CN101381359A - 一种从绿茶中提取高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从绿茶中提取高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)技术及方法。所述绿茶为市面普通绿茶，通过咖啡因沉淀、液相萃取和闪烁硅胶柱色谱技术联用纯化后，可以得到高纯度的EGCG，提纯后EGCG纯度可达到97％以上。咖啡因沉淀浓度为20－50mmol/L，液相萃取剂为氯仿、乙酸乙酯，闪烁硅胶色谱柱填料为硅胶G(200－300目)，柱子长30cm，内径2.0cm，洗脱剂为乙酸乙酯、石油醚(60－90℃)体积比为3∶2，加0.4－0.8％三氟乙酸。各种试剂均为常规试剂，经济易采购，除氯仿外，其它试剂均安全无毒，且氯仿易去除。本方法可应用于工业大量生产高纯度EGCG和ECG。

Description

一种从绿茶中提取高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种从绿茶中提取表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的方法，特别是涉及一种从绿茶中提取纯化出高纯度的表没食子儿茶素没食子酸酯的方法。该方法可以应用于工业化提取高纯度的表没食子儿茶素没食子酸酯。

(二)背景技术

茶是中国的传统饮品之一，具有抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗老年痴呆、调节免疫功能等多种功能，其主要活性成分为茶多酚中儿茶素类物质。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是儿茶素组分中含量最高，活性最强的一种组分，占茶多酚制品的50％～60％，它是2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，具有酚类抗氧化剂的通用性，同时因其结构中有6个邻位酚羟基而有优于其他儿茶素的许多性质，因此对它的生物活性和生理作用进行了广泛研究。中美等许多国家将EGCG列为一种潜在的抗癌新药，研究了它对某些促癌剂、癌细胞的增殖、某些与肿瘤有关的酶的活性的抑制作用，对诱导癌细胞的凋亡和提高某些细胞的细胞毒增敏和对干预癌细胞信号转导通路等作用。许多研究已经揭示了茶多酚的抗肿瘤、抗衰老等多种生物活性均与其抗氧化性有关，茶多酚的抗氧化作用占有非常重要的地位。通过研究电子自旋共振和化学发光技术，研究人员发现儿茶素4种单体中以(-)-EGCG对超氧自由基的清除能力最强。在儿茶素抑制胆固醇及低浓度脂肪蛋白氧化的作用中，儿茶素抗铜促氧化能力顺序为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)＝表儿茶素没食子酸酯(ECG)>表儿茶素(EC)>儿茶素(C)>表没食子儿茶素(EGC)。在对茶叶中的单体诱导代谢解毒酶活性的能力的研究时，发现EGCG对体外培养的HipG2肝肿瘤细胞中NAD(P)H-醌还原酶(QR)作用有显著性。用气相色谱法研究儿茶素消除三甲胺、硫化氢、吲哚气味的机制，实验表明，在儿茶素各个单体中，EGCG消臭能力最强。通过研究EGCG对紫外线辐射氧化损伤的保护机制，发现EGCG能减少中波紫外线(UVB)辐射引起的丙二醛沉积，增加抗氧化酶的活性；并且可能抑制由UVB诱导的MMP1mRNA表达，减少胶原蛋白的降解。从而对UVB辐射损伤的体外培养的纤维细胞起到保护作用。通过观察几种茶多酚对大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、枯草杆菌、沙门氏菌及多种霉菌和酵母菌的抑菌情况，发现多金农脱咖啡因儿茶素比金农大叶儿茶素和金农小叶和儿茶素的抑菌效果强，而前者中EGCG的量恰恰比后两者高。在对口腔细菌Porphyromonal gingivalis生长的抑制作用中，儿茶素各单体作用能力为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)>表儿茶素没食子酸酯(ECG)>表儿茶素(EC)。

