CN111944798B

CN111944798B - 一种固定化脂肪酶及其制备方法和在生物柴油中的应用

Info

Publication number: CN111944798B
Application number: CN202010679190.XA
Authority: CN
Inventors: 王永华; 林森; 杨博; 王卫飞; 蓝东明
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2040-07-15
Also published as: CN111944798A

Abstract

本发明公开了一种固定化脂肪酶及其制备方法和在生物柴油中的应用，将脂肪酶MAS1‑H108A与载体固定化，所述脂肪酶MAS1‑H108A的氨基酸序列如SEQ NO.1所示；所述载体为疏水非极性树脂，其孔径≥30nm。本申请的固定化酶同时具有高酯化能力和高转酯化能力，耐受高温和有机溶剂，且多次重复使用后保留较高的催化能力，适合用于制备生物柴油。使用这种固定化脂肪酶可以在20‑55℃均可高效制备生物柴油，生物柴油的产率为95‑98％，酸价为0.7‑2mg/g，且反应30‑50批次催化效果无明显降低，从而一定程度解决了酶促反应过程中时间久，生物柴油酸价高和酶稳定性差的问题。

Description

一种固定化脂肪酶及其制备方法和在生物柴油中的应用

技术领域

本发明涉及含有固定化脂肪酶及其制备方法。本发明还涉及固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用。

背景技术

近年来化石能源日渐枯竭，生态环境不断恶化，发展可再生能源是国家实现可持续发展和低碳经济的战略选择。生物柴油是指由动植物油脂或废弃油脂与醇(如甲醇或乙醇)反应制得的脂肪酸单烷基酯，如脂肪酸甲酯。生物柴油具有清洁环保、可再生、点火性能佳、适用性广等特点，性质与化石柴油非常相近，是良好的替代原料，受到全世界的研究和利用。

目前制备生物柴油的方法主要采用化学法，即在酸或碱性催化剂作用下催化油脂与醇发生酯交换反应，生成脂肪酸单烷基酯。化学法制备生物柴油有诸多缺点，如产生废液，污染环境、能耗高、对原料中脂肪酸和水的含量有严格的要求等。

采用酶法制备生物柴油，有广泛的原料适用性，反应条件温和，环保节能，符合绿色化学的发展方向，引起人们的重视。然而，酶法制备生物柴油，也存在一些问题，(1)因反应体系中水分、脂肪酸等因素影响，难以一步法制备低酸价的生物柴油；(2)不耐高温和甲醇，影响高熔点底物油的催化；(3)酶的稳定性差，反应时间久。

固定化技术可以提高脂肪酶的重复使用性和催化稳定性，其中载体对固定化酶的酶学性质有重要的影响，载体的疏水性、极性、孔径、携带的基团会影响固定化脂肪酶的催化性能。多孔树脂因其高比表面积、疏水性和配有功能性基团成为热门的固定化酶载体。但在酶促制备生物柴油的反应中因甘油、甲醇等存在，常用的介孔树脂所制备的固定化酶效果不好。关于使用超大孔疏水载体制备固定化酶研究较少，尚无此类固定化酶催化生物柴油的报告。

发明内容

针对目前酶促制备生物柴油过程中反应时间久，生物柴油酸价高和酶的稳定性差等问题，本发明提供了一种固定化脂肪酶及其制备生物柴油的应用技术。

本发明为了达到上述目的，通过以下技术方案实现：

第一方面，提供一种固定化脂肪酶，是来源于放线菌(Streptomycessp.)的脂肪酶MAS1的突变体，其中脂肪酶的第108位氨基酸由His变为Ala，简称MAS1-H108A；所述突变体的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明中所用脂肪酶突变体MAS1-H108A是一种无位置特异性的脂肪酶，与超大孔疏水非极性树脂结合，可以得到催化效果突出的固定化酶，该固定化酶的酯化能力和转酯化能力较强，耐高温和有机溶剂，同时稳定性好，反应时间短，产率高，酸价可以控制在0.7-2mg/g，且反应30-50批次催化效果无明显降低。

一种固定化脂肪酶的制备方法，将脂肪酶MAS1-H108A与载体固定化，所述脂肪酶MAS1-H108A的氨基酸序列如SEQ NO.1所示；所述载体为疏水非极性树脂，其孔径≥30nm。

