐射诱导的DNA分子的断裂和/或防止正常DNA修复机制；及各种在疾病的治疗中已被假设为放射敏感剂的作用的其它可能的作用机制。
目前许多癌症治疗方案使用放射致敏剂结合X射线的辐射。X射线活化的放射致敏剂的实例包括，但不限于下述的：甲硝唑、米索硝唑、去甲米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧尿苷、氟脱氧尿苷(FudR)、羟基脲、顺铂及其治疗有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力学疗法(PDT)采用可见光作为敏化剂的辐射活化剂。光动力学放射致敏剂的实例包括下述的，但不限于：血卟啉衍生物、光伏灵(Photofrin)、苯并卟啉衍生物、卟啉锡、pheoborbide-a、细菌叶绿素-a、萘菁、酞菁、锌酞菁及其治疗有效的类似物和衍生物。
放射致敏剂可以与治疗有效量的一种或多种其它化合物结合给药，所述其它化合物包括但不限于：促进放射致敏剂结合靶细胞的化合物；控制治疗剂、营养物和/或氧流向靶细胞的化合物；在有或者没有另外的辐射下作用于肿瘤的化疗剂；或者其它治疗癌症或其它疾病的治疗有效的化合物。
化学致敏剂可以与治疗有效量的一种或多种其它化合物结合给药，所述其它化合物包括但不限于：促进化学致敏剂结合靶细胞的化合物；控制治疗剂、营养物和/或氧流向靶细胞的化合物；在有或者没有另外的辐射下作用于肿瘤的化疗剂；或者其它治疗癌症或其它疾病的治疗有效的化合物。钙拮抗剂例如维拉帕米被发现在与抗肿瘤剂组合以建立肿瘤细胞对接受的化疗剂的抗性的化学敏感性和增强这样的化合物在药物敏感的恶性肿瘤中的功效中有用。
鉴于其有用的药理学特性，根据本发明的组合的组分，即其它药剂和p53-MDM抑制剂可以被配制成多种用于给药目的的药物形式。所述组分可以在各个药物组合物中分别配制或在包含两种组分的单一药物组合物中配制。
因此，本发明也涉及一种药物组合物，其包含其它药剂和p53-MDM及一种或多种药物载体。
本发明进一步涉及根据本发明的组合在制备抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
本发明进一步涉及一种包含作为第一活性成分的根据本发明的p53-MDM2抑制剂和作为第二活性成分的抗癌剂的产品，作为用于同时、分开或依序使用用于治疗患有癌症的患者的混合制剂。
其它药剂及p53-MDM2抑制剂可以同时给药(例如在分开或在单一组合物中)或者以任何顺序给药。在后者的情况中，两种化合物将在一个期间内以足以确保获得有利作用或协同作用的数量和方式给药。应当理解对组合中各种组分的给药的优选的方法和顺序及各自的剂量和疗法将取决于要给药的特定的其它药剂及p53-MDM2抑制剂、它们的给药途径、要治疗的特定的肿瘤及要治疗的特定的宿主。给药的最佳方法和顺序及剂量和疗法可容易地由本领域技术人员使用常规方法和参考本文所列出的信息确定。
铂配位化合物有利的给药剂量为每平方米体表面积1至500mg(mg/m2)，例如50至400mg/m2，特别是对于顺铂，每疗程剂量为约75mg/m2，而对于卡铂，每疗程剂量为约300mg/m2。
紫杉烷化合物有利的给药剂量为每平方米体表面积50至400mg(mg/m2)，例如75至250mg/m2，特别是对于紫杉醇，每疗程剂量为约175mg至250mg/m2，而对于多西他赛，每疗程剂量为约75至150mg/m2。
喜树碱化合物有利的给药剂量为每平方米体表面积0.1至400mg(mg/m2)，例如1至300mg/m2，特别是对于伊立替康，每疗程剂量为约100至350mg/m2，而对于托泊替康，每疗程剂量为约1至2mg/m2。
抗肿瘤鬼臼毒素衍生物有利的给药剂量为每平方米体表面积30至300mg(mg/m2)，例如50至250mg/m2，特别是对于依托泊苷，每疗程剂量为约35至100mg/m2，而对于替尼泊苷，每疗程剂量为约50至250mg/m2。
抗肿瘤长春花生物碱有利的给药剂量为每平方米体表面积2至30mg(mg/m2)，特别是对于长春碱，每疗程剂量为约3至12mg/m2，而对于长春新碱，每疗程剂量为约1至2mg/m2，和对于长春瑞滨，每疗程剂量为约10至30mg/m2。
抗肿瘤核苷衍生物有利的给药剂量为每平方米体表面积200至2500mg(mg/m2)，例如700至15001500mg/m2，特别地对于5-FU，每疗程剂量为200至500mg/m2，对于吉西他滨，每疗程剂量为约800至1200mg/m2，和对于卡培他滨，每疗程剂量为约1000至2500mg/m2。
烷化剂比如氮芥或亚硝基脲有利的给药剂量为每平方米体表面积100至500mg(mg/m2)，例如120至200mg/m2，特别地对于环磷酰胺，每疗程剂量为100至500mg/m2，对于苯丁酸氮芥，每疗程剂量为约0.1至0.2mg/kg，对于卡莫司汀，每疗程剂量为约150至200mg/m2，和对于洛莫司汀，每疗程剂量为约100至150mg/m2。
抗肿瘤蒽环类衍生物有利的给药剂量为每平方米体表面积10至75mg(mg/m2)，例如15至60mg/m2，特别地对于多柔比星，每疗程剂量为40至75mg/m2，对于柔红霉素，每疗程剂量为约25至45mg/m2，和对于伊达比星，每疗程剂量为约10至15mg/m2。
抗雌激素药有利的给药剂量为每日约1至100mg，取决于具体的药剂和要治疗的病症。他莫昔芬有利地以5至50mg，优选10至20mg的剂量每天两次口服，持续治疗足够的时间以获得并维持治疗效果。托瑞米芬有利地以约60mg的剂量一天一次口服给药，持续治疗足够的时间以获得并维持治疗效果。阿那曲唑有利地以约1mg的剂量一天一次口服给药。屈洛昔芬有利地以约20-100mg的剂量一天一次口服给药。雷洛昔芬有利地以约60mg的剂量一天一次口服给药。依西美坦有利地以约25mg的剂量一天一次口服给药。
抗体有利的给药剂量为每平方米体表面积约1至5mg(mg/m2)，或者如果与此不同，如本领域已知的。曲妥单抗有利的给药剂量为每平方米体表面积1至5mg(mg/m2)，特别地每疗程2至4mg/m2。
这些剂量可以每疗程给药例如一次、二次或多次，其例如可以每隔7、14、21或28天重复。
式(I)的化合物、其可药用酸加成盐和立体异构体形式可具有有价值的诊断特性，因为其可用于检测或鉴定生物试样中的p53-MDM2相互作用，包含检测或测量标记化合物和/或p53和/或MDM2和/或其它分子、肽、蛋白质、酶或受体之间络合物的形成。
