CN101314041A

CN101314041A - 一种聚合物胶束载药系统及其制备方法

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Publication number: CN101314041A
Application number: CNA2008100626490A
Authority: CN
Inventors: 胡富强; 魏晓红; 杜永忠; 袁弘
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-06-26
Filing date: 2008-06-26
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2028-06-26
Also published as: CN101314041B

Abstract

本发明公开了一种聚合物胶束载药系统及其制备方法，所述的聚合物胶束载药系统是由水杨酸－g－壳寡糖接枝物构成的聚合物胶束，以及至少一种被包埋在所述聚合物胶束中的水难溶性药物组成，所述的水难溶性药物是指在1000ml水性介质中的溶解度等于或小于1g的药物。本发明采用了水杨酸－g－壳寡糖接枝物构成的聚合物胶束作为药物载体，提高了水难溶性药物的载药量，同时该给药系统在体外漏槽条件下可控缓释水难溶性药物。并且，所述聚合物胶束载药系统制备简单、工艺合理。

Description

一种聚合物胶束载药系统及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种聚合物胶束载药系统及其制备方法。

(二)背景技术

临床应用的抗肿瘤化疗药物大多为难溶性药物。它们由于溶解度很小，很难在人体水溶性环境中溶解并被机体吸收，生物利用度低。包括增溶、助溶和采用微粒给药系统等制剂学技术，能够在一定程度上改善难溶性药物的溶解度，但存在的问题依然比较突出，比如在体内遇到体液的不稳定性，以及所应用的增溶材料或溶剂存在的毒性等。因此，根据抗肿瘤药物的结构和理化性质设计合成新型药物载体，是实现安全高效抗肿瘤新制剂需要解决的关键问题之一，也是研究和开发具有自主知识产权医药产品的必经之路。

两亲性高分子聚合物胶束作为难溶性药物载体材料，是近几年用于提高难溶性药物溶解度的一个新手段。聚合物胶束是由两亲基团在溶剂中自发形成的核-壳状结构，和常用的表面活性剂相比，具有较低的临界胶束浓度和稳定的空间结构，能够体现出特有的生物稳定性。通过对亲水、疏水二部分基团的选择和修饰，可赋予聚合物胶束不同的特性，以满足不同药物结构和给药部位的要求。纳米尺寸的聚合物胶束还具有“增强了的渗透和滞留作用”，对于肿瘤靶向治疗有特殊意义。

聚合物胶束作为药物载体存在的主要困难包括：(1)胶束内部载药量受到胶束核结构大小的限制；(2)载药胶束在体内水性环境中因解聚而导致药物的提前释放。要解决这二个问题，需要对载体与药物在化学结构之间进行分子互补性设计。从所包裹药物的结构特征出发，设计胶束载体分子适宜的亲水基团和疏水基团，构建具有高载药量、良好生物稳定性的聚合物胶束。

水杨酸是能将难溶性药物溶解度提高的向水性化合物，它在水中呈微溶，化学结构为苯环上带有相邻的一个羧基和一个羟基。它不仅含有π键，而且是以难溶性药物大都具有的苯环结构存在。它主要是通过π键与难溶性药物的苯环相互作用，增加了和难溶性药物之间的作用力，从而提高了难溶性药物在水中的溶解度，同时也增加难溶性药物进入水溶性介质后的稳定性。研究表明紫杉醇在3.5M水杨酸钠水溶液中的溶解度为5.543mg/ml，这与紫杉醇在纯水中的溶解度(0.3μg/ml)相比，增加了大约18,000倍。事实上，水杨酸钠对于难溶性药物的增溶性已广为人知并加以利用，它常被加在体外释放介质中营造漏槽条件。但是作为小分子化合物，水杨酸钠作为药物载体时，容易随药物进入细胞，产生毒性。因此，需要将水杨酸与其他化合物接枝或嵌段共聚成高分子化合物作为药物载体材料。

壳聚糖，是天然存在的、阳离子多糖。可生物降解，具有良好的生物相容性。由于壳聚糖具有一系列特殊的化学和生物性质，适合作为药物的控缓释载体，被广泛用于制剂研究。然而，由于壳聚糖呈高分子量、高粘性和高乙酰化，使得它不溶于一般的有机溶剂和水，这为其广泛应用造成了很大困难。为了改进其溶解性，人们对其进行了许多改性工作，其中经过酸溶和酶解得到的低分子壳寡糖保留了壳聚糖的优点，改进了其缺点，是理想的亲水性骨架材料，可用于聚合物胶束的构建。通过对壳寡糖分子量的调控，可实现胶束粒径的人为控制；其具有打开细胞膜间隙的能力，有利于聚合物胶束跨膜的转运；糖链上大量游离的自由氨基，为胶束接枝疏水性基团或其他功能基团提供可能。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型的载运水难溶性药物的聚合物胶束载药系统以及其制备方法。

