CN101300351B - 乳酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性减低或丧失、且具有生产乳酸的能力的微生物,特别是含有对具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质进行编码的基因的一部分或全部缺失了的染色体DNA的微生物,以及使用了该微生物的乳酸制造方法。
Description
技术领域
本发明涉及具有生产乳酸的能力的微生物以及使用了该微生物的乳酸制造方法。
作为生产乳酸的微生物,已报道有乳酸菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)等乳酸菌,根霉菌属(Rhizopus)的丝状菌、酵母菌属(Saccharomyces)等酵母以及大肠埃希杆菌,但已知乳酸菌显示复杂的营养要求性,且乳酸的光学纯度低(非专利文献1和2);丝状菌多有甘油、乙醇或富马酸等副产物(非专利文献3和4);酵母在使用重组菌株时也会副产生大量的乙醇,从而对于耗糖量的收率低(非专利文献5)。
作为使用了大肠埃希杆菌的乳酸制造方法,已知有使用丙酮酸甲酸裂解酶基因和与有机酸或乙醇的副产生有关的基因的缺失株的方法(非专利文献6),使用磷酸转乙酰酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的突变株的方法(非专利文献7),但乳酸的生产率均较低。
大肠埃希杆菌(Escherichia coli)的4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶(4-Hydroxybenzoate polyprenyltransferase)(以下称作UbiA蛋白质)以及2-八异戊二烯基苯酚羟化酶(以下称作UbiB蛋白质)是与大肠埃希杆菌中泛醌的生物合成有关的蛋白质,且UbiA蛋白质和UbiB蛋白质的氨基酸序列及编码该蛋白质的基因的碱基序列是已知的(非专利文献8和9)。另外,对于多数微生物,其染色体DNA的整个碱基序列是已知的(非专利文献10)。
已知在大肠埃希杆菌中,泛醌生物合成基因的突变株蓄积有2.5g/L的D-乳酸(非专利文献11和12),该突变株(AN59株)为ubiE基因的突变株(非专利文献13),其它泛醌生物合成基因产物的活性已降低了的株的乳酸的生产率以及泛醌生物合成基因突变株的乙酸产量等是未知的。
乙酸是乳酸发酵时的副产物,由于妨碍乳酸的精制或聚合化,因此寻 求乙酸的副产量少、廉价的乳酸制造方法。
非专利文献1:Appl.Microbiol.Biotechnol.,45,307(1996)
非专利文献2:Enzyme Microb.Technol.,26,87(2000)
非专利文献3:Appl.Biochem.Biotechnol.,51,57(1995)
非专利文献4:J.Biosci.Bioeng.,97,19(2004)
非专利文献5:Appl.Environ.Microbiol.,71,2789(2005)
非专利文献6:Appl.Environ.Microbiol.,69,399(2003)
非专利文献7:Appl.Environ.Microbiol.,65,1384(1999)
非专利文献8:FEBS Letters,307,347(1992)
非专利文献9:Science,257,771(1992)
非专利文献10:http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html
非专利文献11:J.Bacteriol.,99,450(1969)
非专利文献12:Biochem.J.,117,551(1970)
非专利文献13:J Bacteriol.,182,5139(2000)
本发明的目的在于提供乳酸的生产率有所提高的微生物及使用了该微生物的乳酸制造方法。
本发明涉及以下的(1)~(8)。
(1)一种微生物,其中,4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或者2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性降低或丧失,且所述微生物具有生产乳酸的能力。
(2)上述(1)所述的微生物,其具有对下述蛋白质进行编码的基因的一部分或全部缺失了的染色体DNA,所述蛋白质为具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性的蛋白质或具有2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质。
(3)上述(2)所述的微生物,其中,基因为对下述蛋白质进行编码的基因:具有序列号1或序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质,或者与序列号1或2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质。
(4)上述(2)所述的微生物,其中,基因为具有序列号3或序列号4所示的碱基序列的基因,或者为在严格条件下和具有与序列号3或4所示的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸杂交且对下述蛋白质进行编码的基因,所述蛋白质具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性。
(5)上述(1)~(4)任一项所述的微生物,其中,微生物为通过选自下述[1]~[5]的方法而强化了生产乳酸的能力的微生物。
[1]将控制乳酸的生物合成的机制的至少一个缓和或解除的方法
[2]将与乳酸的生物合成相关的酶的至少一个的表达强化的方法
[3]使与乳酸的生物合成相关的酶基因的至少一个的拷贝数增加的方法
[4]将从乳酸的生物合成路径向该有用物质以外的代谢产物分支的代谢路径的至少一个弱化或阻断的方法
[5]选择对于乳酸类似物的耐性度高于野生型株的细胞株的方法
(6)上述(1)~(5)任一项所述的微生物,其中,微生物是属于下述属的微生物:欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷菌属(Serratia)、沙门菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、酸硫杆状菌属(AcidithioBacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特菌属(Bordetella)、短根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、柄杆菌属(Caulobacter)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、梭菌属(Clostridium)、考克斯体属(Coxiella)、脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium)、地杆菌属(Geobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、Magnetococcus、磁螺菌属(Magnetospirillum)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基芽孢杆菌属(MethyloBacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟球菌属(Neisseria)、亚硝化单孢菌属(Nitrosomonas)、念珠藻属(Nostoc)、巴斯德菌属(Pasteurella)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、红杆菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(RhodoPseudomonas)、立克次体属(Rickettsia)、志贺菌属(Shigella)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、鞘胺醇单胞菌属(Sphingomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、弧菌属(Vibrio)、木质部小菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersina)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或黄单胞菌属(Xanthomonas)。
(7)上述(1)~(6)任一项所述的微生物,其中,微生物是选自下述组中的微生物:草生欧文氏菌(Erwinia berbicola)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、鸟氨酸脱羧酶阴性沙雷菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷菌(Serratia fonticola)、鸟氨酸脱羧酶阳性沙雷菌(Serratialiquefaciens)、肠炎沙门菌亚属(Salmonella enterica)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)、副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、都伯林沙门菌(Salmonella dublin)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、雷氏变形菌(Proteus rettgeri)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、德阿昆假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)、萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、Pseudomonasthazdinophilum、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(AcidithioBacillus ferrooxidans)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC 33305、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、副百日咳博代氏菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、马尔他布鲁杆菌(Brucella melitensis)、类鼻疽伯霍尔德杆菌(Burkholderia pseudomallei)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、伯内特考克斯体(Coxiella burnetii)、Desulfitobacter iumhafniense、芳香族化合物降解耦连铁还原细菌(Geobacter metallireducens)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、嗜肺军团病杆菌(Legionell apneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、Magnetococcus MC-1、趋磁螺旋菌(Magnetospirillum magnetotacticum)、溶血曼海姆菌(Mannheimiahaemolytica)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、Methylobacillusflagellatus、甲基营养菌属(Methylobacterium extorquens)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、欧洲亚硝化毛杆菌(Nitrosomonas europaea)、点形念珠藻(Nostoc punctiforme)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、原核绿藻(Prochlorococcus marinus)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)、苯酚降解菌红球菌菌株(Rhodococcus sp.strain)I24、沼泽红假单胞菌(RhodoPseudomonas palustris)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、聚球藻(Synechococcus sp.)WH8102、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersina pestis)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)和甘蓝黑腐病黄单胞杆菌(Xanthomonascapestris)。
(8)乳酸的制造方法,其中,在培养基中培养上述(1)~(7)任一项所述的微生物,从而在培养物中生成乳酸并使其蓄积,然后从该培养物中采集乳酸。
通过本发明,可以提供乳酸的生产率有所提高的微生物以及使用了该微生物的乳酸制造方法。
1.本发明的微生物
