BRPI0709077A2 - derivados de alquilaminas cìclicas como inibidores da interação entre mdm2 e p53 - Google Patents

Abstract

DERIVADOS DE ALQUILAMINAS CìCLICAS COMO INIBIDORES DA INTERAçãO ENTRE MDM2 E p53. A presente invenção refere-se a compostos de fórmula (I), a sua aplicação como inibidor de uma interação de p53-MDM2, assim como composições farmacêuticas compreendendo os compostos de fórmula (I), em que n, m, p, t, R^ 1^, R^ 2^, R^ 3^, R^ 4^, R^ 5^, R^ 6^, R^ 7^, Q, Y e Z têm os significados definidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOS DE ALQUILAMINAS CÍCLICAS COMO INIBIDORES DA INTERAÇÃO EN- TRE MDM2 E p53".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a compostos e a composições contendo os compostos que atuam como inibidores da interação entre MDM2 e p53. Além disso, a presente invenção fornece processos para a preparação dos inibidores descritos, composições que os compreendem e métodos de usá-los, por exemplo, como um medicamento. p53 é uma proteína supressora de tumor, que desempenha um papel crucial na regulação do equilíbrio entre a proliferação celular e o arres- to de crescimento celular/apoptose. Sob condições normais, a meia-vida de p53 é muito curta e, conseqüentemente o nível de p53 nas células é baixo. No entanto, em resposta à lesão de DNA celular ou ao estresse celular (por exemplo, ativação de oncogene, erosão de telômero, hipoxia), os níveis de p53 aumentam. Esse aumento nos níveis de p53 conduz à ativação da transcrição de inúmero genes, que impele a célula ou para o arresto do crescimento ou para o processo de apoptose. Portanto, uma função impor- tante de p53 é evitar a proliferação não controlada de células Iesionadas e, portanto, proteger o organismo do desenvolvimento de câncer.

MDM2 é um regulador negativo-chave da função p53. Ela forma um laço auto-regulatório negativo por ligação ao domínio de transativação terminal de p53 e, portanto, MDM2 tanto inibe a capacidade de p53 para ati- var a transcrição quanto aponta para p53 para a degradação proteolítica. Sob condições normais, esse laço regulatório é responsável por manter os baixos níveis de p53. Entretanto, em tumores com p53 do tipo selvagem, a concentração de equilíbrio de p53 ativa pode ser aumentada por antagonis- mo da interação entre MDM2 e p53. Isso resultará na restauração dos efei- tos pró-apoptóticos e antiproliferativos mediados por p53 em tais células de tumor.

MDM2 é um proto-óncogene celular. A superexpressão de MDM2 tem sido observada em uma gama de cânceres. MDM2 é superex- presso em uma variedade de tumores devido à amplificação de gene ou a transcrição ou tradução aumentadas. O mecanismo pelo qual a amplificação de MDM2 promove a gênese de tumor está pelo menos relacionado a sua interação com p53. Em células que superexpressem MDM2, a função prote- tora de p53 está bloqueada e, portanto, as células são incapazes de respon- der à lesão ao DNA ou ao estresse celular por aumento dos níveis de p53, conduzindo ao arresto do crescimento celular e/ou à apoptose. Portanto, depois da lesão ao DNA e/ou do estresse celular, as células que superex- pressam MDM2 estão livres para continuarem a se proliferar e para assumir um fenótipo gerador de tumor. Sob essas condições, a interrupção da intera- ção de p53 e MDM2 liberaria a p53 e, portanto, permitiria que sinais normais de arresto de crescimento e/ou de apoptose funcionassem.

MDM2 também pode ter funções separadas, em adição à inibi- ção de p53. Por exemplo, mostrou-se que MDM2 interage diretamente com o fator de transcrição regulado por pRb E2F1/DP1. Essa interação poderia ser crucial para as atividades oncogênicas independentes de p53 de MDM2. Um domínio de E2F1 mostra espantosa similaridade com relação ao domínio de ligação de MDM2 de p53. Uma vez que as interações de MDM2 tanto com p53 quanto com E2F1 se localizam no mesmo sítio de ligação em MDM2, pode ser esperado que antagonistas de MDM2/p53 não somente ativarão p53 celular, mas, também modulam atividades de E2F1, que estão comumente desreguladas em células de tumores.

Também a eficácia terapêutica de agentes que Iesionam o DNA atualmente usados (quimioterapia e radioterapia), pode ser limitada através da regulação negativa de p53 por MDM2. Portanto, se a inibição por retroa- limentação de MDM2 de p53 for interrompida, um aumento dos níveis de p53 funcionais aumentará a eficácia terapêutica de tais agentes por restau- ração da função de p53 de tipo selvagem, que conduz à apoptose e/ou à reversão de resistência à fármaco associada à p53. Foi demonstrado que combinando-se tratamentos de inibição de MDM2 e de lesão ao DNA in vivo se conduziu a efeitos antitumor sinergísticos (Vousden K.H., Cell, Vol. 103 , 691 -694, 2000). Portanto, a interrupção da interação de MDM2 e de p53 oferece uma abordagem para intervenção terapêutica em tumores com p53 do tipo selvagem, poderia mesmo exibir efeitos antiproliferativos em células de tu- mor que sejam desprovidas de p53 funcional, e, além disso, que possam sintetizar células geradoras de tumor para quimioterapia e radioterapia.

Antecedentes da Invenção

O documento japonês de número 11130750, publicado em 18 de maio de 1999, entre outros, descreve derivados de fenilaminocarbonilindolila como antagonistas de receptor 5-HT.

O documento europeu de WO número 129074, publicado em 18 de maio de 2000, descreve amidas de ácido antranílico como inibidores de receptores de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) e úteis no tratamento de distúrbios angiogênicos.

O documento europeu de número 1317443, publicado em 21 de março de 2002, descreve derivados de amina terciária tricíclicos, úteis como receptor de quimiocina CXCR4 ou moduladores de CCR5 para o tratamento de vírus de imunodeficiência humana e de vírus de imunodeficiência felina.

O documento europeu de número 1379239, publicado em 10 de outubro de 2002, descreve N-(2-ariletil) benzilaminas como antagonistas do receptor 5-HT6. O documento de número WO 00/15537, publicado em 23 de março de 2000, fornece derivados de piperazina-4-fenila como inibidores da interação entre MDM2 e p53. O documento europeu de número 1137418, publicado em 8 de junho de 2000, fornece compostos tricíclicos para a res- tauração da estabilidade conformacional de uma proteína da família de p53.

O documento europeu de número 1443937, publicado em 22 de maio de 2003, descreve 1,4-benzodiazepinas e as suas aplicações como inibidores das interações MDM2-p53.

O documento de número 1458380, publicado em 26 de junho de 2003, fornece cis-2,4,5-trifenil-imidazolonas que inibem a interação de prote- ína de MDM2 com peptídeos semelhantes a p53 e têm atividade antiprolife- rativa. O documento de número 1519932, publicado em 15 de janeiro de 2004, descreve compostos de bisarilsulfonamida que se ligam a MDM2 e que podem ser usados em terapia contra o câncer.

Continua a existir uma demanda por moléculas pequenas efica- zes e potentes, que inibam as interações entre MDM2 e p53.

Os compostos da presente invenção diferem daquelas da técni- ca anterior em estrutura, em sua atividade farmacológica e/ou em potência farmacológica.

Descrição da Invenção

A presente invenção fornece compostos, composições para, e métodos de, inibição das interações entre MDM2 e p53 para o tratamento do câncer. Além disso, os compostos e as composições da presente invenções são úteis em intensificar a eficácia de quimioterapia e de radioterapia.

Essa invenção refere-se a compostos de fórmula (I),

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uma forma de N-óxido, um sal de adição ou uma forma estereoquimicamen- te isomérica dos mesmos, na qual

m é O, 1 ou 2 e, quando m for O, então uma ligação direta é pretendida;

η é O, 1, 2 ou 3 e, quando η for O, então, uma ligação direta é pretendida;

ρ é O ou 1 e, quando ρ for O, então, uma ligação direta é pretendida;

t é O ou 1, e, quando t for O, então, uma ligação direta é pretendida;

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-CR8=C< e, então, a linha tracejada é uma ligação, -C(=0)-CH<, -C(=0)-N<, -CHR8-Chk ou -CHR8-N<; sendo que cada R8, independente- mente, é hidrogênio ou C1-C6-alquila;

R1 e R2 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidrogê- nio, halo, C1-C6-alquila, C1-C6-alquilóxi, aril-C1-C6-alquilóxi, heteroaril-C1-C6- alquilóxi, feniltio, hidróxi-C1-C6-alquilcarbonila, CrC6-alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de amino, arila, heteroarila; ou C3-C7- cicloalquila substituída com um substituinte selecionado a partir de amino, arila e heteroarila;

R3 e R4 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidrogê- nio, halo, C1-C6-alquila, polihalo-C1-C6-alquila, ciano, ciano-C1-C6-alquila, hidróxi, amino ou C1-C6-alquilóxi; ou

R4 e R5, em conjunto, podem opcionalmente formar um radical bivalente se- lecionado a partir de metilenodióxi ou etilenodióxi; R5 é hidrogênio, C1-C6-alquiloxicarbonila ou C1-C6-alquila; R6 e R7 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidrogê- nio, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila ou C1-C6-alquila; ou R6 e R7, em conjunto, podem opcionalmente formar um radical bivalente se- lecionado a partir de

-(CH2)2-O-(CH2)2- (b-1),

-(CH2)2-NR9-(CH2)2- (b-2),

em que R9 é hidrogênio, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila ou C1-C6-alquila; Z é um radical selecionado a partir de

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nos quais: R10 e R11 são, cada um independentemente selecionados, a partir de hidro- gênio, halo, hidróxi, amino, C1-C6-alquila, nitro, polihalo-C1-C6-alquila, ciano, ciano-C1-C6-alquila, tetrazolo-C1-C6-alquila, arila, heteroarila, aril-C1-C6- alquila, heteroaril-C1-C6-alquila, aril (hidróxi) C1-C6-alquila, heteroaril (hidróxi) C1-C6-alquila, arilcarbonila, heteroarilcarbonila, C1-C6-alquilcarbonila, aril-Cr C6-alquilcarbonila, heteroaril-C1-C6-alquilcarbonila, C1-C6-alquilóxi, C3-C7- cicloalquilcarbonila, C3-C7-cicloalquil (hidróxi) C1-C6-alquila, aril-C1-C6- alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6- alquilcarbonilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquiloxicarbonil-C1-C6-alquilóxi-C1-C6- alquila, hidróxi-C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquiloxicarbonil-C1-C6- alquenila, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquiloxicarbonila, C1-C6- alquilcarbonilóxi, aminocarbonila, hidróxi-C1-C6-alquila, amino-C1-C6-alquila, hidroxicarbonila, hidroxicarbonil-C1-C6-alquila e -(CH2)v-(C(=0)r)-(CHRl7)u- NR13R14; em que

v é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e, quando ? for 0, então, uma ligação direta é preten- dida;

r é 0 ou 1, e, quando r for 0, então, uma ligação direta é pretendida; u é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e, quando u for 0, então, uma ligação direta é preten- dida;

R17 é hidrogênio ou C1-C6-alquila;

R12 é hidrogênio, C1-C6-alquila, C3-C7-CiCloalquila, C1-C6-alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, amino, C1-C6-alquilóxi e arila; ou C3-C7-cicloalquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, amino, arila e C1-C6-alquilóxi;

R13 e R14 são, cada um independentemente, selecionado a partir de hidro- gênio, C1-C12-alquila, C1-C6-alquilcarbonila, C1-C6-alquilsulfonila, aril-C1-C6- alquilcarbonila, C3-C7-cicloalquila, C3-C7-cicloalquilcarbonila, -(CH2)k- NR15R16, C1-12-alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, hidroxicarbonila, ciano, C1-C6-alquiloxicarbonila, C1-C6-alquilóxi, arila ou heteroarila; ou C3-C7-cicloalquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, C1-C6-alquilóxi, arila, amino, aril-C1-C6- alquila, heteroarila ou heteroaril-C1-C6-alquila; ou R13 e R14, em conjunto com o nitrogênio ao qual eles estão ligados, podem opcionalmente formar uma morfolinila, piperidinila, pirrolidinila, piperazinila ou piperazinila substituída com um substituinte selecionado a partir de Cr C6-alquila, aril-C1-C6-alquila, anl-C1-C6-alquiloxicarbonila, heteroaril-C1-C6- alquila, C3-C7-cicloalquila e C3-C7-cicloalquil-C1-C6-alquila; em que k é O, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, e, quando k for O, então, uma ligação direta é pre- tendida;

R15 e R16 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidro- gênio, C1-C6-alquila, aril- C1-C6 -alquiloxicarbonila, C3-C7-cicloalquila, C1-C12- alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, C1-C6- alquilóxi, arila e heteroarila; e C3-C7-CiCloalquila substituída com um substitu- inte selecionado a partir de hidróxi, CrC1-C61-C6-alquilóxi, arila, aril-CrC6-alquila, heteroarila, e heteroaril-C1-C6-alquila; ou

R15 e R16, em conjunto com o nitrogênio ao qual eles estão ligados, podem C1-C6opcionalmente formar uma morfolinila, uma piperazinila ou uma piperazinila substituída com CrC6-alquiloxicarbonila; arila é fenila ou naftalenila;

cada fenila ou naftalenila pode opcionalmente estar substituída com um, dois ou três substituintes cada um independentemente selecionados a partir de halo, hidróxi, C1-C6-alquila, amino, polihalo-C1-C6-alquila e C1-C6-alquilóxi; e cada fenila ou naftalenila pode opcionalmente estar substituída com um radi- cal bivalente selecionado a partir de metilenodióxi e etilenodióxi; heteroarila é piridinila, indolila, quinolinila, imidazolila, furanila, tienila, oxadi- azolila, tetrazolila, benzofuranila ou tetrahidrofuranila; cada piridinila, indolila, quinolinila, imidazolila, furanila, tienila, oxadiazolila, tetrazolila, benzofuranila ou tetrahidrofuranila pode opcionalmente estar substituída com um, dois ou três substituintes cada um independentemente selecionado a partir de halo, hidróxi, C1-C6-alquila, amino, polihalo-C1-C6- alquila, arila, aril-C1-C6-alquila ou C1-C6-alquilóxi; e cada piridinila, indolila, quinolinila, imidazolila, furanila, tienila, benzofuranila ou tetrahidrofuranila pode opcionalmente estar substituída com um radical bivalente selecionado a partir de metilenodióxi ou etilenodióxi. Os compostos de fórmula (I) também pode existir em suas for- mas tautoméricas. Pretende-se que tais formas, embora não explicitamente indicadas na fórmula acima, estejam incluídas dentro do escopo da presente invenção.

