CN101402665B - 罗汉果苷v的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的操作方便、收得率高、产品纯度高、纯化效果好的罗汉果苷V的制备方法，该方法能顺利地应用于规模化生产实际，并可降低生产成本。本发明提供的罗汉果苷V的制备方法，包括粗苷的硅胶柱层析和后续的C18反相柱层析，(1)在对含有罗汉果苷V的粗苷进行硅胶柱层析时，用两种比例的二氯甲烷/乙醇混合物作为流动相进行两次洗脱，第二次洗脱时的流动相中二氯甲烷的比例小于第一次洗脱时的流动相，收集第二次洗脱的组份，浓缩干燥后得A；(2)将A进行C18反相柱层析时，用乙腈/水混合物洗脱，通过紫外检测器结合记录仪监控，收集波长为198nm～220nm时记录仪显示的峰值最大的峰所代表的组份，浓缩干燥即得。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物的纯化，具体是从罗汉果提取物中制备罗汉果苷V的方法。
背景技术
罗汉果，为葫芦科植物罗汉果属多年生草质藤本植物罗汉果Momordica grosvenori Swingle的干燥成熟果实，为一常用中药，具有清热解暑、润肺止渴作用，临床上可用于治疗高血压、肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性支气管炎和急慢性扁桃体炎等多种疾病，同时罗汉果也是常用饮料干果，提取物是常用甜味剂，大量出口，远销日本、韩国、台湾、东南亚、加拿大、美国等地。
罗汉果及罗汉果提取物中的主要成分为葫芦烷型三萜皂苷，包括罗汉果苷IV(mogrosideIV)、罗汉果苷V(mogroside V)、赛门苷I(siamenoside I)、11-氧-罗汉果苷V(11-oxo-mogrosideV)、罗汉果苷IIE(mogroside IIE)、罗汉果苷IIIE(mogroside IIIE)等多种皂苷，其中罗汉果苷V为主要皂苷类成分。罗汉果苷V也是罗汉果的主要甜味成分，其甜度高，为蔗糖的四百多倍。由于制药工业及食品工业的发展，目前国内外对高纯度的罗汉果V的需求量非常大，但目前尚未见有高纯度的罗汉果苷V生产、销售。虽有多项专利申请涉及罗汉果甜苷的提取，方法简单，但所得产物为罗汉果总苷，提取物中罗汉果苷V的纯度均较低，不超过80％，限制了其应用范围和发展前景。
公开号为CN101029071A的“从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法”是将醇浸膏用乙醇乙酯萃取，继用正丁醇萃取得正丁醇浸膏，再用聚酰胺柱处理正丁醇浸膏得粗皂苷，然后用氯仿—甲醇—水作为流动相进行硅胶柱层析，最后进行C18反相硅胶柱层析，水洗、乙醇洗脱、收集纯度在95％以上的流分得纯度大于95％的罗汉果苷V。该法使用的氯仿、甲醇毒性较大。硅胶柱层析的收得率低，C18反相硅胶柱层析的纯化效果不理想，收得率也低，只有50％左右，而且操作过程复杂，对流出物需分成小分(如接收的每一小杯20ml)都要频繁进行HPLC检测，不利于实际生产应用。
发明内容
本发明的目的是提供新的操作方便、收得率高、产品纯度高、纯化效果好的罗汉果苷V的制备方法，该方法能顺利地应用于规模化生产实际，并可降低生产成本。
本发明提供的罗汉果苷V的制备方法，包括粗苷的硅胶柱层析和后续的C18反相柱层析，
(1)在对含有罗汉果苷V的粗苷进行硅胶柱层析时，用两种比例的二氯甲烷/乙醇混合物作为流动相进行两次洗脱，第二次洗脱时的流动相中二氯甲烷的比例小于第一次洗脱时的流动相，收集第二次洗脱的组份，浓缩干燥后得A；
(2)将A进行C18反相柱层析时，用乙腈/水混合物洗脱，通过紫外检测器结合记录仪监控，收集波长为198nm～220nm时记录仪显示的峰值最大的峰所代表的组份，浓缩干燥即得。
本发明中，两种比例的二氯甲烷/乙醇混合物的重量比例分别为58/42～70/30，45/55～55/45。其中的乙醇为市售的重量百分浓度为95％产品。
新的罗汉果苷V的制备方法，硅胶的粒度为200～300目，上样量为硅胶重量的1/40～1/20，第一次洗脱时，流动相的用量为硅胶重量的5～10倍(体积/重量，ml/g或L/kg)，第二次洗脱时，流动相的用量为硅胶重量的10～20倍(体积/重量，ml/g或L/kg)，当第二次洗脱有5倍流动相进入硅胶后，开始收集流出的组份，直至规定量的流动相洗脱完毕。
