JPWO2007029664A1

JPWO2007029664A1 - 乳酸の製造法

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Publication number: JPWO2007029664A1
Application number: JP2007534411A
Authority: JP
Inventors: 幹人伊東; 貴美枝桝田; 英郎森; 真輝子加藤
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2005-09-05
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2009-03-19
Anticipated expiration: 2026-09-05
Also published as: CN101300351A; CN101300351B; EP1932910A4; EP1932910A1; AU2006288323A1; KR20080065610A; US20100003731A1; JP5014998B2; WO2007029664A1

Abstract

本発明によれば、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、もしくは２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物、特に４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物、および該微生物を用いた乳酸の製造法が提供される。

Description

本発明は、乳酸を生産する能力を有する微生物、および該微生物を用いた乳酸の製造法に関する。

乳酸を生産する微生物としては、Lactobacillus属やLactococcus属などの乳酸菌、Rhizopus属の糸状菌、Saccharomyces属などの酵母、および大腸菌が報告されているが、乳酸菌は複雑な栄養要求性を示し、乳酸の光学純度が低いこと（非特許文献１および２）、糸状菌は、グリセロール、エタノールやフマル酸などの副生物が多いこと（非特許文献３および４）、酵母は組換え菌株を用いた場合でも多量のエタノールが副生し、糖消費量に対する収率が低いこと（非特許文献５）が知られている。

大腸菌を用いた乳酸の製造法としては、ピルベートホルメートリアーゼ遺伝子、および有機酸やエタノールの副生に関係する遺伝子の欠損株を用いる方法（非特許文献６）、およびホスホトランスアセチラーゼ遺伝子およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の変異株を用いる方法（非特許文献７）が知られているが、いずれも乳酸の生産性が低い。

大腸菌（Escherichia coli）の４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ（以下、UbiA蛋白質という）および２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ（以下、UbiB蛋白質という）は、大腸菌においてユビキノン（ubiquinone）の生合成に関与している蛋白質であり、UbiA蛋白質とUbiB蛋白質のアミノ酸配列および該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は既に知られている（非特許文献８および９）。また、多くの微生物では、その染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかになっている（非特許文献１０）。

大腸菌において、ユビキノン生合成遺伝子の変異株が2.5g/LのD-乳酸を蓄積することは知られている（非特許文献１１および１２）が、該変異株（AN59株）は、ubiE遺伝子の変異株であり（非特許文献１３）、他のユビキノン生合成遺伝子産物の活性が低下した株の乳酸の生産性、およびユビキノン生合成遺伝子変異株の酢酸の生成量等は知られていない。

酢酸は、乳酸発酵の際の副生物であり、乳酸の精製や重合化を妨害するため、酢酸の副生量が少ない、安価な乳酸の製造法が求められている。
Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 307(1996) Enzyme Microb. Technol., 26, 87(2000) Appl. Biochem. Biotechnol., 51, 57(1995) J. Biosci. Bioeng., 97, 19(2004) Appl. Environ. Microbiol., 71, 2789(2005) Appl. Environ. Microbiol., 69, 399(2003) Appl. Environ. Microbiol., 65, 1384(1999) FEBS Letters, 307, 347(1992) Science, 257, 771(1992) http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html J. Bacteriol., 99, 450(1969) Biochem. J., 117, 551(1970) J Bacteriol., 182, 5139(2000)

本発明の目的は、乳酸の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた乳酸の製造法を提供することにある。