作为本发明的微生物,只要是4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性 或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性降低或丧失、且具有生产乳酸的能力的微生物,则并无特别限定,例如可以举出下述微生物:染色体DNA上的对具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性的蛋白质(以下也称为UbiA蛋白质)进行编码的基因或者对具有2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质(以下也称为UbiB蛋白质)进行编码的基因的一部分或全部缺失、且具有生产乳酸的能力的微生物。
另外,本说明书中,基因含有结构基因和启动子、操作基因等具有特定控制功能的区域,作为具有编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的一部分或全部缺失了的染色体DNA的微生物,由于染色体DNA上的该基因的碱基序列中有碱基的缺失,因此可以举出下述微生物:(1)编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的启动子或操作基因等的转录控制不发挥功能、且不表达UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的微生物,(2)产生移码、且UbiA蛋白质或UbiB蛋白质不作为具有活性的蛋白质而表达的微生物,(3)对UbiA蛋白质或UbiB蛋白质进行编码的基因中的结构基因的一部分或全部缺失的微生物等,可以优选举出(3)的微生物,更优选对UbiA蛋白质或UbiB蛋白质进行编码的基因中的结构基因全部缺失的微生物。
编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因中的结构基因的一部分缺失可以是结构基因部分的1个碱基缺失,优选结构基因中的5~10个碱基缺失、更优选该基因中的10~50个碱基缺失、进一步优选该基因中的50~100个碱基缺失。
作为4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性有所降低的微生物,与具有编码野生型UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的微生物相比,只要是其活性有所降低的微生物则无特别限定,一般可以举出降低至60%以下、优选40%以下、更优选20%以下、进一步优选10%以下、特别优选5%以下的微生物。
编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因只要是编码具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性的蛋白质的基因或编码具有2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质的基因,则无特别限定,例如可以举出编码具有序列号1或2所示的氨基酸序列的蛋白质的基因;对与具有序列号1或2所示的氨基酸序列的蛋白质具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、 进一步优选98%以上、特别优选99%以上的同源性,且具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质进行编码的基因;分别编码具有序列号1或2所示的氨基酸序列的蛋白质的基因即具有序列号3或4所示的碱基序列的基因;在严格条件下和具有与序列号3或4所示的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸杂交且对具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质进行编码的基因。
氨基酸序列或碱基序列的同源性可以使用Karlin and Altschul的算法BLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或FASTA[Methods Enzymol.,183,63(1990)]来决定。根据该算法BLAST,开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。根据BLAST,利用BLASTN来解析碱基序列时,参数例如设为Score=100、wordlength=12。另外,根据BLAST,利用BLASTX来解析氨基酸序列时,参数例如设为Score=50、wordlength=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时,使用各程序的缺省参数。这些解析方法的具体方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
另外,这里所说的“杂交”是指基因杂交于具有特定碱基序列的多核苷酸或该多核苷酸的一部分。因此,该具有特定碱基序列的多核苷酸或其一部分是可以用作RNA或DNA印迹法解析的探针的多核苷酸,还是可以作为PCR解析的寡核苷酸引物使用的多核苷酸。作为探针使用的多核苷酸可以举出至少100个碱基以上、优选200个碱基以上、更优选500个碱基以上的多核苷酸,作为引物使用的多核苷酸可以举出至少10个碱基以上、优选15个碱基以上的多核苷酸。
多核苷酸的杂交实验的方法众所周知,例如只要是本领域技术人员即可根据本申请说明书来决定杂交的条件。该杂交的条件除了记载于分子克隆第2版、第3版(2001年)、Methods for General and Molecular Bacteriolgy,ASM Press(1994)、Immunology methods manual,Academic press(Molecular)中之外,还可以根据多数其它的标准教科书来进行。
上述严格条件优选下述的条件:将多核苷酸、优选固定了DNA的过滤器和探针、优选探针DNA在含有50%甲醛、5×SSC(750mM的氯化钠、 75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH为7.6)、5×登哈特溶液(Denhardt’s solution)、10%的硫酸葡聚糖和20μg/l的改性后的鲑鱼精子DNA的溶液中、于42℃下孵育1晚,然后在例如约65℃的0.2×SSC溶液中洗涤该过滤器。但也可以使用更低的严格条件。严格条件的更改可以通过甲醛的浓度调整(越降低甲醛浓度则成为越低的严格)、盐浓度和温度条件的改变来进行。作为低严格条件,例如可以举出在含有6×SSCE(20×SSCE为3mol/l的氯化钠、0.2mol/l的磷酸二氢钠、0.02mol/l的EDTA、pH为7.47)、0.5%的SDS、30%的甲醛、100μg/l的改性后的鲑鱼精子DNA的溶液中、于37℃下孵育1晚后,使用50℃的1×SSC、0.1%SDS溶液中进行洗涤的条件。另外,作为更低严格条件,可以举出在上述低严格条件下使用高盐浓度(例如5×SSC)的溶液进行杂交后洗涤的条件。
上述各种条件还可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景而使用的阻断剂来设定。上述阻断剂的添加为了使条件适合,还可以伴随杂交条件的改变。
作为在上述严格条件下可以杂交的基因,例如可以举出在使用上述BLAST或FASTA等根据上述参数等计算时,与序列号3或4所示的碱基序列具有至少90%以上、优选95%以上、更优选97%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上的同源性的基因。
可以通过例如使用基因重组法表达该基因所编码的蛋白质、并测定该蛋白质的活性来确认在严格条件下和具有与序列号3或4所示的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交的基因是对具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质进行编码的基因。
另外,本发明的微生物可以优选举出原核生物、更优选举出细菌。
细菌可以举出属于下述属的微生物:欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷菌属(Serratia)、沙门菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、酸硫杆状菌属(AcidithioBacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特菌属(Bordetella)、短根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、柄杆菌属(Caulobacter)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、梭菌属(Clostridium)、考克斯体属(Coxiella)、脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium)、地杆菌属(Geobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、Magnetococcus、磁螺菌属(Magnetospirillum)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基芽孢杆菌属(MethyloBacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟球菌属(Neisseria)、亚硝化单孢菌属(Nitrosomonas)、念珠藻属(Nostoc)、巴斯德菌属(Pasteurella)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、红杆菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(RhodoPseudomonas)、立克次体属(Rickettsia)、志贺菌属(Shigella)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、鞘胺醇单胞菌属(Sphingomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、弧菌属(Vibrio)、木质部小菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersina)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或黄单胞菌属(Xanthomonas)。
另外,属于上述属的细菌可以举出草生欧文氏菌(Erwinia berbicola)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、鸟氨酸脱羧酶阴性沙雷菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷菌(Serratia fonticola)、鸟氨酸脱羧酶阳性沙雷菌(Serratia liquefaciens)、肠炎沙门菌亚属(Salmonella enterica)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)、副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、都伯林沙门菌(Salmonella dublin)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、雷氏变形菌(Proteus rettgeri)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、德阿昆假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)、萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、Pseudomonasthazdinophilum、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(AcidithioBacillus ferrooxidans)、不 动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC 33305、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、副百日咳博代氏菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、马尔他布鲁杆菌(Brucella melitensis)、类鼻疽伯霍尔德杆菌(Burkholderia pseudomallei)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、伯内特考克斯体(Coxiella burnetii)、Desulfitobacter iumhafniense、芳香族化合物降解耦连铁还原细菌(Geobacter metallireducens)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、Magnetococcus MC-1、趋磁螺旋菌(Magnetospirillum magnetotacticum)、溶血曼海姆菌(Mannheimiahaemolytica)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、Methylobacillusflagellatus、甲基营养菌属(Methylobacterium extorquens)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、欧洲亚硝化毛杆菌(Nitrosomonas europaea)、点形念珠藻(Nostoc punctiforme)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、原核绿藻(Prochlorococcus marinus)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)、苯酚降解菌红球菌菌株(Rhodococcus sp.strain)I24、沼泽红假单胞菌(Rhodo Pseudomonas palustris)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、聚球藻(Synechococcus sp.)WH8102、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersina pestis)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)和甘蓝黑腐 病黄单胞杆菌(Xanthomonas capestris)等,更优选举出大肠埃希杆菌(E.coli)。
