ES2431564T3 - Inhibidores de la interacción entre MDM2 y p53 - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula (I),**Fórmula** una forma de N-óxido, una sal de adición o una forma estereoquímicamente isomérica del mismo, en la quem es 0 y entonces se pretende que sea un enlace directo; n es 0 ó 2 y cuando n es 0 entonces se pretende que sea un enlace directo; p es 1 s es 0 y entonces se pretende que sea un enlace directo; t es 0 y entonces se pretende que sea un enlace directo; R1 y R2 son cada uno independientemente hidrógeno, A es un radical seleccionado de **Fórmula** en las que R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o alquiloxilo C1-6,Z es un radical seleccionado de **Fórmula** en la que R6 o R7 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno.

Description

Inhibidores de la interacción entre MDM2 y p53

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos y composiciones que contienen dichos compuestos que actúan como inhibidores de la interacción entre MDM2 y p53. Además, la presente invención proporciona procedimientos para la preparación de los inhibidores dados a conocer, composiciones que los comprenden y métodos de uso de los mismos, por ejemplo como medicamento.

La p53 es una proteína supresora de tumores que desempeña un papel fundamental en la regulación del equilibrio entre proliferación celular y apoptosis/detención del crecimiento celular. En condiciones normales, la semivida de p53 es muy corta y, por consiguiente, el nivel de p53 en células es bajo. Sin embargo, en respuesta al daño a ADN

15 celular o estrés celular (por ejemplo, activación de oncogenes, erosión de telómeros, hipoxia), los niveles de p53 aumentan. Este aumento en los niveles de p53 conduce a la activación de la transcripción de varios genes que dirigen la célula a o bien detener el crecimiento o bien a procesos de apoptosis. Por tanto, una importante función de p53 es impedir la proliferación descontrolada de células dañadas y, por tanto, proteger el organismo frente al desarrollo de cáncer.

La MDM2 es un regulador negativo clave de la función de p53. Forma un bucle autorregulador negativo uniéndose al dominio de transactivación amino-terminal de p53 y, por tanto, MDM2 tanto inhibe la capacidad de p53 para activar la transcripción como selecciona como diana p53 para la degradación proteolítica. En condiciones normales, este bucle regulador es responsable del mantenimiento de niveles bajos de p53. Sin embargo, en tumores con p53 de

25 tipo natural, la concentración en equilibrio de p53 activa puede aumentarse antagonizando la interacción entre MDM2 y p53. Esto dará como resultado la restauración de los efectos proapoptóticos y antiproliferativos mediados por p53 en tales células tumorales.

MDM2 es un protooncogén celular. Se ha observado la sobreexpresión de MDM2 en una gama de cánceres. MDM2 se sobreexpresa en una variedad de tumores debido a la amplificación genética o al aumento de la transcripción o traducción. El mecanismo mediante el cual la amplificación de MDM2 promueve la carcinogénesis está relacionado, al menos en parte, con su interacción con p53. En células que sobreexpresan MDM2, la función protectora de p53 está bloqueada y, por tanto, las células no pueden responder al daño al ADN o al estrés celular aumentando los niveles de p53, lo que conduce a apoptosis y/o detención del crecimiento celular. Por tanto, tras el daño al ADN y/o

35 estrés celular, las células que sobreexpresan MDM2 tienen la libertad para seguir proliferando y adoptan un fenotipo carcinogénico. En estas condiciones, la alteración de la interacción de p53 y MDM2 liberaría la p53 y, por tanto, permitiría que funcionen las señales normales de apoptosis y/o detención del crecimiento.

MDM2 también puede tener funciones separadas además de la inhibición de p53. Por ejemplo, se ha mostrado que MDM2 interacciona directamente con el factor E2F1/DP1 de transcripción regulado por pRb. Esta interacción podría ser crucial para las actividades oncogénicas de MDM2 independientes de p53. Un dominio de E2F1 muestra una similitud llamativa con el dominio de unión a MDM2 de p53. Puesto que las interacciones de MDM2 tanto con p53 como con E2F1 se localizan en el mismo sitio de unión en MDM2, puede esperarse que los antagonistas de MDM2/p53 no solo activen p53 celular sino que también modulen actividades de E2F1, que habitualmente están

45 desreguladas en células tumorales.

Además, la eficacia terapéutica de agentes que dañan el ADN usados actualmente (quimioterapia y radioterapia), puede estar limitada a través de la regulación negativa de p53 por MDM2. Por tanto, si se interrumpe la inhibición de p53 por retroalimentación de MDM2, un aumento de los niveles de p53 funcional aumentará la eficacia terapéutica de tales agentes restaurando la función de p53 de tipo natural que conduce a apoptosis y/o reversión de la resistencia a fármacos asociada a p53. Se demostró que combinar la inhibición de MDM2 y tratamientos que dañan el ADN in vivo conducía a efectos antitumorales sinérgicos (Vousden K.H., Cell, vol. 103, 691-694, 2000).

Por tanto, la alteración de la interacción de MDM2 y p53 ofrece un enfoque para la intervención terapéutica en

55 tumores con p53 de tipo natural, incluso podría presentar efectos antiproliferativos en células tumorales que carecen de p53 funcional y además pueden sensibilizar células tumorigénicas para la quimioterapia y radioterapia.

Antecedentes de la invención

El documento JP 11130750, publicado el 18 de mayo de 1999, describe entre otros, derivados de fenilaminocarbonilindolilo sustituidos como antagonistas de receptores de 5-HT.

El documento EP1129074 (WO 00/27819), publicado el 18 de mayo de 2000, describe amidas del ácido antranílico como inhibidores de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y útiles en el tratamiento de

65 trastornos angiogénicos.

El documento EP1317443 (WO 02/22599), publicado el 21 de marzo de 2002, da a conocer derivados de aminas terciarias tricíclicos, útiles como moduladores de receptores CXCR4 o CCR5 de quimiocinas para tratar el virus de la inmunodeficiencia humana y el virus de la inmunodeficiencia felina.

El documento EP1379239 (WO 02/078639), publicado el 10 de octubre de 2002, da a conocer N-(2ariletil)bencilaminas como antagonistas del receptor de 5-HT6.

El documento WO00/15357, publicado el 23 de marzo de 2000, proporciona derivados de piperazin-4-fenilo como inhibidores de la interacción entre MDM2 y p53. El documento EP1137418, publicado el 8 de junio de 2000, proporciona compuestos tricíclicos para restaurar la estabilidad conformacional de una proteína de la familia de p53.

El documento EP1443937, publicado el 22 de mayo de 2003, describe 1,4-benzodiazepinas sustituidas y los usos de las mismas como inhibidores de las interacciones MDM2-p53.

El documento EP1458380, publicado el 26 de junio de 2003, proporciona cis-2,4,5-trifenil-imidazolonas que inhiben la interacción de la proteína MDM2 con péptidos similares a p53 y tienen actividad antiproliferativa.

El documento EP1519932, publicado el 15 de enero de 2004, da a conocer compuestos de bisarilsulfonamida que se unen a MDM2 y pueden usarse en la terapia contra el cáncer.

Además, la técnica anterior incluye el documento WO 03/040402. Este documento da a conocer una amplia clase de compuestos dirigidos a inhibir o alterar la interacción entre una hélice alfa de una primera proteína y una cavidad de unión a hélice alfa de una segunda proteína.

Aún existe la necesidad de moléculas pequeñas eficaces y potentes que inhiban las interacciones entre MDM2 y p53.

En cuanto a tales inhibidores, también se hace referencia al documento WO 2006/032631, que representa una solicitud de patente presentada con anterioridad, no publicada previamente.

Los compuestos de la presente invención difieren de la técnica anterior en estructura, en su actividad farmacológica y/o en la potencia farmacológica.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona compuestos, composiciones para, y métodos de, inhibir las interacciones entre MDM2 y p53 para tratar el cáncer. Además, los compuestos y las composiciones de la presente invención son útiles en la potenciación de la eficacia de la quimioterapia y radioterapia.

Esta invención se refiere a compuestos de fórmula (I) tal como se definen en la reivindicación 1.

Los compuestos de fórmula (I) también pueden existir en sus formas tautoméricas. Tales formas, aunque no indicadas explícitamente en la fórmula anterior, se pretende que estén incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Varios términos se explican a continuación en el presente documento. A veces, estos términos se usan como tal o en términos compuestos.

Tal como se usa a continuación en el presente documento, halo es genérico para flúor, cloro, bromo y yodo; alquilo C1-6 define radicales hidrocarbonados saturados de cadena lineal o ramificada que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono tales como, por ejemplo metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, 1-metiletilo, 2-metilpropilo, 2-metil-butilo, 2-metilpentilo y similares; hidroxi-alquilo C1-6 define un sustituyente hidroxilo en radicales hidrocarbonados saturados de cadena lineal o ramificada que tienen desde 1 hasta 6 átomos de carbono; trihalometilo define metilo que contiene tres sustituyentes halo idénticos o diferentes, por ejemplo trifluorometilo; cicloalquilo C3-7 incluye grupos hidrocarbonados cíclicos que tienen desde 3 hasta 10 carbonos, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, y similares.

El término “sal de adición” comprende las sales que pueden formar los compuestos de fórmula (I) con bases orgánicas o inorgánicas tales como aminas, bases de metales alcalinos y bases de metales alcalinotérreos, o bases de amonio cuaternario, o con ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como ácidos minerales, ácidos sulfónicos, ácidos carboxílicos o ácidos que contienen fósforo.

El término “sal de adición” comprende además sales farmacéuticamente aceptables, complejos metálicos y solvatos y las sales de los mismos, que pueden formar los compuestos de fórmula (I).