本発明は、以下の（１）〜（８）に関する。
（１）４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、もしくは２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物。
（２）微生物が４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する、上記（１）の微生物。
（３）遺伝子が配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である、上記（２）の微生物。
（４）遺伝子が配列番号３もしくは４で表される塩基配列を有する遺伝子、または配列番号３もしくは４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性もしくは２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である、上記（２）の微生物。
（５）微生物が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法によって乳酸を生産する能力が強化された微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
［１］乳酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
［２］乳酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
［３］乳酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
［４］乳酸の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
［５］野生型株に比べ、乳酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
（６）微生物がErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属、Acidithiobacillus属、Acinetobacter属、Agrobacterium属、Bacillus属、Bordetella属、Bradyrhizobium属、Brucella属、Burkholderia属、Caulobacter属、Chloroflexus属、Clostridium属、Coxiella属、Desulfitobacterium属、Geobacter属、Haemophilus属、Legionella属、Leptospira属、Magnetococcus属、Magnetospirillum属、Mannheimia属、Mesorhizobium属、Methylobacillus属、Methylobacterium属、Mycobacterium属、Neisseria属、Nitrosomonas属、Nostoc属、Pasteurella属、Prochlorococcus属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Rhodopseudomonas属、Rickettsia属、Shigella属、Sinorhizobium属、Sphingomonas属、Streptomyces属、Synechococcus属、Synechocystis属、Vibrio属、Xylella属、Yersinia属、Zymomonas属またはXanthomonas属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいずれか１つの微生物。
（７）微生物がErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、 Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella enterica、Salmonella enteritidis、Salmonella paratyphi、Salmonella typhi、Salmonella dublin、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas syringae、Pseudomonas thazdinophilum、Acidithiobacillus ferrooxidans、Acinetobacter sp. ATCC 33305、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus halodurans、Bordetella bronchiseptica、Bordetella parapertussis、Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、Brucella melitensis、Burkholderia pseudomallei、Caulobacter crescentus、Chloroflexus aurantiacus、Clostridium acetobutylicum、Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Coxiella burnetii、Desulfitobacter iumhafniense、Geobacter metallireducens、Haemophilus ducreyi、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Magnetococcus MC-1、Magnetospirillum magnetotacticum、Mannheimia haemolytica、Mesorhizobium loti、Methylobacillus flagellatus、Methylobacterium extorquens、Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nitrosomonas europaea、Nostoc punctiforme、Pasteurella multocida、Prochlorococcus marinus、Rhodobacter capsulatus、Rhodococcus sp. strain I24、Rhodopseudomonas palustris、Rickettsia prowazekii、Shigella flexneri、Sinorhizobium meliloti、Sphingomonas aromaticivorans、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Synechococcus sp. WH8102、Synechocystis sp. PCC6803、Vibrio cholerae、Xylella fastidiosa、Xylella fastidiosa、Yersinia pestis、Zymomonas mobilis、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisからなる群より選ばれる微生物である上記（１）〜（６）のいずれか１つの微生物。
（８）上記（１）〜（７）のいずれか１つの微生物を培地に培養し、培養物中に乳酸を生成、蓄積させ、該培養物から乳酸を採取する乳酸の製造法。

本発明により、乳酸の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた乳酸の製造法を提供することができる。

１．本発明の微生物
本発明の微生物としては、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、もしくは２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下、または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば染色体ＤＮＡ上の４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質（以下、UbiA蛋白質ともいう）をコードする遺伝子、もしくは２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質（以下、UbiB蛋白質ともいう）をコードする遺伝子の一部または全部が欠損しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物をあげることができる。

なお、本明細書中では、遺伝子は構造遺伝子およびプロモーター、オペレーターなどの特定の制御機能を有する領域を含んでおり、UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物としては、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失があるため、（１）UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質を発現しない微生物、（２）フレームシフトが生じ、UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物、および（３）UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子中の構造遺伝子の一部または全部が欠損している微生物、などをあげることができ、好ましくは（３）の微生物、より好ましくはUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子中の構造遺伝子の全部が欠損している微生物をあげることができる。

UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子中の構造遺伝子の一部が欠損しているとは、構造遺伝子部分の１塩基の欠失でもよく、好ましくは構造遺伝子中の５〜１０塩基、より好ましくは該遺伝子中の１０〜５０塩基、さらに好ましくは該遺伝子中の５０〜１００塩基の欠失をあげることができる。
４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下した微生物としては、野生型のUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子を有する微生物に比べ、その活性が低下している微生物であれば特に限定されないが、一般には６０％以下、好ましくは４０％、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下に低下した微生物をあげることができる。

UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子は、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、それぞれ配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子である配列番号３または４で表される塩基配列を有する遺伝子、および配列番号３もしくは４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をあげることができる。

アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。

また、ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの一部に遺伝子がハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるポリヌクレオチドである。プローブとして用いられるポリヌクレオチドとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のポリヌクレオチドをあげることができ、プライマーとして用いられるポリヌクレオチドとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のポリヌクレオチドをあげることができる。

ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。

上記のストリンジェントな条件とは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを固定化したフィルターとプローブ、好ましくはプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な遺伝子としては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号３または４で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する遺伝子をあげることができる。

配列番号３または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であることは、例えば、遺伝子組換え法を用いて該遺伝子にコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。

また、本発明の微生物としては、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
細菌としてはErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属、Acidithiobacillus属、Acinetobacter属、Agrobacterium属、Bacillus属、Bordetella属、Bradyrhizobium属、Brucella属、Burkholderia属、Caulobacter属、Chloroflexus属、Clostridium属、Coxiella属、Desulfitobacterium属、Geobacter属、Haemophilus属、Legionella属、Leptospira属、Magnetococcus属、Magnetospirillum属、Mannheimia属、Mesorhizobium属、Methylobacillus属、Methylobacterium属、Mycobacterium属、Neisseria属、Nitrosomonas属、Nostoc属、Pasteurella属、Prochlorococcus属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Rhodopseudomonas属、Rickettsia属、Shigella属、Sinorhizobium属、Sphingomonas属、Streptomyces属、Synechococcus属、Synechocystis属、Vibrio属、Xylella属、Yersinia属、Zymomonas属またはXanthomonas属に属する微生物をあげることができる。

