CN101361831A - 栀子的新用途 - Google Patents

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本发明属于医药领域，具体涉及栀子的新用途。所要解决的技术问题是提供栀子的新的医药用途，即在制备治疗血管性痴呆的药物中的用途。通过实验证明，发明人采用双侧颈总动脉永久结扎方法建立血管性痴呆动物模型后，予不同剂量栀子苷及阳性对照药物治疗一月后，进行行为学和病理检测，观察栀子苷对痴呆大鼠行为学和脑组织病理及相关生化指标的影响。发现不同剂量的栀子苷对血管性痴呆大鼠的认知功能障碍都具有改善和恢复作用，具有剂量依赖性，其中中、高剂量具有接近多奈哌齐对痴呆治疗作用。故可采用栀子或采用栀子苷用于治疗血管性痴呆。

Description

栀子的新用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及栀子的新用途。
背景技术
血管性痴呆(英文名称：vascular dementiame简称：VaD)是脑血管病(如脑梗塞或脑出血等)所致精神障碍中的一种，一般在50—60岁发病。近年来发病年龄趋于中年化，男性多于女性。病程短则2个月长达20多年，平均5.2年。其早期表现主要是头痛眩晕、肢体麻木、睡眠障碍、耳鸣等，可有近期记忆力轻度受损、注意力不集中和一些情绪变化，无明显的痴呆，所常将此表现称为“脑衰弱综合征”。但随着病情的发展，就会出现神经精神症状，如发音不清、吞咽困难、而肌麻痹、失认、尿失禁、偏竣、凭空听见声音(幻听)、看见实际不存在的东西(幻视)，或情感脆弱易激惹、哭笑无常等等。
VaD是一个综合征，不是一个单一的疾病，不同的血管病理变化均可引起VaD症状，包括大、小动脉病变，弥漫性缺血性白质病变，心脏脱落栓子的栓塞，血液动力学改变，出血，血液学因素和遗传性疾病等。
目前，常用于治疗血管性痴呆的药物有多奈哌齐(商品名安理申)、重酒石酸卡巴拉汀(商品名艾斯能)、石杉碱甲(商品名有哈伯因、双益平等)。
栀子始载于《神农本草经》，是药食两用传统中药，属茜草科植物。栀子苷(geniposide)分子式为C17H24O11，是栀子的主要提取物，其化学结构已经明确。我们前期在对脑出血的研究中发现栀子苷能促进神经轴突再生；增加细胞对拟胆硷药物的敏感性；增加细胞膜的去极化；抑制颅内非感染性炎性病变(邓世山，付莉，熊若虹等，栀子提取物(环烯醚萜总甙)对大鼠尾状核脑出血病理指标的影响.华西医学，2005；20(2)293-294)。
另中国专利申请200610113892.1已公开了栀子有效部位在治疗老年性痴呆中的用途。该栀子有效部位含有至少50％重量的栀子苷，是采用十倍量的55％乙醇浸泡、渗漉后，合并渗漉液，提取液减压浓缩至无醇味，再用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇萃取，减压蒸干以后，得到栀子苷含量过50％含量的有效部位。老年性痴呆又称为Alzheimer病，病理表现以老年斑、神经元纤维缠结和神经元减少为主要特征，临床表现以持续性进行性的智能衰减为特征，多为慢性起病，进行性发展，影像学检查可见脑萎缩征象；目前治疗本病的药物主要有：乙酰胆碱酯酶抑制剂，抗炎药物等。而血管性痴呆是指脑血管性病变引起的脑损害所致的痴呆，病理表现以多发的脑血管病变为主，临床表现以执行功能障碍为主，多急性起病，波动性或阶梯性恶化，具有脑血管病的病史和相应的神经影像学改变；目前缺乏认知功能症状治疗的标准疗法，一些研究表明：多奈哌齐、重酒石酸卡巴拉汀、石杉碱甲等可用于治疗血管性疾病，尼莫地平、胞二磷胆碱等可能具有治疗作用。因此老年性痴呆与血管性痴呆的临床表现，病理学特点，治疗手段等均有明显的不同。
目前，尚无栀子或从其分离出的成分可应用于治疗血管性痴呆的相关报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供栀子的新的医药用途。
具体地，栀子的新用途为：在制备治疗血管性痴呆的药物中的用途。
通过实验证明，发明人采用双侧颈总动脉永久结扎方法建立血管性痴呆动物模型后，给予不同剂量(25mg·kg-1·d-1、50mg·kg-1·d-1、75mg·kg-1·d-1)栀子苷(栀子中的单体成分)及阳性对照药物(多奈哌齐1.75mg·kg-1·d-1)治疗一月后，进行行为学和病理检测，观察栀子苷对痴呆大鼠行为学和脑组织病理及相关生化指标的影响。发现不同剂量的栀子苷对血管性痴呆大鼠的认知功能障碍都具有改善和恢复作用，具有剂量依赖性，其中中、高剂量具有接近多奈哌齐对痴呆治疗作用。