El término “sales farmacéuticamente aceptables” significa sales de adición de ácidos o bases farmacéuticamente

aceptables. Se entiende que las sales de adición de ácidos o bases farmacéuticamente aceptables tal como se mencionan anteriormente comprenden las formas de sal de adición de ácidos no tóxicos y de bases no tóxicas terapéuticamente activas que pueden formar los compuestos de fórmula (I). Los compuestos de fórmula (I) que tienen propiedades básicas pueden convertirse en sus sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables tratando dicha forma de base con un ácido apropiado. Los ácidos apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos, tales como ácidos hidrácidos halogenados, por ejemplo ácido clorhídrico o bromhídrico; ácidos sulfúrico; nítrico; fosfórico y similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácidos acético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico, salicílico, paminosalicílico, pamoico y similares. Los compuestos de fórmula (I) que tienen propiedades ácidas pueden convertirse en sus sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables tratando dicha forma de ácido con una base orgánica o inorgánica adecuada. Las formas de sal de bases apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, por ejemplo las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, sales con bases orgánicas, por ejemplo las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginina, lisina y similares. Los términos sal de adición de ácidos o bases también comprenden los hidratos y las formas de adición de disolventes que pueden formar los compuestos de fórmula (I). Ejemplos de tales formas son, por ejemplo hidratos, alcoholatos y similares.

El término “complejos metálicos” significa un complejo formado entre un compuesto de fórmula (I) y una sal o más sales metálicas orgánicas o inorgánicas. Los ejemplos de dichas sales orgánicas o inorgánicas comprenden los halogenuros, nitratos, sulfatos, fosfatos, acetatos, trifluoroacetatos, tricloroacetatos, propionatos, tartratos, sulfonatos, por ejemplo metilsulfonatos, 4-metilfenilsulfonatos, salicilatos, benzoatos y similares de los metales del segundo grupo principal del sistema periódico, por ejemplo las sales de magnesio o calcio, del tercer o cuarto grupo principal, por ejemplo aluminio, estaño, plomo así como de los grupos de transición primero a octavo del sistema periódico tales como, por ejemplo, de cromo, manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, zinc y similares.

El término “formas estereoquímicamente isoméricas de compuestos de fórmula (I)”; define todos los compuestos posibles constituidos por los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces pero que tienen diferentes estructuras tridimensionales que no son intercambiables, que pueden tener los compuestos de fórmula (I) . A menos que se mencione o indique lo contrario, la designación química de un compuesto engloba la mezcla de todas las formas estereoquímicamente isoméricas posibles que puede tener dicho compuesto. Dicha mezcla puede contener todos los diastereómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho compuesto. Se pretende que todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de fórmula (I) tanto en forma pura como en mezcla de unas con otras estén abarcadas dentro del alcance de la presente invención.

De especial interés son los compuestos de fórmula (I) que son estereoquímicamente puros.

Las formas estereoisoméricas puras de los compuestos y productos intermedios tal como se mencionan en el presente documento se definen como isómeros sustancialmente libres de otras formas enantioméricas o diastereoméricas de la misma estructura molecular básica de dichos compuestos o productos intermedios. En particular, el término “estereoquímicamente puro” se refiere a compuestos o productos intermedios que tienen un exceso estereoisomérico de al menos el 80% (es decir, como mínimo el 90% de un isómero y como máximo el 10% de los demás isómeros posibles) hasta un exceso estereoisomérico del 100% (es decir, el 100% de un isómero y nada de los demás), más en particular, compuestos o productos intermedios que tienen un exceso estereoisomérico del 90% hasta el 100%, incluso más en particular que tienen un exceso estereoisomérico del 94% hasta el 100% y lo más en particular que tienen un exceso estereoisomérico del 97% hasta el 100%. Los términos “enantioméricamente puro” y “diastereoméricamente puro” deben entenderse de manera similar, pero teniendo en cuenta entonces el exceso enantiomérico, respectivamente el exceso diastereomérico de la mezcla en cuestión.

Se pretende que las formas tautoméricas de los compuestos de fórmula (I) comprendan aquellos compuestos de fórmula (I) en los que, por ejemplo, un grupo enol se convierte en un grupo ceto (tautomería cetoenólica).

Se pretende que las formas de N-óxido de los compuestos de fórmula (I) comprendan aquellos compuestos de fórmula (I) en los que uno o varios átomos de nitrógeno se oxidan para dar el denominado N-óxido, particularmente aquellos N-óxidos en los que uno o más de los nitrógenos de piperidina, piperazina o piridazinilo se oxidan en N.

Los compuestos de fórmula (I) pueden convertirse en las formas de N-óxido correspondientes siguiendo procedimientos conocidos en la técnica para convertir un nitrógeno trivalente en su forma de N-óxido. Dicha reacción de N-oxidación puede llevarse a cabo generalmente haciendo reaccionar el material de partida de fórmula (I) con un peróxido orgánico o inorgánico apropiado. Los peróxidos inorgánicos apropiados comprenden, por ejemplo, peróxido de hidrógeno, peróxidos de metales alcalinos o metales alcalinotérreos, por ejemplo peróxido de sodio, peróxido de potasio; los peróxidos orgánicos apropiados pueden comprender peroxiácidos tales como, por ejemplo, ácido bencenocarboperoxoico o ácido bencenocarboperoxoico halosustituido, por ejemplo ácido 3clorobencenocarboperoxoico, ácidos peroxoalcanoicos, por ejemplo ácido peroxoacético, hidroperóxidos de alquilo, por ejemplo hidro-peróxido de t-butilo. Disolventes adecuados son, por ejemplo, agua, alcoholes inferiores, por ejemplo etanol y similares, hidrocarburos, por ejemplo tolueno, cetonas, por ejemplo 2-butanona, hidrocarburos halogenados, por ejemplo diclorometano, y mezclas de tales disolventes.

La presente invención también pretende incluir cualquier isótopo de los átomos presentes en los compuestos de la invención. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio y los isótopos de carbono incluyen C-13 y 5 C-14.

Siempre que se use a continuación en el presente documento, el término “compuestos de fórmula (I)” pretende incluir también las formas de N-óxido, las sales de adición de ácidos o bases farmacéuticamente aceptables y todas las formas estereoisoméricas.

10 Un grupo de compuestos más preferidos consiste en aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos en los que m es 0; n es 2; p es 1; s es 0; t es 0; R1 y R2 son cada uno independientemente hidrógeno; A es un radical seleccionado de (a-21), (a-39) o (a-40); R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o alquiloxilo C1-6; Z es el radical (b-2); o R6 y R7 se seleccionan cada uno independientemente de

15 hidrógeno.

Los compuestos mas preferidos son el compuesto n.º 2, el compuesto n.º 3 o el compuesto n.º 5.

Comp. n.º 2

Comp. n.º 3

Comp. n.º 5

20 Los compuestos de fórmula (I), sus N-óxidos y sales farmacéuticamente aceptables y formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos pueden prepararse de manera convencional. Los materiales de partida y algunos de los productos intermedios son compuestos conocidos y están disponibles comercialmente o puede prepararse según procedimientos de reacción convencionales tal como se conoce generalmente en la técnica.

25 Varios métodos de preparación se describirán a continuación en el presente documento en más detalle. Las variables son tal como se definen en la reivindicación 1 a menos que se indique lo contrario. Otros métodos para obtener compuestos de fórmula (I) finales se describen en los ejemplos.

Los compuestos de fórmula (I) pueden prepararse haciendo reaccionar un producto intermedio de fórmula (II) con un

30 producto intermedio de fórmula (III) en la que W es un grupo saliente apropiado tal como, por ejemplo, halo, por ejemplo flúor, cloro, bromo o yodo, o un radical sulfoniloxilo tal como metilsulfoniloxilo, 4-metilfenilsulfoniloxilo y similares. La reacción puede realizarse en un disolvente inerte para la reacción tal como, por ejemplo, un alcohol, por ejemplo metanol, etanol, 2-metoxi-etanol, propanol, butanol y similares; un éter, por ejemplo 4,4-dioxano, 1,1’oxibispropano y similares; una cetona, por ejemplo 4-metil-2-pentanona; o N,N-dimetilformamida, nitrobenceno,

35 acetonitrilo, ácido acético y similares. La adición de una base apropiada tal como, por ejemplo, un carbonato o hidrogenocarbonato de metales alcalinos o alcalinotérreos, por ejemplo trietilamina o carbonato de sodio, puede utilizarse para recoger el ácido que se libera durante el transcurso de la reacción. Una pequeña cantidad de un yoduro de metal apropiado, por ejemplo, yoduro de sodio o de potasio puede añadirse para promover la reacción. La agitación puede potenciar la velocidad de la reacción. La reacción puede llevarse a cabo convenientemente a una

40 temperatura que oscila entre temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción y, si se desea, la reacción puede llevarse a cabo a una presión aumentada.

Los compuestos de fórmula (I), en la que p es 1, denominados en el presente documento compuestos de fórmula (Ia) pueden prepararse convirtiendo productos intermedios de fórmula (IV) con hidruro de litio y aluminio en un disolvente adecuado tal como tetrahidrofurano.

Los compuestos de fórmula (I-a) también pueden prepararse haciendo reaccionar un carboxaldehído apropiado de

10 fórmula (VI), con un producto intermedio de fórmula (V), en presencia de un reactivo apropiado, tal como un borohidruro de sodio, por ejemplo cianotrihidroborato soportado por polímero o tetrahidroborato de sodio, en un disolvente adecuado, tal como un alcohol, por ejemplo metanol.

Los compuestos de fórmula (I) o sus productos intermedios también pueden convertirse unos en otros mediante reacciones o transformaciones de grupos funcionales conocidas en la técnica. Varias de tales transformaciones se han descrito ya anteriormente en el presente documento. Otros ejemplos son hidrólisis de ésteres carboxílicos para dar el ácido carboxílico o alcohol correspondiente; hidrólisis de amidas para dar los ácidos carboxílicos o aminas 20 correspondientes; hidrólisis de nitrilos para dar las amidas correspondientes; pueden sustituirse grupos amino en imidazol o fenilo por un hidrógeno mediante reacciones de diazotación conocidas en la técnica y posterior sustitución del grupo diazo por hidrógeno; pueden convertirse alcoholes es ésteres y éteres; pueden convertirse aminas primarias en aminas secundarias o terciarias; pueden hidrogenarse dobles enlaces para dar el enlace sencillo correspondiente; puede convertirse un radical yodo en un grupo fenilo en un grupo éster mediante inserción de

25 monóxido de carbono en presencia de un catalizador de paladio adecuado.