また、上記した属に属する細菌としては、Erwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、 Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella enterica、Salmonella enteritidis、Salmonella paratyphi、Salmonella typhi、Salmonella dublin、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas syringae、Pseudomonas thazdinophilum、Acidithiobacillus ferrooxidans、Acinetobacter sp. ATCC 33305、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus halodurans、Bordetella bronchiseptica、Bordetella parapertussis、Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、Brucella melitensis、Burkholderia pseudomallei、Caulobacter crescentus、Chloroflexus aurantiacus、Clostridium acetobutylicum、Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Coxiella burnetii、Desulfitobacter iumhafniense、Geobacter metallireducens、Haemophilus ducreyi、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Magnetococcus MC-1、Magnetospirillum magnetotacticum、Mannheimia haemolytica、Mesorhizobium loti、Methylobacillus flagellatus、Methylobacterium extorquens、Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nitrosomonas europaea、Nostoc punctiforme、Pasteurella multocida、Prochlorococcus marinus、Rhodobacter capsulatus、Rhodococcus sp. strain I24、Rhodopseudomonas palustris、Rickettsia prowazekii、Shigella flexneri、Sinorhizobium meliloti、Sphingomonas aromaticivorans、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Synechococcus sp. WH8102、Synechocystis sp. PCC6803、Vibrio cholerae、Xylella fastidiosa、Xylella fastidiosa、Yersinia pestis、Zymomonas mobilis、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisなどをあげることができ、より好ましくはE. coliをあげることができる。
２．本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、（１）乳酸を生産する能力を有する微生物の染色体ＤＮＡ上に存在するUbiA蛋白質もしくはUbiB蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部を欠損させる方法、または（２）染色体ＤＮＡ上のUbiA蛋白質もしくはUbiB蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、乳酸の生産性を付与する方法により製造することができる。

乳酸を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制限されず、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により乳酸を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）乳酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）乳酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）乳酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）乳酸の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、乳酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。

上記（ａ）の方法としては、ピルベートホルメートリアーゼ遺伝子による乳酸の生合成制御を解除する方法［Appl. Environ. Microbiol., 69, 399(2003)］、（ｃ）の方法としてはＬ−乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に６コピー導入する方法［Appl. Environ. Microbiol., 71, 2789(2005)］、（ｄ）の方法としては、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に変異を導入する方法［Appl. Environ. Microbiol., 65, 1384(1999)］などをあげることができる。

染色体ＤＮＡ上のUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば下記した微生物の染色体ＤＮＡ上のUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報を利用して、微生物の染色体ＤＮＡ上にあるUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。各微生物が有するUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号３または４で表される塩基配列をクエリーに用いた各種ＤＮＡ配列データベースの検索、配列番号３または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの全部または一部をプローブに用いた、各種微生物の染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションによりUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子を同定、取得し、または配列番号３または４で表される塩基配列に基づき設計したプライマーを用い、各種微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりUbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析することにより決定することができる。サザンハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに供する染色体ＤＮＡは、いずれの微生物の染色体ＤＮＡであってもよく、好ましくは、Erwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属、Acidithiobacillus属、Acinetobacter属、Agrobacterium属、Bacillus属、Bordetella属、Bradyrhizobium属、Brucella属、Burkholderia属、Caulobacter属、Chloroflexus属、Clostridium属、Coxiella属、Desulfitobacterium属、Geobacter属、Haemophilus属、Legionella属、Leptospira属、Magnetococcus属、Magnetospirillum属、Mannheimia属、Mesorhizobium属、Methylobacillus属、Methylobacterium属、Mycobacterium属、Neisseria属、Nitrosomonas属、Nostoc属、Pasteurella属、Prochlorococcus属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Rhodopseudomonas属、Rickettsia属、Shigella属、Sinorhizobium属、Sphingomonas属、Streptomyces属、Synechococcus属、Synechocystis属、Vibrio属、Xylella属、Yersinia属、Zymomonas属またはXanthomonas属に属する微生物、より好ましくはErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、 Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella enterica、Salmonella enteritidis、Salmonella paratyphi、Salmonella typhi、Salmonella dublin、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas syringae、Pseudomonas thazdinophilum、Acidithiobacillus ferrooxidans、Acinetobacter sp. ATCC 33305、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus halodurans、Bordetella bronchiseptica、Bordetella parapertussis、Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、Brucella melitensis、Burkholderia pseudomallei、Caulobacter crescentus、Chloroflexus aurantiacus、Clostridium acetobutylicum、Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Coxiella burnetii、Desulfitobacter iumhafniense、Geobacter metallireducens、Haemophilus ducreyi、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Magnetococcus MC-1、Magnetospirillum magnetotacticum、Mannheimia haemolytica、Mesorhizobium loti、Methylobacillus flagellatus、Methylobacterium extorquens、Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nitrosomonas europaea、Nostoc punctiforme、Pasteurella multocida、Prochlorococcus marinus、Rhodobacter capsulatus、Rhodococcus sp. strain I24、Rhodopseudomonas palustris、Rickettsia prowazekii、Shigella flexneri、Sinorhizobium meliloti、Sphingomonas aromaticivorans、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Synechococcus sp. WH8102、Synechocystis sp. PCC6803、Vibrio cholerae、Xylella fastidiosa、Xylella fastidiosa、Yersinia pestis、Zymomonas mobilis、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisの染色体ＤＮＡをあげることができる。

ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲは、常法たとえばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、配列番号３または４で表される塩基配列を有する遺伝子、Shigella flexneri 2a由来のubiA遺伝子およびyigR遺伝子（Genbank accession no. AE005674）、Salmonella enterica由来のubiA遺伝子およびaarF遺伝子（Genbank accession no. NC004631）などをあげることができる。

微生物の染色体ＤＮＡ上の遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。

該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。

上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、例えばエシェリヒア属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。

具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているエシェリヒア・コリをあげることができる。

λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるpKD46［エシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリ JM101株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）薬剤耐性遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性があるＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡ、または該ＤＮＡと相同性があるＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が連結したＤＮＡの両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性があるＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)〕が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。

薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。

ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のsacB遺伝子〔Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366（1993）〕、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のrpsL遺伝子〔Genomics, 72, 99-104(2001)〕等をあげることができる。

上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の導入対象となる領域の両外側に位置するＤＮＡと相同性があるＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは10bp〜100bp程度が好ましく、20bp〜50bp程度がより好ましく、30〜40bp程度がさらに好ましい。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。

相同性があるとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したBLASTやFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。

上記直鎖ＤＮＡは、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（ｂ）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。

上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。

方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。

上記方法により得られた変異株が、４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下または喪失していることは、例えば該変異株とその元株のユビキノンの生産性を公知の方法で測定し、比較することにより確認することができる。

また、本発明の微生物のD-乳酸脱水素酵素（EC 1.1.1.28）活性を低下または喪失させ、さらに好ましくはL-乳酸脱水素酵素（EC 1.1.2.27）活性を強化することにより、L-乳酸の生産性が高い微生物を造成することができ、逆にL-乳酸脱水素酵素活性を低下または喪失させ、さらに好ましくはD-乳酸脱水素酵素活性を強化することにより、D-乳酸の生産性が高い微生物を造成することもできる。

D-乳酸脱水素酵素、およびL-乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列、および該酵素をコードする遺伝子の塩基配列は多くの微生物で知られており、各種データベースから容易にその配列を取得することができる。
よって、D-乳酸脱水素酵素、またはL-乳酸脱水素酵素の活性が低下または喪失した微生物は、取得される配列情報を利用して上記した方法に準じて染色体DNA上に存在するそれら酵素遺伝子の一部または全部を欠損させることにより取得することができる。

また、D-乳酸脱水素酵素、またはL-乳酸脱水素酵素の活性が強化された微生物は、それら酵素遺伝子を公知の方法で該微生物に導入することにより取得することができる。該遺伝子は、染色体DNA上に組み込まれていてもよいし、染色体外にプラスミドDNAとして存在していてもよい。
Escherichia coliを微生物として、L-乳酸の生産性が向上した微生物を造成する場合、Escherichia coliのD-乳酸脱水素酵素遺伝子のORF全部を欠損させ、かつL-乳酸脱水素酵素遺伝子、好ましくはBacillus subtilisのL-乳酸脱水素酵素遺伝子を染色体DNA上に組み込む方法をあげることができる。
３．本発明の微生物を用いた乳酸の製造法
本発明の方法ではD-乳酸、およびL-乳酸のいずれも生産することができる。

上記２の本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に乳酸を生成、蓄積させ、該培養物から乳酸を採取することにより、乳酸を製造することができる。
該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。

炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。

培養物中に生成、蓄積した乳酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、イオン交換膜を用いた電気透析法、エステル化後に蒸留して加水分解する方法、有機溶媒による抽出法、減圧蒸留し結晶化させる方法、高速液体クロマトグラフィー等を用いたクロマトグラフィー法により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

UbiA蛋白質またはUbiB蛋白質をコードする遺伝子が欠損した株の造成
E. coli KM22株［Gene, 246, 321-330 (2000)］の染色体ＤＮＡを鋳型とし、各々の3’末端の25塩基が、KM22株染色体ＤＮＡ上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計してある配列番号５および６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、染色体ＤＮＡ断片 10ng、プライマーＤＮＡ各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で１分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。

