CN107281207A

CN107281207A - 黄芪皂苷i在制备防治老年性痴呆的药物或保健品中的用途

Info

Publication number: CN107281207A
Application number: CN201610192546.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Nanjing Huibao Biological Medicine Co Ltd
Current assignee: Nanjing Huibao Biological Medicine Co Ltd
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2017-10-24

Abstract

本发明公开了一种防治老年性痴呆的药物或保健品，它是由黄芪皂苷Ⅳ或包含黄芪皂苷I的药物组合制备而成。本发明的黄芪皂苷I可用于防治阿尔茨海默病、血管性痴呆、阿尔茨海默病和血管性痴呆并存的混合性痴呆一种或几种。

Description

黄芪皂苷I在制备防治老年性痴呆的药物或保健品中的用途

技术领域

本发明涉及中药领域，特别是涉及黄芪皂苷I或包含黄芪皂苷I的药物组合在制备防治老年性痴呆的药物或保健品中的应用。

背景技术

老年性痴呆主要包括阿尔茨海默病(AD)和血管性痴呆(VD)，阿尔茨海默病约占60～70％，血管性痴呆约占20～30％。阿尔茨海默病（Alzheimer ’s disease, AD）是一种以进行性痴呆为主的中枢神经系统的退行性疾病。其临床特征为记忆及其他认知功能障碍，早期临床症状包括运动、感觉或协调功能缺陷。AD患者的主要的病理改变为细胞外淀粉样蛋白沉淀形成老年斑、神经元纤维缠结以及广泛神经元突触的缺失、炎症、氧化甚至是坏死。

随着社会的发展和人口的老龄化，阿尔茨海默病的发病随年龄的增长而增加。根据世界卫生组织（WHO）和国际阿尔茨海默病协会（ADI）统计，目前全球患有痴呆的患者估计在4700万左右，其中阿尔茨海默病患者大约占60%-70%。这个数字预计每20年增长1倍，即每4秒钟地球的某个角落就出现一例新的痴呆病例。痴呆的患病率和巨大耗费给社会和科研以巨大挑战，然而到目前为止，还没有一种药物可以从根本上治疗阿尔茨海默病，科研工作者们十多年来屡战屡败，屡败屡战。

AD发病机制复杂，目前国内外尚没有能根本治疗AD的药物，因此早期治疗至关重要。目前已上市的治疗药物主要分为两种，一种为胆碱酯酶抑制剂，如盐酸多奈哌齐、加兰他敏、酒石酸卡巴拉汀、石杉碱甲等；另一种为兴奋性氨基酸受体拮抗剂，如盐酸美金刚。另有抗炎、抗氧化、抗胆固醇、抗β淀粉样蛋白类药物用于AD的辅助治疗。上述药物能短期改善AD患者的症状，但不能缓解疾病的发展，且易形成耐药，不良反应明显；而中医药在防治轻度认知障碍和老年性痴呆具有较好的临床效果，有多途径、多环节整体调节的特点，且使用天然药物的毒副作用小。因此，中药单体或其有效组分的提取应用于AD的防治具有十分重要的意义。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge. var.Mongholicus (Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，该属植物全世界约有1600多种，主要分布于除大洋州外的世界亚热带和温带地区。我国有130种左右，主产于东北，经北部、西北而至西南，可入药者有10种左右。黄芪入药历史非常悠久，《神农本草经》中把本品列为上品，谓其“味甘，微温。”具有“排脓止痛、补虚”之功，治“痈疽久败疮，大风癞疾，五痔，鼠瘘，小儿百病”。2005年版《中华人民共和国药典》上明列黄芪具有“补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌”功效，“用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，痈疽难溃，久溃不敛，血虚痿黄，内热消渴；慢性肾炎蛋白尿，糖尿病”。

黄芪的化学成分众多，主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等。药理作用研究表明，黄芪所含的皂苷类成分为其抗炎、提高免疫功能的有效成分；多糖为其提高免疫功能的主要有效成分；而黄酮类成分则是其心血管作用的主要有效成分，具有良好的清除氧自由基，降低细胞脂质过氧化物生成及血浆中的总胆固醇，能够升高细胞 SOD活性，维持细胞正常代谢，此外还具有调节免疫、抗病毒等多方面的药理作用。