本发明所述的聚合物胶束载药系统，是由水杨酸-g-壳寡糖接枝物构成的聚合物胶束，以及至少一种被包埋在所述聚合物胶束中的水难溶性药物组成。

所述的水难溶性药物是指在1000ml水性介质中的溶解度等于或小于1g的药物，包括：紫杉醇、阿霉素碱基、羟基喜树碱等。

所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物，其结构如通式(I)如示，所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物通过壳寡糖和水杨酸接枝聚合得到，所述壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70～100％，所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物中壳寡糖链上的部分氨基被水杨酰基取代，氨基取代度为1～80％。

通式(I)中，

具体的，所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法为：

(1)壳寡糖的制备：选取脱乙酰度为70～100％的壳聚糖，在40-60℃和pH4.0-6.0条件下，按纤维素酶与壳聚糖比例0.1-5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖，以粘度法控制壳聚糖的降解程度，所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，选择合适的超滤膜超滤分级，超滤液冷冻干燥，得到分子量为1～100kDa、脱乙酰度为70～100％的壳寡糖。

(2)接枝物的制备：取上述制得的壳寡糖，用水溶解，在5～95℃加入用有机溶剂A溶解的水杨酸和碳二亚胺的溶液(有机溶剂A为乙醇或乙腈，优选乙醇)，在5～95℃反应2～80小时，反应液经膜截留分子量为3500的透析膜透析纯化，透析后的溶液冷冻干燥得到水杨酸-g-壳寡糖接枝物粗品，将水杨酸-g-壳寡糖接枝物粗品溶于水中，超声处理，离心，取上清液冷冻干燥得到水杨酸-g-壳寡糖接枝物纯品，所述的反应物投料物质的量比壳寡糖糖元2位上的自由氨基数∶水杨酸∶碳二亚胺为1∶0.01-1∶1-20。

本发明还提供了一种所述的聚合物胶束载药系统的制备方法，所述制备方法可按照如下步骤进行：往溶有水杨酸-g-壳寡糖的溶媒中加入用有机溶剂B溶解的水难溶性药物的溶液，超声处理，充分分散后混合液经后处理去除多余的溶媒和溶剂，即得到所述的载药胶束，所述的溶媒与所述的有机溶剂B互溶，所述的溶媒为人体可接受的PBS缓冲液或水溶液。所述的PBS缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS)。

制备过程中超声处理推荐采用探头超声。探头超声功率为400w，30～50次，优选400w，40次，工作2s休息3s。

具体推荐所述的后处理采用如下方法：混合液先经膜截留分子量为3500的透析膜透析，取未过生物膜的溶液再次超声处理(400w，40次，工作2s，休息3s)，离心，取上清液，即得载药胶束。

所述的的溶媒优选为水溶液。

所述的用来溶解水难溶性药物的有机溶剂B可选用：乙醇、DMSO等，优选为乙醇。

本发明所述的有机溶剂A和有机溶剂B主要是基于不同反应步骤所做的区分，并不表示它们不可以是同一种有机溶剂。

具体的，聚合物胶束载药系统的制备方法如下：往溶有水杨酸-g-壳寡糖的水溶液中加入用乙醇溶解的难溶性药物的溶液，探头超声处理，400w40次，工作2s休息3s，充分分散后混合液先经膜截留分子量为3500的透析膜透析，取未过生物膜的溶液再次探头超声处理，400w40次，工作2s休息3s，离心，取上清液，即得载药胶束。

本发明的有益效果体现在：

a)本发明所采用的水杨酸-g-壳寡糖接枝物，结合了向水性化合物水杨酸和壳寡糖二者的优点，其中向水性化合物水杨酸为疏水性部分，壳寡糖为亲水性部分。该接枝物在水性介质中，可通过自聚集形成水杨酸-g-壳寡糖胶团。以水杨酸-g-壳寡糖接枝物形成的聚合物胶束作为药物载体，可提高水难溶性药物的载药量，同时该给药系统在体外漏槽条件下可控缓释水难溶性药物。

b)本发明所述以水杨酸-g-壳寡糖接枝物作为胶束载体载运水难溶性药物的载药系统，制备简单。

本发明所涉及的适用于水难溶性药物的载体系统，探索了水难溶性药物的给药新方法和新手段，为丰富治疗手段和提高疗效提供理论与技术基础。

(四)附图说明

图1是实施例5-8制得的载有紫杉醇的水杨酸-g-壳聚糖胶束的体外释放曲线(n＝3)。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1：