Los productos intermedios de fórmula (II), en la que m es 0 y s es 0, denominados en el presente documento

productos intermedios de fórmula (II-a), pueden prepararse mediante una reacción de reducción de nitro a amina partiendo de un producto intermedio de fórmula (IX), en presencia de un catalizador metálico tal como Níquel Raney y un reductor apropiado tal como hidrógeno, en un disolvente adecuado tal como metanol o etanol.

Los productos intermedios de fórmula (X), en la que s es 0, pueden prepararse haciendo reaccionar un producto intermedio de fórmula (XI) con un producto intermedio de fórmula (XII) en presencia de reactivos apropiados, tales como monoclorhidrato de N’-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina (EDC) y 1-hidroxi-1H-benzotriazol

10 (HOBT). La reacción puede realizarse en presencia de una base tal como trietilamina, en un disolvente adecuado, tal como una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano.

15 Los productos intermedios de fórmula (VI) pueden prepararse haciendo reaccionar productos intermedios de fórmula

(XIII) con hidruro de litio y aluminio en un disolvente adecuado tal como tetrahidrofurano.

20 Los productos intermedios de fórmula (IX), en la que p es 1, denominados en el presente documento productos intermedios de fórmula (IX-a), pueden prepararse haciendo reaccionar un producto intermedio de fórmula (XVI) con un producto intermedio de fórmula (XVII), en la que Q es un grupo saliente apropiado tal como, por ejemplo, halo, por ejemplo flúor, cloro, bromo o yodo, o alquiloxilo C1-6, por ejemplo metiloxilo, en diisopropiletilamina.

Los productos intermedios de fórmula (V) en la que m, n y s son 0, denominados en el presente documento productos intermedios de fórmula (Va), pueden prepararse convirtiendo un producto intermedio de fórmula (XX) con disolución de clorhidrato.

Los productos intermedios de fórmula (XX) pueden prepararse haciendo reaccionar un producto intermedio de fórmula (XXI) con un producto intermedio de fórmula (III), en la que W es un grupo saliente apropiado tal como, por ejemplo, halo. La reacción puede realizarse en un disolvente inerte para la reacción tal como, por ejemplo ácido acético.

10 Dentro de la descripción general anterior de transformaciones, los compuestos de la invención pueden prepararse mediante el procedimiento tal como se define en la reivindicación 10.

Los compuestos de fórmula (I) y algunos de los productos intermedios pueden tener al menos un centro estereogénico en su estructura. Tal centro estereogénico puede estar presente en una configuración R o S.

15 Algunos de los compuestos de fórmula (I) y algunos de los productos intermedios en la presente invención pueden contener un átomo de carbono asimétrico. Las formas estereoquímicamente isoméricas puras de dichos compuestos y dichos productos intermedios pueden obtenerse mediante la aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden separarse diaestereoisómeros mediante métodos físicos, tales como técnicas cromatográficas

20 o de cristalización selectiva, por ejemplo distribución a contracorriente, cromatografía de líquidos y métodos similares. Pueden obtenerse enantiómeros a partir de mezclas racémicas convirtiendo en primer lugar dichas mezclas racémicas con agentes de resolución adecuados tales como, por ejemplo, ácidos quirales, en mezclas de sales o compuestos diastereoméricos; después separando dichas mezclas de sales o compuestos diastereoméricos mediante, por ejemplo, técnicas de cristalización selectiva, cromatografía de fluidos supercríticos o cromatográficas,

25 por ejemplo cromatografía de líquidos y métodos similares; y finalmente convirtiendo dichas sales o compuestos diastereoméricos separados en los correspondientes enantiómeros. También pueden obtenerse formas estereoquímicamente isoméricas puras a partir de las formas estereoquímicamente isoméricas puras de los productos intermedios y materiales de partida apropiados, siempre que las reacciones que intervengan se produzcan de manera estereoespecífica.

30 Los compuestos de fórmula (I), las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables y formas estereoisoméricas de los mismos tienen propiedades farmacológicas valiosas porque inhiben la interacción entre p53 y MDM2.

35 El término “MDM2” se usa en el presente documento para significar una proteína obtenida como resultado de la expresión del gen mdm2. Dentro del significado de este término, MDM2 engloba todas las proteínas codificadas por mdm2, mutantes de las mismas, proteínas de corte y empalme alternativo de las mismas, y proteínas fosforiladas de las mismas. Adicionalmente, tal como se usa en el presente documento, el término “MDM2” incluye análogos de MDM2, por ejemplo MDMX, también conocido como MDM4, y homólogos y análogos de MDM2 de otros animales,

40 por ejemplo el homólogo humano HDM2 o el análogo humano HDMX.

El término “inhibir la interacción” o “inhibidor de la interacción” se usa en el presente documento para que signifique impedir o reducir la asociación directa o indirecta de una o más moléculas, péptidos, proteínas, enzimas o

receptores; o impedir o reducir la actividad normal de una o más moléculas, péptidos, proteínas, enzimas o receptores.

El término “inhibidor de la interacción de p53 con MDM2” o “inhibidor de p53-MDM2” se usa en el presente documento para describir un agente que aumenta la expresión de p53 en el ensayo descrito en C.1. Este aumento puede estar provocado por, pero no se limita a, uno o más de los siguientes mecanismos de acción:

-

inhibir la interacción entre p53 y MDM2,

-

asociación directa con o bien la proteína MDM2 o bien p53,

-

interacciones con dianas anteriores o posteriores, por ejemplo cinasas, o actividades enzimáticas implicadas en ubiquitinación o modificación por SUMO,

-

secuestro o transporte de MDM2 y p53 a diferentes compartimentos celulares,

-

modulación de proteínas que se asocian con MDM2, por ejemplo (pero sin limitarse a), p73, E2F-1, Rb, p21waf1 o cip1,

-

regulación por disminución o interferencia en la expresión de MDM2 y/o la actividad de MDM2, por ejemplo (pero sin limitarse a), tener un impacto sobre su localización celular, modificación postraduccional, exportación al núcleo o actividad de ubiquitina ligasa,

-

estabilización directa o indirecta de la proteína p53, por ejemplo manteniéndola en su forma estructural funcional, o impidiendo su plegamiento incorrecto,

-

potenciar la expresión de p53 o la expresión de miembros de la familia p53, por ejemplo p63 y p73.

-

aumentar la actividad de p53, por ejemplo (pero sin limitarse a), potenciando su actividad transcripcional y/o

-

aumentar la expresión de genes y proteínas de la ruta de señalización de p53, por ejemplo (pero sin limitarse a) p21waf1, cip1, MIC-1 (GDF-15), PIG-3 y ATF-3.

Por tanto, la presente invención da a conocer los compuestos de fórmula (I) para su uso como medicamento.

Además, la invención también se refiere al uso de un compuesto para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento tumoral, siendo dicho compuesto un compuesto de fórmula (I)

El término “tratar” o “tratamiento” tal como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad y/o un estado en un animal, particularmente un ser humano, e incluye: (i) impedir que una enfermedad y/o un estado se produzcan en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad y/o el estado pero aún no se ha diagnosticado que lo tiene; (ii) inhibir la enfermedad y/o el estado, es decir, detener su desarrollo; (iii) aliviar la enfermedad y/o el estado, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o el estado.

Los compuestos de la invención pueden tener efectos antiproliferativos en células tumorales, incluso si tales células carecen de p53 funcional. Más en particular, los compuestos de la invención pueden tener efectos antiproliferativos en tumores con p53 de tipo natural y/o en tumores que sobreexpresan MDM2.

Ejemplos de tumores que pueden inhibirse, pero no se limitan a, cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma e incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas), cánceres pancreáticos (por ejemplo, carcinoma pancreático tal como, por ejemplo carcinoma pancreático exocrino), cánceres de colon (por ejemplo, carcinomas colorrectales, tales como, por ejemplo, adenocarcinoma de colon y adenoma de colon), cáncer esofágico, carcinoma escamoso oral, carcinoma de lengua, carcinoma gástrico, cáncer nasofaríngeo, tumores hematopoyéticos del linaje linfoide (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt), linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, leucemias mieloides (por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA)), cáncer folicular de tiroides, síndrome mielodisplásico (SMD), tumores de origen mesenquimatoso (por ejemplo, fibrosarcomas y rabdomiosarcomas), melanomas, teratocarcinomas, neuroblastomas, tumores cerebrales, gliomas, tumos benigno de la piel (por ejemplo, queratoacantomas), carcinoma de mama (por ejemplo, cáncer de mama avanzado), carcinoma de riñón, carcinoma de ovario, carcinoma cervicouterino, carcinoma endometrial, carcinoma de vejiga, cáncer de próstata incluyendo la enfermedad avanzada, cánceres de testículos, osteosarcoma, cáncer de cabeza y cuello y carcinoma epidérmico.

Los compuestos de la presente invención también pueden usarse para el tratamiento y la prevención de estados inflamatorios.

Los compuestos de la presente invención también pueden usarse para el tratamiento de estados y enfermedades autoinmunitarios. Con el término “enfermedades autoinmunitarias” quiere decirse cualquier enfermedad en la que el

sistema inmunitario de un animal reacciona de manera adversa frente a un autoantígeno. Con el término “autoantígeno” quiere decirse cualquier antígeno que se encuentra normalmente en el cuerpo del animal. Las enfermedades autoinmunitarias representativas incluyen, pero no se limitan a: tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, esclerosis múltiple, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES o lupus), dermatomiositis, enfermedad de Crohn, granulomatosis de Wegener, enfermedad por anticuerpos anti-membrana basal glomerular, antifosfolípido, 25 dermatitis herpetiforme, encefalomielitis alérgica, glomerulonefritis, glomerulonefritis membranosa, síndrome de Goodpasture, Lambert-Eaton, síndrome miasténico, miastenia grave, penfigoide ampolloso, poliendocrinopatías, enfermedad de Reiter y síndrome de la persona rígida (Stiff-Man).