2.本发明的微生物的制造方法
本发明的微生物可以通过下述方法来制造:(1)使存在于具有生产乳酸的能力的微生物的染色体DNA上的编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的一部分或全部缺失的方法,或者(2)对染色体DNA上的编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的一部分或全部缺失了的微生物赋予乳酸生产性的方法。
具有生产乳酸的能力的微生物只要是具有该能力的微生物就行,没有特别限定,作为该微生物,从自然界分离的株本身具有该能力时,可以举出该株本身、通过公知方法人为地赋予生产乳酸的能力的微生物等。
作为该公知的方法可以举出:
将控制乳酸的生物合成的机制的至少一个缓和或解除的方法、
将与乳酸的生物合成相关的酶的至少一个的表达强化的方法、
使与乳酸的生物合成相关的酶基因的至少一个的拷贝数增加的方法、
将从乳酸的生物合成路径向该有用物质以外的代谢产物分支的代谢路径的至少一个弱化或阻断的方法、
选择对于乳酸类似物的耐性度高于野生型株的细胞株的方法等。上述公知的方法可以单独使用或者组合使用。
作为上述(a)的方法,可以举出将利用丙酮酸甲酸裂解酶基因进行的乳酸生物合成控制解除的方法[Appl.Environ.Microboil.,69,399(2003)],作为(c)的方法,可以举出将编码L-乳酸脱氢酶的DNA在染色体DNA上引入6拷贝的方法[Appl.Environ.Microboil.,71,2789(2005)],作为(d)的方法,可以举出向磷酸转乙酰酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因引入突变的方法[Appl.Environ.Microboil.,65,1384(1999)]等。
对于染色体DNA上的编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的一部分或全部缺失了的微生物,只要可以获得该微生物则其获得方法并无限定,例如可以利用下述微生物的染色体DNA上的编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的碱基序列信息,向处于微生物染色体DNA上的编码UbiA蛋 白质或UbiB蛋白质的基因引入碱基的缺失、置换或附加的方法来获得。各微生物所具有的编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因的碱基序列可以如下确定:通过使用序列号3或4所示的碱基序列作为查询(query)的各种DNA序列数据库的检索来确定;通过将具有与序列号3或4所示的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针的对各种微生物染色体DNA的DNA杂交,从而鉴定并获得编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因来确定;或者使用根据序列号3或4所示的碱基序列而设计的引物,通过以各种微生物的染色体DNA为模板的PCR来鉴定并获得编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因后,通过常规方法解析该基因的碱基序列来确定。供于DNA杂交和PCR的染色体DNA可以均为微生物的染色体DNA,优选为属于下述属的微生物:欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷菌属(Serratia)、沙门菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、酸硫杆状菌属(AcidithioBacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特菌属(Bordetella)、短根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、柄杆菌属(Caulobacter)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、梭菌属(Clostridium)、考克斯体属(Coxiella)、脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium)、地杆菌属(Geobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、Magnetococcus、磁螺菌属(Magnetospirillum)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基芽孢杆菌属(MethyloBacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟球菌属(Neisseria)、亚硝化单孢菌属(Nitrosomonas)、念珠藻属(Nostoc)、巴斯德菌属(Pasteurella)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、红杆菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(RhodoPseudomonas)、立克次体属(Rickettsia)、志贺菌属(Shigella)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、鞘胺醇单胞菌属(Sphingomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、弧菌属(Vibrio)、木质部小菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersina)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或黄单胞菌属(Xanthomonas),更优选可以举 出草生欧文氏菌(Erwinia berbicola)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、鸟氨酸脱羧酶阴性沙雷菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷菌(Serratia fonticola)、鸟氨酸脱羧酶阳性沙雷菌(Serratia liquefaciens)、肠炎沙门菌亚属(Salmonella enterica)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)、副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、都伯林沙门菌(Salmonella dublin)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、雷氏变形菌(Proteus rettgeri)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、德阿昆假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、Pseudomonas thazdinophilum、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(AcidithioBacillus ferrooxidans)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC33305、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、副百日咳博代氏菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、马尔他布鲁杆菌(Brucellamelitensis)、类鼻疽伯霍尔德杆菌(Burkholderia pseudomallei)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、肉毒梭菌(Clostridium botulmum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、伯内特考克斯体(Coxiella burnetii)、Desulfitobacter iumhafniense、芳香族化合物降解耦连铁还原细菌(Geobactermetallireducens)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、Magnetococcus MC-1、趋磁螺旋菌(Magnetospirillum magnetotacticum)、溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)、Methylobacillus flagellatus、甲基营养菌属(Methylobacteriumextorquens)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、欧洲亚硝化毛杆菌(Nitrosomonas europaea)、点形念珠藻(Nostoc punctiforme)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、原核绿藻(Prochlorococcus marinus)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)、苯酚降解菌红球菌菌株(Rhodococcus sp.strain)I24、沼泽红假单胞菌(Rhodo Pseudomonas palustris)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasaromaticivorans)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、聚球藻(Synechococcus sp.)WH8102、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersina pestis)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)和甘蓝黑腐病黄单胞杆菌(Xanthomonas capestris)的染色体DNA。
杂交和PCR除了常规方法例如记载在分子克隆第2版、第3版(2001年)、Methods for General and Molecular Bacteriolgy、ASM Press(1994)中之外,还可以根据多个其它标准教科书来进行。
作为编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因,例如可以举出编码具有序列号1或2所示的氨基酸序列的蛋白质的基因、具有序列号3或4所示的碱基序列的基因、来自弗氏志贺菌(Shigella flexneri)2a的ubiA基因和yigR基因(Genbank accession no.AE005674)、来自肠炎沙门菌亚属(Salmonella enterica)的ubiA基因和aarF基因(Genbank accession no.NC004631)等。
作为向微生物染色体DNA上的基因引入碱基的缺失、置换或附加的方法,可以举出利用同源重组的方法。作为利用一般的同源重组的方法,可以举出使用可以将引入有碱基的缺失、置换或附加的突变基因与在想要引入碱基缺失等的宿主细胞内无法独立复制且具有耐药剂性基因的质粒DNA连接而制作的同源重组用质粒的方法。
通过常规方法将该同源重组用质粒引入宿主细胞后,以耐药剂性作为指标,选择通过同源重组而在染色体DNA上合并有该同源重组用质粒的转化株。在不含该药剂的培养基中培养所得转化株数小时~1天后,涂于含有该药剂的琼脂培养基和不含该药剂的琼脂培养基中,通过选择在前一个培养基中不会生长、而在后一个培养基中可以生长的株,可以获得在染色体DNA上产生了第2次同源重组的株。通过确定染色体DNA上的引入有缺失等的基因所存在的区域的碱基序列,可以确认向染色体DNA上的目标基因引入了碱基的缺失、置换或附加。
作为通过上述方法可以向染色体DNA上的目标基因引入碱基的缺失、置换或附加的微生物,可以举出属于例如埃希氏菌属的微生物。
