CN101348814B - 一种利用蛋白质等电点提高硫酸软骨素质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双酶法制备硫酸软骨素的工艺，包括清洗蒸煮后加入NaOH和NaCl提取，再向提取液中加入胰酶进行酶解处理，经过酶处理的提取液去蛋白后浓缩，最后通过一次沉淀以及调节pH值去除杂蛋白和二次沉淀即得到硫酸软骨素粗品。本发明在一次沉淀后通过精确的pH值调节，可以进一步除去混在硫酸软骨素中不易除去的杂蛋白，再通过其他步骤的相互配合，从而使最终得到的硫酸软骨素的纯度达到97％以上。
Description
技术领域
本发明属于生化制药领域，具体涉及一种硫酸软骨素的制备方法。
背景技术
硫酸软骨素是广泛存在于人和动物软骨组织中的一类黏多糖，它作为结缔组织的重要组成部分，具有多种药理作用与生理功能。在我国硫酸软骨素用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节炎、肩关节痛和腹腔手术后疼痛等，预防和治疗链霉素引起的听觉障碍及各种噪声引起的听觉困难、耳鸣症等，效果显著。在西方发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。长期的临床应用发现，在动脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质可以被有效去除或减少，能显著降低血浆胆固醇，从而防止动脉粥样硬化的形成。
硫酸软骨素的提取方法主要有碱提-酶解法、碱提法、超声波辅助法和乙酸提取法，而碱提-酶解法又分为稀碱-酶提取工艺、浓碱-酶提取工艺和稀碱稀盐-酶提取工艺等。以上几种提取方法都存在或多或少的问题，如碱盐用量大、生产周期长、耗能高、收率低、产品纯度低等。
发明内容
本发明的目的是针对现有的稀碱稀盐-酶提取工艺中产品收率低、纯度低的缺点，采用较浓的碱液(2％)有效释放硫酸软骨素，同时使部分蛋白质降解及变性沉淀，提高纯度。再将酶解后的滤液浓缩，减少了酒精用量，使沉淀更加完全，然后将一次沉淀物用水溶解，将夹杂在一次沉淀物中的蛋白质根据所含蛋白的种类在不同等电点进行沉降，再经过H2O2的氧化去细菌和漂白，最大限度的去除了产品中的杂蛋白，使产品质量大大提高达到97％以上。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：
(A)用NaHCO3溶液清洗软骨后蒸煮8～10小时；其中NaHCO3溶液的质量含量为1～5‰；
(B)待冷却至30℃以下后，加入NaOH和NaCl提取2次，2小时/次；其中NaOH的用量为软骨质量的0.5～5％，NaCl的用量为软骨质量的5～10％；
(C)向提取液中加入破碎均质好的猪胰脏和2709碱性蛋白酶，在45～55℃、pH8.8～9.0下处理5～10小时；其中猪胰脏的加入量为软骨质量的5～10％，2709蛋白酶的加入量为软骨质量的0.3～1％。；酶解的温度优选为49～51℃，pH优选为8.8～8.9；
(D)经过酶处理的提取液在温度65～67℃、pH4.4～4.6下处理0.5～3小时，再调pH5.5～6.0至明显分层后，用747过滤布过滤，滤液浓缩至1/3体积；
(E)向浓缩液中加入酒精至酒精的体积含量为62～68％，处理2～6小时进行一次沉淀；
(F)沉淀加水溶解，在60～65℃下，根据所含蛋白的种类，在不同等电点沉降不同的蛋白质。先调pH5.0～5.5放置1小时，再调pH6.5～7.0下静置0.5～3小时，然后调pH9.0～9.3，加入0.5～1.0％的H2O2处理0.5～5小时，过滤去掉杂蛋白；
(G)滤液加入酒精至体积含量为70～74％，处理0.2～1小时进行二次沉淀，再过滤，得到的沉淀经脱水、干燥得粗品。
粗品经过球磨后即得到白色粉末状成品。本发明中的酒精除特别说明的以外，一般指纯乙醇。
通过反复实验可以确定本发明的一种优化的工艺条件，其中NaHCO3溶液的质量含量为3‰，NaOH的用量为软骨质量的1～3％，NaCl的用量为软骨质量的7～9％，一次沉淀时加入酒精至酒精的体积含量为64～66％，一次沉淀处理时间3～5小时；将一次沉淀物用水溶解后进行在不同等电点的pH调节，以除去杂质蛋白，去除方法为在60～65℃下，先在pH5.0～5.5下静置处理0.8～1.5小时，再在pH6.5～7.0下静置处理0.8～1.5小时，最后调pH9.0～9.3，加入0.5～1.0％的H2O2处理1～3小时氧化漂白，过滤；滤液进行二次沉淀，加入酒精至酒精的体积含量为71～73％，二次沉淀处理时间0.4～0.6小时。
本发明一方面利用天然酶与蛋白酶的协同作用来提高产品质量，天然酶是利用冷冻的猪胰脏经机器绞碎后用30％左右的酒精均质，酒精能使细胞膜破碎直接刺激胰酶的分泌。此法比用纯胰酶成本低，酶的原始状态好酶活高，实际效果比纯胰酶更好。所用的蛋白酶是2709碱性蛋白酶，此酶是采用地衣型芽孢杆菌2709优良菌株经液态深层培养发酵提取的固态酶。另一方面利用蛋白质等电点来提高硫酸软骨素质量，根据所含蛋白的种类，在不同等电点沉降不同的蛋白质，从而提高硫酸软骨素的纯度。
本发明采用两种酶(2709蛋白酶和猪胰脏)按特定的比例混合使用，由于猪胰脏中胰酶的原始状态好酶活高，通过与2709蛋白酶的协同作用从而提高酶解效率，可以使牛鼻骨最终收率达到25％，其他易提取软骨的收率可达到40％。同时本发明将一次沉淀物中所夹杂的蛋白质通过精确的pH值调节，在不同的等电点时进一步除去混在硫酸软骨素中不易除去的杂蛋白，再通过其他步骤的相互配合，从而使最终得到的硫酸软骨素的纯度达到97％以上。