Inúmeros termos usados nas definições anteriores e nas partes que se seguem são explicadas aqui abaixo. Esses termos são, algumas ve- zes, usados como tais ou em termos compostos.

Conforme usado nas definições anteriores e nas partes que se seguem, halo refere-se genericamente a flúor, cloro, bromo e iodo; CrC6- alquila define radicais de hidrocarboneto saturado de cadeia linear e ramifi- cada tendo desde 1 a 6 átomos de carbono, tais como, por exemplo, metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, 1-metiletila, 2-metilpropila, 2-metil-butila, 2-metilpentila e os similares; hidróxi-CrC6-alquila define um substituinte de hidróxi em radicais de hidrocarboneto saturados de cadeia linear e ramifica- da tendo desde 1 a 6 átomos de carbono; tri-halometila define metila con- tendo três substituintes de halo iguais ou diferentes, por exemplo, trifluoro- metila; C3-C7-cicloalquila inclui grupos hidrocarboneto cíclicos tendo desde 3 a 10 átomos de carbono, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo- pentenila, ciclohexila, ciclo-hexenila, ciclo-heptila e os similares.

O termo "sal de adição" compreende os sais que os compostos de fórmula (I) sejam capazes de formar com bases orgânicas ou inorgânicas, tais como aminas, bases de metais alcalinos e bases de metais alcalino- terrosos, ou bases de amônio quaternário, ou com ácidos orgânicos ou inor- gânicos, tais como ácidos minerais, ácidos sulfônicos, ácidos carboxílicos ou ácidos contendo fósforo.

O termo "sal de adição" compreende adicionalmente sais farma- ceuticamente aceitáveis, complexos com metais e solvatos e os seus sais, que os compostos de fórmula (I) sejam capazes de formar.

O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" significa sais de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitáveis. Entende-se que os sais de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitáveis, conforme mencionados acima, compreendem as formas de sal de adição de ácido não tóxico e de base não tóxica terapeuticamente ativos, que os compostos de fórmula (I) sejam capazes de formar. Os compostos de fórmula (I), que têm propriedades básicas, podem ser convertidos em seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, por tratamento da forma de base com um ácido apropriado. Ácidos apropriados compreendem, por exemplo, áci- dos inorgânicos, tais como ácidos halogenídricos, por exemplo, ácido clorí- drico ou bromídrico; sulfúrico; nítrico, fosfórico e os ácidos similares; ou áci- dos orgânicos, tais como, por exemplo, acético, propanóico, hidróxi-acético, láctico, pirúvico, oxálico, malônico, succínico (isto é, ácido butanodióico), maléico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, etanossulfôni- co, benzenossulfônico, p-toluenossulfônico, ciclâmico, salicílico, p-amino- salicílico, pamóico e os ácidos similares.

Os compostos de fórmula (I), que tenham propriedades ácidas, podem ser convertidos em seus sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis, por tratamento da forma de ácido com uma base orgânica ou i- norgânica adequada. Formas de sal de base apropriadas compreendem, por exemplo, os sais de amônio, os sais de metais alcalinos ou de metais alcali- no-terrosos, por exemplo, os sais de lítio, sódio, potássio, magnésio, cálcio e os similares, sais com bases orgânicas, por exemplo, os sais de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, e sais com aminoácidos, tais como, por exemplo, arginina, Iisina e os similares.

Os termos "sal de adição de ácido ou base" também compreen- de os hidratos e as formas de adição de solvente, que os compostos de fór- mula (I) sejam capazes de formar. Exemplos de tais formas são, por exem- pio, hidratos, alcoolatos e os similares.

O termo "complexos com metais" significa um complexo formado entre um composto de fórmula (I) e um ou mais sal ou sais de metais orgâni- cos ou inorgânicos. Exemplos dos sais orgânicos ou inorgânicos compreen- dem os halogenetos, nitratos, sulfatos, fosfatos, acetatos, trifluoroacetatos, tricloroacetatos, propionatos, tartaratos, sulfonatos, por exemplo, metilsulfo- natos, 4-metilfenilsulfonatos, salicilatos, benzoatos e os similares, dos metais do segundo grupo principal do Sistema Periódico, por exemplo, os sais de magnésio ou de cálcio, ou do terceiro ou do quarto grupos principais, por exemplo, alumínio, estanho, chumbo, assim como do primeiro ao oitavo gru- pos de transição do sistema periódico, tais como, por exemplo, cromo, man- ganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco e os similares.

O termo "formas estereoquimicamente isoméricas de compostos de fórmula (I)", conforme usados anteriormente aqui, define todos os com- postos possíveis constituídos pelos mesmos átomos ligados pela mesma seqüência de ligações, mas, tendo diferentes estruturas tridimensionais, os quais não são intercambiáveis, que os compostos de fórmula (I) possam possuir. A menos se mencionado ou indicado de outra maneira, a designa- ção química de um composto engloba a mistura de todas as formas estereo- quimicamente isoméricas possíveis que o composto possa possuir. A mistu- ra pode conter todos os diastereômeros e/ou enanciômeros da estrutura mo- lecular básica do composto. Pretende-se que todas as formas estereoquimi- camente isoméricas dos compostos de fórmula (I), tanto em forma pura quanto em mistura um com os outros sejam englobadas dentro do escopo da presente invenção.

De especial interesse são aqueles compostos de fórmula (I), que sejam estereoquimicamente puros.

Formas estereoisoméricas puras dos compostos e dos interme- diários, conforme mencionadas aqui, são definidas como isômeros substan- cialmente livres de outras formas enancioméricas ou diastereoméricas da mesma estrutura molecular básica dos compostos ou dos intermediários. Em particular, o termo "estereoisomericamente puros" refere-se a compostos ou a intermediários tendo um excesso estereoisomérico de pelo menos 80% (isto é, no mínimo 90% de um isômero e no máximo 10% dos outros possí- veis isômeros) até um excesso estereoisomérico de 100% (isto é, de um i- sômero de nenhum dos outros), mais particularmente, compostos ou inter- mediários tendo um excesso estereoisomérico de 90% até 100%, ainda mais particularmente tendo um excesso estereoisomérico de 94% até 100% e muitíssimo em particular tendo um excesso estereoisomérico de 97% até 100%. Os termos "enanciomericamente puro" deve ser entendido de uma maneira similar, mas, então, levando-se em consideração ao excesso enan- ciomérico, respectivamente, o excesso diastereomérico da mistura em ques- tão.

Entende-se que as formas tautoméricas dos compostos de fór- mula (I) compreendam aqueles compostos de fórmula (I), na qual, por e- xemplo, um grupo enol é convertido em um grupo ceto (tautomerismo ceto- enólico).

Entende-se que as formas de N-óxido dos compostos de fórmula (I) compreendam aqueles compostos de fórmula (I), na qual um ou vários átomos de nitrogênio são oxidados para formar os assim chamados N- óxidos, particularmente, aqueles N-óxidos, nos quais um ou mais dos nitro- gênios de piperidina, piperazina ou piridazinila estão N-oxidados.

Os compostos de fórmula (I) podem ser convertidos às formas dos N-óxidos correspondentes seguindo procedimentos conhecidos na téc- nica para conversão de um nitrogênio trivalente em sua forma de N-óxido. A reação de N-oxidação, em geral, ser realizada por reação do material de par- tida de fórmula (I) com um peróxido orgânico ou inorgânico apropriado. Pe- róxidos inorgânicos apropriados compreendem, por exemplo, peróxido de hidrogênio, peróxidos de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, por exemplo, peróxido de sódio, peróxido de potássio; peróxidos orgânicos a- propriados podem compreender peróxi-ácidos, tais como, por exemplo, áci- do benzenocarboperoxóico ou ácido benzenocarboperoxóico substituído com halo, por exemplo, ácido 3-clorobenzenocarboperoxóico, ácidos pero- xoalcanóicos, por exemplo, ácido peroxoacético, hidroperóxidos de alquila, por exemplo, hidroperóxido de t-butila. Solventes adequados são, por exem- plo, água, álcoois inferiores, por etanol e os similares, hidrocarbonetos, por exemplo, tolueno, cetonas, por exemplo, 2-butanona, hidrocarbonetos halo- genados, por exemplo, diclorometano, e misturas de tais solventes.

Pretende-se que a presente invenção inclua quaisquer isótopos de átomos presentes nos compostos da invenção. Por exemplo, isótopos de hidrogênio incluem trítio e deutério e isótopos de carbono incluem C-13 e Ο- 14. Sempre que usado nas partes que se seguem, o termo "compos- tos de fórmula (I)" pretende incluir também as formas de N-óxido, os sais de adição de ácido ou de base farmaceuticamente aceitáveis e todas as formas estereoisoméricas.

Um primeiro grupos de compostos de interesse consiste naque- les compostos de fórmula (I), na qual uma ou mais das seguintes restrições se aplicam:

a) m é 0;

b) η é 2;

c) ρ é 1;

d) t é 0;

e) —é -CH=C<;

f) R1 e R2 são, cada um independentemente, hidrogênio;

g) R3 e R4 são, cada um independentemente, hidrogênio;

h) R5 é hidrogênio;

i) R6 e R7 são, cada um independentemente, hidrogênio ou CrC6-alquila; j) Z é um radical selecionado a partir de (a-1), (a-2) ou (a-4); or k) R10 e R11 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hi- drogênio, hidróxi, CrC6-alquiloxicarbonila ou hidróxi-C1-C6-alquila.

Um segundo grupo de compostos de interesse consiste naque- les compostos de fórmula (I) e naqueles compostos do primeiro grupo de compostos de interesse, na qual uma ou mais das seguintes restrições se aplicam:

a) m é 0;

b) η é 2;

c) ρ é 1 ;

d) t é 0;

e) é -CH=C<;

f) R1 e R2 são, cada um independentemente, hidrogênio;

g) R3 e R4 são, cada um independentemente, hidrogênio;

h) R5 é hidrogênio;

i) R6 e R7 são, cada um independentemente, hidrogênio; j) Z é um radical selecionado a partir de (a-2) ou (a-4); ou

k) R10 e R11 são, em cada caso, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi or hidróxi-C1-C6-alquila.

Um grupo de compostos preferidos consiste naqueles compos- tos de fórmula (I) ou em qualquer seu subgrupo, em que m é 0; η é 0; ρ é 1; t é 0; R1 e R2 são, cada um independentemente, hidrogênio; R3 e R4 são, ca- da um independentemente, hidrogênio; R5 é hidrogênio; R6 e R7 são, cada um independentemente, hidrogênio ou C1-C6-alquila; Z é um radical selecio- nado a partir de (a-1), (a-2) ou (a-4); ou R10 e R11 são, cada um independen- temente, selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi, C1-C6- alquiloxicarbonila ou hidróxi-C1-C6-alquila.

Um grupo de compostos mais preferidos consiste naqueles compostos de fórmula (I) ou em qualquer seu subgrupo, em que m é 0; η é 0; ρ é 1 ; t é 0; R1 e R2 são, cada um independentemente, hidrogênio; R3 e R4 são, cada um independentemente, hidrogênio; R5 é hidrogênio; R6 e R7 são, cada um independentemente, hidrogênio; Z é um radical selecionado a partir de (a-2) ou (a-4); ou R10 e R11 são, cada um independentemente, sele- cionados a partir de hidrogênio, hidróxi ou hidróxi-C1-C6-alquila.

Os compostos muitíssimo preferidos são o composto N° 1, o composto N- 2 e o composto Ne 5.

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Os compostos de fórmula (I), seus sais farmaceuticamente acei- táveis e suas formas de N-óxido e estereoquimicamente isoméricas podem ser preparados de maneira convencional. Os materiais de partida e alguns dos intermediários são compostos conhecidos e estão comercialmente dis- poníveis ou podem ser preparados de acordo com procedimentos de reação convencionais, conforme é em geral conhecido na técnica.

Inúmeros tais métodos de preparação serão descritos nas partes que se seguem em mais detalhes. Outros métodos para a obtenção de com- postos finais de fórmula (I) são descritos nos Exemplos.

Os compostos de fórmula (I) podem ser preparados por reação de um intermediário de fórmula (II) com um intermediário de fórmula (III), em que W é um grupo de saída adequado, tal como, por exemplo, halo, por e- xemplo, flúor, cloro, bromo ou iodo, ou um radical sulfonilóxi, tal como metil- sulfonilóxi, 4-metilfenilsulfonilóxi e os similares. A reação pode ser realizada em um solvente inerte à reação, tais como, por exemplo, um álcool, por e- xemplo, metanol, etanol, 2-metóxi-etanol, propanol, butanol e os similares; um éter, por exemplo, 4,4-dioxano, 1,1'-oxibispropano e os similares; uma cetona, por exemplo, 4-metil-2-pentanona; ou Ν,Ν-dimetilformamida, nitro- benzeno, acetonitrila, ácido acético e os similares. A adição de uma base apropriada, tal como, por exemplo, um carbonato ou hidrogeno carbonato de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso, por exemplo, trietilamina ou car- bonato de sódio, pode ser utilizada para se capturar o ácido que é liberado durante o curso da reação. Uma pequena quantidade de um iodeto de metal apropriado, por exemplo, iodeto de sódio ou de potássio, pode ser adiciona- do para promover a reação. A agitação pode intensificar a velocidade de re- ação. A reação pode ser realizada, de maneira conveniente, em uma tempe- ratura variando entre a temperatura ambiente e a temperatura de refluxo da mistura de reação e, se desejado, a reação pode ser realizada em uma pressão aumentada. <formula>formula see original document page 16</formula>

Os compostos de fórmula (I), na qual ρ é 1, aos quais refere-se aqui como compostos de fórmula (1-a), podem ser preparados por conversão de intermediários de fórmula (IV) com hidreto de alumínio e lítio, em um sol-

Os compostos de fórmula (l-a) também podem ser preparados por reação de um carboxaldeído apropriado de fórmula (VI), com um inter- mediário de fórmula (V), na presença de um reagente apropriado, tal como um boro-hidreto de sódio, por exemplo, tetrahidroborato de sódio ou cianotri- idroborato suportado por polímero, em um solvente adequado, tal como um álcool, por exemplo, metanol. <formula>formula see original document page 17</formula>

De uma maneira idêntica, os compostos de fórmula (I), nos quais t é 1, os quais refere-se aqui como compostos de fórmula (l-b), podem ser preparados por reação de um intermediário de fórmula (II), com um carbo- xaldeído apropriado de fórmula (VII).