另外,作为利用高效地向多个基因引入碱基的缺失、置换或附加的同源重组的方法,可以举出使用直链DNA的方法。
具体地为将含有想要引入碱基的缺失、置换或附加的基因的直链DNA并入细胞内,在染色体DNA和导入的直链DNA之间引起同源重组的方法。本方法只要是高效地并入直链DNA的微生物,则可以使用任何微生物,优选的微生物可以举出埃希氏菌属、更优选为大肠埃希杆菌、进一步优选表达来自λ-噬菌体的重组蛋白质组(Red重组体系)的大肠埃希杆菌。
作为表达λRed重组体系的大肠埃希杆菌,可以举出保有作为具有λRed重组体系基因的质粒DNA的pKD46[可以从Escherichia coli Genetic StockCenter(美国耶鲁大学)获得]的大肠埃希杆菌JM101株等。
作为同源重组所用的DNA,可以举出:
(a)在耐药剂性基因的两侧上具有存在于作为碱基的缺失、置换或附加的引入对象的染色体DNA上的区域两外侧的DNA或与该DNA具有同源性的DNA的直链DNA、
(b)直接连接存在于作为碱基的缺失、置换或附加的引入对象的染色体DNA上的区域两外侧的DNA或与该DNA具有同源性的DNA而成的直链DNA、
(c)在连接有耐药剂性基因和可以用于负选择的基因的DNA两端具有存在于作为碱基的缺失、置换或附加的引入对象的染色体DNA上的区域两外侧的DNA或与该DNA具有同源性的DNA的直链DNA、
(d)在上述(a)的直链DNA上,在存在于耐药剂性基因和染色体DNA上的区域两外侧的DNA之间进一步具有酵母来源Flp重组酶[Proc. Natl.Acad.Sci.USA.,82,5875(1985)]所识别的碱基序列的DNA。
作为耐药剂性基因,只要是对于宿主微生物显示敏感性的药剂而赋予耐药剂性的耐药剂性基因,则可以使用任何耐药剂性基因。当在宿主微生物中使用大肠埃希杆菌时,作为耐药剂性基因,例如可以举出耐卡那霉素性基因、耐氯霉素性基因、耐庆大霉素性基因、耐大观霉素性基因、耐四环素性基因、耐氨苄西林性基因等。
可以用于负选择的基因是指在宿主微生物中表达该基因时,在一定培养条件下对该微生物致死的基因,作为该基因,例如可以举出属于芽孢杆菌属的微生物来源的sacB基因[Appl.Environ.Microboil.,59,1361-1369(1993)]和属于埃希氏菌属的微生物来源的rpsL基因[Genomics,72,99-104(2001)]等。
上述存在于直链DNA两末端的与位于染色体DNA上的成为置换或缺失的引入对象的区域的两外侧的DNA具有同源性的DNA在直链DNA中配置在与染色体DNA上的方向相同的方向上,其长度优选为10bp~100bp左右、更优选为20bp~50bp左右、进一步优选为30~40bp左右。
酵母来源的Flp重组酶所识别的碱基序列是指只要是该蛋白质识别、催化同源重组的碱基序列则无特别限定,优选可以举出具有序列号13所示的碱基序列的DNA;和在该DNA中具有1个~数个的碱基缺失、置换或附加的碱基序列、且具有酵母来源的Flp重组酶所识别、催化同源重组的碱基序列的DNA。
具有同源性是指上述直链DNA在染色体DNA上的目标区域中具有发生同源重组的程度的同源性,作为具体的同源性,可以举出80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选100%的同源性。
上述碱基序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序来确定。
上述直链DNA可以通过PCR来制作。另外,还可以在质粒上构建含有上述直链DNA的DNA后,通过限制性酶处理来获得目标直链DNA。
作为向微生物染色体DNA引入碱基的缺失、置换或附加的方法,可以举出下述方法1~4。
方法1:向宿主微生物引入上述(a)或(d)的直链DNA,以耐药剂性为指标,选择该直链DNA通过同源重组而插入染色体DNA上的转化株 的方法。
方法2:向通过上述方法1获得的转化株引入上述(b)的直链DNA,通过消除利用该方法插入到染色体DNA上的药剂基因,使微生物的染色体DNA上的区域置换或缺失的方法。
方法3:
将上述(c)的直链DNA引入宿主微生物,以耐药剂性为指标,选择该直链DNA通过同源重组而插入染色体DNA上的转化株、
合成在与染色体DNA方向相同的方向上连接与存在于染色体DNA上的置换或缺失的对象区域两外侧的DNA具有同源性的DNA而成的DNA,并引入到上述[1]获得的转化株中。
在可以用于负选择的基因表达的条件下,培养进行了上述[2]操作的转化株,选择在该培养中可以生长的株作为耐药剂性基因和可以用于负选择的基因从染色体DNA上消除了的株。
方法4:
将上述(d)的直链DNA引入宿主微生物,以耐药剂性为指标,选择该直链DNA通过同源重组而插入染色体DNA上的转化株、
向上述[1]获得的转化株引入Flp重组酶基因表达质粒,使该基因表达后,获得对上述[1]所用的药剂具有敏感性的株。
作为上述方法中使用的将直链DNA引入宿主微生物的方法,只要是将DNA引入该微生物的方法则可以使用任何方法,例如可以举出使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-2483942)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)]等。
在方法2或方法3[2]所用的直链DNA中,通过使用在该DNA的中央部附近并有想要插入染色体DNA上的任意基因的直链DNA,可以在消除耐药剂性基因等的同时,将任意的基因插入到染色体DNA上。
上述方法2~4中,由于是最终所得转化株的染色体DNA上不会残留耐药剂性基因和可以用于负选择基因等外来基因的方法,因此通过使用该方法,使用相同耐药剂性基因和可以用于负选择的基因来反复进行该方法,可以容易地制造染色体DNA上位置不同的2个以上的区域具有碱基的缺失、置换或附加的微生物。
通过上述方法获得的突变株的4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性降低或丧失,例如可以通过利用公知方法测定该突变株和其原始菌株的泛醌的生产率,并进行比较来确认。
另外,通过使本发明微生物的D-乳酸脱氢酶(EC1.1.1.28)活性降低或丧失、更优选强化L-乳酸脱氢酶(EC1.1.2.27)活性,可以制造L-乳酸的生产率高的微生物;相反,通过使L-乳酸脱氢酶活性降低或丧失、更优选强化D-乳酸脱氢酶活性,可以制造D-乳酸的生产率高的微生物。
D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和编码该酶的基因的碱基序列在多数微生物中是已知的,可以从各种数据库中容易地获得其序列。
因此,D-乳酸脱氢酶或L-乳酸脱氢酶的活性降低或丧失的微生物可以通过利用所得序列信息、根据上述方法使存在于染色体DNA上的这些酶基因的一部分或全部缺失而获得。
另外,D-乳酸脱氢酶或L-乳酸脱氢酶的活性有所强化的微生物可以通过利用公知的方法将这些酶基因引入该微生物而获得。该基因还可以插入染色体DNA上,还可以作为质粒DNA存在于染色体外。
以大肠埃希杆菌(Escherichia coli)为微生物、制作L-乳酸的生产率有所提高的微生物时,可以举出使大肠埃希杆菌(Escherichia coli)的D-乳酸脱氢酶基因的ORF全部缺失、且将L-乳酸脱氢酶基因、优选枯草杆菌(Bacillus subtilis)的L-乳酸脱氢酶基因插入染色体DNA上的方法。
3.本发明的使用了微生物的乳酸制造方法
通过本发明的方法,可以生产D-乳酸和L-乳酸的任一种。
在培养基中培养上述2的本发明微生物,在培养基中生成乳酸并使其蓄积,从该培养基中采集乳酸,从而可以制造乳酸。
在培养基中培养该微生物的方法可以根据微生物培养所用的通常方法来进行。
即,只要是含有该微生物可以吸收的碳源、氮源、无机盐类,且高效地进行该微生物培养的培养基,则可以使用天然培养基、合成培养基的任一种。
作为碳源,只要是该微生物可以吸收的碳源即可,可以使用葡萄糖、 果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜,淀粉或淀粉水解物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有机酸,乙醇、丙醇等醇类等。
作为氮源,可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐,其它含氮化合物以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼和大豆渣水解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机盐,可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养通常在振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度可以为15~40℃、培养时间通常为5小时~7天。培养中pH保持于3.0~9.0。pH的调整使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。
培养物中生成并蓄积的乳酸的采集可以通过使用活性炭或离子交换树脂等的通常方法、或者使用离子交换膜的电透析法、在酯化后蒸馏进行水解的方法、利用有机溶剂的提取法、减压蒸馏使其结晶化的方法、使用高效液相色谱法等色谱法来进行。
以下示出实施例,但本发明并非局限于下述实施例。
实施例1
制作编码UbiA蛋白质或UbiB蛋白质的基因缺失了的株
以大肠埃希杆菌(E.coli)KM22株[Gene,246,321-330(2000)]的染色体DNA为模板,使用由按照各个3’末端的25个碱基杂交于KM22株染色体DNA上的耐卡那霉素性基因两末端的方式而设计的以序列号5和6所示的碱基序列所构成的DNA作为引物对(primer set),进行PCR。PCR使用LA-Taq,根据LA-Taq所附的说明书调制含有染色体DNA片段10ng、引物DNA各20pmol的25μl的反应液,并在下述条件下进行:在94℃下保温2分钟后,重复94℃下15秒钟、55℃下20秒钟、68℃下1分钟的循环30次后,在72℃下保温10分钟。
接着,将在耐卡那霉素性基因的5’末端侧上游附加有序列号7所示的碱基序列、在3’末端侧下游附加有序列号8所示的碱基序列的DNA片段通过与上述相同的方法利用PCR进行扩增。
如下制备编码UbiA蛋白质的基因(以下称作ubiA基因)缺失用DNA片段以及编码UbiB蛋白质的基因(以下称作ubiB基因)缺失用DNA片 段。以上述获得的DNA片段为模板,使用由序列号9和10或序列号11和12所示的碱基序列所构成的DNA作为引物对,进行PCR。由序列号9和11所示的碱基序列所构成的DNA在5’末端侧具有由具有分别与ubiA基因或ubiB基因的5’末端侧区域附近相同的序列的45个碱基所构成的碱基序列,在3’末端侧具有由序列号7所示的碱基序列所构成的DNA。具有序列号10和12所示的碱基序列的DNA在5’末端侧具有由具有分别与ubiA基因或ubiB基因的3’末端侧区域附近相同的序列的45个碱基所构成的碱基序列,在3’末端侧具有由杂交于序列号8所示的碱基序列的25个碱基所构成的DNA。
PCR使用EX-Taq(Takara Bio公司制),根据EX-Taq所附的说明书调制含有扩增DNA片段10ng、引物DNA各10pmol的50μl的反应液,在下述条件下进行:在94℃下保温1分钟后,重复94℃下30秒钟、55℃下30秒钟、72℃下1分钟的循环30次后,在4℃下保冷。
确认在两末端含有具有与各基因的两末端的45个碱基相同区域的耐卡那霉素性基因(km基因)的DNA片段进行了扩增,将该DNA片段供于琼脂凝胶电泳后,从凝胶中切出并进行精制。
接着,根据Gene,246,321-330(2000)所记载的方法制备保持可以表达λRed重组酶的pKD46质粒的大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113株[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,97,6640-6645(2000)]的感受态细胞,使用100ng该DNA片段分别进行转化。转化在0.1cm的比色杯(BioRad公司制)中、在1.8KV、25μF的条件下通过电穿孔进行。将转化后的细胞使用SOC培养基[20g/l蛋白胨(Difco公司制)、5g/l酵母提取物(Difco公司制)、0.5g/l氯化钠、0.2ml/l的5mol/lNaOH、10ml/l的1mol/l氯化镁、10ml/l的1mol/l硫酸镁、10ml/l的2M葡萄糖]在30℃下培养3小时后,将培养液涂布于含有50μg/ml的卡那霉素和10g/l的葡萄糖的LB琼脂板上,在30℃下培养1晚。
确认生长的株分别为大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113株的染色体DNA上的ubiA基因或ubiB基因缺失,分别命名为大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiA株、大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiB株。
实施例2
使用了ubiA基因或ubiB基因缺失株的乳酸的制造(1)
