CN101280297B - 一种固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种固定化脂肪酶的制备方法，具体步骤为：大孔树脂经预处理后，加入脂肪酶液和印迹分子，振荡吸附，冷冻干燥后进行界面激活技术处理，过滤脱除激活剂，再次冷冻干燥，获得固定化脂肪酶。酯交换反应实验表明，本发明制备的固定化脂肪酶具有较好的催化活力和使用稳定性，其催化反应的转化率可达97％以上，重复利用批次为200次。

Description

一种固定化脂肪酶的制备方法

技术领域

本发明属于脂肪酶固定化技术领域。

背景技术

动植物油脂与短链醇在催化剂的作用下，通过酯化和酯交换反应生成的烷基酯类化合物称为生物柴油。生物柴油不含硫和芳烃，十六烷值高，润滑性能好，是一种优质清洁柴油。生物柴油的的制备方法主要有化学法、生物酶法和超临界甲醇法，工业化生产生物柴油的方法仍然是化学法。检索现有专利文献，中国国家知识产权局专利局已经公开了大量与之有关的发明专利。如专利号ZL02133591.5、ZL200310111696.7，专利公开文献号CN1412278A、CN1760336A、CN1861752A、CN1556174、CN1382762A、CN1670128等专利文件公开了生产生物柴油的方法，所用催化剂分别为酸性催化剂(如浓硫酸、苯磺酸)和苛性钠强碱性催化剂。然而，化学法制备生物柴油仍然存在着诸多技术难题，主要体现在：1、使用碱催化法生产生物柴油，由于反应中有皂脚生成，形成絮状沉淀，使得生物柴油产品不易分离；反应过程中生成的皂脚、甘油易与生物柴油、甲醇等乳化，致使生物柴油收率低；反应中易排放废水，形成“二次污染”；2、使用浓硫酸作催化剂，尽管具有催化效率较高、反应时间较短等优点，但同样存在反应中易排放硫酸废水，形成“二次污染”，酯化产物难于分离，催化剂不能被重复利用，从而导致生产成本较高等技术难题。

针对化学法制备生物柴油存在的问题，人们开始研究生物酶法合成生物柴油。如陈志锋等人探讨了无溶剂系统中固定化脂肪酶Novozym 435催化餐饮业高酸废油与乙酸甲酯酯交换生产生物柴油，指出添加有机碱三羟甲基氨基甲烷或三乙胺可使酶的操作稳定性和催化活性有所提高(陈志锋等，固定化脂肪酶催化高酸废油脂酯交换生产生物柴油，催化学报，2006(2)：146-150)。专利ZL200410100479.2公开了脂肪酶法制备生物柴油和微生物发酵生产1，3-丙二醇的偶联技术。公开文献号CN1730613A的专利文件公开了一种生物酶法催化高酸值油脂进行酯交换反应生产生物柴油的方法，以短链脂肪酸酯作为酰基受体，采用碱性物质为添加剂，利用脂肪酶催化高酸值油脂生产生物柴油。

但是，由于甲醇对酶有毒性，致使酶法生物柴油转化率低；脂肪酶耐高温差，生产过程中高温对酶活影响较大；而且酶及酶固定化成本较高。以上种种问题使酶法生产生物柴油仍未不能普及工业化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化脂肪酶的制备方法，得到的固定化脂肪酶具有较好的稳定性和催化效果。

为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：大孔树脂经预处理后，加入脂肪酶液和印迹分子，振荡吸附，冷冻干燥后进行界面激活技术处理，过滤脱除激活剂，再次冷冻干燥，获得固定化脂肪酶。

所述大孔树脂为AB-8或NKA聚苯乙烯型大孔吸附树脂。

作为本发明的改进，按照以下方法对大孔树脂进行预处理：用极性有机溶剂浸泡大孔树脂，过滤脱去有机溶剂，再水洗树脂以去掉残留极性有机溶剂，最后用缓冲液浸泡平衡。

所述极性有机溶剂对大孔树脂的浸泡时间为2～8h，浸泡温度为30～70℃。

所述缓冲液摩尔浓度为0.05～1.50mol/L，pH值为6.8～7.2，缓冲液加入量为2～8mL/g树脂，缓冲液浸泡时间为8～16h，浸泡温度为30～70℃。

所述印迹分子为底物类似物，底物类似物加入量为2～12mg/g树脂。

与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：本发明采用了聚丙乙烯大孔树脂作固定化载体，结合分子印迹和界面激活技术，酶固定化率高(达96％)、催化效果好(甲酯转化率达97％)、重复利用批次多(高达200批次)。