(1)壳寡糖的制备

取市售分子量为550kDa的壳聚糖(70％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶(上海伯奥生物科技有限公司生产)，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。取分子量介于10kDa和30kDa的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为70％、分子量18kDa的壳寡糖。

(2)水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备

精密称取0.2756g碳二亚胺(EDC)和0.0397g水杨酸(Salicycleacid，SA)置于3mL的无水乙醇中(A液)，然后精密称取0.1g的壳寡糖(CSO)置于6mL的蒸馏水(DW)中(B液)，在25℃时，将A液滴加到B液中，25℃下反应53hr。冷却后，转入透析袋(MWCO＝3500)透析24小时后，预冻，冻干即得粗产品。将粗产品溶于一定量的水中，探头超声(400w，超声2s，间隔3s，40次)，4000rmp离心10min，取上清液预冻，冻干即得纯化后的载体材料。采用氢谱核磁共振(¹H-NMR)确认CSO-g-SA的结构。

(3)水杨酸-g-壳寡糖接枝物的理化性质测定

A.采用三硝基苯磺酸法，测定所得水杨酸-g-壳寡糖接枝物的氨基取代度。

取不同重量的制得的18KDa分子量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，超声赶走气泡，在344nm波长处测定吸光度值(A)，得到18KDa壳寡糖的氨基取代度标准曲线。称取适量18KDa壳寡糖的水杨酸接枝物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算该水杨酸-g-壳寡糖接枝物的氨基取代度。计算方法：氨基取代度SD＝N/X。

其中X为每molCSO上含有游离NH₂的个数，N为每molCSO被取代的NH₂的个数，而A糖/A载体＝[(m糖/M糖)/(m载体/M载体)]*[X/(X-N)]

B.采用芘荧光法测定，水杨酸-g-壳寡糖接枝物的临界胶团浓度。

取0.5ml 0.0012mg/ml芘放入10ml的试管中，放入50℃烘箱挥干芘(约6hr)。配制0.05mg/ml～500mg/ml不同浓度的空白载体溶液5ml，将5ml这些各浓度的空白载体溶液加入到已挥干芘的试管中，使芘的终浓度为7×10^-7mol·L^-1在37℃的摇床中振摇过夜。测定荧光。将激发光谱固定在339nm，激发光谱的狭缝固定在10nm，发射光谱的狭缝固定在2.5nm，扫描速度为1500nm/min，激发电压为400V.扫描350-450nm发射光谱，测定芘在374nm、384nm处的荧光强度。根据测定得到的I₃₇₄/I₃₈₄计算临界胶团浓度。

C.测定水杨酸-g-壳寡糖接枝物胶团的粒径及Zeta电位。

取水杨酸-g-壳寡糖接枝物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的水杨酸-g-壳寡糖接枝物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪测定水杨酸-g-壳寡糖接枝物胶团的粒径及Zeta电位。

上述理化性质测试结果见表2。

实施例2-4

按照表1所示的合成处方制备水杨酸-g-壳寡糖接枝物，其他条件同实施例1，理化性质的测试结果见表2。

表1：实施例1-4的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的合成处方(n＝3)

实施例	壳寡糖分子量(kDa)	水杨酸的理论取代度	EDC(g)	水杨酸(g)	乙醇(ml)	壳寡糖(g)	蒸馏水(ml)
实施例	壳寡糖分子量(kDa)	水杨酸的理论取代度	EDC(g)	水杨酸(g)	乙醇(ml)	壳寡糖(g)	蒸馏水(ml)	实施例1	1,8000	50％	0.2756	0.0397	3	0.1	6
实施例2	2,8000	15％	0.0826	0.0119	1	0.1	6	实施例1	1,8000	50％	0.2756	0.0397	3	0.1	6
实施例2	2,8000	15％	0.0826	0.0119	1	0.1	6	实施例3	2,8000	50％	0.2756	0.0397	3	0.1	6
实施例4	2,8000	100％	0.5512	0.0794	6	0.1	6	实施例3	2,8000	50％	0.2756	0.0397	3	0.1	6

表2实施例1-4制得的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的理化性质(n＝3)