将大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiA株、大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiB株、以及作为对照根据实施例1所述的方法制作的ubiE基因缺失株(E.coli BW25113△ubiE)、ubiG基因缺失株(E.coliBW25113△ubiG)、ubiH基因缺失株(E.coli BW25113△ubiH)、大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113株分别接种在装有5ml的含有10g/l葡萄糖的LB液体培养基的试管中,在37℃下振荡培养17小时,获得培养物。将60μl的该培养物接种在装有6ml的含有3%碳酸钙和2%酪蛋白氨基酸的M9液体培养基(4%葡萄糖、11.28g/l M9 Minimal Salts(X5)(Difco公司制)、100μmol/l氯化钙、2mmol/l硫酸镁、10μg/ml硫酸铁)的粗型试管中,在37℃下振荡培养28小时。离心分离28小时后的培养物,将其上清从10倍稀释至30倍,然后使用Roche Diagnostics公司制的F-kit D-/L-乳酸、F-kit乙酸和F-kit葡萄糖,测定培养液中蓄积的D-乳酸量和乙酸量。结果示于表1。
表1
E.coliBW25113 | 0 | n.d. |
E.coli BW25113△ubiA | 35.0 | 0.8 |
E.coli BW25113△ubiB | 35.7 | 0.4 |
E.coli BW25113△ubiE | 25.0 | 5.0 |
E.coli BW25113△ubiG | 28.8 | 4.1 |
E.coli BW25113△ubiH | 29.0 | 6.0 |
表1中n.d.表示未测定。
如表1所示,大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiA株和大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiB株与其它泛醌生物合成基因缺失株相比,D-乳酸生产率更高,且成为乳酸精制时的杂质并阻碍乳酸聚合化的乙酸的副产生量更少。另外,D-乳酸的光学纯度为99%以上。
实施例3
使用ubiA基因或ubiB基因缺失株的乳酸的制造(2)
将大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiA株、大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiB株分别接种在装有5ml的含有10g/l葡萄糖的LB液体培养基的试管中,在37℃下振荡培养17小时,获得培养物。将55μl的该培养物接种于装有5ml的含有6%碳酸钙和2%酪蛋白氨基酸的M9液体培养基(5%葡萄糖、11.28g/l M9 Minimal Salts(X5)(Difco公司制)、100μmol/l氯化钙、2mM硫酸镁、10μg/ml硫酸铁)的粗型试管中,在37℃下振荡培养25小时。25小时后,在培养物中加入1041μl的30%葡萄糖、104μl的22.56g/l的M9 Minimal Salts(X10)(Difco公司制)、104μl的酪蛋白氨基酸、2μl的1mol/l硫酸镁、1μl的10mg/ml硫酸铁、0.06g的碳酸钙,继续培养,在培养48小时后回收培养物。离心分离培养物,将其上清从10倍稀释至1000倍,使用Roche Diagnostics公司制的F-kit D-/L-乳酸、F-kit乙酸和F-kit葡萄糖,测定培养液中蓄积的D-乳酸量、乙酸量和残糖量。结果示于表2。
表2
E.coli BW25113△ubiA | 99.6 | 2.0 | 0.2 |
E.coli BW25113△ubiB | 100.9 | 1.4 | 0.1 |
如表2所示,大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiA株和大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiB株具有生产约100g/l的D-乳酸的能力,且乙酸的副产量非常低。另外,D-乳酸的光学纯度为99%以上。
实施例4
制作具有生产L-乳酸的能力的微生物
(1)制作D-乳酸脱氢酶基因缺失了的大肠埃希杆菌(E.coli)
使用具有耐氯霉素性基因(cat基因)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)来源的果聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因(sacB基因、GeneBank accessionno.BG10388)的直链DNA,通过以下的方法制作保持pKD46质粒的大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113株的染色体DNA上的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA基因)缺失了的株。
首先,利用PCR法以编码区域的上游400bp至下游200bp的区域获得 sacB基因。PCR以枯草杆菌(B.subtilis)168株(可以从各种官方机关获得)的染色体DNA为模板,将由序列号14和15所示的碱基序列所构成的DNA作为引物对来进行。该PCR使用LA-Taq,根据LA-Taq所附的说明书来调制含有染色体DNA100ng、引物DNA各20pmol的25μl的反应液,在下述条件下进行:在94℃下保温3分钟后,重复94℃下15秒钟、55℃下20秒钟、68℃下1.5分钟的循环30次后,在72℃下保温10分钟。
使用PCR纯化试剂盒精制通过上述PCR获得的扩增DNA片段(sacB基因片段)后,溶解于50μl的水中。
接着,以pHSG399质粒(Takara Bio公司制)为模板,使用由序列号16和17所示的碱基序列构成的DNA作为引物对来进行PCR,获得耐氯霉素性基因(cat基因)片断。
该PCR使用LA-Taq,根据LA-Taq所附的说明书调制含有质粒DNA40ng、引物DNA各20pmol的25μl的反应液,在下述条件下进行:在94℃下保温3分钟后,重复94℃下15秒钟、55℃下20秒钟、68℃下1.5分钟的循环30次后,在72℃下保温10分钟。
使用Gel extraction试剂盒精制通过上述PCR获得的扩增DNA片段(cat基因片段)后,溶解于50μl的水中。
接着,以上述获得的sacB基因片段和cat基因片段为模板,使用由序列号14和17所示的碱基序列构成的DNA作为引物对来进行PCR。该PCR使用LA-Taq,根据LA-Taq所附的说明书来调制含有上述获得的sacB片段和cat片段各1μl、引物DNA各20pmol的25μl的反应液,在下述条件下进行:在94℃下保温3分钟后,重复94℃下15秒钟、55℃下20秒钟、68℃下3分钟的循环30次后,在72℃下保温10分钟。
使用Gel extraction试剂盒来精制通过上述PCR获得的扩增DNA片段(sacB基因片段和cat基因片段在相同方向上连接而成的DNA片段)后,溶解于50μl的水中。
接着,以该DNA片段为模板,使用由序列号18和19所示的碱基序列构成的DNA作为引物对来进行PCR。由序列号18所示的碱基序列构成的DNA在5’末端侧具有由具有与ldhA基因的5’末端侧区域附近相同的序列的43个碱基所构成的碱基序列,在3’末端侧具有由序列号7所示的碱基序 列所构成的DNA。具有序列号19所示的碱基序列的DNA在5’末端侧具有由与ldhA基因的3’末端侧区域附近具有互补性的43个碱基所构成的碱基序列,在3’末端侧具有由杂交于序列号8所示的碱基序列的25个碱基所构成的DNA。
该PCR使用EX-Taq,根据EX-Taq所附的说明书来调制含有模板DNA片段10ng、引物DNA各10pmol的50μl的反应液,在下述条件下进行:在94℃下保温1分钟后,重复94℃下30秒钟、55℃下30秒钟、72℃下3分钟的循环30次后,在4℃下保冷。
确认通过上述PCR,将在两末端具有与ldhA基因的两末端的43个碱基相同的区域、含有sacB基因和cat基因的DNA片段(sacB基因+cat基因片断)发生了扩增,将该DNA片段供于琼脂凝胶电泳后,从凝胶中切出并进行精制。
接着,根据实施例1所记载的方法制备保持pKD46质粒的大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113株的感受态细胞,使用100ng上述获得的DNA片段进行转化。转化为在0.1cm的比色杯(BioRad公司制)中、在1.8KV、25μF的条件下通过电穿孔进行。
将转化后的细胞使用SOC培养基在30℃下培养3小时后,将培养液涂布于含有30μg/ml的氯霉素的LB琼脂板上,在30℃下培养1晚。将生长的耐氯霉素性株拷贝到SuLB琼脂培养基[10g/l蛋白胨(Difco公司制)、5g/l酵母提取物(Difco公司制)、10%蔗糖、1ml/l的1mol/l NaOH]板上,选择显示蔗糖敏感性的株。确认显示耐氯霉素性且蔗糖敏感性的株是大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113株的染色体DNA上的ldhA基因被破坏,并命名为大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ldhA::cat-sacB株。
(2)制作引入有L-乳酸脱氢酶基因的微生物
在上述(1)制作的大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ldhA::cat-sacB株的染色体DNA上的ldhA基因区域上引入枯草杆菌(B.subtilis)来源的L-乳酸脱氢酶基因(lctE基因),在大肠埃希杆菌(E.coli)的ldhA基因的启动子控制下如下制成具有lctE基因的大肠埃希杆菌(E.coli)。
以枯草杆菌(B.subtilis)168株的染色体DNA作为模板,使用由序列号20和21所示的碱基序列构成的DNA作为引物对的PCR而获得枯草杆 菌(B.subtilis)的lctE基因。由序列号20所示的碱基序列构成的DNA在5’末端侧具有由ldhA基因的起始密码子上游区域的45个碱基所构成的碱基序列,在3’末端侧具有由包括lctE基因的起始密码子的下游区域的27个碱基所构成的碱基序列。由序列号21所示的碱基序列所构成的DNA在5’末端侧具有由与ldhA基因的终止密码子的下游区域具有互补性的45个碱基所构成的碱基序列,在3’末端侧具有由与包括lctE基因的终止密码子的上游区域具有互补性的27个碱基所构成的碱基序列。
PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio公司制),根据酶所附的说明书来调制含有染色体DNA 100ng、引物DNA各10pmol的50μl的反应液,在下述条件下进行:在94℃下保温1分钟后,重复94℃下30秒钟、55℃下30秒钟、72℃下80秒钟的循环30次后,在4℃下保冷。
确认通过上述PCR,在末端具有与ldhA基因的上游或下游的45个碱基相同的区域的lctE基因片段进行了扩增,将该DNA片段供于琼脂凝胶电泳后,从凝胶中切出并进行精制。
根据实施例1所记载的方法制备保持pKD46质粒的大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ldhA::cat-sacB株的感受态细胞,使用100ng上述获得的DNA片段进行转化。
转化为在0.1cm的比色杯(BioRad公司制)中、在1.8KV、25μF的条件下通过电穿孔进行。将转化后的细胞使用SOC培养基在30℃下培养3小时后,将培养液涂布于SuLB琼脂培养基板上,在30℃下培养1晚。确认生长的耐蔗糖性株是在大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ldhA::cat-sacB株的染色体DNA上的ldhA基因区域上引入有lctE基因,并命名为大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ldhA::lctE株。
(3)制作ubiB基因缺失株
使用含有20mg/l的卡那霉素和10g/l的葡萄糖的LB液体培养基,将实施例1获得的大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiB株在30℃下培养1晚,将所得培养液0.5ml与1.4ml新的LB液体培养基和100μl的0.1M氯化钙溶液混合。
在30℃下振荡培养5~6小时后,将400μl的培养物移至灭菌管中,添加2μl的P1噬菌体汤料(phage stock),在37℃下保温10分钟。在该管中添加3ml保温于50℃的软琼脂溶液(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5mM氯化钙、1ml/l的1mol/l NaOH、3g/l琼脂),充分搅拌后,接种在Ca-LB琼脂培养基板(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5mM氯化钙、1ml/l的1mol/lNaOH、15g/l琼脂、板的直径为15cm)上,在37℃下培养7小时。
接着,用撒布机微细地粉碎,从而回收软琼脂部分,在1500g、4℃下离心分离10分钟。在所得上清1.5ml中添加100μl的氯仿,在4℃下放置1晚后,在15000g下离心分离2分钟,将所得上清制成噬菌体汤料并保存在4℃。
在Ca-LB液体培养基中、在30℃下培养大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113ΔldhA::lctE株4小时,将所得培养物的200μl离心分离,除去上清后,将菌体混悬于100μl的MC缓冲液(0.1mol/l硫酸镁、0.005mol/l氯化钙)中,制备菌体混悬液。
将上述获得的100μl的噬菌体汤料添加于菌体混悬液中并缓慢地混合,在37℃下保温10分钟后,添加200μl的1mol/l柠檬酸钠溶液,离心分离后除去上清,从而洗涤菌体。进一步重复该洗涤操作2次后,混悬于2ml的LB液体培养基中,并在30℃下培养2小时。
接着,将所得培养物100μl涂布在含有30mg/l卡那霉素和10g/l葡萄糖的LB琼脂培养基中,并在30℃下培养。确认耐卡那霉素性株ubiB基因缺失,并命名为大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113ΔubiB ΔldhA::lctE株。