Los compuestos de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con proteínas conformacionales inestables o con plegamiento incorrecto. Los ejemplos de enfermedades asociadas con proteínas conformacionales inestables o con plegamiento incorrectoincluyen pero no se limitan a: fibrosis quística (CFTR), síndrome de Marfan (fibrilina), esclerosis lateral amiotrófica (superóxido dismutasa), escorbuto (colágeno), enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (complejo de alfa-cetoácido deshidrogenasa), osteogénesis imperfecta (procolágeno pro-alfa tipo l), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (prión), enfermedad de Alzheimer (beta-amiloide), amiloidosis familiar (lisozima), cataratas (cristalinas), hipercolesterolemia familiar (receptor de LDL), deficiencia de α1-antitripsina, enfermedad de Tay-Sachs (beta-hexosaminidasa), retinitis pigmentaria (rodopsina) y leprechaunismo (receptor de insulina).

En vista de sus propiedades farmacológicas útiles, los compuestos objeto pueden formularse en diversas formas farmacéuticas para fines de administración.

Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, se combina una cantidad eficaz de un compuesto particular, en forma de sal de adición de bases o ácidos, como principio activo, en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, portador que puede adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas están de manera deseable en forma de dosificación unitaria adecuada, preferiblemente, para la administración por vía oral, por vía rectal, por vía percutánea o mediante inyección parenteral. Por ejemplo, en la preparación de composiciones en forma de dosificación oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos habituales, tal como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales, tales como suspensiones, jarabes, elixires y disoluciones; o portadores sólidos, tales como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos.

Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma unitaria de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. Para composiciones parenterales, el portador comprenderá habitualmente agua estéril, al menos en gran parte, aunque pueden incluirse otros componentes, para ayudar por ejemplo en la solubilidad. Por ejemplo, pueden prepararse disoluciones inyectables en las que el portador comprende solución salina, disolución de glucosa o una mezcla de solución salina y disolución de glucosa. También pueden prepararse suspensiones inyectables en cuyo caso pueden emplearse portadores, agentes de suspensión y similares líquidos apropiados. En las composiciones adecuadas para la administración percutánea, el portador comprende opcionalmente un agente de potenciación de la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones minoritarias, aditivos que no provocan un efecto perjudicial significativo en la piel. Dichos aditivos pueden facilitar la administración a la piel y/o pueden útiles para preparar las composiciones deseadas. Estas composiciones pueden administrarse de diversas maneras, por ejemplo, como un parche transdérmico, como una pipeta para aplicación en la piel (spot on), como una pomada. Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma unitaria de dosificación por su facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Forma unitaria de dosificación tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones en el presente documento se refiere unidades diferenciadas físicamente adecuadas como dosificaciones unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Ejemplos de tales formas unitarias de dosificación son comprimidos (incluyendo comprimidos ranurados o recubiertos), cápsulas, pastillas, paquetes de polvos, obleas, disoluciones o suspensiones inyectables, cucharadas pequeñas, cucharadas y similares, y múltiplos segregados de los mismos.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma unitaria de dosificación por su facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Forma unitaria de dosificación tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones en el presente documento se refiere a unidades diferenciadas físicamente adecuadas como dosificaciones unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador farmacéutico requerido. Ejemplos de tales formas unitarias de dosificación son comprimidos (incluyendo comprimidos ranurados o recubiertos), cápsulas, pastillas, paquetes de polvos, obleas, disoluciones o suspensiones inyectables, cucharadas pequeñas, cucharadas y similares, y múltiplos segregados de los mismos.

El compuesto de la invención se administra en una cantidad suficiente para inhibir la interacción entre MDM2 y p53 u

otras proteínas celulares que inducen apoptosis, inducen muerte celular o regulan el ciclo celular.

El potencial oncogénico de MDM2 no solo está determinado por su capacidad de suprimir p53, sino también por su capacidad para regular otras proteínas supresoras de tumores, por ejemplo la proteína del retinoblastoma pRb y el factor de transcripción E2F1 estrechamente asociado.

Por tanto, el compuesto de la invención se administra en una cantidad suficiente para modular la interacción entre MDM2 y los factores de transcripción E2F.

Los expertos en la técnica podrían determinar fácilmente la cantidad eficaz a partir de los resultados de las pruebas presentadas a continuación en el presente documento. En general, se contempla que una cantidad terapéuticamente eficaz sería de desde 0,005 mg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal, y en particular de desde 0,005 mg/kg hasta 10 mg/kg de peso corporal. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida como, dos, tres, cuatro o más subdosis individuales a intervalos apropiados en todo el día. Dichas subdosis pueden formularse como formas de dosificación unitarias, por ejemplo, que contienen de 0,5 a 500 mg, y en particular de 10 mg a 500 mg de principio activo por forma de dosificación unitaria.

Como otro aspecto de la presente invención, se prevé una combinación de un inhibidor de p53-MDM2 con otro agente anticancerígeno, especialmente para su uso como medicamento, más específicamente en el tratamiento del cáncer o enfermedades relacionadas.

Para el tratamiento de los estados anteriores, los compuestos de la invención pueden emplearse ventajosamente en combinación con uno o más de otros agentes farmacológicos, más particularmente, con otros agentes anticancerígenos. Los ejemplos de agentes anticancerígenos incluyen pero no se limitan a:

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compuestos de coordinación de platino, por ejemplo, cisplatino, carboplatino u oxaliplatino;

-

compuestos de taxano, por ejemplo paclitaxel o docetaxel;

-

inhibidores de la topoisomerasa I, tales como compuestos de camptotecina, por ejemplo irinotecán o topotecán;

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inhibidores de la topoisomerasa II, tales como epipodofilotoxinas o derivados de podofilotoxinas antitumorales, por ejemplo etopósido o tenipósido;

-

alcaloides de la vinca antitumorales, por ejemplo vinblastina, vincristina o vinorelbina;

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derivados de nucleósidos antitumorales, por ejemplo 5-fluorouracilo, leucovorina, gemcitabina o capecitabina;

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agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas o nitrosourea, por ejemplo ciclofosfamida, clorambucilo, carmustina, tiotepa, melfalán o lomustina;

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derivados de antraciclinas antitumorales, por ejemplo daunorubicina, doxorubicina, doxil, idarubicina o mitoxantrona;

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moléculas que seleccionan como diana el receptor de IGF-1, por ejemplo picropodofilina;

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derivados de tetracarcina, por ejemplo tetrocarcina A;

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glucocorticoides, por ejemplo prednisona;

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anticuerpos, por ejemplo trastuzumab (anticuerpo anti-HER2), rituximab (anticuerpo anti-CD20), gemtuzamab, cetuximab, pertuzumab o bevacizumab;

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antagonistas de receptores de estrógenos o moduladores selectivos de receptores de estrógenos , por ejemplo, tamoxifeno, fulvestrant, toremifeno, droloxifeno, faslodex o raloxifeno;

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inhibidores de la aromatasa, tales como exemestano, anastrozol, letrazol y vorozol;

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agentes de diferenciación, tales como retinoides, vitamina D o ácido retinoico y agentes bloqueantes del metabolismo del ácido retinoico (RAMBA), por ejemplo Accutane;

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inhibidores de la ADN metil transferasa, por ejemplo azacitidina o decitabina;

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antifolatos, por ejemplo pemetrexed disódico;

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antibióticos, por ejemplo actinomicina D, bleomicina, mitomicina C, dactinomicina, carminomicina o daunomicina;

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antimetabolitos, por ejemplo clofarabina, aminopterina, arabinósido de citosina o metotrexato;

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agentes inductores de apoptosis y agentes antiangiogénicos, tales como inhibidores de Bcl-2, por ejemplo, YC 137, BH 312, ABT 737, gosipol, HA 14-1, TW 37 o ácido decanoico;

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agentes de unión a tubulina, por ejemplo combrestatina, colchicinas o nocodazol;

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inhibidores de cinasas, por ejemplo flavoperidol, mesilato de imatinib, erlotinib o gefitinib;

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inhibidores de la farnesiltransferasa, por ejemplo tipifarnib;

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inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC), por ejemplo butirato de sodio, ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), depsipéptido (FR 901228), NVP-LAQ824, R306465, JNJ-26481585 o tricostatina A;

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Inhibidores de la ruta de ubiquitina-proteasoma, por ejemplo PS-341, MLN .41 o bortezomib;

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Yondelis;

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inhibidores de la telomerasa, por ejemplo telomestatina;

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inhibidores de metaloproteinasas de la matriz, por ejemplo batimastat, marimastat, prinostat o metastat.

Tal como se indicó anteriormente, los compuestos de la presente invención también tienen aplicaciones terapéuticas en la sensibilización de células tumorales para la quimioterapia y radioterapia.

Por tanto, los compuestos de la presente invención pueden usarse como “radiosensibilizador” y/o “quimiosensibilizador” o pueden administrarse en combinación con otro “radiosensibilizador” y/o “quimiosensibilizador”.

El término “radiosensibilizador”, tal como se usa en el presente documento, se define como una molécula, preferiblemente una molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en cantidades terapéuticamente eficaces para aumentar la sensibilidad de las células a radiación ionizante y/o para promover el tratamiento de enfermedades que pueden tratarse con radiación ionizante.

El término “quimiosensibilizador”, tal como se usa en el presente documento, se define como una molécula, preferiblemente una molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en cantidades terapéuticamente eficaces para aumentar la sensibilidad de células a quimioterapia y/o promover el tratamiento de enfermedades que pueden tratarse con agentes quimioterápicos.