目前黄芪多以药物组方的形式应用于治疗老年性痴呆，也有研究发现黄芪多糖可以改善大鼠学习记忆的作用。黄芪皂苷I从豆科植物蒙古黄芪中提取炼制，白色结晶粉末状，CASRN为84680-75-1，分子式为C₄₃H₆₈O₁₆。本发明人进一步研究发现黄芪皂苷I能显著改善APP/PS1双转基因痴呆小鼠认知功能障碍，其对防治老年痴呆意义非常重大。

发明内容

本发明的目的在于提供黄芪皂苷I或包含黄芪皂苷I的药物组合在制备防治老年性痴呆药物或保健品中的用途。

本发明所述的防治老年性痴呆的药物或保健品，其特征在于：其剂型为丸剂、颗粒剂、片剂、糖浆剂、合剂、胶囊剂、酊剂、茶剂、注射剂。

本发明所述的防治老年性痴呆的药物或保健品，其特征在于：可制成注射剂、片剂、缓释片、滴丸、颗粒剂、粉针剂、胶囊剂、微粒剂。优选剂型为片剂、滴丸、粉针剂、胶囊剂。可与任何一种或一种以上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各种剂型。

本发明所述的防治老年性痴呆的药物或保健品，其特征在于：给药途径优选口服。

本发明所述的防治老年性痴呆的药物或保健品，其特征在于：所述老年性痴呆为阿尔茨海默病、血管性痴呆、阿尔茨海默病和血管性痴呆并存的混合性痴呆一种或几种。

本发明所述的防治老年性痴呆的药物或保健品，其特征在于：所述老年性痴呆主要为阿尔茨海默病。

本发明提供的黄芪提取物黄芪皂苷Ⅳ还可以用于制备保健食品添加剂和/或保健食品，可以制备成保健食品的各种剂型，例如片剂、胶囊剂、口服液、保健饮料、保健茶等；也可以作为食品添加剂，应用于食物（如面包、面条等）、保健茶、保健饮料等。

具体实施方式

下面通过具体实施例对该发明作进一步的描述。

实施例1：体外研究证明黄芪皂苷I抑制Aβ的神经毒性对AD具有治疗作用

1.细胞株及主要试剂

大鼠嗜铬细胞瘤SH-SY5Y细胞（购自ATCC）、DMEM/F12、胎牛血清、MTT、盐酸多奈哌齐（在美国 Sigma购买）、石杉碱甲（在美国 Sigma购买）

2.药物配制

①黄芪皂苷I用三蒸水配制成浓度分别为5ug/ml、50ug/ml、500ug/ml。

②Aβ25-35用三蒸水配制成100 μmol /L，过滤，分装，－20℃ 冻存；使用前配制成所需浓度，并在37℃孵育7 d。

3.模型建立

取对数生长期SH-SY5Y细胞，1mL 0.25％胰酶消化、离心后用完全培养基重悬，密度为10⁵mL^-1 ，接种于96孔板( 100μL)或24孔板( 1mL)。待80% 融合时吸去旧培养液，加入新培养液，并将细胞分为15组，加入Aβ_25-3530μmol/L，作用24h后加黄芪提取物，其浓度分别为5ug/ml、50ug/ml、500ug/ml，温度37℃培养24h。

4.神经元细胞活力检测

每组设3个平行样本，取均值。96孔板分别培养相应时间，每孔加入 20 μl MTT(浓度为5 mg/ml)，调零孔只加培养液。37℃继续培养4 h后，以扣板法扣除液体，每孔再加入150μl DMSO，37 ℃振荡10 min ，待紫色结晶充分溶解后，置酶标仪上，以滤过波长490 nm，测各孔光吸收值(OD)。然后以OD值求细胞存活率。

细胞存活率(%) =实验组OD/对照组OD×100%

5.神经元凋亡率检测

Annexin-V/PI双染法使用流式细胞仪检测神经元凋亡率。收集神经元离心(2000rpm离心5min)；PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1~5×10⁵细胞；加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15min；流式细胞仪检测。