实施例5
L-乳酸的制造
将实施例4获得的大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113ΔubiBΔldhA::lctE株接种于装有含有20g/l葡萄糖的2ml的LB液体培养基的试管中,在37℃下振荡培养24小时,获得培养物。将50μl的该培养物接种于装有5ml的含有6%碳酸钙和1%酪蛋白氨基酸的M9液体培养基[5%葡萄糖、11.28g/lM9 Minimal Salt(X5)(Difco公司制)、100μmol/l氯化钙、2mmol/l硫酸镁、10μg/ml硫酸铁)的试管中,在37℃下振荡培养24小时。离心分离24小时后的培养物,将其上清从10倍稀释至100倍,使用Roche Diagnostics公司制的F-kit D-/L-乳酸和F-kit乙酸,测定培养液中蓄积的L-乳酸量、D- 乳酸量和乙酸量。结果示于表3。
表3
菌株名 | D-乳酸(g/l) | 乙酸(g/l) | 残糖量(g/l) |
菌株名 | D-乳酸(g/l) | 乙酸(g/l) | |
菌株名 | L-乳酸(g/l) | D-乳酸(g/l) | 乙酸(g/l) |
E.coli BW25113△ubiB △ldhA::lctE株 | 44.9 | 检测限以下 | 0.6 |
表3所示,大肠埃希杆菌(E.coli)BW25113△ubiB △ldhA::lctE株不产生D-乳酸、仅产生L-乳酸。即,ubiB基因的缺失株也生产L-乳酸。
通过本发明,可以高效地制造乳酸。
序列表自由正文
序列号5-人工序列的说明:合成DNA
序列号6-人工序列的说明:合成DNA
序列号7-人工序列的说明:合成DNA
序列号8-人工序列的说明:合成DNA
序列号9-人工序列的说明:合成DNA
序列号10-人工序列的说明:合成DNA
序列号11-人工序列的说明:合成DNA
序列号12-人工序列的说明:合成DNA
序列号13-人工序列的说明:合成DNA
序列号14-人工序列的说明:合成DNA
序列号15-人工序列的说明:合成DNA
序列号16-人工序列的说明:合成DNA
序列号17-人工序列的说明:合成DNA
序列号18-人工序列的说明:合成DNA
序列号19-人工序列的说明:合成DNA
序列号20-人工序列的说明:合成DNA
序列号21-人工序列的说明:合成DNA。
序列表
<110>协和酦酵工业株式会社
<120>乳酸的制造方法
<130>1807
<140>200680041323.9
<141>2008-05-05
<150> PCT/JP2006/317489
<151>2006-09-05
<160>21
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>290
<212>PRT
<213>Escherichia coli
<400>1
Met Glu Trp Ser Leu Thr Gln Asn Lys Leu Leu Ala Phe His Arg Leu
1 5 10 15
Met Arg Thr Asp Lys Pro Ile Gly Ala Leu Leu Leu Leu Trp Pro Thr
20 25 30
Leu Trp Ala Leu Trp Val Ala Thr Pro Gly Val Pro Gln Leu Trp Ile
35 40 45
Leu Ala Val Phe Val Ala Gly Val Trp Leu Met Arg Ala Ala Gly Cys
50 55 60
Val Val Asn Asp Tyr Ala Asp Arg Lys Phe Asp Gly His Val Lys Arg
65 70 75 80
Thr Ala Asn Arg Pro Leu Pro Ser Gly Ala Val Thr Glu Lys Glu Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Phe Val Val Leu Val Leu Ile Ser Phe Leu Leu Val Leu
100 105 110
Thr Leu Asn Thr Met Thr Ile Leu Leu Ser Ile Ala Ala Leu Ala Leu
115 120 125
Ala Trp Val Tyr Pro Phe Met Lys Arg Tyr Thr His Leu Pro Gln Val
130 135 140
Val Leu Gly Ala Ala Phe Gly Trp Ser Ile Pro Met Ala Phe Ala Ala
145 150 155 160
Val Ser Glu Ser Val Pro Leu Ser Cys Trp Leu Met Phe Leu Ala Asn
165 170 175
Ile Leu Trp Ala Val Ala Tyr Asp Thr Gln Tyr Ala Met Val Asp Arg
180 185 190
Asp Asp Asp Val Lys Ile Gly Ile Lys Ser Thr Ala Ile Leu Phe Gly
195 200 205
Gln Tyr Asp Lys Leu Ile Ile Gly Ile Leu Gln Ile Gly Val Leu Ala
210 215 220
Leu Met Ala Ile Ile Gly Glu Leu Asn Gly Leu Gly Trp Gly Tyr Tyr
225 230 235 240
Trp Ser Ile Leu Val Ala Gly Ala Leu Phe Val Tyr Gln Gln Lys Leu
245 250 255
Ile Ala Asn Arg Glu Arg Glu Ala Cys Phe Lys Ala Phe Met Asn Asn
260 265 270
Asn Tyr Val Gly Leu Val Leu Phe Leu Gly Leu Ala Met Ser Tyr Trp
275 280 285
His Phe
<210>2
<211>546
<212>PRT
<213>Escherichia coli
<400>2
Met Thr Pro Gly Glu Val Arg Arg Leu Tyr Phe Ile Ile Arg Thr Phe
1 5 10 15
Leu Ser Tyr Gly Leu Asp Glu Leu Ile Pro Lys Met Arg Ile Thr Leu
20 25 30
Pro Leu Arg Leu Trp Arg Tyr Ser Leu Phe Trp Met Pro Asn Arg His
35 40 45
Lys Asp Lys Leu Leu Gly Glu Arg Leu Arg Leu Ala Leu Gln Glu Leu
50 55 60
Gly Pro Val Trp Ile Lys Phe Gly Gln Met Leu Ser Thr Arg Arg Asp
65 70 75 80
Leu Phe Pro Pro His Ile Ala Asp Gln Leu Ala Leu Leu Gln Asp Lys
85 90 95
Val Ala Pro Phe Asp Gly Lys Leu Ala Lys Gln Gln Ile Glu Ala Ala
100 105 110
Met Gly Gly Leu Pro Val Glu Ala Trp Phe Asp Asp Phe Glu Ile Lys
115 120 125
Pro Leu Ala Ser Ala Ser Ile Ala Gln Val His Thr Ala Arg Leu Lys
130 135 140
Ser Asn Gly Lys Glu Val Val Ile Lys Val Ile Arg Pro Asp Ile Leu
145 150 155 160
Pro Val Ile Lys Ala Asp Leu Lys Leu Ile Tyr Arg Leu Ala Arg Trp
165 170 175
Val Pro Arg Leu Leu Pro Asp Gly Arg Arg Leu Arg Pro Thr Glu Val
180 185 190
Val Arg Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Ile Asp Glu Leu Asn Leu Leu Arg
195 200 205
Glu Ser Ala Asn Ala Ile Gln Leu Arg Arg Asn Phe Glu Asp Ser Pro
210 215 220
Met Leu Tyr Ile Pro Glu Val Tyr Pro Asp Tyr Cys Ser Glu Gly Met
225 230 235 240
Met Val Met Glu Arg Ile Tyr Gly Ile Pro Val Ser Asp Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Asn Gly Thr Asn Met Lys Leu Leu Ala Glu Arg Gly Val
260 265 270
Gln Val Phe Phe Thr Gln Val Phe Arg Asp Ser Phe Phe His Ala Asp
275 280 285
Met His Pro Gly Asn Ile Phe Val Ser Tyr Glu His Pro Glu Asn Pro
290 295 300
Lys Tyr Ile Gly Ile Asp Cys Gly Ile Val Gly Ser Leu Asn Lys Glu
305 310 315 320
Asp Lys Arg Tyr Leu Ala Glu Asn Phe Ile Ala Phe Phe Asn Arg Asp
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385 390 395 400
Gln Leu Val Leu Leu Gln Lys Thr Leu Leu Tyr Val Glu Gly Val Gly
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Leu Glu Ser Trp Ile Lys Asp Gln Val Gly Ile Pro Ala Leu Val Arg
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Ala Phe Lys Glu Lys Ala Pro Phe Trp Val Glu Lys Met Pro Glu Leu
450 455 460
Pro Glu Leu Val Tyr Asp Ser Leu Arg Gln Gly Lys Tyr Leu Gln His
465 470 475 480
Ser Val Asp Lys Ile Ala Arg Glu Leu Gln Ser Asn His Val Arg Gln
485 490 495
Gly Gln Ser Arg Tyr Phe Leu GlyIle Gly Ala Thr Leu Val Leu Ser
500 505 510
Gly Thr Phe Leu Leu Val Ser Arg Pro Glu Trp Gly Leu Met Pro Gly
515 520 525
Trp Leu Met Ala Gly Gly Leu Ile Ala Trp Phe Val Gly Trp Arg Lys
530 535 540
Thr Arg
545
<210>3
<211>1170
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>3
gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc 60
ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg 120
ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc acatcatcga cattaacccg ggactttatt 180
gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa 240
ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg gcgtcaccgt tgtactaaga ggaaaaaaat 300
atg gag tgg agt ctg acg cag aat aag ctg ctg gcg ttt cat cgc tta 348
Met Glu Trp Ser Leu Thr Gln Asn Lys Leu Leu Ala Phe His Arg Leu
1 5 10 15
atg cgt acg gat aag cca att ggc gcg tta ctg ctg ctc tgg cca aca 396
Met Arg Thr Asp Lys Pro Ile Gly Ala Leu Leu Leu Leu Trp Pro Thr
20 25 30
tta tgg gcg ttg tgg gtg gcg aca ccg ggc gtt ccc cag ctc tgg atc 444
Leu Trp Ala Leu Trp Val Ala Thr Pro Gly Val Pro Gln Leu Trp Ile
35 40 45
ctg gcg gtg ttt gtc gcg ggt gtc tgg ctg atg cgc gct gcc gga tgt 492