Se han sugerido varios mecanismos para el modo de acción de los radiosensibilizadores en la bibliografía incluyendo: radiosensibilizadores de células hipóxicas (por ejemplo, compuestos de 2-nitroimidazol, y compuestos de dióxido de benzotriazina) que imitan al oxígeno o alternativamente se comportan como agentes biorreductores con hipoxia; radiosensibilizadores de células no hipóxicas (por ejemplo, pirimidinas halogenadas) pueden ser análogos de bases de ADN y se incorporan preferentemente en el ADN de células cancerosas y promueven de ese modo la rotura inducida por radiación de moléculas de ADN y/o impiden los mecanismos de reparación de ADN normales; y se han planteado como hipótesis otros posibles mecanismos de acción diversos para radiosensibilizadores en el tratamiento de enfermedad. Muchos protocolos de tratamiento contra el cáncer emplean actualmente radiosensibilizadores junto con radiación de rayos X. Los ejemplos de radiosensibilizadores activados por rayos X incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, nicotinamida, 5bromodesoxiuridina (BUdR), 5-yododesoxiuridina (IUdR), bromodesoxicitidina, fluorodesoxiuridina (FudR), hidroxiurea, cisplatino y análogos y derivados terapéuticamente eficaces de los mismos. La terapia fotodinámica (TFD) de cánceres emplea luz visible como el activador de radiación del agente de sensibilización. Los ejemplos de radiosensibilizadores fotodinámicos incluyen los siguientes, pero no se limitan a: derivados de hematoporfirina, Photofrin, derivados de benzoporfirina, etioporfirina de estaño, feoforbida-a, bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de zinc, y análogos y derivados terapéuticamente eficaces de los mismos. Pueden administrarse radiosensibilizadores junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de otros compuestos, incluyendo pero sin limitarse a: compuestos que promueven la incorporación de radiosensibilizadores a las células diana; compuestos que controlan el flujo de agentes terapéuticos, nutrientes y/u oxígeno a las células diana; agentes quimioterápicos que actúan sobre el tumor con o sin radiación adicional; u otros compuestos terapéuticamente eficaces para tratar el cáncer u otra enfermedad.

Pueden administrarse quimiosensibilizadores junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de otros compuestos, incluyendo pero sin limitarse a: compuestos que promueven la incorporación de quimiosensibilizadores en las células diana; compuestos que controlan el flujo de agentes terapéuticos, nutrientes y/u oxígeno a las células

diana; agentes quimioterápicos que actúan sobre el tumor u otros compuestos terapéuticamente eficaces para tratar el cáncer u otra enfermedad. Se ha encontrado que los antagonistas de calcio, por ejemplo verapamilo, son útiles en combinación con agentes antineoplásicos para establecer quimiosensibilidad en células tumorales resistentes a agentes quimioterápicos aceptados y para potenciar la eficacia de tales compuestos en tumores malignos sensibles a fármacos.

En vista de sus propiedades farmacológicas útiles, los componentes de las combinaciones según la invención, es decir el otro agente farmacológico y el inhibidor de p53-MDM pueden formularse en diversas formas farmacéuticas para fines de administración. Los componentes pueden formularse por separado en composiciones farmacéuticas individuales o en una composición farmacéutica unitaria que contiene ambos componentes.

Por tanto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el otro agente farmacológico y el inhibidor de p53-MDM junto con uno o más portadores farmacéuticos.

La presente invención se refiere además al uso de una combinación según la invención en la fabricación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de células tumorales.

La presente invención se refiere además a un producto que contiene como primer principio activo un inhibidor de p53-MDM2 según la invención y como segundo principio activo un agente anticancerígeno, como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer.

El otro agente farmacológico y el inhibidor de p53-MDM2 pueden administrarse simultáneamente (por ejemplo, en composiciones separadas o unitarias) o secuencialmente en cualquier orden. En este último caso, los dos compuestos se administrarán en un periodo y en una cantidad y manera que sean suficientes para garantizar que se logra un efecto ventajoso o sinérgico. Se apreciará que el método y orden de administración preferidos y las cantidades y los regímenes de dosificación respectivos para cada componente de la combinación dependerán del otro agente farmacológico particular y del inhibidor de p53-MDM2 que estén administrándose, su vía de administración, el tumor particular que esté tratándose y el huésped particular que esté tratándose. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el método y el orden de administración y las cantidades y los regímenes de dosificación óptimos usando métodos convencionales y en vista de la información expuesta en el presente documento.

El compuesto de coordinación de platino se administra ventajosamente en una dosificación de 1 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 50 a 400 mg/m2, particularmente para cisplatino en una dosificación de aproximadamente 75 mg/m2 y para carboplatino de aproximadamente 300 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El compuesto de taxano se administra ventajosamente en una dosificación de 50 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 75 a 250 mg/m2, particularmente para paclitaxel en una dosificación de aproximadamente 175 a 250 mg/m2 y para docetaxel de aproximadamente 75 a 150 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El compuesto de camptotecina se administra ventajosamente en una dosificación de 0,1 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 1 a 300 mg/m2, particularmente para irinotecán en una dosificación de aproximadamente 100 a 350 mg/m2 y para topotecán de aproximadamente 1 a 2 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El derivado de podofilotoxina antitumoral se administra ventajosamente en una dosificación de 30 a 300 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 50 a 250 mg/m2, particularmente para etopósido en una dosificación de aproximadamente 35 a 100 mg/m2 y para tenipósido de aproximadamente 50 a 250 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El alcaloide de la vinca antitumoral se administra ventajosamente en una dosificación de 2 a 30 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, particularmente para vinblastina en una dosificación de aproximadamente 3 a 12 mg/m2, para vincristina en una dosificación de aproximadamente 1 a 2 mg/m2, y para vinorelbina en una dosificación de aproximadamente 10 a 30 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El derivado de nucleósido antitumoral se administra ventajosamente en una dosificación de 200 a 2500 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 700 a 1500 mg/m2, particularmente para 5-FU en una dosificación de 200 a 500 mg/m2, para gemcitabina en una dosificación de aproximadamente 800 a 1200 mg/m2 y para capecitabina de aproximadamente 1000 a 2500 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

Los agentes alquilantes, tales como mostaza nitrogenada o nitrosourea se administran ventajosamente en una dosificación de 100 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 120 a 200 mg/m2, particularmente para ciclofosfamida en una dosificación de aproximadamente 100 a 500 mg/m2, para clorambucilo en una dosificación de aproximadamente 0,1 a 0,2 mg/kg, para carmustina en una dosificación de

aproximadamente 150 a 200 mg/m2, y para lomustina en una dosificación de aproximadamente 100 a 150 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El derivado de antraciclina antitumoral se administra ventajosamente en una dosificación de 10 a 75 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 15 a 60 mg/m2, particularmente para doxorubicina en una dosificación de aproximadamente 40 a 75 mg/m2, para daunorubicina en una dosificación de aproximadamente 25 a 45 mg/m2, y para idarubicina en una dosificación de aproximadamente 10 a 15 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El agente antiestrógenos se administra ventajosamente en una dosificación de aproximadamente 1 a 100 mg al día dependiendo del agente particular y del estado que esté tratándose. El tamoxifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosificación de 5 a 50 mg, preferiblemente de 10 a 20 mg dos veces al día, continuando la terapia durante un tiempo suficiente para lograr y mantener un efecto terapéutico. El toremifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosificación de aproximadamente 60 mg una vez al día, continuando la terapia durante un tiempo suficiente para lograr y mantener un efecto terapéutico. El anastrozol se administra ventajosamente por vía oral en una dosificación de aproximadamente 1 mg una vez al día. El droloxifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosificación de aproximadamente 20-100 mg una vez al día. El raloxifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosificación de aproximadamente 60 mg una vez al día. El exemestano se administra ventajosamente por vía oral en una dosificación de aproximadamente 25 mg una vez al día.

Los anticuerpos se administran ventajosamente en una dosificación de aproximadamente 1 a 5 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, o tal como se conoce en la técnica, si es diferente. El trastuzumab se administra ventajosamente en una dosificación de 1 a 5 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, particularmente de 2 a 4 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

Las dosificaciones pueden administrarse por ejemplo una, dos o más veces por ciclo de tratamiento, lo que puede repetirse, por ejemplo, cada 7, 14, 21 ó 28 días.

Los compuestos de fórmula (I), las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables y formas estereoisoméricas de los mismos pueden tener propiedades de diagnóstico valiosas de modo que pueden usarse para detectar o identificar una interacción p53-MDM2 en una muestra biológica que comprende detectar o medir la formación de un complejo entre un compuesto marcado y/o p53 y/o MDM2 y/u otras moléculas, péptidos, proteínas, enzimas o receptores.

Los métodos de detección o identificación pueden usar compuestos que están marcados con agentes de marcaje, tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas, etc. Los ejemplos de los radioisótopos incluyen 125I, 131I, 3H y 14C. Las enzimas se hacen detectables habitualmente mediante la conjugación de un sustrato apropiado que, a su vez cataliza una reacción detectable. Los ejemplos de las mismas incluyen, por ejemplo, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, fosfatase alcalina, peroxidasa y malato deshidrogenasa, preferiblemente peroxidasa del rábano. Las sustancias luminosas incluyen, por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, aequorina y luciferasa. Las muestras biológicas pueden definirse como tejidos corporales o líquidos corporales. Ejemplos de líquidos corporales son líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, saliva y similares.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención.

Parte experimental

A continuación en el presente documento, “DCM” se define como diclorometano, “DIPE” se define como diisopropil éter, “EtOAc” se define como acetato de etilo, “EtOH” se define como etanol, “MeOH” se define como metanol y “THF” se define como tetrahidrofurano.

Puntos de fusión

Para varios compuestos, indicados mediante (Kofler), se obtuvieron los puntos de fusión con una placa caliente de Kofler, que consiste en una plancha caliente con gradiente de temperatura lineal, un indicador deslizable y una escala de temperatura en grados centígrados.

CL-EM

Procedimiento general

Se suministró el gradiente de HPLC mediante un sistema Alliance HT 2795 (Waters) que comprende una bomba cuaternaria con desgasificador, un inyector automático y un detector por red de diodos (DAD). El flujo desde la columna se fraccionó en un detector de EM. El detector de EM estaba configurado con una fuente de ionización por

electropulverización. La tensión de la aguja capilar era de 3 kV y se mantuvo la temperatura de la fuente a 100ºC en el espectrómetro de masas LCT (tiempo de vuelo-pulverización Z) de Waters). Se usó nitrógeno como el gas nebulizador. Se realizó la adquisición de datos con un sistema de datos Waters-Micromass MassLynx-Openlynx.