次に、カナマイシン耐性遺伝子の5’末端側上流に配列番号７で表される塩基配列、3’末端側下流に配列番号８で表される塩基配列が付加したＤＮＡ断片を上記と同様の方法でＰＣＲにより増幅した。
UbiA蛋白質をコードする遺伝子（以下、ubiA遺伝子という）欠損用ＤＮＡ断片、およびUbiB蛋白質をコードする遺伝子（以下、ubiB遺伝子という）欠損用ＤＮＡ断片を以下のように調製した。上記で取得したＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号９および１０、または配列番号１１および１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。配列番号９および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、5’末端側にそれぞれubiA遺伝子、またはubiB遺伝子の5’末端側領域付近との相同配列を有する45塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側に配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡを有している。配列番号１０および１２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、5’末端側にそれぞれubiA遺伝子、またはubiB遺伝子の3’末端側領域付近と相同配列を有する45塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側に配列番号８で表される塩基配列にハイブリダイズする25塩基からなるＤＮＡを有している。

ＰＣＲは、EX-Taq（タカラバイオ社製）を用いて、増幅ＤＮＡ断片 10ng、プライマーＤＮＡ各10pmolを含む50μlの反応液をEX-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で1分間保温後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で１分間のサイクルを30回繰り返した後、4℃で保冷するという条件で行った。
両末端に各遺伝子の両末端の45塩基と相同な領域を有するカナマイシン耐性遺伝子（ｋｍ遺伝子）を含むＤＮＡ断片が増幅していることを確認し、該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから切り出して精製した。

次に、λ Red recombinaseを発現可能なpKD46プラスミドを保持するE. coli BW25113株[Proc. Natl. Acad. Sci., U S A., 97, 6640-6645(2000)]のコンピテントセルを、Gene, 246, 321-330 (2000)に記載の方法に従って調製し、100ngの該ＤＮＡ断片を用いてそれぞれ形質転換を行った。形質転換は、0.1cmのキュベット(BioRad社製)中で、1.8KV、25μFの条件で、エレクトロポレーションにより行った。形質転換した細胞をＳＯＣ培地[20g/l バクトトリプトン（Difco社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（Difco社製）、0.5g/l 塩化ナトリウム、0.2ml/lの5mol/l NaOH、10ml/lの1mol/l 塩化マグネシウム、10ml/lの1mol/l 硫酸マグネシウム、10ml/lの２Ｍグルコース]を用いて30℃で3時間培養した後、培養液を50μg/mlのカナマイシンと10g/lのグルコースを含むＬＢ寒天プレート上に塗布し、30℃で一晩培養した。

生育してきた株は、それぞれE. coli BW25113株の染色体ＤＮＡ上のubiA遺伝子、またはubiB遺伝子が欠損していることを確認し、それぞれE. coli BW25113ΔubiA株、E. coli BW25113ΔubiB株と命名した。

ubiA遺伝子またはubiB遺伝子欠損株を用いた乳酸の製造（１）
E. coli BW25113ΔubiA株、E. coliBW25113ΔubiB株、並びに対照として実施例１記載の方法に準じて造成したubiE遺伝子欠損株（E. coliBW25113ΔubiE）、ubiG遺伝子欠損株（E. coli BW25113ΔubiG）、ubiH遺伝子欠損株（E. coli BW25113ΔubiH）、およびE. coli BW25113株を、それぞれ5mlの10g/lのグルコースを含むＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、37℃にて17時間、振とう培養し培養物を得た。60μlの該培養物を、6mlの3％の炭酸カルシウムと2％のカザミノ酸を含むＭ９液体培地（4％グルコース、11.28g/l M9 Minimal Salts(X5)（Difco社製）、100μmol/l 塩化カルシウム、2mmol/l 硫酸マグネシウム、10μg/ml 硫酸鉄）が入った太型試験管に植菌し、37℃で28時間振とう培養した。28時間後の培養物を遠心分離し、その上清を10から30倍に希釈してロシュ・ダイアグノスティックス社製のF-kit D-/L-乳酸、F-kit 酢酸およびF-kit グルコースを用いて培養液中に蓄積したD-乳酸量および酢酸量を測定した。結果を表１に示す。