在本发明的罗汉果苷V的制备方法的第二步将A进行C18反相柱层析时，所用流动相乙腈/水混合物的体积比为20/80～30/70。监控时紫外检测器的波长设于200nm～210nm。C18反相柱层析的反相填料的粒径为20μm～50μm，上样量为反相填料重量的1/250～1/180。
本发明在对罗汉果粗苷进行硅胶柱层析时，采用梯度层析，即进行两次洗脱。第一次洗脱时所用流动相的二氯甲烷比例较高，由于粗苷中苷V以及其它苷类溶于水，而脂肪酸、油脂、黄酮、甾体类属于脂溶性成份，所以二氯甲烷比例较高的流动相可以有效地洗除脂溶性成份，而将苷V及其苷类留在柱中。第二次洗脱时，二氯甲烷的比例降低，适当提高乙醇比例，从而增大了流动相的极性，有利于水溶性成份的洗脱，但是，乙醇比例不能无限制提高，本发明经过实验验证，乙醇比例在45％～55％之间，有利于最大限度地洗脱苷V而将其它苷类仍留在柱中，从而使罗汉果苷V与其它苷类得到很好的分离。
用乙腈/水作流动相的C18反相柱层析，并结合紫外检测器和记录仪进行过程监控，是本发明的关键所在。本发明发现，C18反相材料作为填料进行柱层析时，乙腈/水的混合物作流动相，比其它溶剂如乙醇、乙醇/水、丙酮/水等具有更好的效果。乙醇的粘度较大，在柱中流速慢，需要较高的压力才能使其达到正常流速，由于压力的增加，提高了对生产设备的要求。丙酮作流动相时，实践证明分离效果不好，各组分不集中，在柱中分散，容易互相污染，既达不到纯化效果，也降低了各组分的收得率。另外，乙醇和丙酮均有较强的紫外吸收，用紫外检测器进行过程监控时也会出峰，抬高了基线，甚至覆盖了部分含量较少的物质峰和最大峰(主要组分)的下部。这时如果从起峰时接收流出物，无疑会大大降低接收组分的收得率，因为接收到的流出物只是峰的尖尖的一小部分。但是，若接收起始时间提前，并将结束时间延后，一是无法在看不到峰的情况下准确判断时间点，二是有可能也将没有看见的挨近的其他物质一起接收了，这样就影响了纯化效果，也提高了操作难度，甚至无法操作。而乙腈粘度小，紫外吸收很弱，与水完全混容，所以本发明采用乙腈/水作C18反相柱层析的流动相，克服了乙醇、乙醇/水、丙酮/水作流动相的缺陷，结合紫外检测器和记录仪进行过程监控，大大提高了纯化效果和产品收得率。
紫外检测器结合记录仪对层析过程进行适时监控，可以很直观地看到物料中各成份在层析过程中的流出情况。在紫外检测器的波长为198nm～220nm内，罗汉果苷V的响应灵敏，因此，在记录仪上能清晰显示出峰情况。由于进入C18反相柱层析的物料中，罗汉果苷V的含量已经较高，是主要组分，所以记录仪上显示的峰值最大(峰高最高，峰面积最大)的峰所代表的组份就是罗汉果苷V，经过取样，采用HPLC用法定对照品进行确认，也证明了事实确是如此。由此可以很准确地判断苷V的起始流出时间和流出结束时间，据此收集流份，不需要频繁进行HPLC检测，操作方便，可以确保产品纯度，提高纯化效果，提高罗汉果苷V的收得率，适于规模化生产，而且大大降低监测费用(HPLC检测费用高)。
本发明中，罗汉果苷V的检测方法采用HPLC法，即高效液相色谱外标法。色谱条件为：
检测波长：203nm
色谱柱：ZORBAX SB-C18 5μm 250mm×4.6mm
Symmetry Shield RP18 250mm×4.6mm
溶剂比例：水：乙腈＝77：23
流 速：1.0ml/min
柱 温：35℃
进样量：10μl
稀释剂：甲醇
试 剂：水(超纯水)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)
具体操作步骤为，取样品约25mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加入稀释剂溶解并稀释至刻度，制成约1mg/ml的样品溶液，置超声仪中震荡5S，摇匀待用。用注射器吸取约2ml样品溶液经过0.45μm滤头过滤后，装入样品瓶中，放入液相色谱仪样品盘内，按上述色谱条件运行。记录图谱，并计算结果。