Leu Ala Val Phe Val Ala Gly Val Trp Leu Met Arg Ala Ala Gly Cys
50 55 60
gtg gtg aat gat tat gct gac cgc aag ttt gat ggt cat gtt aag cgc 540
Val Val Asn Asp Tyr Ala Asp Arg Lys Phe Asp Gly His Val Lys Arg
65 70 75 80
acg gcg aac cga cca ctt ccc agc ggc gcg gta aca gag aaa gag gcg 588
Thr Ala Asn Arg Pro Leu Pro Ser Gly Ala Val Thr Glu Lys Glu Ala
85 90 95
cgc gcg ctg ttt gtc gtg ctg gta ctg att tcg ttt tta ctg gtg ctg 636
Arg Ala Leu Phe Val Val Leu Val Leu Ile Ser Phe Leu Leu Val Leu
100 105 110
acg ctg aat acg atg acc att ctg ttg tcg att gcc gcg cta gcg ctg 684
Thr Leu Asn Thr Met Thr Ile Leu Leu Ser Ile Ala Ala Leu Ala Leu
115 120 125
gcg tgg gtg tac ccg ttt atg aag cgg tat acc cat cta ccg caa gtg 732
Ala Trp Val Tyr Pro Phe Met Lys Arg Tyr Thr His Leu Pro Gln Val
130 135 140
gtg ctg ggc gcg gcg ttt ggc tgg tcg att cca atg gct ttt gcc gct 780
Val Leu Gly Ala Ala Phe Gly Trp Ser Ile Pro Met Ala Phe Ala Ala
145 150 155 160
gtg agt gag tcg gtg cca ttg agt tgc tgg tta atg ttc ctc gcc aat 828
Val Ser Glu Ser Val Pro Leu Ser Cys Trp Leu Met Phe Leu Ala Asn
165 170 175
att ctc tgg gcg gtg gct tac gac acg cag tat gcg atg gtt gac cgc 876
Ile Leu Trp Ala Val Ala Tyr Asp Thr Gln Tyr Ala Met Val Asp Arg
180 185 190
gat gat gat gtg aag att ggc att aaa tcc acg gca atc ctg ttc ggc 924
Asp Asp Asp Val Lys Ile Gly Ile Lys Ser Thr Ala Ile Leu Phe Gly
195 200 205
caa tac gat aaa ttg att att ggt att ttg cag att ggc gta ctg gca 972
Gln Tyr Asp Lys Leu Ile Ile Gly Ile Leu Gln Ile Gly Val Leu Ala
210 215 220
ctg atg gcg atc atc ggt gag tta aat ggc tta ggc tgg gga tat tac 1020
Leu Met Ala Ile Ile Gly Glu Leu Asn Gly Leu Gly Trp Gly Tyr Tyr
225 230 235 240
tgg tca att ctg gtg gct ggc gcg ctg ttt gtt tat caa caa aaa ctg 1068
Trp Ser Ile Leu Val Ala Gly Ala Leu Phe Val Tyr Gln Gln Lys Leu
245 250 255
att gcc aac cgc gag cgt gaa gcc tgc ttt aaa gca ttt atg aat aat 1116
Ile Ala Asn Arg Glu Arg Glu Ala Cys Phe Lys Ala Phe Met Asn Asn
260 265 270
aac tat gtt ggt ctg gta cta ttt tta ggg ctg gca atg agt tac tgg 1164
Asn Tyr Val Gly Leu Val Leu Phe Leu Gly Leu Ala Met Ser Tyr Trp
275 280 285
cat ttc 1170
His Phe
290
<210>4
<211>1938
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>4
tattcaggtg gtgcaaaact tcgttgcgct ggcagatctg gcagagttcg accctgcgga 60
actgctggcc ccttataccg gtgatatcgc cgctgaagga atcagcaaag ccatgcgcgg 120
aggcgcaaag ttcctgcatc acggcattaa gcgccagcaa cgttatgtgg cggaagccat 180
tactgaagag tggcgtatgg cacccggtcc gcttgaagtg gcctggtttg cggaagagac 240
ggctgccgtc gagcgtgctg ttgatgccct gaccaaacgg ctggaaaaac tggaggctaa 300
atg acg cca ggt gaa gta cgg cgc cta tat ttc atc att cgc act ttt 348
Met Thr Pro Gly Glu Val Arg Arg Leu Tyr Phe Ile Ile Arg Thr Phe
1 5 10 15
tta agc tac gga ctt gat gaa ctg atc ccc aaa atg cgt atc acc ctg 396
Leu Ser Tyr Gly Leu Asp Glu Leu Ile Pro Lys Met Arg Ile Thr Leu
20 25 30
ccg cta cgg cta tgg cga tac tca tta ttc tgg atg cca aat cgg cat 444
Pro Leu Arg Leu Trp Arg Tyr Ser Leu Phe Trp Met Pro Asn Arg His
35 40 45
aaa gac aaa ctt tta ggt gag cga cta cga ctg gcc ctg caa gaa ctg 492
Lys Asp Lys Leu Leu Gly Glu Arg Leu Arg Leu Ala Leu Gln Glu Leu
50 55 60
ggg ccg gtt tgg atc aag ttc ggg caa atg tta tca acc cgc cgc gat 540
Gly Pro Val Trp Ile Lys Phe Gly Gln Met Leu Ser Thr Arg Arg Asp
65 70 75 80
ctt ttt cca ccg cat att gcc gat cag ctg gcg tta ttg cag gac aaa 588
Leu Phe Pro Pro His Ile Ala Asp Gln Leu Ala Leu Leu Gln Asp Lys
85 90 95
gtt gct ccg ttt gat ggc aag ctg gcg aag cag cag att gaa gct gca 636
Val Ala Pro Phe Asp Gly Lys Leu Ala Lys Gln Gln Ile Glu Ala Ala
100 105 110
atg ggc ggc ttg ccg gta gaa gcg tgg ttt gac gat ttt gaa atc aag 684
Met Gly Gly Leu Pro Val Glu Ala Trp Phe Asp Asp Phe Glu Ile Lys
115 120 125
ccg ctg gct tct gct tct atc gcc cag gtt cat acc gcg cga ttg aaa 732
Pro Leu Ala Ser Ala Ser Ile Ala Gln Val His Thr Ala Arg Leu Lys
130 135 140
tcg aat ggt aaa gag gtg gtg att aaa gtc atc cgc ccg gat att ttg 780
Ser Asn Gly Lys Glu Val Val Ile Lys Val Ile Arg Pro Asp Ile Leu
145 150 155 160
ccg gtt att aaa gcg gat ctg aaa ctt atc tac cgt ctg gct cgc tgg 828
Pro Val Ile Lys Ala Asp Leu Lys Leu Ile Tyr Arg Leu Ala Arg Trp
165 170 175
gtg ccg cgt ttg ctg ccg gat ggt cgc cgt ctg cgc cca acc gaa gtg 876
Val Pro Arg Leu Leu Pro Asp Gly Arg Arg Leu Arg Pro Thr Glu Val
180 185 190
gtg cgc gag tac gaa aag aca ttg att gat gaa ctg aat ttg ctg cgg 924
Val Arg Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Ile Asp Glu Leu Asn Leu Leu Arg
195 200 205
gaa tct gcc aac gcc att cag ctt cgg cgc aat ttt gaa gac agc ccg 972
Glu Ser Ala Asn Ala Ile Gln Leu Arg Arg Asn Phe Glu Asp Ser Pro
210 215 220
atg ctc tac atc ccg gaa gtt tac cct gac tat tgt agt gaa ggg atg 1020
Met Leu Tyr Ile Pro Glu Val Tyr Pro Asp Tyr Cys Ser Glu Gly Met
225 230 235 240
atg gtg atg gag cgc att tac ggc att ccg gtg tct gat gtt gcg gcg 1068
Met Val Met Glu Arg Ile Tyr Gly Ile Pro Val Ser Asp Val Ala Ala
245 250 255
ctg gag aaa aac ggc act aac atg aaa ttg ctg gcg gaa cgc ggc gtg 1116
Leu Glu Lys Asn Gly Thr Asn Met Lys Leu Leu Ala Glu Arg Gly Val
260 265 270
cag gtg ttc ttc act cag gtc ttt cgc gac agc ttt ttc cat gcc gat 1164
Gln Val Phe Phe Thr Gln Val Phe Arg Asp Ser Phe Phe His Ala Asp
275 280 285
atg cac cct ggc aac atc ttc gta agc tat gaa cac ccg gaa aac ccg 1212
Met His Pro Gly Asn Ile Phe Val Ser Tyr Glu His Pro Glu Asn Pro
290 295 300
aaa tat atc ggc att gat tgc ggg att gtt ggc tcg cta aac aaa gaa 1260
Lys Tyr Ile Gly Ile Asp Cys Gly Ile Val Gly Ser Leu Asn Lys Glu
305 310 315 320
gat aaa cgc tat ctg gca gaa aac ttt atc gcc ttc ttt aat cgc gac 1308
Asp Lys Arg Tyr Leu Ala Glu Asn Phe Ile Ala Phe Phe Asn Arg Asp
325 330 335
tat cgc aaa gtg gca gag cta cac gtc gat tct ggc tgg gtg cca cca 1356
Tyr Arg Lys Val Ala Glu Leu His Val Asp Ser Gly Trp Val Pro Pro
340 345 350
gat acc aac gtt gaa gag ttc gaa ttt gcc att cgt acg gtc tgt gaa 1404
Asp Thr Asn Val Glu Glu Phe Glu Phe Ala Ile Arg Thr Val Cys Glu
355 360 365
cct atc ttt gag aaa ccg ctg gcc gaa att tcg ttt gga cat gta ctg 1452
Pro Ile Phe Glu Lys Pro Leu Ala Glu Ile Ser Phe Gly His Val Leu
370 375 380