检测或鉴定方法可以使用用标记剂比如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等标记的化合物。放射性同位素的实例包括125I、131I、3H和14C。酶通常通过结合适当的底物而成为可检测的，所述底物依次催化可检测的反应。其实例包括，例如β-半乳糖苷酶、β-糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化酶。所述发光物质包括，例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母素和荧光素酶。
生物试样可以限定为体组织或体液。体液的实例为脑脊液、血液、血浆、血清、尿液、痰、唾液等。
下述实施例举例说明本发明。
试验部分
在下文中，“DMF”定义为N，N-二甲基甲酰胺，“DCM”定义为二氯甲烷，“EtOAc”定义为乙酸乙酯，“EtOH”定义为乙醇，“MeOH”定义为甲醇，且“THF”定义为四氢呋喃。
熔点
对于许多化合物，熔点是用Kofler热态实验台得到的，所述Kofler热态实验台由具有直线温度梯度的加热板、滑动指针和以摄氏度表示的温度标尺组成。
LCMS
方法A
所述HPLC梯度由Alliance HT 2795(Waters)系统提供，该系统包括具有脱气器的四元泵、自动进样器和二极管-阵列检测器(DAD)。将来自柱的物流分离至MS检测器。所述MS检测器装配有电喷雾电离源。毛细管针电压为3kV，保持在LCT(来自Waters的Flight-Z-喷雾质谱仪的时间)中的辐射源温度为100℃。使用氮作为喷雾器的气体。用Waters-Micromass MassLynx-Openlynx数据系统进行数据采集。在nXterra-RP C18柱(5μm，3.9x150mm)上进行反相HPLC，流速为1.0ml/分钟，温度为30℃。采用两个流动相(流动相A：100％的7mM乙酸铵；流动相B：100％的乙腈；)进行梯度条件洗脱：在5分钟内从85％的A、15％的B(维持3分钟)至20％的A、80％的B，保持20％的A和80％的B共6分钟，并用初始条件再平衡3分钟。使用的注射体积为20μl。对于阳性电离方式，锥空电压为20V。通过使用0.08秒的中间扫描延迟以0.8秒从100至900扫描获得质谱。
方法B
所述LC梯度由Acquity UPLC(Waters)系统提供，该系统包括二元泵、样品收集器、柱加热器(设定在55℃)和二极管-阵列检测器(DAD)。将来自柱的物流分离至MS检测器。所述MS检测器装配有电喷雾电离源。使用0.02秒以0.18秒的驻留时间从100至1000扫描获得质谱。所述毛细管针电压为3.5kV，所述源温度保持在140℃。使用氮气作为喷雾器气体。用Waters-Micromass MassLynx-Openlynx数据系统进行数据采集。
在桥连的乙基硅氧烷/二氧化硅(BEH)C18柱(1.7μm，2.1x50mm)
进行反相UPLC，流速0.8ml/min。使用两种流动相(流动相A：在H2O/甲醇95/5中0.1％的甲酸；流动相B：甲醇)进行梯度条件，在1.3分钟从95％的A至5％的A，95％的B，并保持0.2分钟。使用0.5μl的注射体积。
对于阳性电离方式，锥空电压为10V，而对于阴性电离方式，锥空电压为20V。
A.中间体化合物的制备
实施例A1
a)中间体1的制备
在氩气下，在0℃，向5-硝基二氢吲哚(10.0g，0.061mol)和4-氯吡啶盐酸盐(11.0g，0.073mol)在DMF(60ml)中的溶液中分批加入叔丁醇钾(17.0g，0.15mol)。将该混合物加热至100℃16小时。将该混合物倾入冰中，并用EtOAc萃取两次。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：环己烷/EtOAc/MeOH 50/50/0至0/80/20)纯化残余物两次。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到2.49g(17％)呈橙褐色固体的中间体1。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.47(dd，2H，J＝6.4，J＝1.6)，8.06(m，2H)，7.41(d，1H，J＝9.6)，7.28(dd，2H，J＝6.4，J＝1.6)，4.16(t，2H，J＝8.6)，3.22(t，2H，J＝8.6)。
MS(ES+)m/z 242(M+1)。
b)中间体2的制备
在室温下，在30psi的氢气下，搅拌中间体1(2.4g，0.010mol)和拉尼镍(5ml，在水中50％的浆液)在EtOH(45ml)和THF(45ml)中的混合物3小时。在通过硅藻土垫过滤后，蒸发溶剂，得到2.01g(96％)呈褐色固体的中间体2。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.32(dd，2H，J＝6.4，J＝1.5)，7.15(d，1H，J＝8.5)，6.92(dd，2H，J＝6.4，J＝1.5)，6.63(d，1H，J＝2.2)，6.50(dd，1H，J＝8.3，J＝2.4)，3.92(t，2H，J＝8.3)，3.44(brs，2H)，3.08(t，2H，J＝8.3)。
c)中间体3的制备
在氩气下，向中间体2(1.9g，0.0089mol)在DCM(20ml)和THF(20ml)中的溶液中连续加入吲哚-3-乙酸(2.0g，0.012mol)、1-羟基苯并三唑水合物(1.6g，0.012mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.2g，0.012mol)。在室温下，搅拌该反应混合物40小时。为了完成反应，加入吲哚-3-乙酸(1.6g，0.0089mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.7g，0.0089mol)，并在室温下再搅拌该混合物16小时。蒸发溶剂，并通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.1至80/20/0.1)纯化残余物。蒸发收集的成分，用MeOH洗涤得到的固体并干燥，得到1.95g(60％)的中间体3。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.93(brs，1H)，10.08(brs，1H)，8.31(d，2H，J＝6.3)，7.88(d，1H，J＝8.1)，7.58(m，2H)，7.34(m，2H)，7.26(d，1H，J＝2.1)，7.17(d，2H，J＝6.6)，7.07(t，1H，J＝6.9)，6.98(t，1H，J＝7.4)，3.99(t，2H，J＝8.3)，3.71(s，2H)，3.12(t，2H，J＝8.2)。