本发明所得的罗汉果苷V为白色或类白色粉末，无异味，含量达到99％以上，色谱纯度99％以上，符合单一化合物质量要求，可作为高级甜味剂，特别适宜作为抗糖尿病保健品的甜味剂或添加剂，也可直接作为治疗适应病症的药品的原料药。
附图说明
图1是本发明的方法中C18反相柱层析时记录仪记录的过程监控图之一；
图2是根据图1所示过程收集所得罗汉果苷V的HPLC图谱；
图3是本发明的方法中C18反相柱层析时记录仪记录的过程监控图之二；
图4是根据图3所示过程收集所得罗汉果苷V的HPLC图谱；
图5是本发明的方法中C18反相柱层析时记录仪记录的过程监控图之三；
图6是根据图5所示过程收集所得罗汉果苷V的HPLC图谱；
图7是本发明的方法中C18反相柱层析时记录仪记录的过程监控图之四；
图8是根据图7所示过程收集所得罗汉果苷V的HPLC图谱；
图9是本发明的方法所得最终产品罗汉果苷V的HPLC检测结果图谱。
具体实施方式
实施例1
罗汉果粗苷(含罗汉果苷V38.53％)1.005g，溶于95％乙醇中，200～300目硅胶20g干法装柱于内径2.5cm玻璃柱内。上样，以二氯甲烷/乙醇＝60/40共100ml洗柱，然后换用二氯甲烷/乙醇＝50/50的流动相200ml洗脱。两次洗脱的流速均为1ml/2min。于第二次洗脱开始后流动相有100ml进入硅胶时，开始收集流份，直至第二次洗脱完毕。所收集的流份浓缩干燥，得到经HPLC检测罗汉果苷V含量为68.13％的产物A0.371g，罗汉果苷V的收得率为65.27％。
实施例2
罗汉果粗苷(含罗汉果苷V38.53％)1.003g，溶于95％乙醇中，200～300目硅胶30g干法装柱于内径2.5cm玻璃柱内。上样，以二氯甲烷/乙醇＝60/40共150ml洗柱，然后换用二氯甲烷/乙醇＝50/50的流动相300ml洗脱。两次洗脱的流速均为1ml/2min。于第二次洗脱开始后流动相有150ml进入硅胶时，开始收集流份，直至第二次洗脱完毕。所收集的流份浓缩干燥，得到经HPLC检测罗汉果苷V含量为72.44％的产物A0.368g，罗汉果苷V的收得率为68.98％。
实施例3
罗汉果粗苷(含罗汉果苷V38.53％)1.502g，溶于95％乙醇中，200～300目硅胶45g干法装柱于内径2.5cm玻璃柱内。上样，以二氯甲烷/乙醇＝68/32共360ml洗柱，然后换用二氯甲烷/乙醇＝50/50的流动相855ml洗脱。两次洗脱的流速均为1ml/2min。于第二次洗脱开始后流动相有225ml进入硅胶时，开始收集流份，直至第二次洗脱完毕。所收集的流份浓缩干燥，得到经HPLC检测罗汉果苷V含量为76.58％的产物A0.529g，罗汉果苷V的收得率为70.00％。
实施例4
罗汉果粗苷(含罗汉果苷V38.53％)1.002g，溶于95％乙醇中，200～300目硅胶30g干法装柱于内径2.5cm玻璃柱内。上样，以二氯甲烷/乙醇＝60/40共150ml洗柱，然后换用二氯甲烷/乙醇＝53/47的流动相600ml洗脱。两次洗脱的流速均为1ml/2min。于第二次洗脱开始后流动相有150ml进入硅胶时，开始收集流份，直至第二次洗脱完毕。所收集的流份浓缩干燥，得到经HPLC检测罗汉果苷V含量为67.67％的产物A0.411g，罗汉果苷V的收得率为72.04％。
实施例5
罗汉果粗苷(含罗汉果苷V38.53％)1.495g，溶于95％乙醇中，200～300目硅胶45g干法装柱于内径2.5cm玻璃柱内。上样，以二氯甲烷/乙醇＝65/35共450ml洗柱，然后换用二氯甲烷/乙醇＝47/53的流动相450ml洗脱。两次洗脱的流速均为1ml/2min。于第二次洗脱开始后流动相有225ml进入硅胶时，开始收集流份，直至第二次洗脱完毕。所收集的流份浓缩干燥，得到经HPLC检测罗汉果苷V含量为66.81％的产物A0.604g，罗汉果苷V的收得率为70.05％。
实施例6
C18填料80g，湿法装柱于内径3cm玻璃柱内，物料A(含罗汉果苷V72.44％)0.403g溶于流动相，流动相为23/77的乙腈/水(体积比)混合物，上样后以流动相洗脱，流速为15ml/min，使用紫外检测器与记录仪对流出液进行监控，紫外检测器波长设置为203nm，收集记录仪显示的响应值最大的峰所代表的组份，从起峰开始，直至峰回落到平衡线，减压浓缩干燥收集的组份得0.214g，经HPLC检测，罗汉果苷V色谱纯度(峰面积百分数)为99.51％，含量为99.56％，计算罗汉果苷V的收得率为72.98％。