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Os compostos de fórmula (I) também podem ser convertidos uns nos outros, via reações conhecidas na técnica ou transformações de grupos funcionais. Inúmeras de tais concentrações já são descritas aqui, acima. Ou- tros exemplos são hidrólise de ésteres carboxílicos para formar o ácido car- boxílico correspondente ou álcool; hidrólise de amidas para formar os ácidos carboxílicos correspondentes ou aminas; hidrólise de nitrilas para formar as amidas correspondentes; grupos amino em imidazol ou fenila, podem ser substituídos por um hidrogênio por reações de diazotização conhecidas na técnica e substituição subseqüente do grupo diazo por hidrogênio; álcoois podem ser convertidos em ésteres ou éteres; aminas primárias podem ser convertidas em aminas secundárias ou terciárias; ligações duplas podem ser hidrogenadas à ligação simples correspondente; um radical de iodo em um grupo fenila pode ser convertido em um grupo éster por inserção de monóxi- do de carbono, na presença de um catalisador de paládio adequado.

Os intermediários de fórmula (V), na qual m é O, aos quais refe- re-se aqui como intermediários de fórmula (V-a), podem ser preparados por conversão de um intermediário de fórmula (VIII) com hidrato de hidrazina, em um solvente adequado, tal como metanol.

Os intermediários de fórmula (V-a) também podem ser prepara- dos por uma reação de nitro a amina, partindo-se de um intermediário de fórmula (XVI), na presença de um catalisador de metal, tal como Níquel de Raney, e um redutor adequado, tal como hidrogênio, em um solvente ade- quado, tal como metanol ou etanol.

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Os intermediários de fórmula (X) podem ser preparados por rea- ção de um intermediário de fórmula (XI) com um intermediário de fórmula (XII), na presença de reagentes apropriados, tais como N'-(etilcarbonimidoil)- N,N-dimetil-1,3-propanodiamina, monocloridrato (EDC) e 1 -hidróxi-1 H- benzotriazol (HOBT). A reação pode ser realizada na presença de uma ba- se, tal como trietilamina, em um solvente adequado, tal como uma mistura de diclorometano e tetraidrofurano. <formula>formula see original document page 19</formula>

Os intermediários de fórmula (VI) podem ser preparados por re- ação de intermediários de fórmula (XIII) com hidreto de alumínio e lítio, em um solvente adequado, tal como tetraidrofurano.

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Os intermediários de fórmula (VIII) (idem para intermediários de fórmula (XVI)), nas quais t é O, aos quais refere-se aqui como intermediários de fórmula (VIII-a), podem ser preparados por reação de um intermediário de fórmula (IX) com um intermediário de fórmula (XIV), na qual L é um grupo de saída apropriado, tal como, por exemplo, halo, por exemplo, flúor, cloro, bromo ou iodo, ou C1-C6-alquilóxi, por exemplo, metilóxi, na presença de uma solução de cloridrato em 2-propanol, em um solvente inerte à reação, tal como N,N-dimetilformamida.

<formula>formula see original document page 19</formula> Os intermediários de fórmula (IX), na qual R6 e R7 são ambos hidrogênio, aos quais refere-se aqui como intermediários de fórmula (IX-a), podem ser preparados por conversão de um intermediário de fórmula (XV), na presença de cianoboro-hidreto de sódio. A reação pode ser realizada em um solvente inerte à reação, tal como, por exemplo, ácido acético.

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Os compostos de fórmula (I) e alguns dos intermediários pode ter pelo menos um centro estereogênico em sua estrutura. Tal centro este- reogênico pode estar presente em uma configuração R ou S.

Alguns dos compostos de fórmula (I) e alguns dos intermediários na presente invenção podem conter um átomo de carbono assimétrico. For- mas isoméricas estereoquimicamente puras dos compostos e dos intermedi- ários podem ser obtidas pela aplicação de procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, diastereoisômeros podem ser separados por métodos físicos, tais como cristalização seletiva ou técnicas cromatográficas, por e- xemplo, distribuição em contra-corrente, cromatografia líquida e os métodos similares. Enanciômeros podem ser obtidos a partir de misturas racêmicas, primeiro, por conversão das misturas racêmicas com agentes de resolução adequados, tais como, por exemplo, ácidos quirais, para formar misturas de sais ou de compostos diastereoméricos; então, separando-se fisicamente as misturas de sais ou de compostos diastereoméricos, por exemplo, por crista- lização seletiva, cromatografia fluida supercrítica ou técnicas cromatográfi- cas, por exemplo, cromatografia líquida e os métodos similares; e, finalmen- te, por conversão dos sais ou dos compostos diastereoméricos separados nos enanciômeros correspondentes. Formas isoméricas estereoquimicamen- te puras também podem ser obtidas a partir das formas isoméricas estereo- quimicamente puras dos intermediários e materiais de partida apropriados, contanto que as reações intervenientes ocorram de maneira estéreo- específica. Os compostos de fórmula (I), os seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e suas formas estereoisoméricas têm valiosas propriedades farmacológicas pelo fato de que eles inibem a interação entre p53 e MDM2.

O termo "MDM2" é usado aqui a significar uma proteína obtida como um resultado de expressão do gene mdm2. Dentro do significado des- se termo, MDM2 engloba todas as proteínas codificadas por mdm2, seus mutantes, suas proteínas de corte alternativas e suas proteínas fosforiladas. Adicionalmente, conforme usado aqui, o termo "MDM2" inclui análogos de MDM2, por exemplo, MDMX, também conhecido como MDM4, e homólogos de MDM2 e análogos de outros animais, por exemplo, a HDM2 homóloga humana ou a HDMX análoga humana.

O termo "inibindo a interação" ou "inibidor da interação" é usado aqui a significar a prevenção ou a redução da associação direta ou indireta de uma ou mais moléculas, peptídeos, proteínas, enzimas ou receptores; ou a prevenção ou a redução da atividade normal de uma ou mais moléculas, peptídeos, proteínas, enzimas ou receptores.

O termo "inibidor da interação de p53 com MDM2" ou "inibidor de p53-MDM2" é usado aqui a descrever um agente que aumente a expres- são de p53 no ensaio descrito em C.1. Esse aumento pode ser causado por, mas, não está limitado a, um ou mais dos seguintes mecanismos de ação:

- inibição da interação entre p53 e MDM2;

- associação direta ou com a proteína de MDM2 ou com a proteína de p53;

- interações com alvos à montante ou à jusante, por exemplo, quinases, ou atividades enzimáticas envolvidas em ubiquitinação ou na modificação SU- MO;

- seqüestro ou transporte de MDM2 e p53 em diferentes compartimentos celulares;

- modulação de proteínas que se associem com MDM2, por exemplo (mas, não limitadas a), p73, E2F-1, Rb, p21 wafl ou cip 1;

- regulação à jusante ou interferência com a expressão de MDM2 e/ou a ati- vidade de MDM2, por exemplo (mas, não limitado a), impacto em sua Iocali- zação celular, modificação após a tradução, exportação nuclear ou atividade de ubiquitina quinase;

- estabilização direta ou indireta da proteína p53, por exemplo, mantendo-a em sua forma estrutural funcional, ou evitando-se o seu dobramento indevi- do;

- intensificação da expressão de p53 ou a expressão de membros da família de p53, por exemplo, de p63 e de p73;

- aumento de atividade de p53, por exemplo, por (mas, não limitado a), in- tensificação de sua atividade transcricional e/ou

- aumento da expressão de genes e proteínas da via de sinalização de p53, por exemplo (mas, não limitado a), p21waf1, cipl, MIC-1 (GDF-15), PIG-3 e ATF-3.

Portanto, a presente invenção descreve os compostos de fórmu- la (I) para uso como um medicamento.

Além disso, a invenção também diz refere-se à aplicação de um composto para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio mediado através da interação de p53-MDM2, em que o composto é um composto de fórmula (I).

O termo "tratar" ou "tratamento", conforme usado aqui cobre qualquer tratamento de uma doença e/ou condição em um animal, particu- larmente um ser humano, e inclui: (i) a prevenção de uma doença e/ou con- dição de ocorrer em um sujeito que possa estar predisposto à doença e/ou à condição, mas, que não tenha sido ainda diagnosticada como a tendo; (ii) a inibição da doença e/ou da condição, isto é, causando a regressão da doen- ça e/ou da condição.

Com o termo "um distúrbio mediado por meio de uma interação p53-MDM2" entende-se qualquer condição indesejada ou prejudicial, que resulte na ou da inibição da interação entre a proteína de MDM2 e p53 ou outras proteínas celulares, que induzam apoptose, induzam a morte celular ou regulem o ciclo celular.

Esta invenção também fornece um método para o tratamento de um distúrbio mediado por meio de uma interação p53-MDM2, por adminis- tração de uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, a um indivíduo, por exemplo, um mamífero (e mais particularmente, a um ser humano) que necessite de um tal tratamento.

Os compostos da invenção podem ter efeitos antiproliferativos em células de tumor, mesmo se tais células estiverem desprovidas de p53 funcional. Mais particularmente, os compostos da invenção têm efeito anti- proliferativo em tumores com p53 de tipo selvagem e/ou em tumores que superexpressem MDM2. Portanto, essa invenção também fornece um méto- do para a inibição de crescimento de tumor por administração de uma quan- tidade eficaz de um composto da presente invenção, a um indivíduo, por e- xemplo, um mamífero (e mais particularmente, um ser humano) que necessi- te de um tal tratamento.

Exemplos de tumores que podem ser inibidos, mas, que não es- tão limitados a, são câncer de pulmão (por exemplo, adenocarcinoma e in- cluindo câncer de não células pequenas), cânceres pancreáticos (por exem- plo, carcinoma pancreático, tal como, por exemplo, carcinoma pancreático exócrino), cânceres de cólon (por exemplo, carcinomas colo-retais, tais co- mo, por exemplo, adenocarcinoma de cólon e adenoma de cólon), câncer esofágico, carcinoma escamoso oral, carcinoma de língüa, carcinoma gástri- co, carcinoma naso-faringeano, tumores hematopoiéticos ou de linhagem linfóide (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, Iinfoma de células B, Iinfo- ma de Burkitt), Iinfoma não Hodgkin, Doença de Hodgkin, Ieucemias mielói- des (por exemplo, leucemia mielógena aguda (AML)), câncer folicular de tireóide, síndrome mielodisplásica (MDS), tumores de origem mesenquimal (por exemplo, fibrossarcomas e rabdomiossarcomas), melanomas, terato- carcinomas, neuroblastomas, tumores cerebrais, gliomas, tumores benignos da pele (por exemplo, queratocantomas), carcinoma de seio (por exemplo, câncer de seio avançado), carcinoma de rim, carcinoma de ovário, carcino- ma de cérvix, carcinoma endometrial, carcinoma de bexiga, câncer de prós- tata incluindo a doença avançada, cânceres testiculares, osteossarcoma, câncer da cabeça e do pescoço e carcinoma epidermóide. Os compostos da presente invenção também podem ser usados para o tratamento e a prevenção de condições infpasta fluidatórias.

Portanto, esta invenção também fornece um método para o tra- tamento de a prevenção de condições infpasta fluidatórias por administração de uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, a um indi- víduo, por exemplo, um mamífero (e mais particularmente, um ser humano) que necessite de um tal tratamento.

Os compostos da presente invenção também podem ser usados para o tratamento de doenças e condições auto-imunes. Com o termo "do- enças auto-imunes" entende-se qualquer doença, na qual o sistema imune do animal reage adversamente a um auto-antígeno. Com o termo "auto- antígeno" entende-se qualquer antígeno, que seja normalmente encontrado no corpo do animal. Doenças auto-imunes representativas incluem, mas, não estão limitadas a: tiroidite de Hashimoto, Doença de Graves, esclerose múltipla, anemia perniciosa, Doença de Addison, diabetes mellitus depen- dente de insulina, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE ou lúpus), dermatomiosite, Doença de Crohn, granulomatose de Wegener, do- ença de membrana basal antiglomerular, síndrome antifosfolipídica, dermati- te herpetiforme, encefalomielite alérgica, glomerulonefrite, Lambert-Eaton, síndrome miastênica, miastenia gravis, buloso penfigóide, poliendocrinopati- as, Doença de Reiter e Síndrome de Stiffman.

Portanto, esta invenção também fornece um método para o tra- tamento de doenças e condições auto-imunes e o tratamento de doenças associadas com proteínas instáveis conformacionalmente ou indevidamente dobradas, por administração de uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, a um indivíduo, por exemplo, um mamífero (e mais parti- cularmente, a um ser humano), que necessite de um tal tratamento.

Os compostos da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de doenças associadas com proteínas instáveis confor- macionalmente ou indevidamente dobradas.

Exemplos de doenças associadas com proteínas instáveis con- formacionalmente ou indevidamente dobradas incluem, mas, não estão Iimi- tados a: fibrose cística (CFTR), Síndrome de Marfan (fibrilina), esclerose la- teral amiotrófica (colágeno), doença de urina de xarope de bordo (complexo de alfa-cetoácido desidrogenase), osteogênese imperfeita (tipo pró-colágeno pró-alfa), Doença de Kreutzfeldt-Jakob (príon), Doença de Alzheimer (beta- amilóide), amiloidose familiar (lisozima), catarata (cristalino), hipercolestero- lemia familiar (receptor de LDL), deficiência de antritripsina α I, Doença de Tay-Sachs (β-hexosaminidase), retinite pigmentosa (rodopsina) e Ieprecau- nismo (receptor de insulina).

Portanto, esta invenção também fornece um método para o tra- tamento de doenças associadas com proteínas instáveis conformacional- mente ou indevidamente dobradas, por administração de uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, a um indivíduo, por exemplo, a um mamífero (e mais particularmente, a um ser humano), que necessite de um tal tratamento.

Em vista de suas propriedades farmacológicas úteis, os compos- tos em questão podem ser formulados em várias formas farmacêuticas para finalidades de administração.