栀子苷成人(体重以60kg计算)每日有效剂量为250～1000mg/d。通过大鼠和人的体型系数剂量换算公式计算出成人的使用剂量，人体服用剂量8.1mg·kg-1·d-1＝大鼠剂量50mg·kg-1·d-1×0.162，人体服用剂量12.15mg·kg-1·d-1＝大鼠剂量75mg·kg-1·d-1×0.162，那么成人(体重以60kg计算)的口服剂量为486-729mg/d时最佳。
故采用栀子或采用栀子苷用于治疗血管性痴呆具有明显的治疗效果。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
通过以下实验数据证明应用栀子或栀子苷在制备治疗血管性痴呆中的药物中的用途。
材料与方法
1.1 材料
健康雄性清洁二月龄SD大鼠66只，体重180±40g，由四川大学华西医学实验动物中心提供，固体颗粒饮料自由摄取，自由饮水，室温22℃左右，光照周期12/12h。多奈哌齐为卫材制药有限公司产品，批号：070910A。栀子苷，纯度为94.8％，批号：SZY071229，购自成都双子叶生物科技公司。Morris水迷宫为北京新天地科技公司产品。
1.2 方法
1.2.1 模型的制备：按参考文献[1]制作血管性痴呆大鼠模型：水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，颈前部去毛消毒后，沿右侧颈总动脉上方的颈侧部切开，分离右侧颈总动脉后结扎，分层缝合。该侧结扎后间隔5d，于第2次手术行另一侧的结扎。第2次手术后为完成模型制作。假手术组大鼠作为正常对照组，仅分离双侧颈总动脉，不作结扎。
1.2.2 分组及处理：手术后3d将造模后大鼠随机分为模型组、多奈哌齐组、栀子苷高、中、低剂量组。栀子苷用生理盐水配制成浓度为25mg/ml液体，高、中、低剂量组给药剂量分别为75mg·kg-1·d-1、50mg·kg-1·d-1、25mg·kg-1·d-1。多奈哌齐组给药剂量为1.75mg·kg-1·d-1(大鼠剂量和人剂量换算按体表面积计算)，上述药物给药时均稀释成5ml/kg灌胃，每天一次。假手术组及模型组灌胃同体积的生理盐水，连续给药28d。
1.2.3 行为学检测：采用Morris水迷宫进行行为学研究，各组大鼠在连续给药28d后进行测试，试验期间继续给药。水迷宫试验连续进行11d，前5d，将大鼠在1、3、4象限3个不同的入水点头朝池壁放入水中，测定大鼠在1min内到达平台(置于2象限，距池壁24cm，隐藏于水面下2cm)的时间(逃避潜伏期)、游程、轨迹及平均速度。如果大鼠在1min内未找到平台，潜伏期计为1min，并将其至引导至平台并让其在平台上停留15s，每次测试间隔20min。第6天撤掉平台，进行空间探索(probe trial)测试，观察大鼠在2min内在水池内的活动，包括各象限逗留时间、在各象限内的游程占总游程的百分比、平均速度、轨迹等。7-9天进行反向平台试验，操作基本同隐蔽平台试验，只是将平台位置移至对面象限。第10天再进行空间探索试验。第11d进行可视平台试验，平台露出水面2cm，其余操作基本同隐蔽平台试验。
1.2.4 病理学检测：水迷宫试验结束后，经升主动脉以生理盐水冲洗，多聚甲醛灌注固定脑组织后，取脑包埋，冠状面方向切片，行HE染色，观察海马、皮层的病理变化。
1.2.5 统计学处理：数据以x＝5表示，用SPSS13.0软件分析处理，采用方差分析进行比较。以P<0.05为有显著统计学差异。
结果
2.1 一般情况：结扎双侧颈总动脉后，大多数大鼠，自发运动减少，活动能力减低，但分组时所有存活的大鼠都恢复正常，均未发现神经系统偏侧体征，与文献报道相符。手术后大鼠术后48h内无死亡，分组后1月内各组大鼠的存活率分别是模型组46.15％(6/13)、多奈哌齐组54.55％(6/11)、栀子苷高剂量组80.00％(8/10)、栀子苷中剂量组62.73％(8/12)、栀子苷低剂量组58.33％(7/11)，假手术组大鼠全部存活。
2.2 Morris水迷宫实验
在隐藏平台试验(学习阶段)，以大鼠逃避潜伏期变化曲线代表学习曲线，逃避潜伏期下降越快，表明学习记忆能力越强。采用重复测量资料的单因素方差分析[6，8]显示各组大鼠逃避潜伏期随着训练增加都有逐渐缩短的趋势，时间因素(day)有统计学意义(P<0.05)；各组潜伏期总体上不同(P<0.05)，说明分组因素起作用。假手术组与模型组比较，假手术组逃避潜伏期在第2、3、4、5天明显缩短(P<0.05)；药物治疗组与模型组比较在第3、4、5天逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，栀子苷治疗组与假手术组及多奈哌齐组组间比较没有显著性(P>0.05)差异，结果见表1。
       表1 各组大鼠不同时间的逃避潜伏期(s)(x±5)
 