MS(ES+)m/z 369(M+1)。
实施例A2
a)中间体4的制备
在氩气下，向5-硝基二氢吲哚(5.0g，0.030mol)和4-氯喹啉(6.0g，0.037mol)在DMF(30ml)中的溶液中分批加入叔丁醇钾(8.4g，0.075mol)。在100℃搅拌该混合物16小时，然后在室温下搅拌70小时。将该混合物倾入冰中，并用EtOAc萃取3次。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：EtOAc/环己烷50/50至100/0)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到2.26g(26％)呈橙色固体状的中间体4。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.93(d，1H，J＝4.9)，8.11(m，2H)，7.92(dd，1H，J＝8.9，J＝2.5)，7.85(d，1H，J＝7.7)，7.82(dt，1H，J＝7.0，J＝1.4)，7.60(dt，1H，J＝6.8，J＝1.2)，7.54(d，1H，J＝4.9)，6.26(d，1H，J＝8.9)，4.30(t，2H，J＝8.4)，3.35(t，2H，J＝8.2)。
MS(ES+)m/z 292(M+1)。
b)中间体5的制备
在室温下，在30psi的氢气下，搅拌中间体4(2.0g，0.0069mol)和拉尼镍(5ml，在水中50％的浆液)在EtOH(30ml)和THF(30ml)中的混合物4.5小时。在通过硅藻土垫过滤后，蒸发溶剂，得到1.81g(100％)呈橙色固体的中间体5。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.71(d，1H，J＝5.1)，8.07(d，1H，J＝8.5)，8.01(d，1H，J＝8.5)，7.67(t，1H，J＝7.0)，7.41(t，1H，J＝7.1)，7.09(d，1H，J＝5.1)，6.67(s，1H)，6.49(d，1H，J＝8.3)，6.38(dd，1H，J＝8.3，J＝1.9)，4.04(t，2H，J＝7.9)，3.39(brs，2H)，3.12(t，2H，J＝7.8)。
MS(ES+)m/z 262(M+1)。
c)中间体6的制备
在氩气下，向中间体5(1.7g，0.0064mol)在DCM(50ml)和THF(50ml)中的溶液中连续加入吲哚-3-乙酸(5.0g，0.0084mol)、1-羟基苯并三唑水合物(1.1g，0.0084mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.6g，0.0084mol)。在室温下，搅拌该混合物16小时。蒸发溶剂，并通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：DCM/MeOH/NH4OH90/10/0.1)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到1.15g(43％)呈褐色泡沫状的中间体6。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.74(d，1H，J＝5.1)，8.61(brs，1H)，8.09(d，1H，J＝8.1)，7.91(d，1H，J＝8.4)，7.70-7.62(m，2H)，7.41(m，4H)，7.22(m，3H)，7.09(d，1H，J＝5.1)，6.74(dd，1H，J＝8.4，J＝1.8)，6.38(d，1H，J＝8.4)，4.04(t，2H，J＝8.0)，3.89(s，2H)，3.15(t，2H，J＝7.9)。
MS(ES+)m/z 419(M+1)。
实施例A3
中间体7的制备
在室温下，在氩气下，搅拌吲哚-3-乙酸(2.0g，0.013mol)和1，1-羰二咪唑(2.1g，0.013mol，滴加)在DCM(28ml)中的混合物2小时。加入N，O-二甲基羟基胺盐酸盐(1.3g，0.013mol)，在室温下搅拌该混合物16小时，然后倾入冰和水中。用4N氢氧化钠溶液调节pH至10，并用EtOAc萃取水层两次。分离有机层，用3N盐酸洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂，得到2.37g(89％)呈粉红色固体的中间体7。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.09(brs，1H)，7.66(d，1H，J＝7.5)，7.36(d，1H，J＝7.5)，7.22-7.10(m，3H)，3.92(s，2H)，3.66(s，3H)，3.23(s，3H)。
实施例A4
a)中间体8的制备
在Biotage Initiator微波装置中，加热5-硝基二氢吲哚(4.0g，0.024mol)和4-氯-2-吡啶羧酸、甲基酯(5.0g，0.029mol)在乙酸(24ml)中的混合物至120℃25分钟。用冰淬灭该反应，通过加入饱和碳酸钾溶液调节pH至pH 9。用DCM萃取该混合物3次。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：DCM/MeOH 100/0至90/10)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到1.37g(19％)呈黄色固体状的中间体8。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.65(d，1H，J＝5.6)，8.16(dd，1H，J＝8.9，J＝2.1)，8.11(s，1H)，7.98(d，1H，J＝2.5)，7.35(d，1H，J＝8.9)，7.30(dd，1H，J＝5.7，J＝2.5)，4.23(t，2H，J＝8.5)，4.05(s，3H)，3.32(t，2H，J＝8.4)。
MS(ES+)m/z 300(M+1)。
b)中间体9的制备
在室温下，在1气压的氢气下，搅拌中间体8(1.2g，0.0045mol)和拉尼镍(4ml，在水中50％的浆液)在MeOH(20ml)和THF(20ml)中的混合物20小时。在通过硅藻土垫过滤后，蒸发溶剂，得到1.06g(88％)呈橙色固体的中间体9。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.40(d，1H，J＝5.8)，7.77(d，1H，J＝2.5)，7.18(d，1H，J＝8.4)，7.05(dd，1H，J＝5.8，J＝2.6)，6.62(d，1H，J＝2.2)，6.52(dd，1H，J＝8.4，J＝2.4)，4.00(m，5H)，3.09(t，2H，J＝8.3)。