Para preparar as composições farmacêuticas desta invenção, uma quantidade eficaz de um composto em particular, em forma de sal de adição com base ou com ácido, como o ingrediente ativo, é combinada, em íntima adição sob mistura, com um veículo farmaceuticamente aceitável, veículo este que pode assumir uma ampla variedade de formas, dependen- do da forma de preparação desejada para a administração. Essas composi- ções farmacêuticas estão, desejavelmente, em forma de dosagem unitária, de preferência, para administração de maneira oral, retal, percutânea ou por injeção parenteral. Por exemplo, na preparação das composições em forma de dosagem oral, podem ser empregados qualquer dos meios farmacêuticos usuais, tais como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois e os similares no caso de preparações líquidas orais, tais como suspensões, xaropes, elixí- res e soluções; ou veículos sólidos, tais como amidos, açúcares, caulim, lu- brificantes, aglutinantes, agentes desintegrantes e os similares no caso de pós, pílulas, cápsulas e comprimidos. Devido à facilidade de administração, comprimidos e cápsulas representam a forma unitária de dosagem oral mais vantajosa, em cujo caso, veículos farmacêuticos sólidos sejam obviamente empregados. Para compo- sições parenterais, o veículo usualmente compreenderá água estéril, pelo menos em grande parte, embora outros ingredientes, para auxiliar a solubili- dade, por exemplo, possam estar incluídos. Soluções injetáveis, por exem- plo, podem ser preparadas, nas quais o veículo compreenda solução salina, solução de glicose ou uma mistura de soluções salina e de glicose. Suspen- sões injetáveis também podem ser preparadas, em cujo caso veículos líqui- dos apropriados, agentes de suspensão e os similares podem ser emprega- dos. Nas composições adequadas para a administração percutânea, o veí- culo opcionalmente compreende um agente intensificador de penetração e/ou um agente de umectação adequados, opcionalmente combinados com aditivos adequados de qualquer natureza em menores proporções, aditivos estes que não causem um efeito deletério significativo para a pele. Os aditi- vos podem facilitar a administração à pele e/ou podem ser úteis para a pre- paração das composições desejadas. Essas composições podem ser admi- nistradas de várias maneiras, por exemplo, como um emplastro transdérmi- co, como um tópico local ("spot-on"), como uma pomada. É especialmente vantajoso formular as composições farmacêuticas mencionadas acima em forma unitárias de dosagem, para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem como usada no relatório descritivo e nas reivindicações aqui refere-se a unidades fisicamente discretas ade- quadas como dosagens unitárias, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo, calculada para produzir o efeito tera- pêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico necessário. Exemplos de tais formas unitárias de dosagem são comprimidos (incluindo comprimidos com ranhura ou revestidos), cápsulas, pílulas, pacotes de pós, wafers, soluções ou suspensões injetáveis, medidas de colheres de chá, medidas de colheres de sopa e os similares, e seus múltiplos segregados.

É especialmente vantajoso formular as composições farmacêuti- cas anteriormente mencionadas em forma unitária de dosagem para facili- dade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosa- gem, conforme usada no relatório descritivo e nas reivindicações aqui, refe- re-sem a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitá- rias, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico necessário. Exemplos de tais formas unitárias de dosagem são comprimidos (incluindo comprimidos com ranhura ou revesti- dos), cápsulas, pílulas, pacotes de pós, wafers, soluções ou suspensões injetáveis, medidas de colheres de chá, medidas de colheres de sopa e os similares, e seus múltiplos segregados.

O composto da invenção é administrado em uma quantidade suficiente para inibir a interação entre MDM2 e p53 ou outras proteínas celu- lares que induzam apoptose, induzam morte celular ou regulem o ciclo celu- lar.

O potencial oncogênico de MDM2 é determinado não somente por sua capacidade de suprimir p53, mas, também, por sua capacidade de regular outras proteínas supressoras de tumor, por exemplo, a proteína de retinoblastoma pRb e o fator de transcrição E2F1 intimamente associado.

Portanto, o composto da invenção é administrado em uma quan- tidade suficiente para modular a interação entre MDM2 e os fatores de transcrição de E2F.

Aqueles versados na técnica poderiam facilmente determinar a quantidade eficaz a partir dos resultados de testes apresentados nas partes que se seguem. Em geral, contempla-se que uma quantidade terapeutica- mente eficaz seria de desde 0,005 mg/Kg a 100 mg/Kg de peso corporal, e, em particular, de desde 0,005 mg/Kg a 10 mg/Kg de peso corporal. Pode ser apropriado administrar a dose necessária como dose única, duas, três, qua- tro ou mais subdoses, em intervalos apropriados, ao longo do dia. As subdo- ses podem ser formuladas como formas unitárias de dosagem, por exemplo, contendo 0,5 a 500 mg, e, em particular, 10 mg a 500 mg de ingrediente ati- vo por forma de dosagem unitária. Como outro aspecto da presente invenção, uma combinação de inibidor de ap53-MDM2 com outro agente anticâncer é vislumbrada, especi- almente para aplicação como um medicamento, mais especificamente, no tratamento de câncer ou de doenças relacionadas.

Para o tratamento das condições acima, os compostos da inven- ção podem ser empregados de maneira vantajosa em combinação com um ou mais outros agentes medicinais, mais particularmente, com outros agen- tes anticâncer. Exemplos de agentes anticâncer incluem, mas, não estão limitados a:

- compostos de coordenação de platina, por exemplo, cisplatina, carboplati- na ou oxaliplatina;

- compostos de taxano, por exemplo, paclitaxel ou docetaxel;

- inibidores de topoisomerase I, tais como compostos de camptotecina, por exemplo, irinotecano ou topotecano;

- inibidores de topoisomerase II, tais como epipodofilotoxinas ou derivados de podofilotoxina antitumor, por exemplo, etoposida ou teniposida;

- alcalóides de vinca antitumor, por exemplo, vinblastina, vincristina ou vino- relbina;

- derivados de nucleosídeos antitumor, por exemplo, 5-fluoro-uracila, Ieuco- vorina, gencitabina ou capecitabina;

- agentes alquilantes, tais como, mostarda de nitrogênio ou nitroso-uréia, por exemplo, ciclofosfamida, clorambucila, carmustina, tiotepa, mefalan ou Io- mustina;

- derivados de antraciclina antitumor, por exemplo, daunorubicina, doxorubi- cina, doxil, idarubicina ou mitoxantrona;

- moléculas que objetivem o receptor de IGF-I, por exemplo, picropodofilina;

- derivados de tetracarcina, por exemplo, tetracarcina A;

- glicocorticóides, por exemplo, prednisona;

- anticorpos, por exemplo, trastuzumab (anticorpo HER2), rituximab (anticor- po CD20), gemtuzamab, cetuximab, pertuzumab ou bevacizumab;

- antagonistas de receptores de estrogênio ou moduladores seletivos de re- ceptores de estrogênio, por exemplo, tamoxifeno, fulvestrant, toremifeno, droloxifeno, faslodex ou raloxifeno;

- inibidores de aromatase, tais como exemestano, anastrozol, Ietrazol e vo- rozol;

- agentes de diferenciação, tais como retinóides, vitamina D, ou ácido reti- nóide e agentes de bloqueio do metabolismo de ácido retinóide (RAMBA), por exemplo, acutano;

- inibidores de metil transferase de DNA, por exemplo, azacitidina ou decita- bina;

- antifolatos, por exemplo, premetrexed dissódico;

- anti-bióticos, por exemplo, antinomicina D, bleomicina, mitomicina C, dacti- nomicina, carminomicina ou daunomicina;

- antimetabólitos, por exemplo, clofarabina, aminopterina, arabinosídeo de citosina ou metotrexato;

- agentes que induzem apoptose e agentes anti-angiogênicos, tais como ini- bidores de Bcl-2, por exemplo, YC 137, BH 312, ABT 737, gossipol, HA 14-1, TW 37 ou ácido decanóico;

- agentes que se ligam a tubulina, por exemplo, combrestatina, colchicinas ou nocodazol;

- inibidores de quinase, por exemplo, flavoperidol, mesilato de imatinib, erlo- tinib ou gefitinib;

- inibidores de farnesil transferase, por exemplo, tipifarnib;

- inibidores de histona deacetilase (HDAC), por exemplo, butirato de sódio, ácido hidroxamida suberoilanilida (SAHA), depsipeptídeo (FR 901228), NVP- LAQ824, R306465, JNJ-26481585 ou tricostatina A;

- inibidores da via de ubiquitina-proteossoma, por exemplo, PS-341, MLN .41 ou bortezomib;

- Yondelis;

- inibidores de telomerase, por exemplo, telomestatina;

- inibidores de metaloproteinase de matriz, por exemplo, batimastat, mari- mastat, prinostat ou metastat.

Conforme mencionado acima, os compostos da presente inven- ção também têm aplicações terapêuticas na sensibilização de células de tumor para quimioterapia e radioterapia.

Portanto, os compostos da presente invenção podem ser usados como "rádiosensibilizadores" e/ou "químiosensibilizadores" ou podem ser ministrados em combinação com outro "rádiosensibilizador" e/ou "químio- sensibilizador".

O termo "rádiosensibilizador", conforme usado aqui, é definido como uma molécula, de preferência, uma molécula de baixo peso molecular, administrada a animais, em quantidades terapeuticamente eficazes, para aumentar a sensibilidade das células à radiação ionizante e/ou para promo- ver o tratamento de doenças, que sejam tratáveis com radiação ionizante.

O termo "químiosensibilizador", conforme usado aqui, é definido como uma molécula, de preferência, uma molécula de baixo peso molecular, administrada a animais, em quantidades terapeuticamente eficazes para aumentar a sensibilidade de células à quimioterapia e/ou para promover o tratamento de doenças, que sejam tratáveis com químio-terápicos.

Vários mecanismos para o modo de ação de rádiosensibilizado- res têm sido sugeridos na literatura, incluindo: rádiosensibilizadores de célu- las hipóxicas (por exemplo, compostos de 2-nitro-imidazol, e compostos de dióxido de benzotriazina), mimetizando oxigênio ou, alternativamente, com- portando-se como agentes bioredutores sob hipoxia; rádiosensibilizadores de células não hipóxicas (por exemplo, pirimidinas halogenadas) podem ser análogos de bases de DNA e, de preferência, se incorporarem ao DNA de células cancerosas e, por meio disso, promover a ruptura induzida por radia- ção de moléculas de DNA e/ou prevenir os mecanismos de reparação de DNA normais; e vários outros mecanismos de ação potenciais têm sido hipo- tetizados para rádiosensibilizadores no tratamento de doença.

Muitos protocolos de tratamento de câncer atualmente empregas rádiosensibilizadores, em conjunto com radiação de raios X. Exemplos de rádiosensibilizadores ativados por raios X incluem, mas, não estão limitados a, os seguintes: metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonida- zol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromo-deoxiuridina (BUdR), 5-iodo-deoxiuridina (IU- dR), bromo-deoxicitidina, fluoro-deoxiuridina (FudR)1 hidróxi-uréia, cisplatina e seus análogos terapeuticamente eficazes e seus derivados.

Terapia fotodinâmica (PDT) de cânceres emprega luz visível como o ativador de radiação do agente sensibilizante. Exemplos de rádio- sensibilizadores fotodinâmicos incluem os seguintes, mas, não estão limita- dos a: derivados de hematoporfirina, fotofrina, derivados de benzoporfirina, etioporfirina de estanho, feoborbeto-a, bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de zinco e análogos terapeuticamente eficazes dos mesmos.

Rádiosensibilizadores podem ser administrados em conjunto com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais outros compos- tos, incluindo, mas, não limitados a: compostos que promovam a incorpora- ção de rádiosensibilizadores para as células-alvo; compostos que controlem o escoamento de terápicos, nutrientes e/ou oxigênio para as células-alvo; agentes quimioterapêuticos, que atuem sobre o tumor, com ou sem radiação adicional; ou outros compostos terapeuticamente eficazes para o tratamento de câncer ou outra doença.

Químio-sensibilzadores podem ser administrados em conjunto com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais outros compos- tos, incluindo, mas, não limitados a: compostos que promovam a incorpora- ção de químiosensibilizadores às células-alvo; compostos que controlem o escoamento de terápicos, nutrientes e/ou oxigênio para as células-alvo; a- gentes químio-terápicos para o tratamento de câncer ou outra doença. Anta- gonistas de cálcio, por exemplo, verapamil, são considerados úteis em com- binação com agentes antineoplásticos para estabelecer químio-sensibilidade em células de tumor resistentes aos agentes químio-terápicos aceitos e para potencializa a eficácia de tais compostos em malignâncias sensíveis a fár- macos.

Em vista de suas propriedades farmacológicas úteis, os compo- nentes das combinações de acordo com a invenção, isto é, o outro agente medicinal e o inibidor de p53-MDM, podem ser formulados em várias formas farmacêuticas para finalidades de administração. Os componentes podem ser formulados separadamente em composições farmacêuticas individuais ou em uma composição farmacêutica unitária contendo ambos os compo- nentes.

Portanto, a presente invenção também refere-se a uma compo- sição farmacêutica compreendendo o outro agente medicinal e o inibidor de p53-MDM em conjunto com um ou mais veículos farmacêuticos.

A presente invenção refere-se adicionalmente à aplicação de uma combinação de acordo com a invenção, na preparação de uma compo- sição farmacêutica para a inibição do crescimento de células de tumores.

A presente invenção refere-se adicionalmente a um produto con- tendo, como primeiro ingrediente ativo, um inibidor de p53-MDM de acordo com a invenção, e, como segundo ingrediente ativo, um agente anticâncer, como uma preparação combinada para aplicação simultânea, separa ou se- qüencial no tratamento de pacientes sofrendo de câncer. O outro agente medicinal e inibidor de p53-MDM pode ser administrado simultaneamente (por exemplo, em composições separadas ou unitárias) ou seqüencialmente em qualquer ordem. No último caso, os dois compostos serão administrados dentro de um período e em uma quantidade de maneira que seja suficiente para assegurar que um efeito vantajoso ou sinergístico seja conseguido. Se- rá apreciado que o método preferido e ordem de administração e as respec- tivas quantidades de dosagem e regimes para cada componente da combi- nação dependerão do outro agente medicinal particular e do inibidor de p53- MDM2 sendo administrado, sua rota de administração, do tumor particular sendo tratado e do hospedeiro particular sendo tratado. O método ótimo e a ordem de administração e as quantidades e regime de dosagem podem ser prontamente determinados por aqueles versados na técnica usando méto- dos convencionais e em vista das informações expostas aqui.

O composto de coordenação de platina é administrado de ma- neira vantajosa em uma dosagem de 1 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 50 a 400 mg/m2, parti- cularmente, para cisplatina em uma dosagem de cerca de 75 mg/m2, e para carboplatina em cerca de 300 mg/m2 por decurso de tratamento. O composto de taxano é vantajosamente administrado em uma dosagem de 50 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 75 a 250 mg/m2, particularmente para paclitaxel em uma dosagem de cerca de 175 a 250 mg/m2 e para docetaxel em cerca de 75 a 150 mg/m2 por decurso de tratamento.