实施例	壳寡糖分子量(kDa)	水杨酸的理论取代度	氨基取代度(％)	临界胶团浓度(μg/ml)	Z均粒径(nm)	Zeta电位(mV)
实施例	壳寡糖分子量(kDa)	水杨酸的理论取代度	氨基取代度(％)	临界胶团浓度(μg/ml)	Z均粒径(nm)	Zeta电位(mV)	实施例1	1,8000	50％	12.41±0.47	454.79	481.0	39.9±38.3
实施例2	2,8000	15％	8.94±1.31	368.89	513.2	51.9±22.9	实施例1	1,8000	50％	12.41±0.47	454.79	481.0	39.9±38.3
实施例2	2,8000	15％	8.94±1.31	368.89	513.2	51.9±22.9	实施例3	2,8000	50％	11.44±1.75	163.98	461.8	48.6±9.9
实施例4	2,8000	100％	23.39±2.63	78.90	440.8	44.1±1.6	实施例3	2,8000	50％	11.44±1.75	163.98	461.8	48.6±9.9

实施例5-8载有紫杉醇胶束的制备

分别准确称取实施例1-4得到的空白水杨酸-g-壳寡糖载体材料10mg依次作为实施例5～8的原料，各自用10ml蒸馏水配成1mg/ml的载体水溶液；同时准确称取紫杉醇10mg，用1ml乙醇溶解，得到10mg/ml的紫杉醇母液。将此紫杉醇溶液以10％药载比(w/w)加入到载体溶液中，探头超声，400w40次，工作2s休息3s。然后将溶液转入透析袋(膜截留MWCO＝3500)中透析以除去乙醇，透析4.5小时。将透析后的溶液转入西冷瓶中，再次探头超声，400w40次，工作2s休息3s。4000rpm离心10min，除去尚未溶解的紫杉醇晶体。取上清液。即得载药胶束。

实施例9-12载有阿霉素碱基胶束的制备

分别准确称取实施例1-4制得的空白水杨酸-g-壳寡糖载体材料，各自用蒸馏水配成1mg/ml的载体溶液；同时准确称取阿霉素碱基1mg，用1mlDMSO溶解，得到1mg/ml的阿霉素碱基溶液。将此阿霉素碱基溶液以10％药载比(w/w)加入到载体溶液中，探头超声，400w 40次，工作2s休息3s。。然后将溶液转入透析袋(膜截留MWCO＝3500)中透析以除去DMSO，透析24小时。将透析后的溶液转入西冷瓶中，再次探头超声，400w 40次，工作2s休息3s。4000rpm离心10min，除去尚未溶解的阿霉素碱基晶体。取上清液。即得载药胶束。

实施例13-16载有羟基喜树碱胶束的制备

分别准确称取实施例1-4制得的空白水杨酸-g-壳寡糖载体材料，各自用蒸馏水配成1mg/ml的载体溶液；同时准确称取羟基喜树碱1mg，用1ml乙醇溶解，得到1mg/ml的羟基喜树碱溶液。将此羟基喜树碱溶液以10％药载比(w/w)加入到载体溶液中，探头超声400w40次，工作2s休息3s。然后将溶液转入透析袋(膜截留MWCO＝3500)中透析以除去乙醇，透析24小时。将透析后的溶液转入西冷瓶中，再次超声400w 40次，工作2s休息3s。4000rpm离心10min，除去尚未溶解的羟基喜树碱晶体。取上清液。即得载药胶束。

实施例17载有紫杉醇胶束的理化性质测试

以实施例5-8制得的载药胶束作为测试对象。

1、粒径和表面电位的测定

以动态光散射测量法和Zeta电位测定仪分别测定载药胶束在双蒸水溶液中的粒径和表面电位。结果见表3。

2、载药胶束载药量和包封率的测定

2-1载药量的测定：

取0.1ml的载药胶束溶液，加0.4ml流动相(乙腈∶水＝1∶1，流速为1mg/ml)提取载药胶束中的紫杉醇，离心(4000rpm，10min)去除载体材料后，HPLC测定提取液上清液中的紫杉醇浓度，计算载药胶束的载药量。(HPLC测定条件：25℃，乙腈∶水＝50∶50，λ＝230nm，流速：1ml/min)。

载药量＝[HPLC测定的总的药物量/(总的载体+总的药物)]*100％

2-2包封率的测定：

取0.2ml的载药胶束溶液经4℃超滤(超滤膜截留分子量为10，000)离心(10,000rpm，20min)后，取续滤液，HPLC测定游离药物的浓度(25℃，乙腈∶水＝50∶50，λ＝230nm)。计算载药胶束的药物包封率。