MS(ES+)m/z 270(M+1)。
实施例A5
a)中间体10的制备
在100℃下，搅拌5-氨基吲哚(1.1g，0.0086mol)和邻苯二甲酸酐(2.6g，0.017mol)在DMF(20ml)中的混合物5小时，然后在室温下搅拌64小时。在EtOAc中稀释该反应混合物，用氯化铵的饱和溶液洗涤两次，干燥(MgSO4)，过滤，并蒸发溶剂。将得到的油状物收集在乙酸(15ml)中，并在室温下搅拌20分钟，然后加热至80℃1.5小时。加入冰，并用饱和碳酸钠溶液调节pH至pH 4。用EtOAc萃取该混合物两次。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：EtOAc/环己烷40/60)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到2.06g(91％)的中间体10。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.32(brs，1H)，7.97(m，2H)，7.79(m，2H)，7.66(d，1H，J＝2.0)，7.49(d，1H，J＝8.6)，7.27(dd，1H，J＝5.7，J＝2.8)，7.17(dd，1H，J＝8.6，J＝2.0)，6.61(t，1H，J＝1.1)。
MS(ES+)m/z 263(M+1)。
b)中间体11的制备
在室温下，搅拌中间体10(2.1g，0.0079mol)和氰基硼氢化钠(987mg，0.016mol)在乙酸(30ml)中的混合物18小时。加入冰，并用饱和碳酸钠溶液调节pH至6。用EtOAc萃取该混合物两次。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：EtOAc/环己烷30/70至70/30)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到726mg(35％)呈黄色固体状的中间体11。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.93(m，2H)，7.77(m，2H)，7.09(s，1H)，7.00(d，1H，J＝8.2)，6.70(d，1H，J＝8.2)，3.62(t，2H，J＝8.4)，3.09(t，2H，J＝8.4)。
MS(ES+)m/z 265(M+1)。
c)中间体12的制备
在Biotage Initiator微波装置中，加热中间体11(570mg，0.0022mol)、4-溴-6，7-二氢-5H-[1]吡啶-7-醇(554mg，0.0026mol)和5N盐酸在2-丙醇(0.57ml，0.0029mol)在DMF(11ml)中的混合物至120℃1小时。用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，并用DCM萃取3次。蒸发溶剂。并通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：EtOAc/MeOH 100/0至80/20，然后是DCM/MeOH 95/5至90/10)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到651mg(76％)呈黄色固体状的中间体12。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.30(d，1H，J＝5.6)，7.95(m，2H)，7.79(m，2H)，7.23-7.12(m，3H)，6.94(d，1H，J＝8.4)，5.24(t，1H，J＝7.0)，4.18(m，1H)，4.08(m，1H)，3.25(m，2H)，3.00(m，1H)，2.85(m，1H)，2.57(m，1H)，2.06(m，1H)。
MS(ES+)m/z 398(M+1)。
d)中间体13的制备
在室温下，将水合肼(137μl，0.0028mol)加入到中间体12(557mg，0.0014mol)在MeOH(5.5ml)中的混悬液中，并加热该得到的混合物至70℃40分钟。用水淬灭该反应，并用EtOAc萃取4次。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂，得到392mg(100％)呈橙褐色固体的中间体13。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.18(d，1H，J＝5.8)，7.07(d，1H，J＝5.8)，6.49(d，1H，J＝8.3)，6.63(d，1H，J＝2.1)，6.48(dd，1H，J＝8.3，J＝2.4)，5.21(m，1H)，4.19(brs，2H)，4.03(m，3H)，3.05(m，3H)，2.84(m，1H)，2.50(m，1H)，2.03(m，1H)。
实施例A6
a)中间体14的制备
在140℃的微波炉中的封闭管中，加热2，3-二氢-3，3-二甲基-5-硝基-1H-吲哚(0.003mol)和4-溴-吡啶(0.003mol)在1-丁醇(5ml)中的混合物30分钟，然后将其收集在10％碳酸钾的溶液中，并用EtOAc萃取。用水洗涤有机层，然后用NaCl和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(20-45μm)(洗脱剂：DCM/MeOH 100/0至98/2)纯化残余物(0.8g)。收集纯成分并蒸发溶剂。从乙腈中结晶残余物(0.45g，64％)。滤出沉淀物并干燥，得到0.216g(31％)的中间体14，熔点为217℃(Kofler)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.4(6H，s)，3.92(2H，s)，7.3(2H，m)，7.45(1H，m)，8.10(2H，m)，8.47(2H，m)
LCMS(ES+)m/z 270(M+1)，Rt＝0.77，方法B
b)中间体15的制备
在室温下，在3bar压力下氢化中间体14(0.003mol)和拉尼镍(0.9g)在MeOH(20ml)中的混合物1小时，然后用硅藻土过滤。用MeOH洗涤硅藻土。蒸发滤液，得到0.8g(100％)的中间体15。
c)中间体16的制备