O composto de camptotecina é vantajosamente administrado em uma dosagem de 0,1 a 400 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de su- perfície corporal, por exemplo, 1 a 300 mg/m2, particularmente para irinote- cano em uma dosagem de cerca de 100 a 350 mg/m2 e para topotecano em cerca de 1 a 2 mg/m2 por decurso de tratamento.

O derivado de podofilotoxina antitumor é vantajosamente admi- nistrado em uma dosagem de 30 a 300 mg por metro quadrado de área de superfície corporal, por exemplo, 50 a 250 mg/m2, particularmente para eto- posídeo em uma dosagem de cerca de 35 a 100 mg/m2 e para teniposídeo em cerca de 50 a 250 mg/m2 por decurso de tratamento.

O alcalóide de vinca antitumor é vantajosamente administrado em uma dosagem de 2 a 30 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de su- perfície corporal, particularmente para vinblastina em uma dosagem de cer- ca de 3 a 12 mg/m2, para vincristina em uma dosagem de cerca de 1 a 2 mg/m2, e para vinorelbina em dosagem de cerca de 10 a 30 mg/m2 por de- curso do tratamento.

O derivado de nucleosídeo antitumor é vantajosamente adminis- trado em uma dosagem de 200 a 2.500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 700 a 1.500 mg/m2, particularmen- te para 5-FU em uma dosagem de 200 a 500 mg/m2, para gencitabina em uma dosagem de cerca de 800 a 1.200 mg/m2 e para capecitabina em cerca de 1.000 a 2.500 mg/m2 por decurso de tratamento.

Os agentes de alquilação, tais como mostrada de nitrogênio ou nitroso-uréia é vantajosamente administrada em uma dosagem de 100 a 500 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 120 a 200 mg/m2, particularmente para ciclofosfamida em uma dosagem de cerca de 100 a 500 mg/m2, para clorambucil em uma dosagem de cerca de 0,1 a 0,2 mg/m2, para carmustina em uma dosagem de cerca de 150 a 200 mg/m2, e para Iomustina em uma dosagem de cerca de 100 a 150 mg/m2 por decurso de tratamento.

O derivado de antraciclina antitumor é vantajosamente adminis- trado em uma dosagem de 10 a 75 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, por exemplo, 15 a 60 mg/m2, particularmente para doxorubicina em uma dosagem de cerca de 40 a 75 mg/m2, para daunorubi- cina em uma dosagem de cerca de 25 a 45 mg/m2 por decurso de tratamen- to.

O agente antiestrogênio é vantajosamente administrado em uma dosagem de cerca de 1 a 100 mg ao dia dependendo do agente particular e da condição sendo tratada. Tamoxifeno é vantajosamente administrado de maneira oral em uma dosagem de 5 a 50 mg, de preferência, de 10 a 20 mg duas vezes ao dia, continuando a terapia durante tempo suficiente para se alcançar e se manter um efeito terapêutico. Toremifeno é vantajosamente administrado de maneira oral em uma dosagem de cerca de 60 mg uma vez ao dia, continuando a terapia durante tempo suficiente para se alcançar e se manter um efeito terapêutico. Anastrazol é vantajosamente administrado de maneira oral de cerca de 1 mg uma vez ao dia. Droloxifeno é vantajosamen- te administrado de maneira oral em uma dosagem de cerca de 20 - 100 mg uma vez ao dia. raloxifeno é vantajosamente administrado de maneira oral em uma dosagem de cerca de 60 mg uma vez ao dia. Exemestano é vanta- josamente administrado de maneira oral em uma dosagem de cerca de 25 mg uma vez ao dia.

Anticorpos são vantajosamente administrados em uma dosagem de cerca de 1 a 5 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície cor- poral, ou conforme conhecido na técnica, se diferente. Trastuzumab é vanta- josamente administrado em uma dosagem de 1 a 5 mg por metro quadrado (mg/m2) de área de superfície corporal, particularmente 2 a 4 mg/m2 por de- curso do tratamento.

Essas dosagens podem ser administradas, por exemplo, uma vez, duas vezes ou mais por decurso do tratamento, as quais podem ser repetidas, por exemplo, a cada 7, 14, 21 ou 28 dias. Os compostos de fór- mula (I), os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e suas formas estereoisoméricas podem ter propriedades diagnosticas valiosas pelo fato de que eles podem ser usados para detectar ou identificar uma intera- ção de p53-MDM2 em uma amostra biológica compreendendo a detecção ou a medição da formação de um complexo entre um composto marcado e/ou p53 e/ou MDM2 e/ou outras moléculas, peptídeos, proteínas, enzimas ou receptores.

Os métodos de detecção o de identificação podem usar compos- tos que estejam marcados com agentes de marcação, tais como rádioisóto- pos, enzimas, substâncias fluorescentes, substâncias luminosas, etc. Exem- plos dos rádioisótopos incluem 125I, 131I1 3H e 14C. Enzimas são usualmente tornadas detectáveis por conjugação de um substrato adequado que, por sua vez, catalisa uma determinada reação. Exemplos dessas incluem, por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase e malato desidrogenase, de prefe- rência, peroxidase de rábano silvestre. As substâncias luminosas incluem, por exemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, equorina e luciferase.

Amostras biológicas podem ser definidas como tecido corporal ou fluidos corporais. Exemplos de fluidos corporais são fluido cérebro- espinhal, sangue, plasma, soro, urina, escarro, saliva e os similares.

Os seguintes exemplos ilustram a presente invenção. Parte Experimental

Nas partes que se seguem, "DMF" é definido como N,N- dimetilformamida, "DCM" é definido como diclorometano, "EtOAc" é definido como acetato de etila, "EtOH" é definido como etanol, "MeOH" é definido como metanol e "THF" é definido como tetraidrofurano. Pontos de Fusão

Para inúmeros compostos, os pontos de fusão foram obtidos com uma bancada quente kofler, consistindo em uma placa aquecida com gradiente de temperatura linear, um ponteiro deslizante e uma escala de temperatura em graus Celsius. LCMS Método A

O gradiente de HPLC foi fornecido por um sistema Alliance HT 2795 (Waters) compreendendo uma bomba quaternária com desgaseifica- dor, um auto-amostrador e um detector de conjunto de diodos (DAD). O es- coamento a partir da coluna foi dividido para um detector de EM. O detector de EM foi configurado com uma fonte de ionização de spray de elétrons. A voltagem de agulha capilar era de 3 KV e a temperatura de fonte foi mantida a 100°C no LCT (espectrômetro de massa de tempo de vôo de spray Z partir de Waters. O nitrogênio foi usado como o gás de nebulizador. A aquisição de dados foi realizada com um sistema de dados Waters-Micromass Mass- Lynx-Openlynx. HPLC de fase reversa foi realizada em uma coluna Xterra- RP Cl 8 (5 μm, 3,9 χ 150 mm) com uma velocidade de escoamento de 1,0 mL/min em uma temperatura de 30°C. As fases móveis (fase móvel A: 100% de acetato de amônio a 7 mM; fase móvel B: 100% de acetonitrila; foram empregados para correr uma condição de gradiente a partir de 85% de A, 15% de B (mantido durante 3 minutos) a 20% de A, 80% de B em 5 minutos, mantido em 20% de A e 80% de B durante 6 minutos e reequilibrado com condições iniciais durante 3 minutos. Um volume de injeção de 20 pL foi u- sado. A voltagem de cone era de 20 V para o modo de ionização positivo. Os espectros de massa foram adquiridos por varredura a partir de 100 a 900 em 0,8 segundos usando um intervalo entre as varreduras de 0,08 segundos.

Método B

O gradiente de cromatografia líquida foi fornecido por um siste- ma Acquity UPLC (Waters) compreendendo uma bomba binária, um organi- zador de amostra, um aquecedor de coluna (ajustado em 55°C) e detector de conjunto de diodos (DAD). O escoamento a partir da coluna foi dividido para um detector de EM. O detector de EM foi configurado com uma fonte de ionização de spray de elétrons. Espectros de massa foram adquiridos por varredura a partir de 100 a 1.000 em 0,18 segundos usando um tempo de retenção de 0,02 segundos. A voltagem de agulha capilar era de 3,5 KV e a temperatura de fonte foi mantida em 140°C. O nitrogênio foi usado como gás de nebulizador. A aquisição de dados foi realizada com um sistema de da- dos Waters-Micromass MassLynx-OpenIynx.

UPLC de fase reversa foi realizada em uma coluna Cl 8 etilsilo- xano/sílica ligada em ponte (1,7 pm, 2,1 χ 50 mm) com uma velocidade de escoamento de 0,8 mL/min. Duas fases móveis (fase móvel A; 0,1% de áci- do fórmico em H20/metanol 95/5; fase móvel B: metanol) foram usados para correr uma condição de gradiente de desde 95% de A a 5% de A, 95% de B em 1,3 minutos e mantido durante 0,2 minutos. Um volume de injeção de 0,5 μL foi usado.

A voltagem de cone era de 10 V para modo de ionização positiva e de 20 V para modo de ionização negativa.

A. Preparação dos compostos intermediários

Exemplo A1

a) Preparação do intermediário 1

A uma solução de 5-nitro-indolina (10,0 g, 0,061 mols) e cloridra- to de 4-cloropiridina (11,0 g, 0,073 mols) em DMF (60 ml), sob argônio, à 0°C, foi adicionado em porções t-butóxido de potássio (17,0 g, 0,15 mols). A mistura foi aquecida até 100°C durante 16 horas. A mistura foi vertida sobre gelo e extraída duas vezes com EtOAc. A camada orgânica separada, seca- da (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado duas vezes por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (40 - 63 μιτι) (eluente: ciclohexano/EtOAc/MeOH 50/50/0 a 0/80/20). As frações puras foram cole- tadas e o solvente foi evaporado, fornecendo 2,49 g (17%) do intermediário 1 como um sólido laranja amarronzado.

1H-RMN (300 MHz DMSO-d6) δ 8,47 (dd, 2H, J = 6,4, J = 1,6), 8,06 (m, 2H), 7,41 (d, 1H, J = 9,6), 7,28 (dd, 2H, J = 6,4, J = 1,6), 4,16 (t, 2H, J = 8,6), 3,22 (t, 2H, J = 8,6).

MS (ES+) m/z 242 (M+1). b) Preparação do intermediário 2

<formula>formula see original document page 38</formula>

Uma mistura do intermediário 1 (2,4 g, 0,010 mois) de Níquel de Raney (5 mL, 50% de pasta fluida em água) em EtOH (45 mL) e THF (45 mL) foi agitada à temperatura ambiente sob 207 Kpa (30 psi) de hidrogênio durante 3 horas. Depois de filtração através de uma "lama" de celite, o sol- vente foi evaporado para dar 2,01 g (96%) do intermediário 2 como um sóli- do marrom.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,32 (dd, 2H, J = 6,4, J = 1,5), 7,15 (d, IH, J = 8,5), 6,92 (dd, 2H, J = 6,43 J = 1,5), 6,63 (d, 1H, J = 2,2), 6,50 (dd, 1H, J = 8,3, J = 2,4), 3,92 (t, 2H, J = 8,3), 3,44 (brs, 2H), 3,08 (t, 2H, J = 8,3).

c) Preparação do intermediário 3

<formula>formula see original document page 38</formula>

A uma solução do intermediário 2 91,9 g, 0,0089 mois) em DCM (20 mL) e THF (20 mL), sob argônio, foram adicionados sucessivamente á- cido indol-3-acético (2,0 g, 0,012 mois) e hidrato de 1-hidróxi-benzotriazol (1,6 g, 0,012 mois) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida (2,2 g, 0,012 mois). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 40 horas. Para completar a reação, ácido indol-3-acético (1,6 g, 0,0089 mois) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida (1,7 g, 0,00089 mois) foram adicionados e a mistura foi agitada à temperatura ambiente e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica- gel (40 - 63 pm) (eluente: DCM/Me0H/NH40H 95/5/0,1 a 80/20/0,1). As fra- ções coletadas foram evaporadas, o sólido resultante foi lavado com MeOH e secado, fornecendo 1,95 g (60%) do intermediário 3. 1H-RMN (300 MHz DMSO-d6) δ 10,93 (brs, 1H), 10,08 (brs, 1H), 8,31 (d, 2H, J = 6,3), 7,88 (d, 1H, J = 8,1), 7,58 (m, 2H), 7,34 (m, 2H), 7,26 (d, 1H, J = 2,1), 7,17 (d, 2H, J = 6,6), 7,07 (t, 1H, J = 6,9), 6,98 (t, 1H, J = 7,4), 3,99 (t, 2H, J = 8,3), 3,71 (s, 2H), 3,12 (t, 2H, J = 8,2). MS (ES+) m/z 369 (M+1).

Exemplo A2

a) Preparação do intermediário 4

<formula>formula see original document page 39</formula>

A uma solução de 5-nitro-indol (5,0 g, 0,030 mols) e 4- cloroquinolina (6,0 g, 0,037 rnols) em DMF (30 mL), sob argônio, foi adicio- nado em porções t-butóxido de potássio (8,4 g, 0,075 mols). A mistura foi agitada à 100°C durante 16 horas, então, à temperatura ambiente durante 70 horas. A mistura foi vertida por sobre gelo e extraída 3 vezes com EtOAc. A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, secada (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (40 - 63 μm) (eluente: EtOAc/ciclohexano 50/50 a 100/0). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, forne- cendo 2,26 g (26%) do intermediário 4 como um sólido laranja. 1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,93 (d, 1H, J = 4,9), 8,11 (m, 2H), 7,92 (dd, 1H, J = 8,9, J = 2,5), 7,85 (d, 1H, J = 7,7), 7,82 (dt, 1H, J = 7,0, J = 1,4), 7,60 (dt, 1H, J = 6,8, J = 1,2), 7,54 (d, 1H, J = 4,9), 6,26 (d, 1H, J = 8,9), 4,30 (t, 2H, J = 8,4), 3,35 (t, 2H, J = 8,2).