6.结果

6.1 MTT提示Aβ_25-35明显降低神经元的生存率，黄芪皂苷I能抑制Aβ的神经毒性：

Aβ_25-35浓度为30 μmol /L 时，与空白对照组比较，模型组细胞生存率为( 77. 3± 4.4) %，出现明显的下降( P＜0. 01），说明造模成功；与模型组比较，黄芪皂苷I低剂量组(86. 3± 5. 2) %、中剂量组( 92. 4± 4. 9) %和高剂量组( 95.0± 5.6) %的细胞生存率均明显的上升( P＜0. 001），说明黄芪皂苷I能抑制Aβ的神经毒性。

6.2 AV/PI结果显示黄芪皂苷I能减少Aβ_25-35导致的神经细胞凋亡，Aβ_25-35浓度为30 μmol /L时，与空白对照组比较，模型组细胞生存状态出现明显变化，凋亡率增加明显，可达40% 以上；与模型组比较，黄芪皂苷I中剂量组（22.7%）和高剂量组的凋亡率（20.4%）明显的减少( P ＜0. 01），说明黄芪皂苷I能抑制Aβ的导致的神经细胞凋亡。

7.结论

黄芪皂苷I能保护Aβ_25-35对SH-SY5Y细胞的损伤，增加SH-SY5Y细胞的存活。

实施例2：在体研究证明黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因痴呆小鼠具有治疗作用

1材料

1.1实验动物

5月龄APP/PS1双转基因小鼠60只，雄性，体重25±2g，SPF级，相同遗传背景C57BL/6J小鼠10只为正常对照。

1.2实验药物及试剂

阳性对照药物选用盐酸多奈哌齐(商品名称：安理申)，5mg/片，使用前将片剂研成粉末，以双蒸水配制成灌胃药液0.65mg/kg·d^{- 1}；石杉碱甲胶囊用双蒸水配制成灌胃药液，配制浓度为0.026mg/kg·d^{- 1}。乙酰胆碱酯酶 ( AChE)试剂盒、胆碱乙酰转移酶(ChAT)试剂盒、SOD活性试剂盒、MDA含量试剂盒、GSH含量试剂盒。

1.3主要仪器

DMS-2型Morris水迷宫仪数据自动采集及处理系统，BH-2型生物显微镜，DpxView Pro型计算机彩色图像处理系统，石蜡切片装置，全自动封闭式组织脱水机，包埋机，病理组织漂烘仪，Image-Pro Plus图像分析系统，高速冷冻低温离心机。

2方法

2.1分组与给药

按体重一致原则，随机将APP/PS1双转基因小鼠分为模型组、黄芪皂苷I低剂量组30mg/kg/d、黄芪皂苷I中剂量组60mg/kg/d、黄芪皂苷Ⅳ高剂量组150mg/kg/d、盐酸多奈哌齐组(0.65mg/kg/d)和石杉碱甲组（0.026mg/kg·d），每组10只；相同遗传背景的同月龄C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组。正常组和模型组给以等体积蒸馏水灌胃，每日1次。各组小鼠灌胃8周，至7月龄时进行Morris水迷宫试验。

2.2脑组织样品处理

小鼠于末次行为学测试后，禁食12h，进行脑组织取材。对脑组织进行病理及免疫组化染色、组织含量测定等实验。

2.4统计学处理

所得数据以均数±标准差表示，采用统计软件SPSS18.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析，采用LSD、Dunnett′sC(方差不齐时)检验，以P＜0.05为差异有显著性意义。行为学Morris水迷宫测定中定位航行试验采用重复测量设计的方差分析，空间探索试验采用单因素方差分析。