在室温下，将溴-三吡咯烷基磷代六氟磷酸酯(bromotris(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate)(0.004mol)分批加入中间体15(0.003mol)、1H-吲哚-3-乙酸(0.004mol)、1-羟基苯并三唑(0.04mol)和二异丙醚(0.005mol)在DCM(15ml)的溶液中。在室温下搅拌该混合物过夜。用10％的碳酸钾溶液洗涤有机层两次，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(15-40μm)(洗脱剂：DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2)纯化残余物(3.2g)。收集纯成分，并蒸发溶剂。从乙腈中结晶残余物(0.7g，52％)。滤出沉淀物并干燥，得到0.55g(41％)的中间体16，熔点158℃(Kofler)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.28(6H，s)，3.7(2H，s)，3.73(2H，s)，6.99(1H，t，J＝7.7Hz)，7，07-7.11(3H，m)，2.25(1H，d，J＝3.6Hz)，7.30-7.39(3H，m)，7.55(1H，br，d，J＝3.6Hz)，7.62(1H，d，J＝7.7Hz)，8.3(2H，d，J＝7.7Hz)，10.03(1H，br，s)，10.92(1H，br，s)
LCMS(ES+)m/z 397(M+1)，Rt＝8.43，方法A
B.最终化合物的制备
实施例B1
化合物1的制备
在氩气下，将氢化铝锂(423mg，0.0011mol)分批加入中间体3(1.0g，0.0027mol)在THF(60ml)的混悬液中。在室温下搅拌该混合物24小时，用冰和稀释的Rochelle盐溶液淬灭，并用DCM萃取3次。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.1)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到170mg(18％)呈黄色泡沫状的化合物1。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.36(brs，1H)，8.32(d，2H，J＝6.6)，7.63(d，1H，J＝7.8)，7.39(d，1H，J＝7.5)，7.24-7.11(m，3H)，7.07(d，1H，J＝1.8)，6.93(d，2H，J＝6.6)，6.58(s，1H)，6.45(dd，1H，J＝8.4，J＝2.1)，3.93(t，2H，J＝8.2)，3.62(brs，1H)，3.46(t，2H，J＝7.5)，3.09(m，4H)。
LCMS(ES+)m/z355(M+1)，Rt＝8.30，方法A
实施例B2
化合物2的制备
在氩气下，在室温下，将氢化铝锂(391mg，0.010mol)分批加入中间体6(1.1g，0.0026mol)在THF(55ml)中的溶液中。在室温下搅拌该混合物18小时。在0℃，用MeOH淬灭该反应。加入冰和稀释的Rochelle盐溶液，用DCM萃取该混合物3次。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.5)纯化该残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到121mg(12％)呈橙色泡沫状的化合物2。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.70(d，1H，J＝5.1)，8.18(brs，1H)，8.07(d，1H，J＝8.7)，8.03(d，1H，J＝8.7)，7.66(m，2H)，7.41(m，2H)，7.22(t，1H，J＝7.7)，7.12(m，3H)，6.63(s，1H)，6.56(d，1H，J＝8.4)，6.34(dd，1H，J＝8.4，J＝2.1)，4.06(t，2H，J＝7.8)，3.46(t，2H，J＝6.8)，3.12(m，4H)。
MS(ES+)m/z405(M+1)。
实施例B3
化合物3的制备
在0℃，在氩气下，将氢化铝锂(14mg，0.00036mol)加入到中间体7(74mg，0.00036mol)在THF(1ml)中的溶液中。在0℃，搅拌该混合物1小时，用5％的硫酸氢钾溶液淬灭，并用EtOAc萃取两次。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂，得到呈橙色油状物的吲哚-3-基乙醛。
将中间体9(200mg，0.00074mol)和氰基硼氢化钠(64mg，0.0010mol)在MeOH(2.3ml)和乙酸(2滴)的混合物滴加至前述醛(236mg，0.0015mol)在MeOH(2ml)中的溶液中。在室温下，搅拌该反应混合物16小时。用水淬灭反应，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，并用EtOAc萃取3次。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：EtOAc/MeOH 100/0至90/10)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到190mg(44％)呈橙色泡沫状的化合物3。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.42(d，1H，J＝5.7)，8.08(brs，1H)，7.79(d，1H，J＝2.4)，7.63(d，1H，J＝7.8)，7.40(d，1H，J＝8.1)，7.25-7.07(m，5H)，6.59(s，1H)，6.48(dd，1H，J＝8.7，J＝2.1)，4.00(m，5H)，3.48(t，2H，J＝6.8)，3.12(m，4H)。
MS(ES+)m/z 413(M+1)。
实施例B4
化合物4的制备
将硼氢化钠(92mg，0.0024mol)慢慢地加入到化合物3(100mg，0.00024mol)在MeOH(3ml)中的溶液中。在室温下搅拌该混合物1小时，然后在80℃搅拌4小时，并在室温下再搅拌85小时。用水淬灭该反应，并用EtOAc萃取该混合物。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：DCM/MeOH 90/10至85/15)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到50mg(54％)呈黄色泡沫状的化合物4。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.83(brs，1H)，8.14(d，1H，J＝5.7)，7.54(d，1H，J＝7.8)，7.35(d，1H，J＝7.8)，7.22(m，2H)，7.14(d，1H，J＝2.1)，7.70(dt，1H，J＝7.6，J＝1.2)，6.98(dt，1H，J＝7.5，J＝0.9)，6.86(dd，1H，J＝6.0，J＝2.4)，6.62(d，1H，J＝2.1)，6.45(dd，1H，J＝8.7，J＝2.2)，5.39(brs，2H)，4.49(d，2H，J＝4.0)，3.92(t，2H，J＝8.2)，3.30(m，2H)，3.06(t，2H，J＝8.1)，2.96(t，2H，J＝7.5)。