Método A

Además del procedimiento general: se llevó a cabo HPLC de fase inversa en una columna Xterra-RP C 18 (5 μm, 3,9 x 150 mm) con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. a una temperatura de 30ºC. Se emplearon dos fases móviles (fase móvil A: 100% de acetato de amonio 7 mM; fase móvil B: 100% de acetonitrilo; para ejecutar una condición en gradiente de desde el 85% de A, el 15% de B (mantenido durante 3 minutos) hasta el 20% de A, el 80% de B en 5 minutos, mantenido al 20% de A y al 80% de B durante 6 minutos y reequilibrado con las condiciones iniciales durante 3 minutos. Se usó un volumen de inyección de 20 μl. La tensión de cono era de 20 V para el modo de ionización positiva y negativa. Se adquirieron los espectros de masas mediante barrido desde 100 hasta 900 en 0,8 segundos usando una demora entre barridos de 0,08 segundos.

Método B

Además del procedimiento general: se llevó a cabo HPLC de fase inversa en una columna Xterra-RP C 18 (5 μm, 3,9 x 150 mm) con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. a una temperatura de 30ºC. Se emplearon dos fases móviles (fase móvil A: 100% de acetato de amonio 7 mM; fase móvil B: 100% de acetonitrilo; para ejecutar una condición en gradiente de desde el 100% de A (mantenido durante 1 minuto) hasta el 50% de A, el 50% de B en 4 minutos, mantenido al 50% de A y al 50% de B durante 9 minutos y reequilibrado con las condiciones iniciales durante 3 minutos. Se usó un volumen de inyección de 20 μl. La tensión de cono era de 20 V para el modo de ionización positiva y de 20 V para el modo de ionización negativa. Se adquirieron los espectros de masas mediante barrido desde 100 hasta 900 en 0,8 segundos usando una demora entre barridos de 0,08 segundos.

A. Preparación de los compuestos intermedios

Ejemplo A1

Preparación del producto intermedio 1

Se agitó una mezcla de benzo[b]furan-3-ona (400 mg, 0,0029 mol) y N-metoxi-Nmetil(trifenilfosforaniliden)acetamida (1,19 g, 0,0032 mol) en xileno (10 ml) a 135ºC durante 35 horas. Se extinguió la reacción con agua y se basificó con una disolución saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Se extrajo la mezcla con EtOAc, se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (40-63 μm) (eluyente: EtOAc/ciclohexano 50/50). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 210 mg (32%) de producto intermedio 1 como un aceite de color marrón. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,63 (m, 2H), 7,46 (d, 1H, J=7,1), 7,25 (m, 2H), 3,84 (s, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,22 (s, 3H).

EM (ES+) mlz 220 (M+1).

Ejemplo A2

a) Preparación del producto intermedio 2

Se agitó una mezcla de 1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-etanamina (0,014 mol), 1-fluoro-4-nitrobenceno (0,015 mol) y DIPE (0,048 mol) a 210ºC durante 30 minutos. Se evaporó el DIPE. Se disolvió el precipitado en DCM/MeOH. Se lavó la fase orgánica con carbonato de potasio al 10%, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el 55 residuo (2 g) mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 μm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,3). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 0,152 g (28%) de producto

intermedio 2, punto de fusión de 201ºC (Kofler). b) Preparación del producto intermedio 3

Se hidrogenó una mezcla de producto intermedio 2 (0,004 mol) y níquel Raney (1 g) en MeOH (20 ml) a temperatura ambiente durante 2 horas a una presión de 3 bares, entonces se filtró sobre Celite. Se lavó el Celite con MeOH. Se evaporó el filtrado, proporcionando 0,92 g (100%) de producto intermedio 3.

Ejemplo A3

a) Preparación del producto intermedio 4

Se hidrogenó una mezcla de imidazo[1,2-a]piridin-3-acetonitrilo (0,028 mol) y Rh/Al2O3 al 5% (4,5 g) en EtOH (45 ml) y MeOH/NH3 (12,5 ml) a temperatura ambiente durante 72 horas a una presión de 3 bares, entonces se filtró sobre Celite. Se lavó el Celite con DCM/EtOH. Se evaporó el filtrado. Se disolvió el residuo en DCM. Se lavó la fase

20 orgánica con carbonato de potasio al 10%, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente, proporcionando: 3,4 g (73%) de producto intermedio 4.

b) Preparación del producto intermedio 5

Se calentó una mezcla de producto intermedio 4 (0,006 mol), 1-fluoro-4-nitro-benceno (0,007 mol) y DIPE (0,021 mol) a 210ºC durante 30 minutos. Se evaporó el DIPE. Se diluyó el aceite en bruto en DCM y EtOH (90/10). Se lavó la fase orgánica con carbonato de potasio al 10%, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se

30 purificó el residuo (1,3 g) mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (20-45 μm) (eluyente: DCM/MeOH 98/2). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente. Se cristalizó el residuo (0,36 g) en acetonitrilo. Se retiró el precipitado mediante filtración y se secó, proporcionando 0,199 g de producto intermedio 5, punto de fusión de 171ºC (Kofler).

35 c) Preparación del producto intermedio 6

Se hidrogenó una mezcla de producto intermedio 5 (0,003 mol) y níquel Raney (1 g) en MeOH (20 ml) a temperatura 40 ambiente durante 3 horas a una presión de 3 bares, entonces se filtró sobre Celite. Se lavó el Celite con MeOH. Se evaporó el filtrado, proporcionando 1 g (>100%) de producto intermedio 6.

Ejemplo A4

45 a) Preparación del producto intermedio 7

Se agitó una mezcla de 1-fluoro-4-nitro-benceno (0,0083 mol), 1H-indol-5-amina (0,0076 mol) y DIPE (0,0166 mol) a 210ºC durante 18 horas, entonces se llevó a DCM. Se lavó la fase orgánica con ácido clorhídrico 3 N, después con 5 NaHCO3, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se llevó el residuo a EtOH. Se filtró el precipitado, se lavó con dietil éter y se secó, proporcionando 1,08 g (65%) de producto intermedio 7, punto de fusión de 180ºC.

b) Preparación del producto intermedio 8

Se hidrogenó una mezcla de producto intermedio 7 (0,0039 mol) y níquel Raney (1 g) en MeOH (20 ml) a temperatura ambiente durante 2 horas a una presión de 3 bares, entonces se filtró sobre Celite. Se lavó el Celite con DCM/MeOH. Se evaporó el filtrado, proporcionando 1 g (>100%) de producto intermedio 8.

Ejemplo A5

Preparación del producto intermedio 9

Se añadió gota a gota 1,1’-carboxildiimidazol (315 mg, 0,0019 mol) a una disolución de ácido (6-metoxi-benzofuran3-il)-acético (400 mg, 0,0019 mol) en DCM (10 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadió clorhidrato de O,N-dimetil-hidroxilamina (190 mg, 0,0019 mol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente

25 durante 4 horas. Se extinguió la reacción con hielo y se basificó con una disolución 4 N de hidróxido de sodio. Se extrajo la mezcla con DCM, se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (40-63 μm) (eluyente: EtOAc/ciclohexano 50/50). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 410 mg (85%) de producto intermedio 9 como un aceite incoloro.

30 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,54 (m, 2H), 6,99 (s, 1H), 6,88 (d, 1H, J=6,4), 3,83 (s, 3H), 3,79 (s, 2H), 3,69 (s, 3H), 3,21 (s, 3H).

Ejemplo A6

a) Preparación del producto intermedio 10

40 Se agitó una mezcla de éster 1,1-dimetiletílico del ácido (3-yodo-2-tienil)-carbámico (0,0105 mol), éster etílico del ácido 4-bromo-2-butenoico (0,0158 mol) y carbonato de potasio (0,021 mol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadieron trifenil-fosfina (0,001 mol) y acetato de paladio (0,0005 mol). Se agitó la mezcla a 70ºC durante 8 horas, entonces se lavó con agua. Se separó la fase orgánica con EtOAc, se secó (MgSO4) y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente: EtOAc/ciclohexano 10/90), proporcionando 2,3 g (70%) de producto intermedio 10.

b) Preparación del producto intermedio 11

Se agitó gota a gota una disolución de producto intermedio 10 (0,0016 mol) en THF (10 ml) a -78ºC bajo argón. Se agitó una disolución de N,O-dimetilhidroxilamina HCl (0,0004 mol) en THF (40 ml) a -78ºC bajo argón. Se añadió 10 gota a gota butil-litio (1,6 M en hexano) (0,016 mol) a -78ºC a N,O-dimetilhidroxilamina HCl (0,0004 mol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos, entonces se enfrió de nuevo hasta -78ºC. Se añadió gota a gota el producto intermedio 10. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 2 horas, se vertió en NH4Cl saturado a -78ºC y se extrajo con EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente: EtOAc/ciclohexano de 10/90 a 30/70). Se

15 recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 0,4 g (77%) de producto intermedio 11.

c) Preparación del producto intermedio 12

20 Se disolvió producto intermedio 11 (0,0012 mol) en DCM y se absorbió sobre gel de sílice. Se agitó la mezcla a 60ºC durante 24 horas a vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente: EtOAc/ciclohexano 80/20). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando (62%) de producto intermedio 12.

d) Preparación del producto intermedio 13

30 Se añadió lentamente hidruro de litio y aluminio (0,0008 mol) a 0ºC a una disolución de producto intermedio 12 (0,0008 mol) en THF (4 ml, seco). Se agitó la mezcla a 0ºC durante 1 hora, se vertió sobre hielo, se lavó con KHSO4 al 5% y se extrajo con EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente, proporcionando el producto intermedio 13. Este producto se usó directamente en la siguiente etapa de reacción.