3实验结果

3.1 Morris水迷宫实验中黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力影响结果显示，与空白对照组比较，模型组的逃避潜伏期显著延长（P＜0.01），平台停留时间显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪皂苷I中剂量组（P＜0.01）、高剂量组（P＜0.001）和阳性药盐酸多奈哌齐组（P＜0.05）逃避潜伏期显著减少，黄芪皂苷I高剂量组平台穿越平台次数和平台停留时间显著增加（P＜0.01），说明黄芪皂苷I可以提高大鼠学习记忆能力；与阳性药比较，黄芪皂苷I高剂量组潜伏期比阳性药组短、平台停留时间比阳性药组长和穿越平台次数比阳性药组多，说明黄芪皂苷I高剂量组对大鼠学习记忆能力的提高作用比阳性药好（见表1）。

表1黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠空间学习记忆能力的影响

组别

数量

逃避潜伏期(s)

目标象限穿越次数

平台停留时间(s)

目标象限停留时间(s)

穿越平台次数

空白对照组

10

20.2±2.4

4.3±0.4

0.7±0.1

13.4±1.1

1.9±0.3

模型组

10

42.3±4.2^##

3.8±0.3

0.4±0.1^#

11.8±1.0

1.3±0.3

黄芪皂苷I低剂量组

10

37.1±3.3

4.2±0.4

0.6±0.1

12.4±1.3

1.5±0.2

黄芪皂苷I中剂量组

10

33.8±4.6^**

3.7±0.4

0.5±0.1

12.2±1.5

1.6±0.3

黄芪皂苷I高剂量组

10

31.4±3.9^***

4.8±0.5^*

0.8±0.1^**

13.1±1.6

2.2±0.5^**

盐酸多奈哌齐组

10

36.7±3.2^*

4.2±0.3

0.7±0.1^*

12.9±1.1

1.5±0.4

石杉碱甲组

10

38.0±4.0

4.0±0.3

0.5±0.1

12.3±1.2

1.7±0.3

与空白对照组比较，^#P＜0.05、^##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05

3.2黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠海马内胆碱乙酰转移酶（AchE）和乙酰胆碱酯酶（ChAT）活性的影响结果显示，与空白对照组比较，模型组的Ach含量显著降低、AchE活性显著增加、ChAT活性显著减少；与模型组比较，黄芪皂苷I高剂量组（P＜0.05）和阳性药盐酸多奈哌齐组（P＜0.01）、石杉碱甲组（P＜0.05）的Ach含量显著增加，黄芪皂苷I中剂量组（P＜0.05）、高剂量组（P＜0.01）和阳性药盐酸多奈哌齐组（P＜0.01）、石杉碱甲组（P＜0.05）的ChAT活性显著增加，说明黄芪皂苷I可通过调节胆碱能神经系统增加小鼠海马乙酰胆碱含量（见表2）。

表2黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠海马内Ach、AchE和ChAT含量的影响

组别	剂量mg/kg	Ach（ug/ml）	AchE( U/g)	ChAT( U/g)
					空白对照组		113.23±10.74	183.35±17.55	41.49±5.62
模型组		89.31±8.63^#	464.54±65.21^###	23.28±3.14^#
					黄芪皂苷I低剂量组	30.0	95.28±10.17	395.14±34.28	25.17±2.14
黄芪皂苷I中剂量组	60.0	97.76±9.88	388.02±36.22	33.58±3.87^*
					黄芪皂苷I高剂量组	150.0	113.38±10.03^*	373.26±35.58	39.11±4.42^**
盐酸多奈哌齐组	0.65	133.64±12.44^**	296.18±26.84^*	42.66±5.58^**
					石杉碱甲组	0.026	108.88±10.21^*	264.67±55.09^**	38.17±3.31^*

与空白对照组比较，^#P＜0.05、^###P＜0.001；与模型组比较*P＜0.05、**P＜0.01

3.3黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠海马中老年斑（SP）的影响结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠海马中SP数量显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，黄芪皂苷I中剂量组（P＜0.01）、高剂量组（P＜0.001）和阳性药组小鼠海马中SP数量显著减少，说明黄芪皂苷I可减少APP/PS1双转基因小鼠海马中老年斑沉积（见表3）。