具体实施方式
实施例1
将牛鼻骨用3‰的NaHCO3溶液清洗后，蒸煮9小时；待冷却至30℃以下后，加入NaOH和NaCl提取两次；其中NaOH的用量为软骨质量的2％，NaCl的用量为软骨质量的8％。
向提取液中加入破碎均质好的猪胰脏和2709蛋白酶，在51℃、pH8.8～8.9下处理7小时，其中猪胰脏的加入量为软骨质量的8％，2709酶的加入量为软骨质量的0.6％。经过酶处理的提取液在温度67℃、pH4.4～4.6下处理1小时，再调pH5.5～6.0至明显分层后，用747过滤布过滤，滤液浓缩至原体积的1/3。
向上述浓缩液中加入酒精至体积含量为64％，处理4小时进行一次沉淀，过滤，滤渣加水溶解后在63℃下，先在pH5.0～5.5下静置处理1小时，再在pH6.5～7.0下静置处理1小时，最后调pH9.0～9.3，加入0.8％的H2O2处理2小时氧化漂白，过滤；滤液再加入酒精至体积含量为73％，处理0.5小时进行二次沉淀，再过滤，滤渣脱水、干燥得粗品，再经过球磨后即为白色粉末成品。最终成品的收率为25％，经检测，硫酸软骨素的纯度为98.6％。
实施例2
将牛鼻骨用3‰的NaHCO3溶液清洗后，蒸煮9小时；待冷却至30℃以下后，加入NaOH和NaCl提取两次；其中NaOH的用量为软骨质量的2％，NaCl的用量为软骨质量的8％。
向提取液中加入均质好的猪胰脏和2709蛋白酶，在50℃、pH8.8～8.9下处理8小时，其中猪胰脏的加入量为软骨质量的6％，2709酶的加入量为软骨质量的1％。。
经过酶处理的提取液在温度66℃、pH4.4～4.6下处理1小时，再调pH5.5～6.0至明显分层后，过滤，滤液浓缩。
向上述浓缩液中加入酒精至体积含量为65％，处理4小时进行一次沉淀，过滤，滤渣加水溶解后在64℃下，先在pH5.0～5.5下静置处理1小时，再在pH6.5～7.0下静置处理1小时，最后调pH9.0～9.3，加入0.7％的H2O2处理2小时氧化漂白，过滤；滤液加入酒精至体积含量为72％，处理0.5小时进行二次沉淀，过滤，滤渣脱水、干燥得粗品，经过球磨后即为白色粉末成品。最终成品的收率为24％，经检测，硫酸软骨素的纯度为98.5％。
实施例3
除将牛鼻骨替换为牛喉管外，其他同实施例1，最终白色粉末的收率为15％，纯度为97.4％。
实施例4
除将牛鼻骨替换为牛脊椎骨外，其他同实施例2，最终白色粉末的收率为6％，纯度为98％。
实施例5
除将牛鼻骨替换为鸭喉管外，其他同实施例1，最终白色粉末的收率为36％，纯度为97.3％。
实施例6
除将牛鼻骨替换为鸡喉管外，其他同实施例2，最终白色粉末的收率为40％，纯度为97.1％。
Claims (3)
1.一种利用蛋白质等电点提高硫酸软骨素质量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(A)用NaHCO3溶液清洗软骨后蒸煮8～10小时；其中所述的NaHCO3溶液的质量含量为1～5‰；
(B)加入NaOH和NaCl提取两次；其中NaOH的用量为软骨质量的0.5～5％，NaCl的用量为软骨质量的5～10％；
(C)向提取液中加入破碎均质好的猪胰脏和2709碱性蛋白酶，在45～55℃、pH8.8～9.0下处理5～10小时；
(D)经过酶处理的提取液在温度65～67℃、pH4.4～4.6下处理0.5～3小时，再调pH5.5～6.0至明显分层后，过滤，滤液浓缩至1/3体积；
(E)向浓缩液中加入酒精至酒精的体积含量为62～68％，处理2～6小时进行一次沉淀；
(F)沉淀加水溶解，在60～65℃下，先调pH5.0～5.5放置1小时，再调pH6.5～7.0下静置0.5～3小时，然后调pH9.0～9.3，加入0.5～1.0％的H2O2处理0.5～5小时，过滤；
(G)滤液加入酒精至体积含量为70～74％，处理0.2～1小时进行第二次沉淀，过滤，将沉淀脱水、干燥得粗品，再经过球磨得成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于均质猪胰脏的加入量为软骨质量的5～10％，2709碱性蛋白酶的加入量为软骨质量的0.3～1％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中酶解的温度为49～51℃，pH为8.8～8.9。
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Application publication date: 20090121 Assignee: HUNAN WUXING BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Nanjing Tech University|SHUANGFENG SHUANGXING BIOCHEMICAL ENGINEERING Co.,Ltd. Contract record no.: 2013430000072 Denomination of invention: Method for improving chondroitin sulfate quality by protein isoelectric point Granted publication date: 20120314 License type: Exclusive License Record date: 20130517 |
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