35 B. Preparación de los compuestos finales

Ejemplo B1

Preparación del compuesto 1

Se añadió gota a gota una disolución de hidruro de litio y aluminio 1 N en THF (0,65 ml) a 0ºC a una suspensión de producto intermedio 1 (162 mg, 0,00065 mol) en THF (4 ml). Se agitó la mezcla durante 1 hora a 0ºC. Se extinguió la 5 reacción a 0ºC mediante la adición lenta de una disolución de bisulfato de potasio al 5% en agua y se extrajo dos veces con EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente dando benzofuran-3-il-acetaldehído. A una disolución de N-4-piridinil-1,4-bencenodiamina en MeOH (3 ml) y ácido acético (4 gotas) se le añadió cianoborohidruro de sodio (57 mg, 0,00091 mol) y se disolvió el aldehído anterior en MeOH (1 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se evaporó el disolvente, se llevó el aceite

10 residual a EtOAc y se lavó con una disolución saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (40-63 μm) (eluyente: DCM/MeOH 95/5). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 41 mg (20%) del compuesto 1, punto de fusión de 152ºC-154ºC.

15 1H-RMN (300 MHz, MeOH-d4) δ 7,98 (d, 2H, J=6,6), 7,59 (m, 2H), 7,43 (d, 1H, J=7,4), 7,24 (m, 2H), 7,00 (dd, 2H, J=8,7, J=3,3), 6,68 (m, 4H), 3,45 (t, 2H, J=7,2), 2,98 (t, 2H, J=7,2).

EM (ES+) m/z 330 (M+1).

20 Ejemplo B2

Preparación del compuesto 2

Se agitó una mezcla de producto intermedio 3 (0,004 mol) y clorhidrato de 4-bromo-piridina (0,004 mol) en ácido acético (5 ml) a 140ºC durante 15 minutos, entonces se evaporó. Se disolvió el residuo en DCM/MeOH. Se lavó la fase orgánica con carbonato de potasio al 10%, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo (1 g) mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 μm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH

30 90/10/1). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente. Se cristalizó el residuo (0,74 g, 63%) en acetonitrilo. Se retiró el precipitado mediante filtración y se secó, proporcionando 0,541 g del compuesto 2, punto de fusión de 182ºC (Kofler).

1H-RMN (DMSO-d6) δ 2,96 (2H, t, J=7,7 Hz), 3,30 (2H, t, J=7,7 Hz), 5,6 (1H, t, a, J=7,6 Hz), 6,58 (4H, m), 6,95 (2H,

35 d, J=7,7 Hz), 7,03 (1H, m), 7,33 (1H, m), 7,96 (1H, d, J=7,7 Hz), 8,03 (2H, d , J=7,6 Hz), 8,17-8,21 (1H,m), 8,22 (1H, s, a), 11,38 (1H, s, a)

CL-EM (ES+) m/z 330 (M+1), Rt = 7,10, método A.

40 Ejemplo B3

Preparación del compuesto 3

Se añadió clorhidrato de 4-bromo-piridina (0,004 mol) a una disolución de producto intermedio 6 (0,004 mol) en ácido acético (10 ml). Se calentó la mezcla a 140ºC durante 15 minutos en un horno de microondas. Se evaporó el ácido acético. Se disolvió el aceite en bruto en DCM/EtOH (90/10). Se lavó la fase orgánica con carbonato de potasio, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo (1 g) mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 μm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH de 90/10/0,5 a 90/10/1). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 0,63 g (48%) del compuesto 3.

1H-RMN (DMSO-d6) δ 1,75-1,93 (4H, m), 2,65-2,78 (4H, m), 3,32 (2H, s), 3,70 (2H, t , J=6,1 Hz), 5,62 (1H, t, a, J=7,6 Hz), 6,58-6,53 (5H, m), 6,95 (2H, d, J=7,7 Hz), 8,05 (2H, d, J=7,6 Hz), 8,24(1H, s)

CL-EM (ES+) m/z 334 (M+1), Rt 5,18, método B.

punto de fusión de 256ºC (Kofler).

Ejemplo B4

Preparación del compuesto 4

Se añadió clorhidrato de 4-bromo-piridina (0,002 mol) a una disolución de producto intermedio 8 (0,0022 mol) en ácido acético (2,8 ml). Se calentó la mezcla a 110ºC durante 30 minutos, se vertió en agua con hielo y se basificó con carbonato de potasio al 10%. Se retiró el precipitado mediante filtración y se secó. Se purificó el residuo (0,739 g) mediante cromatografía en columna sobre Kromasil (5 μm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH de 96/4/0,4 a 88/12/1,2). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 0,018 g del compuesto 4.

1H-RMN (DMSO-d6) δ 6,32 (1H, s a), 6,68 (1 H, d, J = 5,6 Hz), 6,9 (1 H, dd, J = 10,2 Hz, J = 2,5 Hz), 6,55 (2H,d, J = 10,2 Hz), 7,0 (2H, d, J = 10,2 Hz), 7,27 (1 H, m), 7,32 (1 H, d, J=10,2 Hz), 7,7 (1H, s a), 8,17 (1H, dd, J=10,2 Hz, J=2,5 Hz), 8,37 (1H, s a), 10,9 (1H, s a).

CL-EM (ES+) m/z 301 (M+1), Rt 7,73, método A.

Ejemplo B5

Preparación del compuesto 5

Se añadió gota a gota una disolución de hidruro de litio y aluminio 1 N en THF (1,0 ml) a 0ºC a una suspensión de producto intermedio 9 (249 mg, 0,0010 mol). Se agitó la mezcla durante 1 hora a 0ºC. Se extinguió la reacción a 0ºC mediante la adición lenta de una disolución de bisulfato de potasio al 5% en agua y se extrajo dos veces con EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente dando el (6-metoxi-benzofuran-3-il)acetaldehído. A una disolución de N-4-piridinil-1,4-bencenodiamina en MeOH (5 ml) y ácido acético (5 gotas) se le añadieron cianoborohidruro de sodio (90 mg, 0,0014 mol) y el aldehído anterior disuelto en MeOH (1 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se evaporó el disolvente, se llevó el aceite residual a EtOAc y se lavó con una disolución saturada de hidrogenocarbonato de sodio. Se separó la fase orgánica, se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se lavó el residuo con MeOH y se secó, proporcionando 125 mg (34%) del compuesto 5, punto de fusión de 184ºC-186ºC.

1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,23 (s, 1H), 8,01 (dd, 2H, J=6,3, J=1,5), 7,71 (s, 1H), 7,51 (d, 1H, J=8,5), 7,14 (d, 1H, J=2,1), 6,92 (d, 2H, J=8,6), 6,85 (dd, 1H, J=8,5, J=2,2), 6,58 (m, 4H), 5,64 (t, 1H, J=5,6 ), 3,77 (s, 3H), 3,30 (t,

2H, J=7,0), 2,48 (t, 2H, J=7,0). EM (ES+) m/z 360 (M+1). Ejemplo B6 Preparación del compuesto 6

10 Se añadieron gota a gota ácido acético (pocas gotas), después producto intermedio 13 (0,0004 mol) a una disolución de N-4-piridinil-1,4-bencenodiamina (0,0008 mol) y cianoborohidruro de sodio (0,001 mol) en MeOH (4 ml). Se disolvió el producto intermedio 13 (0,0004 mol) en MeOH (4 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas, se vertió en agua, se lavó con NaHCO3 saturado y se extrajo con EtOAc. Se separó la fase orgánica, se

15 secó (MgSO4), se filtró y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente: DCM/MeOH 85/15). Se recogieron las fracciones puras y se evaporó el disolvente, proporcionando 0,086 g (34%) del compuesto 6.

La tabla F-1 enumera los compuestos que se prepararon en uno de los ejemplos anteriores.

Tabla F-1

Comp. n.º 1; Ej. [B1]; p.f. de 152ºC-154ºC

Comp. n.º 2 Ej. [B2]; p.f. de 182ºC

Comp. n.º 3 Ej. [B3]; p.f. de 256ºC

Comp. n.º 4 Ej. [B4]

Comp. n.º 5 Ej. [B5]; p.f. de 184ºC-186ºC

Comp. n.º 6 Ej. [B6]

C. Ejemplo farmacológico:

Se midió la capacidad de los compuestos para conservar p53 en células A2780 con el ensayo de inmunoabsorción

ligado a enzimas de p53. El ensayo de p53 es un inmunoensayo enzimático de tipo “sándwich” que emplea dos

anticuerpos policlonales. Se ha inmovilizado un anticuerpo policlonal, específico para la proteína p53, sobre la

superficie de pocillos de plástico. Cualquier cantidad de p53 presente en la muestra que va a someterse a ensayo se 30 unirá al anticuerpo de captura. El anticuerpo policlonal detector biotinilado también reconoce la proteína p53, y se

unirá a cualquier cantidad de p53, que se haya mantenido retenido por el anticuerpo de captura. El anticuerpo

detector, a su vez, se une mediante estreptavidina conjugada a peroxidasa del rábano. La peroxidasa del rábano

cataliza la conversión del sustrato cromogénico o-fenilendiamina, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de

proteína p53 unida a la placa. Se cuantifica el producto de reacción coloreado usando un espectrofotómetro. Se 35 logra la cuantificación mediante la construcción de una curva patrón usando concentraciones conocidas de proteína

p53 con cola de HIS recombinante purificada (véase el ejemplo C.1.).

Se determinó la actividad celular de los compuestos de fórmula (I) sobre células tumorales U87MG usando un ensayo colorimétrico para determinar la toxicidad o supervivencia celular (véase el ejemplo C.2).

Las células U87MG son células de glioblastoma humano con p53 de tipo natural. En esta línea celular, MDM2 controla estrechamente la expresión de p53.

C.1. ELISA de p53

Se cultivaron células A2780 (ATCC) en RPMI 1640 complementado con el 10% de suero de ternero fetal (SBF), Lglutamina 2 mM y gentamicina a 37ºC en un incubador humidificado con el 5% de CO2.

Se sembraron las células A2780 a 20.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos, se cultivaron durante 24 horas y se trataron con compuesto durante 16 horas a 37ºC en un incubador humidificado. Tras la incubación, se lavaron las células una vez con solución salina tamponada con fosfato y se añadieron 30 μl, por pocillo, de tampón RIPA de bajo contenido en sal (tris 20 mM, pH 7,0, EDTA 0,5 mM, Nonidet P40 al 1%, DOC al 0,5%, SDS al 0,5%, PMSF 1 mM, aprotinina 1 μg/ml y leupeptina 0,5 μ/ml). Se colocaron las placas sobre hielo durante 30 minutos para completar la lisis. Se detectó la proteína p53 en los lisados usando el ELISA de tipo sándwich, descrito a continuación.