表１に示すように、E. coli BW25113ΔubiA株とE. coliBW25113ΔubiB株は、他のユビキノン生合成遺伝子欠損株に比べD-乳酸生産性が高く、かつ乳酸の精製の際の不純物となり、乳酸の重合化を阻害する酢酸の副生が少ないことが明らかになった。また、D-乳酸の光学純度は99％以上であった。

ubiA遺伝子またはubiB遺伝子欠損株を用いた乳酸の製造（２）
E. coli BW25113ΔubiA株、E. coliBW25113ΔubiB株を、それぞれ5mlの10g/lのグルコースを含むＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、37℃にて17時間、振とう培養し培養物を得た。55μlの該培養物を、5mlの6％の炭酸カルシウムと2％のカザミノ酸を含むＭ９液体培地（5％グルコース、11.28g/l M9 Minimal Salts(X5)（Difco社製）、100μmol/l 塩化カルシウム、2mM 硫酸マグネシウム、10μg/ml 硫酸鉄）が入った試験管に植菌し、37℃で25時間振とう培養した。25時間後、培養物に1041μlの30％グルコース、104μlの22.56g/l M9 Minimal Salts(X10)(Difco社製)、104μlの10%カザミノ酸、2μlの1mol/l 硫酸マグネシウム、1μlの10mg/ml 硫酸鉄、0.06gの炭酸カルシウムを加えて培養を続け、培養48時間目に培養物を回収した。培養物を遠心分離し、その上清を10から1000倍に希釈してロシュ・ダイアグノスティックス社製のF-kit D-/L-乳酸、F-kit 酢酸およびF-kit グルコースを用いて培養液中に蓄積したD-乳酸量、酢酸量および残糖量を測定した。結果を表２に示す。

表２に示すように、E. coli BW25113ΔubiA株およびE. coli BW25113ΔubiB株は、約100g/lものD-乳酸を生産する能力を有するが、酢酸の副生量は非常に低いものであった。また、D-乳酸の光学純度は99％以上であった。

L-乳酸を生産する能力を有する微生物の造成
（１）D-乳酸脱水素酵素遺伝子が欠損したE. coliの造成
クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat遺伝子)、およびBacillus subtilis由来のlevansucrase遺伝子（sacB遺伝子、GenBank accession no. BG10388）を有する直鎖ＤＮＡを用いて、以下の方法によりpKD46プラスミドを保持するE. coli BW25113株の染色体ＤＮＡ上のD-乳酸脱水素酵素遺伝子（ldhA遺伝子）が欠損した株を作製した。

まず、sacB遺伝子を、コーディング領域の上流400bp、下流200bpまでの領域としてＰＣＲ法にて取得した。ＰＣＲは、B. subtilis 168株（各種公的機関より入手可能）の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１４および１５で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして行った。該ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、染色体DNA 100ng、プライマーＤＮＡ各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1.5分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。

上記ＰＣＲで取得した増幅ＤＮＡ断片（sacB遺伝子断片）を、PCR purification Kitを用いて精製した後、50μlの水に溶解した。
次にpHSG399プラスミド（タカラバイオ社製）を鋳型にし、配列番号１６および１７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat遺伝子)断片を取得した。

該ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、プラスミドＤＮＡ 40ng、プライマーＤＮＡ各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1.5分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
上記ＰＣＲで取得した増幅ＤＮＡ断片（cat遺伝子断片）を、Gel extraction Kitを用いて精製した後、50μlの水に溶解した。

次に上記で取得したsacB遺伝子断片とcat遺伝子断片を鋳型として、配列番号１４および１７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、上記で取得したsacB断片およびcat断片をそれぞれ1μl、プライマーＤＮＡ各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。

上記ＰＣＲで取得した増幅ＤＮＡ断片（sacB遺伝子断片とcat遺伝子断片が同一方向で連結したＤＮＡ断片）を、Gel extraction Kitを用いて精製した後、50μlの水に溶解した。
次に、該ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１８および１９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡは、5’末端側にldhA遺伝子の5’末端側領域付近との相同配列を有する43塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側に配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡを有している。配列番号１９で表される塩基配列を有するＤＮＡは、5’末端側にldhA遺伝子の3’末端側領域付近と相補性を有する43塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側に配列番号８で表される塩基配列にハイブリダイズする25塩基からなるＤＮＡを有している。

ＰＣＲは、EX-Taqを用いて、鋳型ＤＮＡ断片 10ng、プライマーＤＮＡ各10pmolを含む50μlの反応液をEX-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で1分間保温後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、4℃で保冷するという条件で行った。
上記ＰＣＲにより、両末端にldhA遺伝子の両末端の43塩基と相同な領域を有し、sacB遺伝子、cat遺伝子を含むＤＮＡ断片（sacB遺伝子 + cat遺伝子断片）が増幅していることを確認し、該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから切り出して精製した。