表3 黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠海马中老年斑（SP）的影响

组别	剂量mg/kg	动物数量	SP数量（个）
				空白对照组		10	2.0±0.4
模型组		10	23.9±4.9^###
				黄芪皂苷I低剂量组	30.0	10	19.3±3.5
黄芪皂苷I中剂量组	60.0	10	13.2±3.1^**
				黄芪皂苷I高剂量组	150.0	10	10.8±2.5^***
盐酸多奈哌齐组	0.65	10	12.5±2.8^**
				石杉碱甲组	0.026	10	16.8±3.9^*

与空白对照组比较，^###P＜0.001；与模型组比较**P＜0.01、***P＜0.001

3.4黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠海马SOD活性、MDA含量、GSH含量的结果显示与空白对照组比较，模型组的SOD活性显著减少、MDA含量显著增加、GSH含量显著减少；与模型组比较，黄芪皂苷I中剂量组（P＜0.05）、高剂量组（P＜0.01）和阳性药组（P＜0.01）SOD活性显著增加，黄芪皂苷I高剂量组和阳性药组（P＜0.05）MDA含量显著减少，黄芪皂苷I高剂量组（P＜0.01）GSH含量显著增加；说明黄芪皂苷I可以提高大鼠海马组织的抗氧化能力（见表4）。

表4 黄芪皂苷I对APP/PS1双转基因小鼠海马中SOD活性、MDA含量、GSH含量的影响

组别	SOD(U/mgprot)	MDA(nmol/mgprot)	GSH(mg/gprot)
				空白对照组	77.32±3.48	2.27±0.52	5.24±0.94
模型组	36.29±3.22^##	6.39±0.85^##	3.37±0.87^#
				黄芪皂苷I低剂量组	44.87±4.32	4.04±0.57	4.08±0.95
黄芪皂苷I中剂量组	61.73±6.66^*	3.87±0.36	4.34±0.69
				黄芪皂苷I高剂量组	81.49±8.05^**	3.20±0.33^*	4.93±0.63^**
盐酸多奈哌齐组	66.63±5.74^**	3.28±0.09^*	4.51±0.89
				石杉碱甲组	84.31±6.77^**	3.17±0.48^*	4.98±0.67^**

与空白对照组比较，^#P＜0.05、^##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001

4结论

黄芪皂苷I能改善APP/PS1双转基因痴呆小鼠认知功能障碍；黄芪皂苷I可以调节胆碱能神经系统增加小鼠海马乙酰胆碱含量，减少老年斑（SP）发生；黄芪皂苷I可以提高小鼠海马组织的抗氧化能力，增加SOD活性、降低MDA含量、增加GSH含量。

本发明采用黄芪皂苷I作为制备治疗老年性痴呆的药物，采用相关药理学试验进行黄芪皂苷I防治老年性痴呆的药效学评价，分别从改善中枢胆碱能神经系统、抑制β淀粉样蛋白(Aβ)形成和沉积、神经保护方面，阐明白芍苷多途径、多靶点治疗老年性痴呆的用途。

Claims

1.黄芪皂苷I或包含黄芪皂苷I的药物组合在制备防治老年性痴呆药物或保健品中的用途，其特征在于黄芪皂苷I的结构式为

。

2.根据权利要求1所述防治老年痴呆的药物或保健品的制备方法，其特征在于：其剂型为丸剂、颗粒剂、片剂、糖浆剂、合剂、胶囊剂、酊剂、茶剂、注射剂。

3.根据权利要求1至2所述，其特征在于：可与任何一种或一种以上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各种剂型。

4.根据权利要求1至3所述，其特征在于：制剂可以是口服、非肠道、直肠、鼻内给药的形式，也可以制成气雾剂、吸入剂等给药的形式。

5.根据权利要求1至4所述，其特征在于：给药途径优选口服。

6.如权利要求1至5所述的黄芪皂苷I或包含黄芪皂苷I的药物组合在制备防治老年性痴呆的药物、保健品中的用途。

7.根据权利要求6所述，其特征在于：所述老年性痴呆为阿尔茨海默病、血管性痴呆、阿尔茨海默病和血管性痴呆并存的混合性痴呆一种或几种。

8.根据权利要求7所述，其特征在于：所述老年性痴呆主要为阿尔茨海默病。