MS(ES+)m/z385(M+1)。
实施例B5
化合物5的制备
在0℃，在氩气下，将氢化铝锂(14mg，0.00036mol)加入到中间体7(74mg，0.00036mol)在THF(1ml)中的溶液中。在0℃搅拌该混合物1小时，用5％的硫酸氢钾溶液淬灭，并用EtOAc萃取两次。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂，得到呈橙色油状物的吲哚-3-基乙醛。
向中间体13(100mg，0.00037mol)和氰基硼氢化钠(33mg，0.00052mol)在MeOH(1.5ml)和乙酸(2滴)的混合物中滴加前述醛(57mg 0.00036mol)在MeOH(0.5ml)中的溶液。在室温下，搅拌该反应混合物18小时。用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，并用EtOAc萃取两次。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(40-63μm)(洗脱剂：DCM/MeOH 100/0至90/10)纯化残余物。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到79mg(52％)呈黄色泡沫状的化合物5。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.37(brs，1H)，8.15(d，1H，J＝5.8)，7.63(d，1H，J＝7.8)，7.37(d，1H，J＝7.1)，7.21(dt，1H，J＝7.6，J＝1.2)，7.12(dt，1H，J＝7.6，J＝1.1)，7.07(m，2H)，6.83(d，1H，J＝8.5)，6.56(d，1H，J＝2.0)，6.40(dd，1H，J＝8.5，J＝2.3)，5.22(t，1H，J＝6.7)，4.19(brs，1H)，4.04(m，3H)，3.44(t，2H，J＝6.7)，3.06(m，5H)，2.83(m，1H)，2.54(m，1H)，2.08(m，1H)。
MS(ES+)m/z411(M+1)。
实施例B6
化合物6的制备
在N2气流下，将中间体16(0.001mol)分批加入四氢铝锂(0.002mol)在THF(10ml)中的溶液中。搅拌该混合物并回流24小时，倾入冰水中并用硅藻土过滤。用EtOAc洗涤硅藻土。用EtOAc萃取滤液。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发溶剂。通过在硅胶上的柱色谱(10μm)(洗脱剂：DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.5)纯化残余物(0.45g)。收集纯的成分，并蒸发溶剂，得到0.042g的化合物6。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.28(6H，s)，2.95(2H，t，J＝7.7Hz)，3.27-3.34(2H，m)，3.65(2H，s)，5.38(1H，br，t，J＝6.4Hz)，6.45(1H，dd，J＝4Hz，7.7Hz)，6.57(1H，d，J＝4Hz)，6.96-7.02(3H，m)，7.07(1H，t，J＝7.7Hz)，7.15-7.5(3H，m)，7.35(1H，d，J＝7.7Hz)，7.55(1H，d，J＝7.7Hz)，8.22(1H，d，J＝7.7Hz)，10.83(1H，br，s)
MS(ES+)m/z383(M+1)，Rt＝9.17，方法A
表F-1列出了在上述实施例之一中制备的化合物。
表F-1
C.药理学实施例：
所述化合物保存p53在A2780细胞中的能力用p53酶联免疫吸附分析测定。p53分析法是一种采用两种多克隆的抗体的“三明治”酶免疫分析法。将对p53蛋白质特异性的多克隆抗体固定在塑料孔的表面上。任何存在于要测定的样品中的p53将结合至捕捉抗体(captureantibody)。生物素化的检测剂多克隆抗体也识别p53蛋白质，并将结合任何p53，其通过捕捉抗体保持。反之，所述检测剂抗体被辣根过氧化酶-结合的链霉抗生素蛋结合。所述辣根过氧化酶催化显色底物邻-苯二胺的转化，其强度与结合至培养板上的p53蛋白的量成正比。使用分光光度计定量显色反应产物。定量通过使用已知浓度的纯化的重组HIS标记的p53蛋白质构建标准曲线获得(参见实施例C.1)。
式(I)化合物的细胞活性在U87MG肿瘤细胞上利用比色分析法对细胞毒性或存活率测定(参见实施例C.2)。
U87MG细胞为具有野生型p53的人类成胶质细胞瘤细胞。在该细胞系中，MDM2密切地控制p53表达。
C.1.p53 ELISA
在37℃，在润湿的含有5％CO2的培养箱中，在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺和庆大霉素的RPMI 1640中培养A2780细胞(ATCC)。
在96孔培养板中，以每孔20.000个细胞接种A2780细胞，培养24小时，并在37℃在润湿的培养箱中用化合物处理16小时。在培养后，用磷酸缓冲盐水洗涤细胞一次，且每孔加入30μl的低盐RIPA缓冲液(20mMtris、pH7.0、0.5mM EDTA、1％Nonidet P40、0.5％DOC、0.05％SDS、1mM PMSF、1μg/ml抑肽酶和0.5μ/ml亮肽素)。将培养板置于冰上30分钟以完成溶胞。通过使用如下所述的三明治ELISA检测在溶胞产物中的p53蛋白质。
用在涂层缓冲液(0.1M NaHCO3 pH8.2)中浓度为1μg/ml的捕捉抗体pAb1801(Abcam ab28-100)涂布高结合性聚苯乙烯EIA/RIA 96孔培养板(Costar 9018)，每孔50μl。使抗体在4℃粘附过夜。用磷酸缓冲盐水(PBS)/0.05％吐温20洗涤涂层的培养板，加入300μl的阻断缓冲液(PBS，1％牛血清白蛋白(BSA))，在室温下培养2小时。在阻断缓冲液中制备纯化的重组HIS标记的p53蛋白质的稀释液，范围为3-200ng/ml，并用作标准品。