实施例7
C18填料16kg，湿法装柱，柱内径20cm。物料A(含罗汉果苷V72.44％)80g溶于流动相，流动相为23/77的乙腈/水(体积比)混合物，上样后以流动相洗脱，流速为400ml/min，使用紫外检测器与记录仪对流出液进行监控，紫外检测器波长设置为203nm，收集图1中的III部分(最大峰的上升段III-II)的流出液，减压浓缩干燥收集的流出液，得43.49g，经HPLC检测，罗汉果苷V色谱纯度(峰面积百分数)为99.74％，含量为95.94％(见图2)。计算罗汉果苷V的收得率为72.00％。
实施例8
C18填料16kg，湿法装柱，柱内径20cm。物料A(含罗汉果苷V71.41％)86.5g溶于流动相，流动相为27/73的乙腈/水(体积比)混合物，上样后以流动相洗脱，流速为400ml/min，使用紫外检测器与记录仪对流出液进行监控，紫外检测器波长设置为200nm，收集图3中的III部分(最大峰的上升段III-III)的流出液，减压浓缩干燥收集的流出液，得46.66g，经HPLC检测，罗汉果苷V色谱纯度(峰面积百分数)为99.63％，含量为93.97％(见图4)。计算罗汉果苷V的收得率为。70.98％
实施例9
C18填料16kg，湿法装柱，柱内径20cm。物料A(含罗汉果苷V75.33％)66.7g溶于流动相，流动相为27/73的乙腈/水(体积比)混合物，上样后以流动相洗脱，流速为400ml/min，使用紫外检测器与记录仪对流出液进行监控，紫外检测器波长设置为206nm，收集图5中的III部分(最大峰的上升段III-II)的流出液，减压浓缩干燥收集的流出液，得38.41g，经HPLC检测，罗汉果苷V色谱纯度(峰面积百分数)为99.17％，含量为98.26％(见图6)。计算罗汉果苷V的收得率为75.12％。
实施例10
C18填料16kg，湿法装柱，柱内径20cm。物料A(含罗汉果苷V76.58％)66.7g溶于流动相，流动相为27/73的乙腈/水(体积比)混合物，上样后以流动相洗脱，流速为400ml/min，使用紫外检测器与记录仪对流出液进行监控，紫外检测器波长设置为216nm，收集图7中的III部分(最大峰的上升段III-II)的流出液，减压浓缩干燥收集的流出液，得39.74g，经HPLC检测，罗汉果苷V色谱纯度(峰面积百分数)为99.51％，含量为94.598％(见图8)。计算罗汉果苷V的收得率为73.05％。
实施例11
将实施例7、8、9、10的所得产物混在一起，继续干燥，HPLC检测纯度为99.57％，具体结果见图9，含量为99.7％。
Claims (3)
1.罗汉果苷V的制备方法，包括粗苷的硅胶柱层析和后续的C18反相柱层析，其特征在于：
(1)对含有罗汉果苷V的粗苷进行硅胶柱层析时，用两种比例的二氯甲烷/乙醇混合物作为流动相进行两次洗脱，第一次洗脱时的流动相的重量比例为58/42～70/30，第二次洗脱时的流动相的重量比例45/55～55/45，收集第二次洗脱的组份，浓缩干燥后得A；
(2)将A进行C18反相柱层析时，用乙腈/水混合物洗脱，通过紫外检测器结合记录仪监控，收集波长为198nm～220nm时记录仪显示的峰值最大的峰所代表的组份，浓缩干燥即得。
2.如权利要求1所述的罗汉果苷V的制备方法，其特征在于：硅胶的粒度为200～300目，上样量为硅胶重量的1/40～1/20，第一次洗脱时，流动相的用量为硅胶重量的5～10倍(体积/重量，ml/g)，第二次洗脱时，流动相的用量为硅胶重量的10～20倍(体积/重量，ml/g)，当第二次洗脱有5倍流动相进入硅胶后，开始收集流出的组份，直至规定量的流动相洗脱完毕。
3.如权利要求1所述的罗汉果苷V的制备方法，其特征在于：将A进行C18反相柱层析时，乙腈/水混合物的体积比为20/80～30/70，监控时紫外检测器的波长设于200nm～210nm，C18反相柱层析的反相填料的粒径为20μm～50μm，上样量为反相填料重量的1/250～1/180。
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