由于EGCG具有很多保健功能，因此对它的提取方法研究引起人们的关注，因此一些提取EGCG单体的方法已被报道。(1)高效液相色谱(HPLC)分离与膜蒸馏浓缩相结合，该方法用HPLC制备柱分离，截取富含EGCG馏分，然后用膜蒸馏浓缩，最后真空干燥得到产品(CN 1370776A)。(2)配制合适流动相、固定相的溶剂体系，使用高速逆流色谱分离可以获得高纯度的儿茶素单体，EGCG纯度大于98％(CN 1277068)。(3)采用重结晶法(盐析法)与葡聚糖凝胶LH-20柱层析法相结合，先将茶叶提取物多次重结晶(或氯化钠盐析)，然后晶体溶解后过葡聚糖凝胶LH-20，收集EGCG馏分，减压蒸馏、冷冻干燥得到产品(CN1465572A、CN 1407510A)。(4)微孔膜过滤法和大孔型聚苯乙烯树脂吸附法相结合，将绿茶提取物经微孔膜过滤，滤液通过大孔型聚苯乙烯树脂，稀的低级醇解析，收集含EGCG的馏分，冷冻干燥后得到产品(CN1465572A、CN 1407510A)。(5)乙酰化与硅胶色谱柱分离法相结合，将EGCG乙酰化后用硅胶色谱柱分离，再在质子性溶剂中水解，干燥得到EGCG单体(CN101182319A)。

这些方法的出现，解决了从茶叶中获得高纯度EGCG的技术。但是还存在一些问题，一是使用了较贵重的仪器和昂贵的化学试剂，二是产生大量对环境污染的废液，结果导致EGCG国际价格一直居高不下，因此为了降低成本探讨廉价的EGCG分离提取方法具有重要理论意义和应用价值。

(三)发明内容

本发明的目的是为了寻找一种简单经济的从绿茶中提取纯化出高纯度的表没食子儿茶素没食子酸酯的方法。

本发明是这样实现的：绿茶用热水浸提后，用咖啡因沉淀法和液相萃取法得到EGCG粗品，然后用乙酸乙酯将EGCG粗品溶解，过硅胶色谱柱，收集组分，得到ECG和EGCG单体，纯度分别达到95％和97％以上。

本发明的具体实现是：绿茶磨碎，用沸水浸提半小时，茶汤70℃保温，加入咖啡因至20-50mmol/L与酯型儿茶素形成络合物沉淀，室温冷却1-4小时，4℃冷却0.5-2.0小时，4℃下15000转/分钟(rpm)离心30分钟，取沉淀。

在60℃条件下用二次蒸馏水复溶，用氯仿除去咖啡因，乙酸乙酯萃取，保留有机相，减压蒸馏去掉乙酸乙酯，产物用纯水复溶，-90℃超低温冷冻干燥，得到表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)粗品。

最后把表没食子儿茶素没食子酸酯粗品用乙酸乙酯溶解，过闪烁硅胶色谱柱，洗脱剂是体积比为3:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物，其石油醚的沸程为60-90℃。并在洗脱剂中加三氟乙酸，使其浓度达0.4-0.8％。用波长为280nm的紫外光检测器进行洗脱峰检测，收集两个峰所对应的洗脱液，分别减压蒸馏去除有机溶剂，剩余物用蒸馏水溶解，-90℃超低温冷冻干燥，分别得到表儿茶素没食子酸酯(ECG)单体和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)单体，纯度分别为95％和大于97％。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、利用咖啡因沉淀法、液相萃取法和闪烁硅胶柱色谱法相结合，可以从茶叶中提纯出高纯度的EGCG，具有很高的经济利用价值，同时还得到纯度较高的副产品ECG。