tta aat ctg ttt aat acg gcg cgt cgc ttc aat atg gaa gtg cag ccg 1500
Leu Asn Leu Phe Asn Thr Ala Arg Arg Phe Asn Met Glu Val Gln Pro
385 390 395 400
caa ctg gtg tta ctc cag aaa acc ctg ctc tac gtc gaa ggg gta gga 1548
Gln Leu Val Leu Leu Gln Lys Thr Leu Leu Tyr Val Glu Gly Val Gly
405 410 415
cgc cag ctt tat ccg caa ctc gat tta tgg aaa acg gcg aag cct ttc 1596
Arg Gln Leu Tyr Pro Gln Leu Asp Leu Trp Lys Thr Ala Lys Pro Phe
420 425 430
ctg gag tcg tgg att aaa gat cag gtc ggt att cct gcg ctg gtg aga 1644
Leu Glu Ser Trp Ile Lys Asp Gln Val Gly Ile Pro Ala Leu Val Arg
435 440 445
gca ttt aaa gaa aaa gcg ccg ttc tgg gtc gaa aaa atg cca gaa ctg 1692
Ala Phe Lys Glu Lys Ala Pro Phe Trp Val Glu Lys Met Pro Glu Leu
450 455 460
cct gaa ttg gtt tac gac agt ttg cgc cag ggc aag tat tta cag cac 1740
Pro Glu Leu Val Tyr Asp Ser Leu Arg Gln Gly Lys Tyr Leu Gln His
465 470 475 480
agt gtt gat aag att gcc cgc gag ctt cag tca aat cat gta cgt cag 1788
Ser Val Asp Lys Ile Ala Arg Glu Leu Gln Ser Asn His Val Arg Gln
485 490 495
gga caa tcg cgt tat ttt ctc gga att ggc gct acg tta gta tta agt 1836
Gly Gln Ser Arg Tyr Phe Leu Gly Ile Gly Ala Thr Leu Val Leu Ser
500 505 510
ggc aca ttc ttg ttg gtc agc cga cct gaa tgg ggg ctg atg ccc ggc 1884
Gly Thr Phe Leu Leu Val Ser Arg Pro Glu Trp Gly Leu Met Pro Gly
515 520 525
tgg tta atg gca ggt ggt ctg atc gcc tgg ttt gtc ggt tgg cgc aaa 1932
Trp Leu Met Ala Gly Gly Leu Ile Ala Trp Phe Val Gly Trp Arg Lys
530 535 540
aca cgc 1938
Thr Arg
545
<210>5
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>5
ttatttgccg actaccttgg tgatctgtgt ctcaaaatct ctgatgttac 50
<210>6
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>6
attcccctgc tcgcgcaggc tgggtttaga aaaactcatc gagcatcaaa 50
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>7
ttatttgccg actaccttgg tgatc 25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>8
acccagcctg cgggagcagg ggaat 25
<210>9
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>9
ctgtttttac cggcgtcacc gttgtactaa gaggaaaaaa atatgttatt tgccgactac 60
cttggtgatc 70
<210>10
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>10
acccagaaga aagccggatg atcatccggc ttttttacat catcaattcc cctgctcgcg 60
caggctgggt 70
<210>11
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>11
tgttgatgcc ctgaccaaac ggctggaaaa actggaggct aaatgttatt tgccgactac 60
cttggtgatc 70
<210>12
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>12
ccgcattata cgttacacgg cccgccttga gcgatgaaaa aatcaattcc cctgctcgcg 60
caggctgggt 70
<210>13
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>13
gaagttccta tactttctag agaataggaa cttc 34
<210>14
<211>53
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>14
ttatttgccg actaccttgg tgatcgatcc tttttaaccc atcacatata cct 53
<210>15
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>15
cgtgccgatc aacgtctcat atgccgcccg gtagtccggc ttctg 45
<210>16
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>16
cagaagccgg actaccgggc ggcatatgag acgttgatcg gcacg 45
<210>17
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>17
attcccctgc tcgcgcaggc tgggttgaat ttctgccatt catcc 45
<210>18
<211>68
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>18
agtagcttaa atgtgattca acatcactgg agaaagtctt atgttatttg ccgactacct 60
tggtgatc 68
<210>19
<211>68
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>19
atctgaatca gctcccctgg aatgcagggg agcggcaaga ttaattcccc tgctcgcgca 60
ggctgggt 68
<210>20
<211>72
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>20
tttttagtag cttaaatgtg attcaacatc actggagaaa gtcttatgat gaacaaacat 60
gtaaataaag ta 72
<210>21
<211>71
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400>21
ggattatctg aatcagctcc cctggaatgc aggggagcgg caagattagt tgactttttg 60
ttctgcaaaa t 71
Claims (7)
1.一种乳酸的制造方法,其包括在培养基中培养微生物,从而在培养物中生成乳酸并使其蓄积,然后从该培养物中采集乳酸,其中,所述微生物中的4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性降低或丧失,所述微生物具有生产乳酸的能力,且所述微生物为原核生物。
2.权利要求1所述的乳酸的制造方法,其中,微生物具有对下述蛋白质进行编码的基因的一部分或全部缺失了的染色体DNA,所述蛋白质具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性。
3.权利要求2所述的乳酸的制造方法,其中,基因为对下述蛋白质进行编码的基因:具有序列号1或序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质,或者与序列号1或2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性的蛋白质。
4.权利要求2所述的乳酸的制造方法,其中,基因为具有序列号3或序列号4所示的碱基序列的基因,或者为在严格条件下和具有与序列号3或4所示的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸杂交且对下述蛋白质进行编码的基因,所述蛋白质具有4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶活性或2-八异戊二烯基苯酚羟化酶活性。
5.权利要求1~4任一项所述的乳酸的制造方法,其中,微生物为通过选自下述[1]~[4]的方法而强化了生产乳酸的能力的微生物,
[1]将控制乳酸的生物合成的机制的至少一个缓和或解除的方法;
[2]将与乳酸的生物合成相关的酶的至少一个的表达强化的方法;
[3]使与乳酸的生物合成相关的酶基因的至少一个的拷贝数增加的方法;
[4]将从乳酸的生物合成路径分支的代谢路径的至少一个弱化或阻断的方法。
6.权利要求1~4任一项所述的乳酸的制造方法,其中,微生物是属于下述属的微生物:欧文氏菌属、沙雷菌属、沙门菌属、埃希氏菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、酸硫杆状菌属、不动杆菌属、土壤杆菌属、芽孢杆菌属、博德特菌属、短根瘤菌属、布鲁氏杆菌属、伯霍尔德杆菌属、柄杆菌属、绿屈挠菌属、梭菌属、考克斯体属、脱亚硫酸菌、地杆菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、Magnetococcus、磁螺菌属、曼氏杆菌属、中生根瘤菌属、甲基芽孢杆菌属、甲基杆菌属、分枝杆菌属、奈瑟球菌属、亚硝化单孢菌属、念珠藻属、巴斯德菌属、原绿球藻属、红杆菌属、红球菌属、红假单胞菌属、立克次体属、志贺菌属、中华根瘤菌属、鞘胺醇单胞菌属、链霉菌属、聚球藻属、集胞藻属、弧菌属、木质部小菌属、耶尔森氏菌属、发酵单胞菌属或黄单胞菌属。
7.权利要求1~4任一项所述的乳酸的制造方法,其中,微生物是选自下述组中的微生物:草生欧文氏菌、解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、粘质沙雷菌、鸟氨酸脱羧酶阴性沙雷菌、居泉沙雷菌、鸟氨酸脱羧酶阳性沙雷菌、肠炎沙门菌亚属、肠炎沙门菌、副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、都伯林沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希杆菌、雷氏变形菌、恶臭假单胞菌、萤光假单胞菌、铜绿假单胞菌、德阿昆假单胞菌、萤光假单胞菌、丁香假单胞菌、Pseudomonas thazdinophilum、嗜酸氧化亚铁硫杆菌、不动杆菌ATCC 33305、根癌土壤杆菌、嗜碱芽孢杆菌、支气管炎博德特菌、副百日咳博代氏菌、百日咳博德特菌、慢生型大豆根瘤菌、马尔他布鲁杆菌、类鼻疽伯霍尔德杆菌、新月柄杆菌、橙色绿屈挠菌、丙酮丁醇梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、伯内特考克斯体、Desulftobacterium hafniense、芳香族化合物降解耦连铁还原细菌、杜克雷嗜血杆菌、嗜肺军团病杆菌、问号钩端螺旋体、Magnetococcus MC-1、趋磁螺旋菌、溶血曼海姆菌、百脉根中生根瘤菌、Methylobacillus flagellatus、甲基营养菌属、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海分枝杆菌、结核分支杆菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、欧洲亚硝化毛杆菌、点形念珠藻、多杀巴斯德菌、原核绿藻、荚膜红杆菌、苯酚降解菌红球菌菌株124、沼泽红假单胞菌、普氏立克次体、弗氏志贺菌、苜蓿中华根瘤菌、溶芳烃鞘氨醇单胞菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、聚球藻WH8102、集胞藻PCC6803、霍乱弧菌、苛养木杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、运动发酵单孢菌、水稻黄单胞菌和甘蓝黑腐病黄单胞杆菌。
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