MS (ES+) m/z 292 (M+1). b) Preparação do intermediário 5

<formula>formula see original document page 40</formula>

Uma mistura do intermediário 4 (2,0 g, 0,0069 mols) e Níquel de Raney (3 mL, 50% de pasta fluida em água) em EtOH (30 mL) e THF (30 mL) foi agitada à temperatura ambiente sob 207 Kpa (30 psi) de hidrogênio durante 4,5 horas. Depois de filtração através de uma "lama" de celite, o sol- vente foi evaporado, fornecendo 1,81 g (100%) do intermediário 5 como um sólido laranja.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,71 (d, 1H, J = 5,1), 8,07 (d, 1H, J = 8,5), 8,01 (d, 1H, J = 8,5), 7,67 (t, IH, J = 7,0), 7,41 (t, 1H, J = 7,1), 7,09 (d, 1H, J = 5,1), 6,67 (s, 1H), 6,49 (d, 1H, J = 8,3), 6,38 (dd, 1H, J = 8,3, J = 1,9), 4,04 (t, 2H, J = 7,9), 3,39 (brs, 2H), 3,12 (t, 2H, J = 7,8). MS (ES+) m/z 262 (M+1).

c) Preparação do intermediário 6

<formula>formula see original document page 40</formula>

A uma solução do intermediário 5 (1,7g, 0,0064 mols) em DCM (15 mL) e THF (15 mL), sob argônio, foram adicionados sucessivamente á- cido indol-3-acético (1,5 g, 0,0084 mols), hidrato de 1-hidróxi-benzotriazol (1,1 g, 0,0084 mols) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi- imida (1,6 g, 0,0084 mols). A mistura foi agitada à temperatura ambiente du- rante 16 horas. Os solventes foram evaporados e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (40 - 63 μm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 90/10/0,1). As frações puras foram coletadas e o sol- vente foi evaporado, fornecendo 1,15 g (43%) do intermediário 6 como uma espuma marrom.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,74 (d, IH1J = 5,1), 8,61 (brs, 1H), 8,09 (d, 1H, J = 8,1), 7,91 (d, 1H, J = 8,4), 7,70 - 7,62 (m, 2H), 7,41 (m, 4H), 7,22 (m, 3H), 7,09 (d, 1H, J = 5,1), 6,74 (dd, 1H, J = 8,4, J = 1,8), 6,38 (d, 1H, J = 8,4), 4,04 (t, 2H, J = 8,0), 3,89 (s, 2H), 3,15 (t, 2H, J = 7,9).

MS (ES+) m/z 419 (M+1).

Exemplo A3

Preparação do intermediário 7

<formula>formula see original document page 41</formula>

Uma mistura de ácido indol-3-acético (2,0 g, 0,013 mois) e 1,1- carbonil-di-imidazol (2,1 g, 0,013 mois, adicionados em porções) em DCM (28 mL) foi agitada sob argônio à temperatura ambiente durante 2 horas. Cloridrato de Ν,Ο-dimetil-hidroxilamina (1,3 g, 0,013 mois) foi adicionado, a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas, e, então, verti- da por sobre gelo e água. O pH foi ajustado para 10 com uma solução de hidróxido de sódio a 4 N, e a camada aquosa foi extraída duas vezes com EtOAc. A camada orgânica foi separada, lavada com uma solução de clori- drato a 3 N, secada (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado, fornecendo 2,37 g (89%) do intermediário 7, como um sólido rosa.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,09 (brs, 1H), 7,66 (d, 1H, J = 7,5), 7,36 (d, 1H, J = 7,5), 7,22 - 7,10 (m, 3H), 3,92 (s, 2H), 3,66 (s, 3H), 3,23 (s, 3H).

Exemplo A4

a) Preparação do intermediário 8 <formula>formula see original document page 42</formula>

Uma mistura de 5-nitro-indolina (4,0 g, 0,024 mols) e ácido 4- cloro-2-piridino-carboxílico, éster de metila (5,0 g, 0,029 mols) em ácido acé- tico (24 mL), foi aquecida até 120°C durante 25 minutos em um aparelho de microondas Biotage lnitiator. A reação foi submetida a uma interrupção brus- ca com gelo, o pH foi ajustado para pH 9 por adição de uma solução satura- da de carbonato de potássio. A mistura foi extraída 3 vezes com DCM. A camada orgânica foi separada, secada (MgSO4), filtrada e o solvente foi e- vaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica- gel (40 - 63 μm) (eluente: DCM/MeOH 100/0 a 90/10). As frações puras fo- ram coletadas e o solvente foi evaporado, fornecendo 1,37 g (19%) do in- termediário 8 como um sólido amarelo.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,65 (d, 1H, J = 5,6), 8,16 (dd, 1H, J = 8,9, J = 2,1), 8,11 (s, 1H), 7,98 (d, 1H, J = 2,5), 7,35 (d, 1H, J = 8,9), 7,30 (dd, 1H, J = 5,7, J = 2,5), 4,23 (t, 2H, J = 8,5), 4,05 (s, 3H), 3,32 (t, 2H, J = 8,4). MS (ES+) m/z 300 (M+1).

b) Preparação do intermediário 9

<formula>formula see original document page 42</formula>

Uma mistura do intermediário 8 (1,2 g, 0,0045 mols) e Níquel de Raney (4 mL) 50% de pasta fluida em água) em MeOH (20 mL) e THF (20 mL) foi agitada à temperatura ambiente sob 1 atmosfera de hidrogênio du- rante 20 horas. Depois de filtração através de uma "lama" de celite, o solven- te foi evaporado, fornecendo 1,06 g (88%) do intermediário 9 como um sóli- do laranja.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,40 (d, 1H, J = 5,8), 7,77 (d, 1H, J = 2,5), 7,18 (d, 1H, J = 8,4), 7,05 (dd, 1H, J = 5,8, J = 2,6), 6,62 (d, 1H, J = 2,2), 6,52 (dd, 1H, J = 8,4, J = 2,4), 4,00 (m, 5H), 3,09 (t, 2H, J = 8,3).

MS (ES+) m/z 270 (M+1).

Exemplo A5

a) Preparação do intermediário 10

<formula>formula see original document page 43</formula>

Uma mistura de 5-amino-indol (1,1 g, 0,0086 mois) e anidrido ftálico (2,6 g, 0,017 mois) em DMF (20 mL) foi agitada à 100°C durante 5 horas, então, à temperatura ambiente durante 64 horas. A mistura de reação foi diluída em EtOAc, lavada duas vezes com uma solução saturada de clo- reto de amônio, secada (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado. O óleo resultante foi absorvido em ácido acético (15 mL) e agitado à temperatura ambiente durante 20 minutos, então, aquecido 80°C durante 1,5 horas. Gelo foi adicionado e o pH foi ajustado para pH 4 com uma solução saturada de carbonato de sódio. A mistura foi extraída duas vezes com EtOAc. A camada orgânica foi separada, secada (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (40 - 63 pm) (eluente: EtOAc/ciclohexano 40/60). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, fornecendo 2,06 g (91%) do intermediário 10.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,32 (brs, 1H), 7,97 (m, 2H), 7,79 (m, 2H), 7,66 (d, 1H, J = 2,0), 7,49 (d, IH1J = 8,6), 7,27 (dd, 1H, J = 5,7, J = 2,8), 7,17 (dd, 1H, J = 8,6, J = 2,0), 6,61 (t, 1H, J = 1,1).

MS (ES+) m/z 263 (M+1).

b) Preparação do intermediário 11 <formula>formula see original document page 44</formula>

Uma mistura de intermediário 10 (2,1 g, 0,0079 rnols) de ciano- boro-hidreto de sódio (987 mg, 0,016 mois) em ácido acético (30 mL) foi agi- tado à temperatura ambiente durante 18 horas. Gelo foi adicionado e o pH foi ajustado para 6 com uma solução saturada de carbonato de sódio. A mis- tura foi extraída duas vezes com EtOAc. A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, secada (MgSO4)1 filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (40 - 63 pm) (eluente: EtOAc/ciclohexano 30/70 a 70/30). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, fornecendo 726 mg (35%) do interme- diário 11 como um sólido amarelo.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 7,93 (m, 2H), 7,77 (m, 2H), 7,09 (s, 1H), 7,00 (d, 1H, J = 8,2), 6,70 (d, 1H, J = 8,2), 3,62 (t, 2H, J = 8,4), 3,09 (t, 2H, J = 8,4). MS (ES+) m/z 265 (M+1).

c) Preparação do intermediário 12

<formula>formula see original document page 44</formula>

Uma mistura do intermediário 11 (570 mg, 0,0022 mois), 4- bromo-6,7-dihidro-5H-[1] piridin-7-ol (554 mg, 0,0026 mois) e uma solução de cloridrato a 5 N em 2-propanol (0,57 mg, 0,0029 mois) em DMF (11 mL) foi aquecida até 120°C durante 1 hora em um aparelho de microondas Bio- tage lnitiator. A reação foi submetida a uma interrupção brusca com uma solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio e extraída 3 vezes com DCM. Os solventes foram evaporados. O resíduo foi purificado por cromato- grafia em coluna (40 - 63 pm) (eluente: EtOAc/MeOH 100/0 a 80/20, então DCM/MeOH 95/5 a 90/10). As frações puras foram coletadas e os solvente foi evaporada, fornecendo 651 mg (76%) do intermediário 12 como um sóli- do amarelo.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,30 (d, 1H1 J = 5,6), 7,95 (m, 2H), 7,79 (m, 2H), 7,23 - 7,12 (m, 3H), 6,94 (d, 1H, J = 8,4), 5,24 (t, 1H, J = 7,0), 4,18 (m, 1H), 4,08 (m, 1H), 3,25 (m, 2H), 3,00 (m, IH), 2,85 (m, 1H), 2,57 (m, 1H), 2,06 (m,1H).

MS (ES+) m/z 398 (M+1).

d) Preparação do intermediário 13

<formula>formula see original document page 45</formula>

À temperatura ambiente, hidrato de hidrazina (137 μΙ_, 0,0028 mols) foi adicionado a uma suspensão do intermediário 12 (557 mg, 0,0014 mois) em MeOH (5,5 mL) e a mistura resultante foi aquecida até 70°C duran- te 40 minutos. A reação foi submetida a uma interrupção brusca com água e extraída 4 vezes com EtOAc. A camada orgânica foi separada, secada (Mg- SO4), filtrada e o solvente foi evaporado, fornecendo 392 mg (100%) do in- termediário 13 como um sólido laranja amarronzado.

1H-RMN (300 MHz CDCl3) δ 8,18 (d, 1H, J = 5,8), 7,07 (d, 1H, J = 5,8), 6,49 (d, 1H, J = 8,3), 6,63 (d, 1H, J = 2,1), 6,48 (dd, 1H, J = 8,3, J = 2,4), 5,21 (m, 1H), 4,19 (brs, 2H), 4,03 (m, 3H), 3,05 (m, 3H), 2,84 (m, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,03 (m, 1H). Exemplo A6

a) Preparação do intermediário 14

<formula>formula see original document page 46</formula>

Uma mistura de 2,3-dihidro-3,3-dimetil-5-nitro-1H-indol (0,003 mols) e 4-bromo-piridina (0,003 mois) em 1-butanol (5 mL) foi aquecida em um tubo selado em um forno de microondas a 140°C durante 30 minutos, então, absorvida em uma solução de carbonato de potássio à 10% e extraí- da com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água, então, com NaCI e salmoura, secada (MgS04), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,8 g) foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (20 - 45 μm) (eluente: DCM/MeOH 100/0 a 98/2). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,45 g, 64%) foi cristalizado a partir de acetonitrila. O precipitado foi removido por filtração e secado, fornecendo 0,216 g (31%) do intermediário 14, ponto de fusão a 217°C (Kofler). 1H-RMN (300 MHz DMSO-d6) δ 1,4 (6H, s), 3,92 (2H, s), 7,3 (2H, m), 7,45 (1H, m), 8,10 (2H, m), J = 8,47 (2H, m)

LCMS (ES+) m/z 270 (M+1), Rt = 0,77, Método B

b) Preparação do intermediário 15

<formula>formula see original document page 46</formula>

Uma mistura do intermediário 14 (0,003 mols) e Níquel de Raney (0,9 g) em MeOH (20 mL) foi hidrogenada à temperatura ambiente durante 1 hora sob uma pressão de (3 bar 0,3 MPa, então, filtrada sobre Celite. Celite foi lavada com MeOH. O filtrado foi evaporado, fornecendo 0,8 g (100%) do intermediário 15. c) Preparação do intermediário 16

<formula>formula see original document page 47</formula>

Hexafluorofosfato de bromo-tris (pirrolidino) fosfônio (0,004 mois) foi adicionado em porções, à temperatura ambiente, a uma solução do in- termediário 15 (0,003 mois), ácido 1H-indol-3-acético (0,004 mois), 1-hidróxi- benzotriazol (0,04 mois) e éter diisopropílico (0,005 mois) em DCM (15 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma noite. A camada orgânica foi lavada com uma solução de carbonato de potássio a 10%, se- cada (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (3,2 g) foi puri- ficado por cromatografia em coluna sobre sílica-gei (15-40 μm) (eiuente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,2). As frações puras foram coletadas e o solven- te foi evaporado. O resíduo (0,7 g, 52%) foi cristalizado a partir de acetonitri- la. O precipitado foi removido por filtração e secado, fornecendo 0,55 g (41%) do intermediário 16, ponto de fusão 158°C (Kofler).

1H-RMN (300 MHz DMSO-d6) δ 1,28 (6H, s), 3,7 (2H, s), 3,73 (2H, s), 6,99 (1H, t, J = 7,7 Hz), 7,07 - 7,11 (3H, m), 2,25 (1H, d, J = 3,6 Hz), 7,30 - 7,39 (3H, m), 7,55 (1H, br, d, J = 3,6 Hz), 7,62 (1H, d, J = 7,7 Hz), 8,3 (2H, d, J = 7,7 Hz), 10,03 (1H, br, s), 10,92 (1H, br, s)

LCMS (ES+) m/z 397 (M+1), R, = 8,43, Método A

B. Preparação dos compostos finais

Exemplo B1

Preparação do composto 1

<formula>formula see original document page 47</formula> Hidreto de alumínio e lítio (423 mg, 0,0011 rnols) foi adicionado em porções a uma suspensão do intermediário 3 (1,0 g, 0,0027, mois) em THF (60 mL) sob argônio. A mistura foi agitada à temperatura ambiente du- rante 24 horas, submetida a uma interrupção brusca com gelo e uma solu- ção diluída de Sal de Rochelle e extraída 3 vezes com DCM. A camada or- gânica foi separada, secada (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia sobre sílica-gel (40 - 63 μηη) (eluen- te: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,1). As frações puras foram coletadas e o sol- vente foi evaporado, fornecendo 170 mg (18%) do composto 1, como uma espuma amarela.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,36 (brs, 1H), 8,32 (d, 2H, J = 6,6), 7,63 (d, 1H1 J = 7,8), 7,39 (d, 1H, J = 7,5), 7,24 - 7,11 (m, 3H), 7,07 (d, 1H, J = 1,8), 6,93 (d, 2H, J = 6,6), 6,58 (s, 1H), 6,45 (dd, 1H, J = 8,4, J = 2,1), 3,93 (t, 2H, J = 8,2), 3,62 (brs, 1H), 3,46 (t, 2H, J = 7,5), 3,09 (m, 4H).