2、工艺简单，成本低、效益高，具有广阔的市场前景。

3、整个提纯过程中虽氯仿有毒，但易清除，无残留，其它试剂均安全无毒。

4、整个提纯过程中EGCG氧化少，溶剂沸点低易除去，产品纯度高。

(四)附图说明

图1为本发明技术工艺流程图。

图中1是商品绿茶，2是浸提茶汤，3是咖啡因沉淀离心，4是氯仿萃取除咖啡因，5是乙酸乙酯萃取出EGCG，6是过硅胶色谱柱，7是超低温冷冻干燥，8是成品。

图2为茶汤高效液相色谱图，EGCG含量为30.81％。

图3咖啡因沉淀、液相萃取后产物高效液相色谱图，EGCG含量为53.54％。

图4为过硅胶色谱柱后前峰产物高效液相色谱图，ECG含量为95.43％。

图5为过硅胶色谱柱后后峰产物高效液相色谱图，EGCG含量为97.67％。

图6为过硅胶柱分离色谱图

(五)具体实施方式

下面将通过具体的实例对本发明作进一步的详细说明。

(1)将绿茶研碎，取茶叶末25克，置于500ml烧杯中。

(2)加350ml重蒸水，煮沸20-30分钟，每隔一分钟搅拌一次，抽滤，得茶汤。将茶渣重新加入350ml重蒸水煮沸20-30分钟，抽滤得茶汤，合并两次茶汤，高效液相色谱检测EGCG含量为30.81％(如图2)。

(3)将茶汤置于1000ml大烧杯中，70℃水浴保温，加咖啡因至30mmol/L，完全溶解后在室温下冷却1-4小时，4℃下冷却0.5-2.0小时。4℃下15000g离心30分钟，弃去上清，取沉淀，取60℃重蒸水300ml将沉淀溶解，将溶液转移至500ml容量瓶中。

(4)用氯仿萃取三次，每次用量150ml，弃去有机相。

(5)水相用150ml乙酸乙酯萃取三次，保留有机相。减压蒸馏，去掉乙酸乙酯，加重蒸水50ml重新溶解产品，冷冻干燥，可得到0.710g EGCG粗品，高效液相色谱检测EGCG含量达到53.54％(如图3)。

(6)称取EGCG粗品0.100g，用乙酸乙酯溶解，过闪烁硅胶色谱柱，柱子为(30cm×2cm I.D.)玻璃柱，洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚(60-90℃)＝3:2，加0.4～0.6％三氟乙酸，用波长为280nm的紫外光检测器进行洗脱峰检测，收集两个峰所对应的洗脱液，减压蒸馏，除去有机溶剂。

(7)用水溶解产物，-90℃冷冻干燥。

(8)得到0.008g ECG和0.026g EGCG，经高效液相色谱检测纯度分别达到95.43％(如图4)和97.67％(如图5)。

Claims (1)

1、一种从绿茶中提取高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于将液相萃取法和闪烁硅胶柱色谱法联用，首先将绿茶磨碎，用沸水浸提半小时，茶汤70℃保温，加入咖啡因至20-50mmol/L与酯型儿茶素形成络合物沉淀，室温冷却1-4小时，4℃冷却0.5-2.0小时，4℃下15000转/分钟离心30分钟，取沉淀，再在60℃条件下用二次蒸馏水复溶，用氯仿除去咖啡因，乙酸乙酯萃取，保留有机相，减压蒸馏去掉乙酸乙酯，产物用纯水复溶，-90℃超低温冷冻干燥，得到表没食子儿茶素没食子酸酯粗品，最后把表没食子儿茶素没食子酸酯粗品用乙酸乙酯溶解，过闪烁硅胶色谱柱，洗脱剂是体积比为3:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物，其石油醚的沸程为60-90℃，并在洗脱剂中加三氟乙酸，使其浓度达0.4-0.8％，用波长为280nm的紫外光检测器进行洗脱峰检测，收集两个峰所对应的洗脱液，分别减压蒸馏去除有机溶剂，剩余物用蒸馏水溶解，-90℃超低温冷冻干燥，分别得到表儿茶素没食子酸酯单体和表没食子儿茶素没食子酸酯单体，纯度分别为95％和大于97％。

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