组别 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天
假手术组 45.07±15.06 34.87±12.79* 21.13±9.37* 21.00±7.28* 25.67±7.23*
栀子苷(低) 46.91±11.07 40.33±11.54 31.43±9.74* 28.24±9.06* 21.38±8.82*
栀子苷(中) 47.25±7.84 41.04±6.06 27.75±9.09* 26.67±10.93* 25.50±8.73*
栀子苷(高) 47.25±12.08 35.86±10.33* 24.67±7.66* 22.33±5.13* 18.86±6.51*
多奈哌齐组 47.44±13.82 31.22±8.58* 26.22±12.22* 25.00±13.48* 18.06±6.99*
模型组 54.20±7.96 48.73±10.88 41.47±12.62 32.53±15.76 30.00±10.95
*p<0.05：与模型组比较
在空间探索试验(记忆测试阶段)中，与假手术组相比，模型组在平台象限的活动时间以及平台象限游程/总游程明显减少(p<0.05)；栀子苷高、中、低剂量组和多奈哌齐组在平台象限活动时间以及平台象限游程/总游程都高于模型组，其中栀子苷低剂量组与模型组比较无统计学差异(p>0.05)，并低于其余各组(p<0.05)。而各组的速度比较无显著性差异(p>0.05)，结果见表2。
       表2 各组大鼠定位航行试验结果比较
 