LCMS (ES+) m/z 355 (M+1), R, = 8,30, Método A

Exemplo B2

Preparação do composto 2

Sob argônio, à temperatura ambiente, hidreto de alumínio e lítio (391 mg, 0,010 mois) foi adicionado em porções a uma solução do interme- diário 6 (1,1 g, 0,0026 mois) em THF (55 mL). A mistura foi agitada à tempe- ratura ambiente durante 18 horas. A reação foi submetida a uma interrupção brusca à 0°C com MeOH. Gelo e solução diluída de Sal de Rochelle foram adicionados, e a mistura foi extraída 3 vezes com DCM. A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, secada (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre síli- ca-gel (40 - 63 pm) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,5). As frações puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, fornecendo 121 mg (12%) do composto 2 como uma espuma laranja.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,70 (d, IH1J = 5,1), 8,18 (brs, 1H), 8,07 (d, 1H, J = 8,7), 8,03 (d, 1H, J = 8,7), 7,66 (m, 2H), 7,41 (m, 2H), 7,22 (t, 1H, J = 7,7), 7,12 (m, 3H), 6,63 (s, 1H), 6,56 (d, 1H, J = 8,4), 6,34 (dd, 1H, J = 8,4, J = 2,1), 4,06 (t, 2H, J = 7,8), 3,46 (t, 2H, J = 6,8), 3,12 (m, 4H). MS (ES+) m/z 405 (M+1).

Exemplo B3

Preparação do composto 3

À 0°C sob argônio, hidreto de alumínio e Iftio (14 mg, 0,00036 ml) foi adicionado a uma solução do intermediário 7 (74 mg, 0,00036 mois). A mistura foi agitada à 0°C durante 1 hora, submetida a uma interrupção brusca com uma solução a 5% de hidrogeno sulfato de potássio, e extraída duas vezes com EtOAc. A camada orgânica foi separada, lavada com sal- moura, secada (MgSO^1 filtrada e o solvente foi evaporada, para dar o indol- 3-acetaldeído como um óleo laranja.

Uma mistura do intermediário 9 (200 mg, 0,00074 mois) e ciano- boro-hidreto de sódio (64 mg, 0,0010 mois) em MeOH (2,3 mL) e ácido acé- tico (2 gotas) foi adicionado gota a gota a uma solução do aldeído prévio 9236 mg, 0,0015 mois) em MeOH (2 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A reação foi submetida a uma inter- rupção brusca com água, tornada alcalina com uma solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio e extraída 3 vezes com EtOAc. A camada or- gânica foi separada, lavada com salmoura, secada (MgSO4), filtrada e o sol- vente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (40 - 63 pm) (eluente: EtOAc/MeOH 100/0 a 90/10). As fra- ções puras foram coletadas e o solvente foi evaporado, fornecendo 190 mg (44%) do composto 3 como uma espuma laranja.

1H-RMN (300 MHz CDCI3) δ 8,42 (d, 1H, J = 5,7), 8,08 (brs, 1H), 7,79 (d, 1H, J = 2,4), 7,63 (d, 1H, J = 7,8), 7,40 (d, 1H, J = 8,1), 7,25 - 7,07 (m, 5H), 6,59 (s, 1H), 6,48 (dd, 1H, J = 8,7, J = 2,1), 4,00 (m, 5H), 3,48 (t, 2H, J = 6,8), 3,12 (m,4H).

MS (ES+) w/z 413 (M+1).

Exemplo B4

Preparação do composto 4

<formula>formula see original document page 50</formula>

Boro-hidreto de sódio (92 mg, 0,0024 mois) foi lentamente adi- cionado a uma solução do composto 3 (100 mg, 0,00024 mois) em MeOH (3 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, então, à 80°C durante 4 horas e novamente à temperatura ambiente durante 85 ho- ras. A reação foi submetida a uma interrupção brusca com água e a mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi separada, lavada com sal- moura, secada (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (40 - 63 μm) (eluen- te: DCM/MeOH 90/10 a 85/15). As frações puras foram coletadas e o solven- te foi evaporado, fornecendo 50 mg (54%) do composto 4, como uma espu- ma amarela.

1H-RMN (300 MHz DMSO-d6) δ 10,83 (brs, 1H), 8,14 (d, 1H, J = 5,7), 7,54 (d, 1H, J = 7,8), 7,35 (d, IH1J = 7,8), 7,22 (m, 2H), 7,14 (d, 1H, J = 2,1), 7,70 (dt, 1H, J = 7,6, J = 1,2), 6,98 (dt, 1H, J = 7,5, J = 0,9), 6,86 (dd, 1H, J = 6,0, J = 2,4), 6,62 (d, 1H, J = 2,1), 6,45 (dd, 1H, J = 8,7, J = 2,2), 5,39 (brs, 2H), 4,49 (d, 2H, J = 4,0), 3,92 (t, 2H, J = 8,2), 3,30 (m, 2H), 3,06 (t, 2H, J = 8,1), 2,96 (t, 2H, J = 7,5). Atividade celular dos compostos de fórmula (I) foi determinada sobre células de tumor U87MG usando um ensaio colorimétrico para a toxi- cidade celular ou sobrevivência celular (vide o Exemplo C.2.).

Células U87MG são células de glioblastoma humano com p53 de tipo selvagem. Nessa linhagem de células, MDM2 controla rigidamente a expressão de p53.

C.1. ELISA com p53

Células A2780 (ATCC) foram cultivadas em RPMI 1640 suple- mentado com soro de bezerro fetal (FCS) a 10%, L-glutamina 2 mM e gen- tamicina a 37°C em uma incubadora umidificada com CO2 a 5%.

Células A2780 foram semeadas a 20.000 células por cavidade em uma placa de 96 cavidades, cultivadas durante 24 horas e tratadas com composto durante 16 horas a 37°C, em uma incubadora umidificada. Depois da incubação, as células foram lavadas uma vez com salina tamponada com fosfato e 30 μL, por cavidade, foi adicionado tampão RIPA com baixo teor de sal (Tris 20 mM, pH 7,0, EDTA 0,5 mM, 1% de Nonidet P40, 0,5 % de DOC, 0,05% de SDS, PMSF 1 mM, 1 [pg/mL de aprotinina e 0,5 μ/mL leupeptina). Placas foram colocadas sobre gelo durante 30 minutos para completar a lise. Proteína p53 foi detectada nos Iisados por uso do ELISA sanduíche, descrito abaixo.

Placas com 96 cavidades EIA/RIA de poliestireno altamente ligante (Costar 9018) foram revestidas com o anticorpo de captura pAb 1801 (Abeam ab28-100) em uma concentração de 1 pg/mL em tampão de reves- timento (NaHCO3 0,1 M, pH 8,2), 50 uL por cavidade. O anticorpo foi deixa- do aderir durante uma noite a 4°C. Placas revestidas foram lavadas uma vez com salina tamponada com fosfato (PBS)/0,05% Tween 20 e 300 u/mL de tampão de bloqueio (PBS, 1% de albuminas de soro bovino (BSA)) foram adicionados, durante um período de incubação de 2 horas, à temperatura ambiente. Diluições de proteína p53 marcada com HIS recombinante purifi- cada, variando desde 3 - 200 ng/mL, foram feitas em tampão de bloqueio e usadas como padrões. (dd, 1Η, J = 8,5, J = 2,3), 5,22 (t, 1 Η, J = 6,7), 4,19 (brs, 1 Η), 4,04 (m, 3Η), 3,44 (t, 2Η, J = 6,7), 3,06 (m, 5Η), 2,83 (m, 1Η), 2,54 (m, 1Η), 2,08 (m, 1Η). MS (ES+) m/z 411 (Μ+1).

Exemplo Β6

Preparação do composto 6

<formula>formula see original document page 52</formula>

O intermediário 16 (0,001 mol) foi adicionado em porções a uma solução de tetrahidreto de alumínio e Iftio (0,002 mois) em THF (10 ml_) sob escoamento de N2. A mistura foi agitada e refluxada durante 24 horas, verti- da por sobre água gelada e filtrada sobre Celite. Celite foi lavada com EtO- Ac. O filtrado foi extraído com EtOAc. A camada orgânica foi separada, se- cada (MgSO4), filtrada e o solvente foi evaporado. O resíduo (0,45 g) foi puri- ficado por cromatografia em coluna sobre sílica-gel (10 μητι) (eluente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,5). As frações puras foram coletadas e o solven- te foi evaporada, fornecendo 0,042 g do composto 6.

1H-RMN (DMSO-de) δ 1,28 (6H, s), 2,95 (2H, t, J = 7,7 Hz), 3,27 - 3,34 (2H, m), 3,65 (2H, s), 5,38 (1H, br, t, J = 6,4 Hz), 6,45 (1H, dd, J = 4 Hz, 7,7 Hz), 6,57 (1H, d, J = 4 Hz), 6,96 - 7,02 (3H, m), 7,07 (1H, t, J = 7,7 Hz), 7,15 - 7,5 (3H, m), 7,35 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,55 (1H, d, J = 7,7 Hz), 8,22 (1H, d, J = 7,7 Hz), 10,83 (1H, br, s).

MS (ES+) m/z 383 (M+1), R, = 9,17, Método A

A Tabela F-1 lista os compostos que foram preparados em um dos Exem- plos acima. Tabela F-1

<formula>formula see original document page 53</formula>

C. Exemplo farmacológico

A capacidade dos compostos em preservar p53 em células A2780 foi medida com o ensaio imunossorbente ligado a enzima p53. O en- saio com p53 é um imunoensaio com enzima "sanduíche" empregando dois anticorpos monoclonais. Um anticorpo monoclonal, específico para a proteí- na p53, foi imobilizado por sobre a superfície das cavidades plásticas. Qual- quer p53 presente na amostra a ser ensaiada ligar-se-á ao anticorpo de cap- tura. O anticorpo policlonal detector biotinilado também reconhece a proteína p53, e ligar-se-á a qualquer p53, que tenha sido retida pelo anticorpo de cap- tura. O anticorpo detector, por sua vez, está ligado à estreptavidina conjuga- da à peroxidase de rábano silvestre, A peroxidase de rábano silvestre catali- sa a conversão do substrato cromogênico o-fenileno-diamina, a intensidade do qual é proporcional à quantidade de proteína p53 ligada à placa. O produ- to de reação colorido é quantificado usando um espectrofotômetro. A quanti- ficação é alcançada pela construção de uma curva padrão usando concen- trações conhecidas de proteína p53 marcada com HIS recombinante purifi- cada (vide o Exemplo C.1.). Atividade celular dos compostos de fórmula (I) foi determinada sobre células de tumor U87MG usando um ensaio colorimétrico para a toxi- cidade celular ou sobrevivência celular (vide o Exemplo C.2.).

Células U87MG são células de glioblastoma humano com p53 de tipo selvagem. Nessa linhagem de células, MDM2 controla rigidamente a expressão de p53.

C.1. ELISA com p53

Células A2780 (ATCC) foram cultivadas em RPMI 1640 suple- mentado com soro de bezerro fetal (FCS) a 10%, L-glutamina 2 mM e gen- tamicina a 37°C em uma incubadora umidificada com CO2 a 5%.

Células A2780 foram semeadas a 20.000 células por cavidade em uma placa de 96 cavidades, cultivadas durante 24 horas e tratadas com composto durante 16 horas a 37°C, em uma incubadora umidificada. Depois da incubação, as células foram lavadas uma vez com salina tamponada com fosfato e 30 μL, por cavidade, foi adicionado tampão RIPA com baixo teor de sal (Tris 20 mM, pH 7,0, EDTA 0,5 mM, 1% de Nonidet P40, 0,5 % de DOC, 0,05% de SDS, PMSF 1 mM, 1 [ug/mL de aprotinina e 0,5 μ/mL leupeptina). Placas foram colocadas sobre gelo durante 30 minutos para completar a lise. Proteína p53 foi detectada nos Iisados por uso do ELISA sanduíche, descrito abaixo.

Placas com 96 cavidades EIA/RIA de poliestireno altamente li- gante (Costar 9018) foram revestidas com o anticorpo de captura pAb 1801 (Abeam ab28-100) em uma concentração de 1 pg/mL em tampão de reves- timento (NaHCO3 0,1 M, pH 8,2), 50 uL por cavidade. O anticorpo foi deixa- do aderir durante uma noite a 4°C. Placas revestidas foram lavadas uma vez com salina tamponada com fosfato (PBS)/0,05% Tween 20 e 300 uL de tampão de bloqueio (PBS, 1% de albuminas de soro bovino (BSA)) foram adicionados, durante um período de incubação de 2 horas, à temperatura ambiente. Diluições de proteína p53 marcada com HIS recombinante purifi- cada, variando desde 3 - 200 ng/mL, foram feitas em tampão de bloqueio e usadas como padrões. As placas foram lavadas duas vezes com PBS/0,05% de Tween 20 e tampão de bloqueio ou padrões foram adicionados à 80 μL/cavidade. Aos padrões, 20 μL de tampão de lise foram adicionados. As amostras fo- ram adicionadas às outras cavidades em 20 μL de lisado/cavidade. Depois de uma incubação durante uma noite a 4°C, as placas foram lavadas duas vezes com PBS/0,05% de Tween 20. Alíquotas de 100 μL de anticorpo poli- clonal secundário p53(FL-393) (Tebubio, sc-6243), em uma concentração de 1 Mg/mL em tampão de bloqueio foram adicionadas à cada cavidade e dei- xadas aderir durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram Iava- das três vezes com PBS/0,05% de Tween 20. Anticorpo de detecção antico- elho HRP (sc-2004, Tebubio) a 0,04 pg/mL em PBS/1% de BSA foi adicio- nado e incubado durante 1 horas à temperatura ambiente. Placas foram la- vadas três vezes com PBS/0,05% de Tween 20 e 100 μΙ_ de tampão substra- to foram adicionados (tampão de substrato foi preparado logo antes de usar por adição de 1 comprimido de 10 mg de o-fenileno-diamina (OPD) a partir de Sigma e 125 μl de H2O2 a 3% a 25 mL de tampão de OPD: ácido cítrico 35 mM, Na2HPO4 66 mM, pH 5,6. Depois de 5 a 10 minutos, a reação de cor foi interrompida por adição de 50 μL de tampão de parada (H2SO4 1 M) por cavidade. A absorbância em comprimentos de onda duplos de 490/655 nm foi medida usando uma leitora de microplaca Biorad e os resultados foram, então, analisados.