Se recubrieron placas de 96 pocillos de poliestireno de alta unión para EIA/RIA (Costar 9018) con el anticuerpo de captura pAb1801 (Abcam ab28-100) a una concentración de 1 μg/ml en tampón de recubrimiento (NaHCO3 0,1 M pH 8,2), 50 μl por pocillo. Se dejó que el anticuerpo se adhiriera durante la noche a 4ºC. Se lavaron las placas recubiertas una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween 20 al 0,05% y se añadieron 300 μl de tampón de bloqueo (PBS, albúminas séricas bovinas (BSA) al 1%), durante un periodo de incubación de 2 horas a temperatura ambiente. Se prepararon diluciones de la proteína p53 con cola de HIS recombinante purificada, que oscilaban desde 3-200 ng/ml, en tampón de bloqueo y se usaron como patrones.

Se lavaron las palcas dos veces con PBS/Tween 20 al 0,05% y se añadió tampón de bloqueo o patrones a 80 μl/pocillo. A los patrones, se les añadió 20 μl de tampón de lisis. Se añadieron las muestras a los otros pocillos a 20 μl de lisado/pocillo. Tras una incubación durante la noche a 4ºC, se lavaron las placas dos veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. Se añadieron alícuotas de 100 μl de anticuerpo policlonal secundario p53(FL-393) (Tebubio, sc-6243) a una concentración de 1 μg/ml en tampón de bloqueo a cada pocillo y se dejó que se adhiriera durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. Se añadió anticuerpo de detección anti-HRP de conejo (sc-2004, Tebubio) a 0,04 μg/ml en PBS/BSA al 1% y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05% y se añadieron 100 μl de tampón de sustrato (se preparó el tampón de sustrato poco antes de su uso añadiendo 1 comprimido de 10 mg de ofenilendiamina (OPD) de Sigma y 125 μl de H2O2 al 3% a 25 ml de tampón de OPD: ácido cítrico 35 mM, Na2HPO4 66 mM, pH 5,6). Después de 5 a 10 minutos, se detuvo la reacción de color añadiendo 50 μl de tampón de detención (H2SO4 1 M) por pocillo. Se midió la absorbancia a longitudes de onda dobles de 490/655 nm usando un lector de microplacas de Biorad y se analizaron los resultados.

Para cada experimento, se ejecutaron en paralelo controles (que no contenían fármaco) y una incubación de blanco (que no contenía ni células ni fármaco). Se restó el valor del blanco de todos los valores de controles y muestras. Para cada muestra, se expresó el valor de p53 (en unidades de absorbancia) como el porcentaje del valor para p53 presente en el control. Se definió la conservación del porcentaje mayor que el 140% como significativa. En el presente documento, se expresan los efectos de compuestos de prueba como la menor dosis que proporciona al menos el 140% del valor para p53 presente en el control (LAD) (véase la tabla F-2).

C.2. Ensayo de proliferación

Se disolvieron todos los compuestos sometidos a prueba en DMSO y se prepararon diluciones adicionales en medio de cultivo. Las concentraciones de DMSO finales nunca superaron el 0,1% (v/v) en ensayos de proliferación celular. Los controles contenían células U87MG y DMSO sin compuesto y los blancos contenían DMSO pero no células.

Se sembraron células U87MG en placas de cultivo celular de 96 pocillos a 3000 células/pocillo/100 μl. 24 horas más tarde, se cambió el medio y se añadieron compuesto y/o disolvente hasta un volumen final de 200 μl. Tras 4 días de incubación, se sustituyó el medio por 200 μl de medio recién preparado y se evaluó el crecimiento celular usando un ensayo basado en MTT. Por tanto, se añadieron 25 μl de la disolución de MTT (MTT al 0,5% de calidad para investigación de Serva en solución salina tamponada con fosfato) a cada pocillo y se incubaron adicionalmente las células durante 2 horas a 37ºC. Entonces se aspiró cuidadosamente el medio y se disolvió el producto de MTTformazán de color azul añadiendo a cada pocillo 25 μl de glicina 0,1 M y 100 μl de DMSO. Se agitaron las placas durante otros 10 min. en un agitador de microplacas antes de leer la absorbancia a 540 nm mediante un lector de microplacas de Biorad.

Dentro de un experimento, los resultados para cada condición experimental son la media de 3 pocillos replicados.

Para fines de examen inicial, se sometieron a prueba los compuestos a una única concentración fija de 10-5 M. Para los compuestos activos, se repitieron los experimentos para establecer curvas de concentración-respuesta completas. Para cada experimento, se ejecutaron en paralelo controles (que no contenían fármaco) y una incubación de blanco (que no contenía ni células ni fármaco). Se restó el valor del blanco de todos los valores de controles y 5 muestras. Para cada muestra, se expresó el valor medio para el crecimiento celular (en unidades de absorbancia) como un porcentaje del valor medio para el crecimiento celular del control. Cuando fue apropiado, se calcularon valores de CI50 (concentración del fármaco, necesaria para reducir el crecimiento celular al 50% del control) usando análisis probit para datos clasificados (Finney, D.J., Probit Analyses, 2ª ed. Capítulo 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). En el presente documento, se expresan los efectos de compuestos

10 de prueba como pCI50 (el valor logarítmico negativo del valor de CI50) (véase la tabla F-2).

En algunos de los experimentos, se adaptó el ensayo de proliferación para y se usó en placas de cultivo de 384 pocillos (véase la tabla F-2).

15 Tabla F-2: la tabla F-2 enumera los resultados de los compuestos que se sometieron a prueba según los ejemplos

C.1 y C.2.

Comp. n.º

LAD en ELISA de p53 en A2780 pCI50 de proliferación celular 384 pocillos pCI50 de proliferación celular 96 pocillos

1

1,0 E-05 5,49

2

3,0 E-06 5,36

3

3,0 E-06 5,15

4

1,0 E-06 5,85

5

1,0 E-05 5,35

6

1,0 E-05 <5

D. Ejemplo de composición: comprimidos recubiertos con película

Preparación del núcleo de comprimido

Se mezcla bien una mezcla de 100 g de un compuesto de fórmula (I), 570 g de lactosa y 200 g de almidón y después de esto se humidifica con una disolución de 5 g de dodecilsulfato de sodio y 10 g de polivinilpirrolidona en

25 aproximadamente 200 ml de agua. Se tamiza la mezcla de polvo húmeda, se seca y se tamiza de nuevo. Entonces se le añaden 100 g de celulosa microcristalina y 15 g de aceite vegetal hidrogenado. Se mezcla bien todo y se somete a compresión para dar comprimidos, proporcionando 10,000 comprimidos, que comprenden cada uno 10 mg de un compuesto de fórmula (I).

30 Recubrimiento

A una disolución de 10 g de metilcelulosa en 75 ml de etanol desnaturalizado se le añade una disolución de 5 g de etilcelulosa en 150 ml de diclorometano. Entonces se le añaden 75 ml de diclorometano y 2,5 ml de 1,2,3propanotriol. Se funden 10 g de polietilenglicol y se disuelven en 75 ml de diclorometano. Se añade esta última

35 disolución a la anterior y entonces se le añaden 2,5 g de octadecanoato de magnesio, 5 g de polivinilpirrolidona y 30 ml de una suspensión con color concentrada y se homogeniza todo. Se recubren los núcleos de comprimidos con la mezcla así obtenida en un aparato de recubrimiento.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuesto de fórmula (I),

   una forma de N-óxido, una sal de adición o una forma estereoquímicamente isomérica del mismo, en la que m es 0 y entonces se pretende que sea un enlace directo;

   n es 0 ó 2 y cuando n es 0 entonces se pretende que sea un enlace directo; p es 1

   15 s es 0 y entonces se pretende que sea un enlace directo; t es 0 y entonces se pretende que sea un enlace directo; R1 y R2 son cada uno independientemente hidrógeno,

   A es un radical seleccionado de

   25 en las que R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o alquiloxilo C1-6, Z es un radical seleccionado de

   en la que 35 R6 o R7 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno.

2. 2.

   Compuesto según la reivindicación 1, en el que n es 2; o A es un radical seleccionado de (a-21), (a-39) o (a-40).

3. 3.

   Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, siendo el compuesto, el compuesto n.º 1, el compuesto n.º 2, el compuesto n.º 3, el compuesto n.º 4, el compuesto n.º 5 o el compuesto n.º 6

4. 4.

   Compuesto según la reivindicación 1, 2 ó 3, siendo el compuesto, el compuesto n.º 2, el compuesto n.º 3 o el compuesto n.º 5

5. 5.

   Compuesto según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, para su uso como medicamento.

6. 6.

   Composición farmacéutica que comprende portadores farmacéuticamente aceptables y como principio activo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según las reivindicaciones 1 a 4.

7. 7.

   Procedimiento de preparación de una composición farmacéutica según la reivindicación 6, en el que los portadores farmacéuticamente aceptables y un compuesto según las reivindicaciones 1 a 4 se mezclan de manera íntima.

   40 5

   Comp. n.º 3

   Comp. n.º 4

   Comp. n.º 5

   Comp. n.º 6

   Comp. n.º 2

   Comp. n.º 3

   Comp. n.º 5

   15 8. Uso de un compuesto según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento tumoral.
8. 9. Combinación de un agente anticancerígeno y un compuesto según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4. 20 10. Procedimiento para preparar un compuesto según la reivindicación 1, caracterizado por

   a) hacer reaccionar un producto intermedio de fórmula (II) con un producto intermedio de fórmula (III) en la que W es un grupo saliente apropiado

   b) convertir un producto intermedio de fórmula (IV) en compuestos de fórmula (I), en la que p es 1, denominados en el presente documento compuestos de fórmula (I-a), en presencia de hidruro de litio y aluminio en un disolvente adecuado, o

   c) hacer reaccionar un carboxaldehído apropiado de fórmula (VI), con un producto intermedio de fórmula (V), en presencia de un reactivo apropiado, en un disolvente adecuado,