包封率＝(测定得到的一定体积内总的药物重量-测定得到的该体积内的游离药物重量)/测定得到的一定体积内总的药物重量

结果见表4。

3、载药胶束体外释放行为的考察

将载药胶束(载体浓度为1mg/ml，理论药载比为10％)1ml，放入透析袋(MWCO＝7000)中，然后将透析袋放入20ml的0.8M的水杨酸钠溶液。在37℃的摇床中振荡。在0、1hr、2hr、3hr、5hr、7hr、9hr 19hr、31hr、55hr、67hr取0.8ml样品，补充0.8ml的新鲜介质。HPLC测定样品中的药物浓度(HPLC条件：λ＝230nm，流动相组成：乙腈∶水＝45∶55；流速＝1ml/min，柱温＝25℃)。同时以1ml游离药物的乙醇溶液为阴性对照，游离药物的加入量参照HPLC测定得到的实际载药胶束的载药量。释放曲线见图1。

表3载有紫杉醇的水杨酸-g-壳寡糖胶束的粒径和ζ_电位(n＝3)

载药胶束序号	壳寡糖的分子量	水杨酸的理论接枝率	粒径	ζ电位
载药胶束序号	壳寡糖的分子量	水杨酸的理论接枝率	粒径	ζ电位	实施例5	18000	50％	453.6	31.5±36.5
实施例6	28000	15％	380.8	49.0±1.6	实施例5	18000	50％	453.6	31.5±36.5
实施例6	28000	15％	380.8	49.0±1.6	实施例7	28000	50％	530.2	36.0±1.6
实施例8	28000	100％	361.7	40.6±4.3	实施例7	28000	50％	530.2	36.0±1.6

表4载有紫杉醇的水杨酸-g-壳聚糖胶束的载药量和包封率(n＝3)

载药胶束序号	壳聚糖的分子量	水杨酸的理论接枝率	载药量	包封率
载药胶束序号	壳聚糖的分子量	水杨酸的理论接枝率	载药量	包封率	实施例5	18000	50％	8.39±0.21	98.88±0.79
实施例6	28000	15％	5.60±0.23	99.65±0.04	实施例5	18000	50％	8.39±0.21	98.88±0.79
实施例6	28000	15％	5.60±0.23	99.65±0.04	实施例7	28000	50％	8.84±0.20	99.62±0.30
实施例8	28000	100％	5.95±0.65	99.51±0.30	实施例7	28000	50％	8.84±0.20	99.62±0.30

Claims

1、一种聚合物胶束载药系统，其特征在于所述的载药系统是由水杨酸-g-壳寡糖接枝物构成的聚合物胶束，以及至少一种被包埋在所述聚合物胶束中的水难溶性药物组成，所述的水难溶性药物是指在1000ml水性介质中的溶解度等于或小于1g的药物，所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的结构通式如下：

其中

所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物通过壳寡糖和水杨酸接枝聚合得到，所述壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70～100％，所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物中壳寡糖链上的部分氨基被水杨酰基取代，氨基取代度为1～80％。

2、如权利要求1所述的聚合物胶束载药系统，其特征在于所述的水难溶性药物包括：紫杉醇、阿霉素碱基、羟基喜树碱。

3、一种如权利要求1所述的聚合物胶束载药系统的制备方法，其特征在于所述的制备方法如下：往溶有水杨酸-g-壳寡糖的溶媒中加入用有机溶剂B溶解的难溶性药物的溶液，超声处理，充分分散后混合液经后处理去除多余的溶媒和溶剂，即得到所述的载药胶束，所述的溶媒与所述的有机溶剂B互溶，所述的溶媒为人体可接受的PBS缓冲液或水溶液。

4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的超声处理采用探头超声。

5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的探头超声功率为400w，30～50次。

6、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的后处理为：混合液先经膜截留分子量为3500的透析膜透析，取未过生物膜的溶液再次超声处理，离心，取上清液，即得载药胶束。

7、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的溶媒为水溶液。

8、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂B为乙醇或DMSO。

9、如权利要求3所述的聚合物胶束载药系统的制备方法，其特征在于所述的制备方法如下：往溶有水杨酸-g-壳寡糖的水溶液中加入用乙醇溶解的水难溶性药物的溶液，探头超声处理，400w 40次，工作2s休息3s，充分分散后混合液先经膜截留分子量为3500的透析膜透析，取未过生物膜的溶液再次探头超声处理，400w 40次，工作2s休息3s，离心，取上清液，即得载药胶束。