组别 样本数   平台象限游程/总游程 平均速度 平台象限时间s
假手术组 5 0.4369±0.1209*Δ 18.775±6.157 52.43±14.52*Δ
栀子苷(低) 7 0.2724±0.0542 16.446±3.297 32.68±6.51
栀子苷(中) 8 0.3708±0.1023*Δ 16.258±3.225 44.50±12.28*Δ
栀子苷(高) 8 0.3938±0.09024*Δ 18.125±3.492 47.25±10.83*Δ
多奈哌齐组 6 0.3879±0.09803*Δ 19.63±5.510 46.55±11.76*Δ
模型组 5 0.2443±0.06669 20.138±5.688 29.32±8.0*
*p<0.05：与模型组比较，Δp<0.05：两两比较时与栀子苷低剂量组比较。
平台撤出后，模型组大鼠游泳轨迹分散于四个象限，假手术组和栀子苷高、中剂量组及多奈哌齐组游泳轨迹主要集中于原平台象限，栀子苷低剂量组介于二者之间。
反向平台实验中，模型组游泳轨迹分散于四个象限，且在原平台象限停留时间略高于其它象限，而其他组主要集中于现平台象限。可视平台试验中，各组逃避潜伏期相比较，无统计学差异(p>0.05)。
2.3 病理结果：在光镜下，模型组与假手术组相比，皮层神经元退化，数目减少，可见嗜神经细胞现象，海马锥体细胞密度明显减低，排列松散，层次减少，核固缩深染细胞多见。与模型组相比栀子苷高、中剂量治疗组和多奈哌齐治疗组大脑皮层神经细胞无明显减少，变性、坏死神经细胞少，海马细胞层次清楚，排列整齐，核固缩、深染的三角形神经细胞及嗜神经细胞现象减少，与假手术组接近，栀子苷低剂量组介于二者之间。
采用大鼠双侧颈总动脉结扎模型来研究栀子苷的神经保护作用。双侧颈总动脉结扎可引起大脑长期慢性低灌注，通过过氧化损伤、炎性因子释放，兴奋性氨基酸毒作用和内环境紊乱途径诱导海马神经元凋亡，损害微血管的完整性和皮质下白质，从而导致认知障碍。选取Morris水迷宫实验评价大鼠认知功能。经典的Morris水迷宫所检测的是大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知，所形成的记忆是一种空间参考记忆。其储存的机制主要涉及边缘系统以及大脑皮质有关脑区，属于陈述性记忆。而临床痴呆患者正是陈述性记忆首先受损而且比较突出。故此Morris水迷宫实验作为评价VaD大鼠模型认知障碍和筛选研究防治此类疾病有效药物的标准比较恰当。
从术后动物存活率上看，术后1月模型组存活率为46.15％，栀子苷高中低剂量治疗组分别是80.00％、62.73％、58.33％，多奈哌齐治疗组为54.55％，提示栀子苷可以减少慢性低灌注动物的死亡。从病理结果来看栀子苷能减轻低灌注所致神经元凋亡坏死，提示栀子苷具有抗神经元凋亡作用，能够提高模型大鼠远期生存率。
在大鼠双侧颈总动脉永久结扎后4周时，从学习曲线中可以看出，在5天训练期，模型组学习曲线较平坦且逐渐提高趋势不明显；每天的比较中可以看出，假手术组较模型组逃避潜伏期明显缩短，模型组的记忆能力比对照组差。在记忆测试中，模型组运动轨迹分散于各象限，对原平台的位置没有记忆。在再学习测试阶段，模型组运动轨迹分散于各象限，且原平台象限略占优势，说明模型组再学习能力差。双侧颈总动脉结扎导致的慢性脑组织低灌注可引起学习记忆能力明显下降，造模成功。而栀子苷治疗组学习曲线下降趋势明显，每天的比较中可以看出栀子苷组较模型组逃避潜伏期明显缩短，高剂量组与正常对照组和多奈哌齐组相近，显示栀子苷能改善痴呆大鼠学习能力；在记忆测试中，低剂量栀子苷组与模型组比较未见明显统计学差异，但已反映出其具有改善记忆作用趋势(其趋势可由表2生成的图看出)。而高、中剂量栀子苷组与模型组比较有明显改善(P<0.05)，显示栀子苷能改善大鼠记忆作用，接近于假手术组水平，并呈剂量依赖。可视平台试验中，各组逃避潜伏期相比较，无统计学差异，说明各组大鼠感觉运动能力无差异，而在空间探索实验中成绩的差异不是由于感觉、视觉或运动功能障碍对响造成的，与学习记忆能力有关。
综上所述，大鼠双侧颈总动脉永久性结扎可引起大鼠学习记忆能力明显受损和海马、皮层神经元坏死凋亡。另一方面，栀子苷能改善慢性低灌注导致的学习记忆能力受损，具有剂量依赖性，能明显减轻血管性痴呆大鼠皮层及海马的病理变化，有一定的神经保护以及防治痴呆作用。
参考文献：
1、王兴华，李露斯，两种大鼠2VO模型制作方法的比较.第三军医大学学报，2002；Vol24(12)：1496。

Claims (8)

  1. 【权利要求1】栀子在制备治疗血管性痴呆的药物中的用途。
  2. 【权利要求2】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：栀子采用其单体栀子苷。
  3. 【权利要求3】根据权利要求2所述的用途，其特征在于：栀子苷成人每日有效剂量为250～1000mg/d。
  4. 【权利要求4】根据权利要求3所述的用途，其特征在于：栀子苷成人每日有效剂量为486～729mg/d。
  5. 【权利要求5】根据权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于：所述的药物为口服制剂。
  6. 【权利要求6】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的血管性痴呆由大、小动脉病变引起。
  7. 【权利要求7】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的血管性痴呆由弥漫性缺血性白质病变引起。
  8. 【权利要求8】根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的血管性痴呆由心脏脱落栓子的栓塞引起。
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