用PBS/0.05％吐温20洗涤培养板两次，并加入阻断缓冲液或标准品，80μl/孔。向所述标准品中，加入20μl的溶胞缓冲液。将样品加入到其它孔中，20μl溶胞产物/孔。在4℃培养过夜后，以PBS/0.05％吐温20洗涤培养板两次。将100μl二代多克隆抗体p53(FL-393)(Tebubio，sc-6243)的等分试样以在阻断缓冲液中1μg/ml的浓度加入到各孔中，并使在室温下粘附2小时。用PBS/0.05％吐温20洗涤培养板三次。以0.04μg/ml加入在PBS/1％的BSA中的检测抗体抗兔子HRP(sc-2004，Tebubio)，并在室温下培养1小时。用PBS/0.05％吐温20洗涤培养板三次，并加入100μl的底物缓冲液(底物缓冲液是在使用前不久通过加入1片10mg来自Sigma的邻-苯二胺(OPD)和125μl的3％H2O2至25ml的OPD缓冲液：35mM的柠檬酸，66mM的Na2HPO4，pH5.6而制备的)。在5至10分钟后，通过每孔加入50μl的终止缓冲液(1M H2SO4)终止显色反应。使用Biorad微培养板读数器测量在双波长490/655nm的吸收度，然后分析结果。
对于每个试验，平行进行对照组(不包含药物)和空白培养(不包含细胞或药物)。从所有的对照值和样本值减去空白试验值。对于每个样品，p53的值(吸收度单位)被表示为存在于对照组中p53值的百分比。高于140％的百分数保存被定义为显著的。本文中，试验化合物的效果表示为提供至少140％的存在于对照组中的p53的值的最低剂量(LAD)(参见表F-2)。
C.2.增殖分析
将所有的试验化合物溶于DMSO中，并在培养介质中制备其它稀释液。在细胞增殖分析中最终DMSO浓度从不超过0.1％(v/v)。对照组包含U87MG细胞和DMSO，但没有化合物，而空白组包含DMSO，但没有细胞。
将U87MG细胞以3000个细胞/孔/100μl接种在96-孔细胞培养板中。24小时后，替换培养基并将化合物和/或溶剂加入至200μl的最终容积。在培养4天后，用200μl的新鲜培养基代替培养基，并使用MTT-基分析评价细胞生长。因此，将25μl的MTT溶液(来自Serva的在磷酸缓冲盐水中的0.5％MTT，研究等级)加入到各孔中，并在37℃进一步培养所述细胞2小时。然后，小心地吸出培养基，并通过加入各孔0.1M甘氨酸和100μl DMSO溶解蓝色的MTT-formazan产物。将该培养板在微培养板振荡器上再振摇10分钟，之后通过Biorad微培养板读数器在540nm读取吸光度。
在实验中，各个试验条件的结果为3个重复孔的平均值。对于初筛目的，以单一固定浓度10-5M试验化合物。对于活性化合物，重复试验以建立整个浓度-响应曲线。对于每个试验，平行进行对照组(不包含药物)和空白培养(不包含细胞或药物)。从所有的对照值和样本值减去空白试验值。对于每个样品，细胞生长的平均值(以吸光度单位计)表示为对照组的细胞生长的平均值的百分数。当适当时，使用分级数据的概率单位分析计算IC50-值(降低细胞生长至对照组的50％所需的药物的浓度)(Finney，D.J.，Probit Analyses，第2版，第10章，Graded Responses，Cambridge University Press，Cambridge 1962)。本文中，试验化合物的效果表示为pIC50(IC50-值的负对数值)(参见表F-2)。
在一些试验中，所述增殖试验适于且用于384孔培养板(参见表F-2)。
表F-2：表F-2列出了根据实施例C.1和C.2试验的化合物的结果
| Co No | A2780p53-elisaLAD | 细胞增殖pIC50384孔 | 细胞增殖pIC5096孔 |
| 1 | 1.0E-07 | 8.00 | |
| 2 | 1.0E-06 | 5.77 | |
| 4 | 3.0E-07 | 6.80 | |
| 3 | 1.0E-06 | 5.38 | |
| 5 | 3.0E-07 | 6.53 | |
| 6 | 3.0E-06 | 6.53 |
D.组合物实施例：膜包衣片
片芯的制备
将100g式(I)的化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物充分混合，然后用5g十二烷基硫酸钠和10g聚乙烯-吡咯烷酮在约200ml的水中的溶液润湿。将湿粉末混合物过筛，干燥并再次过筛。之后，加入100g的微晶纤维素和15g的氢化植物油。将全部物质充分混合并压制成片，得到10.000片，每片包含10mg式(I)的化合物。
包衣
将5g的乙基纤维素在150ml的二氯甲烷中的溶液加入到10g甲基纤维素在75ml变性乙醇中的溶液中。然后，加入75ml的二氯甲烷和2.5ml的1，2，3-丙三醇。熔融10g的聚乙二醇并将其溶于75ml的二氯甲烷中。将后者溶液加入到前者中，然后加入2.5g的十八酸镁、5g的聚乙烯吡咯烷酮和30ml浓缩的有色混悬液，并将全部物质均质化。在包衣装置中，采用如此得到的混合物包衣所述片芯。
Claims (10)
1.式(I)的化合物：
其N-氧化物形式、加成盐或立体化学异构体形式，其中：
m为0、1或2，且当m为0时，则指直接键；
n为0、1、2或3，且当n为0时，则指直接键；
p为0或1，且当p为0时，则指直接键；
t为0或1，且当t为0时，则指直接键；
为-CR8＝C＜且虚线为键、-C(＝O)-CH＜、-C(＝O)-N＜、-CHR8-CH＜或-CHR8-N＜；其中
R8各自独立地为氢或C1-6烷基；
R1和R2各自独立地选自氢，卤素，C1-6烷基，C1-6烷氧基，芳基C1-6烷氧基，杂芳基C1-6烷氧基，苯硫基，羟基C1-6烷基羰基，用选自氨基、芳基或杂芳基的取代基取代的C1-6烷基，或用选自氨基、芳基或杂芳基的取代基取代的C3-7环烷基；
R3和R4各自独立地选自氢，卤素，C1-6烷基，多卤代C1-6烷基，氰基，氰基C1-6烷基，羟基，氨基或C1-6烷氧基；或
R4和R5可以任选地形成选自亚甲基二氧基或亚乙基二氧基的二价基团；
R5为氢、C1-6烷氧基羰基或C1-6烷基；
R6和R7各自独立地选自氢、C1-6烷氧基C1-6烷基或C1-6烷基；或
R6和R7可以一起任选地形成选自下述的二价基团
-(CH2)2-O-(CH2)2- (b-1)，
-(CH2)2-NR9-(CH2)2- (b-2)，
其中R9为氢、C1-6烷氧基C1-6烷基或C1-6烷基；
Z为选自下述的基团：
其中