次に、pKD46プラスミドを保持するE. coli BW25113株のコンピテントセルを実施例１に記載の方法に従って調製し、上記で得られたＤＮＡ断片 100ngを用いて形質転換を行った。形質転換は、0.1cmのキュベット(BioRad社製)中で、1.8KV、25μFの条件で、エレクトロポレーションにより行った。
形質転換した細胞をＳＯＣ培地を用いて30℃で3時間培養した後、培養液を30μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に塗布し、30℃で一晩培養した。生育してきたクロラムフェニコール耐性株を、ＳｕＬＢ寒天培地〔10g/l バクトトリプトン（Difco社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（Difco社製）、10% シュークロース、1ml/lの1mol/l NaOH)プレートにレプリカし、シュークロース感受性を示す株を選択した。クロラムフェニコール耐性、かつシュークロース感受性を示す株は、E. coli BW25113株の染色体ＤＮＡ上のldhA遺伝子が破壊されていることを確認し、E. coliBW25113ΔldhA::cat-sacB株と命名した。
（２）L-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した微生物の造成
上記（１）で作製したE. coli BW25113ΔldhA::cat-sacB株の染色体ＤＮＡ上のldhA遺伝子領域にB. subtilis由来のL-乳酸脱水素酵素遺伝子(lctE遺伝子)を導入し、E. coliのldhA遺伝子のプロモーターの制御下にlctE遺伝子があるE. coliを以下のように造成した。

B. subtilisのlctE遺伝子を、B. subtilis 168株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号２０および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより取得した。配列番号２０で表される塩基配列からなるＤＮＡは、5’末端側にldhA遺伝子の開始コドンの上流領域の45塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側にlctE遺伝子の開始コドンを含む下流領域の27塩基からなる塩基配列を有している。配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、5’末端側にldhA遺伝子の終止コドンの下流領域と相補性を有する45塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側にlctE遺伝子の終止コドンを含む上流領域と相補性を有する27塩基からなる塩基配列を有している。

ＰＣＲは、Pyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用いて、染色体ＤＮＡ 100ng、プライマーＤＮＡ各10pmolを含む50μlの反応液を酵素に添付の指示書に従い調製し、９4℃で1分間保温後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で80秒間のサイクルを30回繰り返した後、4℃で保冷するという条件で行った。
上記ＰＣＲにより、末端にldhA遺伝子の上流あるいは下流の45塩基と相同な領域を有するlctE遺伝子断片が増幅していることを確認し、該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから切り出して精製した。

pKD46プラスミドを保持するE. coli BW25113ΔldhA::cat-sacB株のコンピテントセルを実施例１に記載の方法に従って調製し、上記で取得したＤＮＡ断片 100ngを用いて形質転換を行った。
形質転換は、0.1cmのキュベット(BioRad社製)中で、1.8KV、25μFの条件で、エレクトロポレーションにより行った。形質転換した細胞をＳＯＣ培地を用いて30℃で3時間培養した後、培養液をＳｕＬＢ寒天培地プレート上に塗布し、30℃で一晩培養した。生育してきたシュークロース耐性株は、E. coli BW25113ΔldhA::cat-sacB株の染色体ＤＮＡ上のldhA遺伝子領域にlctE遺伝子が導入されていることを確認し、E. coli BW25113ΔldhA::lctE株と命名した。
（３）ubiB遺伝子欠損株の造成
実施例１で取得したE. coli BW25113ΔubiB株を20mg/lのカナマイシンと10g/lのグルコースを含むＬＢ液体培地を用いて一晩、30℃にて培養して得られた培養液 0.5mlを、1.4mlの新しいＬＢ液体培地および100μlの0.1M 塩化カルシウム溶液と混合した。

30℃にて5〜6時間振とう培養した後、400μlの培養物を滅菌したチューブに移し、2μlのP1ファージストックを添加して、37℃にて10分間保温した。該チューブに50℃に保温したソフトアガー溶液（10g/l バクトトリプトン、5g/l バクトイーストエキストラクト、5mM 塩化カルシウム、1ml/l 1mol/l NaOH、3g/l 寒天）3ml添加し、よく攪拌した後に、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（10g/l バクトトリプトン、5g/l バクトイーストエキストラクト、5mM 塩化カルシウム、1ml/l 1mol/l NaOH、15g/l 寒天、プレートの直径は15cm）上にまき、37℃で7時間培養した。

次に、スプレッダーで細かく砕くことによりソフトアガー部分を回収し、1500g、4℃で10分間遠心分離した。得られた上清1.5mlに対し100μlのクロロホルムを添加し、4℃にて一晩おいた後、15000gにて2分間遠心分離し、得られた上清をファージストックとして4℃で保存した。
E. coli BW25113ΔldhA::lctE株をＣａ−ＬＢ液体培地で30℃、4時間培養して得られた培養物の200μlを遠心分離して上清を除去した後、菌体を100μlのMCバッファー（0.1mol/l MgSO₄、0.005mol/l 塩化カルシウム）に懸濁して菌体懸濁液を調製した。