附图说明

图1是本发明工艺流程图。

具体实施方式

图1为本发明工艺流程图，现结合附图和实施例具体说明本发明。

实施例1

称取1.1242g型号为NKA聚苯乙烯大孔树脂，加入5mL无水乙醇浸泡2h，脱除乙醇并以蒸馏水洗涤4次，加5mL浓度为0.05mol/L，pH为6.8的磷酸钠缓冲液液平衡8h，脱除缓冲液，再加入2.5mL浓度为160mg/mL的脂肪酶液和10μmol月桂酸，置于37℃条件下，设定转速为150rpm振荡吸附1h，然后取出过滤，并以磷酸钠缓冲液洗涤3次后，于真空度为20Pa，干燥温度-50℃条件下真空干燥4h。最后，加入125mL激活剂(正己烷、庚烷)，于37℃下界面激活处理1h后，再将固定化脂肪酶置于通风橱中，使有机溶剂挥发完全，得固定化脂肪酶产品。测定脂肪酶固定化率为96％，固定化酶蛋白比酶活为19500U/g.

实施例2

称取1.0042g型号为AB-8聚苯乙烯大孔树脂，加入5mL无水乙醇浸泡2h，脱除乙醇并以蒸馏水洗涤4次，加8mL浓度为1.00mol/L pH为7.2的磷酸钠缓冲液液平衡12h，脱除缓冲液，再加入8.0mL浓度为160mg/mL的脂肪酶液和60μmol月桂酸，置于37℃条件下，设定转速为280rpm振荡吸附4h，然后取出过滤，并以磷酸钠缓冲液洗涤3次后，于真空度为20Pa，干燥温度-50℃条件下真空干燥10h。最后，加入105mL激活剂(正己烷、庚烷)，于37℃下界面激活处理2h后，再将固定化脂肪酶置于通风橱中，使有机溶剂挥发完全，得固定化脂肪酶产品。测定脂肪酶固定化率为89％，固定化酶蛋白比酶活为10600U/g.

实施例3

原料：取乌桕梓油100g

首先，将原料油放入反应釜内，依次加4g固定化脂肪酶(载体为NKA聚苯乙烯大孔树脂)和20mL甲醇，开启恒温水浴控制开关和内循环控制开关，当温度升至40℃时，计时进行酯交换反应，反应20h后停止反应，从反应釜排液口放出酯化产物98.6g，静置分层，收集轻相液，减压蒸馏回收甲醇，生物柴油转化率为97％。对本发明的固定化脂肪酶重复利用结果表明，重复200批次，生物柴油转化率仍为95％。

实施例4：

原料：大豆油下脚料100g，测定原料油的酸价为85mgKOH/g油。

首先，将原料油放入反应釜内，依次加6g固定化脂肪酶(载体为NKA聚苯乙烯大孔树脂)和24mL甲醇，开启恒温水浴控制开关和内循环控制开关，当温度升至60℃时，计时进行酯交换反应，反应18h后停止反应，从反应釜排液口放出酯化产物98.4g，静置分层，收集轻相液，减压蒸馏回收甲醇，生物柴油转化率为97.1％。对本发明的固定化脂肪酶重复利用结果表明，重复180批次，生物柴油转化率仍为95％。

Claims (5)

1.一种固定化脂肪酶的制备方法，具体步骤为：大孔树脂经预处理后，加入脂肪酶液和月桂酸，振荡吸附，冷冻干燥后采用庚烷作为激活剂进行界面激活，过滤脱除激活剂，再次冷冻干燥，获得固定化脂肪酶。

2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为AB-8或NKA聚苯乙烯型大孔吸附树脂。

3.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，按照以下方法对大孔树脂进行预处理：用乙醇浸泡大孔树脂，过滤脱去乙醇，再水洗树脂以去掉残留乙醇，最后用缓冲液浸泡平衡。

4.根据权利要求3所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述乙醇对大孔树脂的浸泡时间为2～8h，浸泡温度为30～70℃。

5.根据权利要求3所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸钠，其摩尔浓度为0.05～1.50mol/L，pH值为6.8～7.2，磷酸钠加入量为2～8mL/g树脂，磷酸钠浸泡时间为8～16h，浸泡温度为30～70℃。

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