R10和R11各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1-6烷基、硝基、多卤代C1-6烷基、氰基、氰基C1-6烷基、四唑并C1-6烷基、芳基、杂芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基C1-6烷基，芳基(羟基)C1-6烷基、杂芳基(羟基)C1-6烷基、芳基羰基、杂芳基羰基、C1-6烷基羰基、芳基C1-6烷基羰基、杂芳基C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基、C3-7环烷基羰基、C3-7环烷基(羟基)C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷氧基C1-6烷基、羟基C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C2-6烯基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基氧基、氨基羰基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基C1-6烷基和-(CH2)v-(C(＝O)r)-(CHR17)u-NR13R14；其中
v为0、1、2、3、4、5或6，且当v为0时，则指直接键；
r为0或1，且当r为0时，则指直接键；
u为0、1、2、3、4、5或6，且当u为0时，则指直接键；
R17为氢或C1-6烷基；
R12为氢，C1-6烷基，C3-7环烷基，被选自羟基、氨基、C1-6烷氧基和芳基的取代基取代的C1-6烷基，或被选自羟基、氨基、芳基和C1-6烷氧基的取代基取代的C3-7环烷基；
R13和R14各自独立地选自氢，C1-12烷基，C1-6烷基羰基，C1-6烷基磺酰基，芳基C1-6烷基羰基，C3-7环烷基，C3-7环烷基羰基，-(CH2)k-NR15R16，被选自羟基、羟基羰基、氰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷氧基、芳基或杂芳基的取代基取代的C1-12烷基，或被选自羟基、C1-6烷氧基、芳基、氨基、芳基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基的取代基取代的C3-7环烷基；或
R13和R14与其所连接的氮一起可以任选地形成吗啉基，哌啶基，吡咯烷基，哌嗪基，或被选自C1-6烷基、芳基C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基羰基、杂芳基C1-6烷基、C3-7环烷基和C3-7环烷基C1-6烷基的取代基取代的哌嗪基；其中
k为0、1、2、3、4、5或6，且当k为0时，则指直接键；
R15和R16各自独立地选自氢，C1-6烷基，芳基C1-6烷氧基羰基，C3-7环烷基，被选自羟基、C1-6烷氧基、芳基和杂芳基的取代基取代的C1-12烷基，被选自羟基、C1-6烷氧基、芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基和杂芳基C1-6烷基的取代基取代的C3-7环烷基；或者
R15和R16与其所连接的氮一起可以任选地形成吗啉基、哌嗪基或被C1-6烷氧基羰基取代的哌嗪基；
芳基为苯基或萘基；
每个苯基或萘基可以任选地被一个、两个或三个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基、氨基、多卤代C1-6烷基和C1-6烷氧基；和
每个苯基或萘基可以任选地被选自亚甲基二氧基和亚乙基二氧基的二价基团取代；
杂芳基为吡啶基、吲哚基、喹啉基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、四唑基、苯并呋喃基或四氢呋喃基；
每个吡啶基、吲哚基、喹啉基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、四唑基、苯并呋喃基或四氢呋喃基可以任选地被一个、两个或三个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基、氨基、多卤代C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基或C1-6烷氧基；和
每个吡啶基、吲哚基、喹啉基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、苯并呋喃基或四氢呋喃基可以任选地被选自亚甲基二氧基或亚乙基二氧基的二价基团取代。
2.根据权利要求1的化合物，其中
m为0；n为0；p为1；t为0；R1和R2各自独立地为氢；R3和R4各自独立地为氢；R5为氢；R6和R7各自独立地为氢或C1-6烷基；Z为选自(a-1)、(a-2)或(a-4)的基团；或R10和R11各自独立地选自氢、羟基、C1-6烷氧基羰基或羟基C1-6烷基。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中
m为0；n为0；p为1；t为0；R1和R2各自独立地为氢；R3和R4各自独立地为氢；R5为氢；R6和7各自独立地为氢；Z为选自(a-2)或(a-4)的基团；或R10和R11各自独立地选自氢、羟基或羟基C1-6烷基。
4.根据权利要求1、2或3的化合物，其中所述化合物为化合物No.1、化合物No.4或化合物No.5，
5.用作药物的根据权利要求1、2、3或4的化合物。
6.药物组合物，包含可药用载体和作为活性成分的治疗有效量的如权利要求1至4中所述的化合物。
7.制备如在权利要求6中所述的药物组合物的方法，其中所述可药用载体和如权利要求1至4中所述的化合物紧密地混合。
8.根据权利要求1、2、3或4的化合物在制备用于治疗由p53-MDM2相互作用介导的病症的药物中的用途。
9.抗癌剂和根据权利要求1、2、3或4的化合物的组合。
10.一种用于制备如在权利要求1中所述的化合物的方法，其特征在于
a)使式(II)的中间体与式(III)的中间体反应，其中W为适当的离去基团，比如例如卤素，
b)在处于适当的溶剂中的氢化铝锂的存在下，将式(IV)的中间体转化成式(I)的化合物，其中p为1，本文称为式(I-a)的化合物，
c)在适当的溶剂中，在适当的试剂的存在下，使适当的式(VI)的醛与式(V)的中间体反应，或者
d)使式(II)的中间体与适当的式(VII)的醛反应，形成其中t为1的式(I)的化合物，本文中称为式(I-b)的化合物，
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