上記で取得した100μlのファージストックを菌体懸濁液に添加して緩やかに混合し、37℃で10分間保温した後、200μlの1mol/l クエン酸ナトリウム溶液を添加し、遠心分離した後、上清を除去することにより菌体を洗浄した。該洗浄操作を更に2回繰り返した後、2mlのＬＢ液体培地に懸濁して30℃で2時間培養した。
次に得られた培養物100μlを30mg/lのカナマイシンと10g/lのグルコースを含むＬＢ寒天培地に塗布し、30℃で培養した。カナマイシン耐性株はubiB遺伝子が欠損していることを確認し、E. coli BW25113ΔubiB ΔldhA::lctE株と命名した。

L-乳酸の製造
実施例４で取得したE. coli BW25113ΔubiB ΔldhA::lctE株を、20g/lのグルコースを含む2mlのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、37℃にて24時間、振とう培養し培養物を得た。50μlの該培養物を、5mlの6％の炭酸カルシウムと1％のカザミノ酸を含むＭ９液体培地［5％グルコース、11.28g/l M9 minimal Salt(×5)（Difco社製）、100μmol/l 塩化カルシウム、2mmol/l 硫酸マグネシウム、10μg/l 硫酸鉄］が入った試験管に植菌し、37℃で24時間振とう培養した。24時間後の培養物を遠心分離し、その上清を10から100倍に希釈してロシュ・ダイアグノスティックス社製のF-kit D-/L-乳酸およびF-kit 酢酸を用いて培養液中に蓄積したL-乳酸量、D-乳酸量および酢酸量を測定した。結果を表3に示す。

表３に示すように、E. coli BW25113ΔubiB ΔldhA::lctE株はD-乳酸を生産せずにL-乳酸のみを生産した。すなわちubiB遺伝子の欠損株はL-乳酸も生産することがわかった。

本発明により、乳酸を効率よく製造することができる。

配列番号５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ

Claims

４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、もしくは２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物。
微生物が４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する、請求項１記載の微生物。
遺伝子が配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号１もしくは２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性または２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である、請求項２記載の微生物。
遺伝子が配列番号３もしくは４で表される塩基配列を有する遺伝子、または配列番号３もしくは４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４−ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性もしくは２−オクタプレニルフェノール２−オクタプレニル−６−メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である、請求項２記載の微生物。
微生物が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法によって乳酸を生産する能力が強化された微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
［１］乳酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
［２］乳酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
［３］乳酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
［４］乳酸の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
［５］野生型株に比べ、乳酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
微生物がErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属、Acidithiobacillus属、Acinetobacter属、Agrobacterium属、Bacillus属、Bordetella属、Bradyrhizobium属、Brucella属、Burkholderia属、Caulobacter属、Chloroflexus属、Clostridium属、Coxiella属、Desulfitobacterium属、Geobacter属、Haemophilus属、Legionella属、Leptospira属、Magnetococcus属、Magnetospirillum属、Mannheimia属、Mesorhizobium属、Methylobacillus属、Methylobacterium属、Mycobacterium属、Neisseria属、Nitrosomonas属、Nostoc属、Pasteurella属、Prochlorococcus属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Rhodopseudomonas属、Rickettsia属、Shigella属、Sinorhizobium属、Sphingomonas属、Streptomyces属、Synechococcus属、Synechocystis属、Vibrio属、Xylella属、Yersinia属、Zymomonas属またはXanthomonas属に属する微生物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
微生物がErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、 Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella enterica、Salmonella enteritidis、Salmonella paratyphi、Salmonella typhi、Salmonella dublin、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas syringae、Pseudomonas thazdinophilum、Acidithiobacillus ferrooxidans、Acinetobacter sp. ATCC 33305、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus halodurans、Bordetella bronchiseptica、Bordetella parapertussis、Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、Brucella melitensis、Burkholderia pseudomallei、Caulobacter crescentus、Chloroflexus aurantiacus、Clostridium acetobutylicum、Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Coxiella burnetii、Desulfitobacter iumhafniense、Geobacter metallireducens、Haemophilus ducreyi、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Magnetococcus MC-1、Magnetospirillum magnetotacticum、Mannheimia haemolytica、Mesorhizobium loti、Methylobacillus flagellatus、Methylobacterium extorquens、Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nitrosomonas europaea、Nostoc punctiforme、Pasteurella multocida、Prochlorococcus marinus、Rhodobacter capsulatus、Rhodococcus sp. strain I24、Rhodopseudomonas palustris、Rickettsia prowazekii、Shigella flexneri、Sinorhizobium meliloti、Sphingomonas aromaticivorans、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Synechococcus sp. WH8102、Synechocystis sp. PCC6803、Vibrio cholerae、Xylella fastidiosa、Xylella fastidiosa、Yersinia pestis、Zymomonas mobilis、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisからなる群より選ばれる微生物である請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中に乳酸を生成、蓄積させ、該培養物から乳酸を採取する乳酸の製造法。