Para cada experimento, controles (não contendo fármaco) e uma incubação em branco (não contendo células ou fármacos) foram realizadas em paralelo. O valor de branco foi subtraído a partir de todos os valores de controles e de amostras. Para cada amostra, o valor de p53 (em unidades de absorbância) foi expresso como a percentagem do valor para p53 presen- te no controle. A preservação de percentagem maior do que 140% foi defini- da como significativa. Aqui, os efeitos de compostos de teste são expressos como a mais baixa dose dando pelo menos 140% do valor para p53 presen- te no controle (LAD) (vide a Tabela F-2). C.2. Ensaio de proliferação

Todos os compostos testados foram dissolvidos em DMSO e diluições ulteriores foram feitas em meio de cultura. As concentrações de DMSO finais nunca excederam 0,1% (v/v) em ensaios de proliferação celu- lar. Os controles continham células U87MG e DMSO sem composto e o brancos continham DMSO, mas, não continham células.

Células U87MG foram semeadas em placas de cultura de célu- las de 96 cavidades a 3.000 células/cavidade/100 μL 24 horas depois, o meio foi trocado e composto e/ou solvente foram adicionados para um volu- me final de 200 μL. Seguindo 4 dias da incubação, o meio foi substituído por 200 μL de meio fresco e o crescimento celular foi avaliado usando um en- saio baseado em MTT. Portanto, 25 μL da solução de MTT (0,5% de MTT grau de pesquisa a partir de Serva em salina tamponada com fosfato) foram adicionados a cada cavidade e as células foram ulteriormente incubadas durante 2 horas, a 37°C. O meio foi, então, cuidadosamente aspirado e o produto de formazano de MTT azul foi dissolvido por adição, a cada cavida- de, de 25 μL de glicina 0,1 M e 100 μί de DMSO. As placas foram agitadas durante outros minutos em um agitador de microplacas antes de se ler a ab- sorbância à 540 nm por uma leitora de microplacas Biorad.

Dentro de um experimento, os resultados para cada condição experimental são a média de 3 cavidades em replicata. Para finalidades de seleção inicial, os compostos foram testados em uma única concentração fixa de 10~5 M. Para os compostos ativos, os experimentos foram repetidos para estabelecer curvas de resposta - concentração completas. Para cada experimento, os controles (não contendo fármaco) e uma incubação em branco (não contendo células ou fármacos) foram realizadas em paralelo. O valor em branco foi subtraído de todos os valores de controles e de amos- tras. Para cada amostra, o valor médio para o crescimento celular (em uni- dades de absorbância) foi expresso como uma percentagem do valor médio para o crescimento celular do controle. Quando apropriado, valores de Cl50 (concentração da fármaco necessária para reduzir o crescimento celular pa- ra 50% do controle) foram computados usando análise probit para os dados graduados (Finney, D. J., Probit Analyses, 2- Ed. Chapter 10, Graded Res- ponses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). Aqui, os efeitos dos compostos de teste são expressos como plC50 (o valor Iog negativo do valor de IC5o) (vide a Tabela F-2).

Em alguns dos experimentos, o ensaio de proliferação foi adap- tado para e usado em placas de cultura de 384 cavidades (vide a Tabela F-2).

Tabela F-2: A Tabela F-2 lista os resultados dos compostos que foram testa- dos de acordo com os Exemplos C.1 e C.2.

<table>table see original document page 57</column></row><table>

D. Exemplo de composição: comprimidos revestidos com filme

Preparação de núcleo de comprimido

Uma mistura de 100 g de um composto de fórmula (I), 570 g de lactose e 200 g de amido é bem misturada e, depois disso, é umidificada com uma solução de 5 g dodecilsulfato de sódio e 10 g de polivinilpirrolidona em cerca de 200 ml_ de água. A mistura de pó úmido é peneirada, secada e novamente peneirada. A seguir, são adicionados 100g de celulose micro- cristalina e 15 g de óleo vegetal hidrogenado. O conjunto é bem misturado e comprimido em comprimidos, dando 10.000 comprimidos, cada um compre- endendo 10 mg de um composto de fórmula (I).

Revestimento

A uma solução de 10 g de metil celulose em 75 mL de etanol desnaturado, é adicionada uma solução de 5 g de etil celulose em 150 mL de diclorometano. Então, foram adicionados 75 mL de diclorometano e 2,5 mL de 1,2,3-propanotriol 10 g de polietileno glicol são fundidos e dissolvidos em 75 mL de diclorometano. A última solução é adicionada à primeira e, en- tão, são adicionados 2,5 g de octadecanoato de magnésio, 5 g de polivinilpir- rolidona e 30 mL de suspensão de cor concentrada e o conjunto é homoge- nizado. Os núcleos de comprimido são revestidos com a mistura assim obti- da em um aparelho de revestimento.

Claims (10)

1. Composto de fórmula (I), <formula>formula see original document page 59</formula> uma forma de N-óxido, um sal de adição ou uma forma estereoquimicamen- te isomérica dos mesmos, na qual m é 0, 1 ou 2 e, quando m for 0, então uma ligação direta é pretendida; n éO, 1, 2 ou 3 e, quando η for 0, então, uma ligação direta é pretendida; p é 0 ou 1 e, quando ρ for 0, então, uma ligação direta é pretendida; t é 0 ou 1, e, quando t for 0, então, uma ligação direta é pretendida; <formula>formula see original document page 59</formula> é -CR8=C< e, então, a linha tracejada é uma ligação, -C(=0)-CH<, -C(=0)-N<, -CHR8-CH< ou -CHR8-ISk; em que cada R8, independentemente, é hidrogênio ou Ci-C6-alquila; R1 e R2 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidrogê- nio, halo, CrC6-alquila, C-i-C6-alquilóxi, aril-C1-C6-alquilóxi, heteroaril-C1-C6- alquilóxi, feniltio, hidróxi-CrC6-alquilcarbonila, C1-C6-alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de amino, arila, heteroarila; ou C3-C7- cicloalquila substituída com um substituinte selecionado a partir de amino, arila e heteroarila; R3 e R4 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidrogê- nio, halo, C1-C6-alquila, polihalo-C1-C6-alquila, ciano, ciano-C1-C6-alquila, hidróxi, amino ou C1-C6-alquilóxi; ou R4 e R5, em conjunto, podem opcionalmente formar um radical bivalente se- lecionado a partir de metilenodióxi ou etilenodióxi; R5 é hidrogênio, C1-C6-alquiloxicarbonila ou C1-C6-alquila; R6 e R7 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidrogê- nio, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila ou C1-C6-alquila; ou R6 e R7, em conjunto, podem opcionalmente formar um radical bivalente se- lecionado a partir de -(CH2)2-O-(CH2)2- (b-1), -(CH2)2-NR9-(CH2)2- (b-2), em que R9 é hidrogênio, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila ou C1-C6-alquila; Z é um radical selecionado a partir de <formula>formula see original document page 60</formula> nos quais: R10 e R11 são, cada um independentemente selecionados, a partir de hidro- gênio, halo, hidróxi, amino, C1-C6-alquila, nitro, polihalo-C1-C6-alquila, ciano, ciano-C1-C6-alquila, tetrazol-C1-C6-alquila, arila, heteroarila, aril-C1-C6- alquila, heteroaril-C1-C6-alquila, aril (hidróxi) C1-C6-alquila, heteroaril (hidróxi) C1-C6-alquila, arilcarbonila, heteroarilcarbonila, C1-C6-alquilcarbonila, aril-C1- C6-alquilcarbonila, heteroaril-C1-C6-alquilcarbonila, C1-C6-alquilóxi, C3-C7- cicloalquilcarbonila, C3-C7-cicloalquil (hidróxi) C1-C6-alquila, aril-C1-C6- alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6- alquilcarbonilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquiloxicarbonil-C1-C6-alquilóxi-C1-C6- alquila, hidróxi-C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquiloxicarbonil-C1-C6- alquenila, C1-C6-alquilóxi-C1-C6-alquila, C1-C6-alquiloxicarbonila, C1-C6- alquilcarbonilóxi, aminocarbonila, hidróxi-CrC6-alquila, amino-C1-C6-alquila, hidroxicarbonila, hidroxicarbonil-C1-C6-alquila e -(CH2)v-(C(=0)r)-(CHRl7)u- NR13R14; em que v é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e, quando v for 0, então, uma ligação direta é preten- dida; r é 0 ou 1, e, quando r for 0, então, uma ligação direta é pretendida; u é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e, quando u for 0, então, uma ligação direta é preten- dida; R17 é hidrogênio ou C1-C6-alquila; R12 é hidrogênio, C1-C6-alquila, C3-C7-cicloalquila, C1-C6-alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, amino, C1-C6-alquilóxi e arila; ou C3-C7-cicloalquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, amino, arila e C1-C6-alquilóxi; R13 e R14 são, cada um independentemente, selecionado a partir de hidro- gênio, C1-C12-alquila, C1-C6-alquilcarbonila, C1-C6-alquilsulfonila, aril-C1-C6- alquilcarbonila, C3-C7-cicloalquila, C3-C7-cicloalquilcarbonila, -(CH2)k- NR15R16, C1-C12-alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, hidroxicarbonila, ciano, C1-C6-alquiloxicarbonila, C1-C6-alquilóxi, arila ou heteroarila; ou C3-C7-cicloalquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, C1-C6-alquilóxi, arila, amino, aril-C1-C6- alquila, heteroarila ou heteroaril-C1-C6-alquila; ou R13 e R14, em conjunto com o nitrogênio ao qual eles estão ligados, podem opcionalmente formar uma morfolinila, piperidinila, pirrolidinila, piperazinila ou piperazinila substituída com um substituinte selecionado a partir de C1- C6-alquila, aril-C1-C6-alquila, aril-C1-C6-alquiloxicarbonila, heteroaril-C1-C6- alquila, C3-C7-cicloalquila e C3-C7-cicloalquil-C1-C6-alquila; em que k é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, e, quando k for 0, então, uma ligação direta é pre- tendida; R15 e R16 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidro- gênio, C1-C6-alquila, aril-C1-C6-alquiloxicarbonila, C3-C7-cicloalquila, C1-C12- alquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, C1-C6- alquilóxi, arila and heteroarila; and C3-C7-cicloalquila substituída com um substituinte selecionado a partir de hidróxi, CrC6-alquilóxi, arila, aril-C1-C6- alquila, heteroarila, e heteroaril-C1-C6-alquila; ou R15 e R16, em conjunto com o nitrogênio ao qual eles estão ligados, podem opcionalmente formar uma morfolinila, uma piperazinila ou uma piperazinila substituída com C1-C6-alquiloxicarbonila; arila é fenila ou naftalenila; cada fenila ou naftalenila pode opcionalmente estar substituída com um, dois ou três substituintes cada um independentemente selecionados a partir de halo, hidróxi, C1-C6-alquila, amino, polihalo-C1-C6-alquila e C1-C6-alquilóxi; e cada fenila ou naftalenila pode opcionalmente estar substituída com um radi- cal bivalente selecionado a partir de metilenodióxi e etilenodióxi; heteroarila é piridinila, indolila, quinolinila, imidazolila, furanila, tienila, oxadi- azolila, tetrazolila, benzofuranila ou tetrahidrofuranila; cada piridinila, indolila, quinolinila, imidazolila, furanila, tienila, oxadiazolila, tetrazolila, benzofuranila ou tetrahidrofuranila pode opcionalmente estar substituída com um, dois ou três substituintes cada um independentemente selecionado a partir de halo, hidróxi, C1-C6-alquila, amino, polihalo-C1-C6- alquila, arila, aril-C1-C6-alquila ou C1-C6-alquilóxi; e cada piridinila, indolila, quinolinila, imidazolila, furanila, tienila, benzofuranila ou tetrahidrofuranila pode opcionalmente estar substituída com um radical bivalente selecionado a partir de metilenodióxi ou etilenodióxi.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que m é 0; η é 2; ρ é 1; t é 0; R1 e R2 são, cada um independentemente, hidro- gênio; R3 e R4 são, cada um independentemente, hidrogênio; R5 é hidrogê- nio; R6 e R7 são, cada um independentemente, hidrogênio ou C1-C6-alquila; Z é um radical selecionado a partir de (a-1), (a-2) ou (a-4); ou R10 e R11 são, cada um independentemente, selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi, C1-C6-alquiloxicarbonila ou hidróxi-C1-C6-alquila.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que m é 0; η é 0; ρ é 1 ; t é 0; R1 e R2 são, cada um independentemente, hidro- gênio; R3 e R4 são, cada um independentemente, hidrogênio; R5 é hidrogê- nio; R6 e R7 são, cada um independentemente, hidrogênio; Z é um radical selecionado a partir de (a-2) ou (a-4); ou R10 e R11 são, em cada caso, inde- pendentemente selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi or hidróxi-C1-C6- alquila.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o composto é o composto Ns 1, o composto N9 2 e o composto Ns 5. <table>table see original document page 63</column></row><table>

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4, para aplicação como um medicamento.

6. Composição farmacêutica compreendendo veículos farmaceu- ticamente aceitáveis e, como um ingrediente ativo, uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um composto, como definido nas reivindicações 1 a 4.

7. Processo de preparação de uma composição farmacêutica, como definido na reivindicação 6, em que os veículos farmaceuticamente aceitáveis e um composto, como definido na reivindicações 1 a 4, são inti- mamente misturados.

8. Uso de um composto, como definido na reivindicação 1, 2, 3 ou 4, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um dis- túrbio mediado por uma interação p53-MDM2.

9. Combinação de um agente anticâncer e um composto como definido na reivindicação 1, 2, 3 ou 4.

10. Processo para a preparação de um composto, como definido na reivindicação 1, caracterizado por a) reação de um intermediário de fórmula (II) com um intermediário de fór- mula (III), em que W é um grupo de saída apropriado, tal como, por exemplo, halo, <formula>formula see original document page 64</formula> b) conversão de um intermediário de fórmula (IV) em compostos de fórmula (I), em que ρ é 1, aos quais refere-se aqui como compostos de fórmula (l-a), na presença de hidreto de alumínio e lítio em um solvente adequado, <formula>formula see original document page 64</formula> c) reação de um carboxaldeído apropriado de fórmula (VI), com um interme- diário de fórmula (V), na presença de um reagente apropriado, em um sol- vente adequado, ou <formula>formula see original document page 65</formula> d) reação de um intermediário de fórmula (II) com um carboxaldeído apropri- ado de fórmula (VII) com a formação de um composto de fórmula (I), em que t é 1, aos quais refere-se aqui como compostos de fórmula (1-b) <formula>formula see original document page 65</formula>