优选地，所述载体为树脂D5753、树脂

AP1090、树脂Lifetech^TMECR1030M、树脂Lifetech^TMECR 8285、树脂AMBERLITE^TMXAD^TM1180N。

优选地，采用物理吸附法制备固定化脂肪酶。

优选地，包括如下步骤：

(1)制备脂肪酶MAS1-H108A酶液；

(2)酶液经过离心、浓缩后，向酶液中加入磷酸盐缓冲液；加入载体，与酶液混合搅拌进行固定化，取出固定化载体，将固定化酶抽滤，使用磷酸盐缓冲液清洗固定化酶至滤液中无蛋白存在，经干燥，即制得固定化脂肪酶。

优选地，所述酶液按照10,000-50,000U/g的总酶活/载体的比例添加；所述固定化的时间为6-12h。

优选地，所述发酵液的体积浓缩5-20倍，得到水解酶活为5,000-50,000U/mL的酶液，再加入占酶液体积10-200％(v/v)的磷酸盐缓冲液，调节pH为6-9。

优选地，所述干燥是30-60℃下干燥2-8h。

上述方法制备得到的固定化脂肪酶在制备生物柴油中的应用，以所述固定化脂肪酶为催化剂，原料油与短链醇直接进行反应，油与短链醇的摩尔比为1:1-1:8，酶添加量为15-60U/g底物，反应温度为20-55℃，反应时间4-10h。

优选地，所述反应温度为25-50℃，优选反应温度35-40℃；所述短链醇为甲醇、乙醇。

所述原料油包括但不限于餐饮废油、潲水油、废弃动植物油、酸化油等。

所述短链醇的添加方式为分批次添加、不分批次添加或不间断流加。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明涉及的固定化酶，将来源于放线菌(Streptomycessp.)的脂肪酶MAS1的突变体与超大孔疏水非极性树脂结合，具有以下优点：

(1)具有较高的酯化能力和转酯化能力。

(2)耐有机溶剂、耐高温。

(3)操作稳定性好。

(4)制备方法简单，成本低。

以本发明涉及的固定化酶催化制备生物柴油，具有以下优点：

(1)短时间催化使生物柴油的产率达到96-98％；生物柴油酸价可以控制在0.4-2mg/g；

(2)固定化酶稳定性好，反应50-80批次，酶的催化效果无明显降低；

(3)在20-55℃均可以高效催化制备生物柴油。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例2中不同载体制备的固定化脂肪酶MAS1-H108A的酯化能力和转酯化能力对比图。

图2为实施例3中超大孔树脂D5753与不同脂肪酶制备多种固定化酶的酯化能力和转酯化能力对比图。

图3为实施例4中由树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶的有机溶剂耐受性对比图。

图4为实施例5中在不同温度下，以潲水油为底物，由树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化生物柴油产率对比图。

图5为实施例6中树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化1kg级放大反应和批次反应对比图。

图6为实施例12制备脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯的效果图。

具体实施方式

1.在下述的实施例中，脂肪酶活力的测定方法如下所述：

固定化脂肪酶的酶活单位(U)的定义为：在一定的反应条件下每分钟催化底物酯化生成1μmol的丙基月桂酸酯所需要的固定化酶质量。

具体的测定步骤如下：4.0114g月桂酸、1.202g正丙醇和160μL蒸馏水依次加至50mL的具塞锥形瓶中，将锥形瓶置于恒温气浴摇床于合适温度(40-60℃)预热10min，然后加入15mg固定化酶，反应10min，停止反应，立即取30μL的样品溶入970μL的正庚烷中，进行气相色谱检测。

气相色谱测定条件如下：色谱柱为OV351(60m×0.32mm×0.10μm)；进样口和检测器温度分别为250℃和280℃，进样量为1μL，分流比为30:1，柱前压为20psi，空气流量为450mL/min，氢气流量为40mL/min，载气流量为25mL/min，升温程序为：140℃保持2min，随后以5℃/min升至210℃，保持15min。固定化脂肪酶MAS1酯化活性的计算公式如下：

式中：L_I—月桂酸初始加入摩尔数(mol)；T—反应时间(min)；m—固定化酶加量(g)，n—月桂酸丙酯、月桂酸的摩尔数(mol)。

2.固定化脂肪酶的酯化能力评价方法如下：

在下列反应体系中，固定化酶催化大豆脂肪酸与甲醇反应，达到平衡时生成的脂肪酸甲酯含量越高，代表固定化酶的酯化能力越强：无溶剂体系中，脂肪酸与甲醇摩尔比为1:1(共10g)，每克油添加25U固定化酶，30℃。

3.固定化脂肪酶的转酯化能力评价方法如下：

在下列反应体系中，固定化酶催化大豆油与甲醇反应，达到平衡时生成的脂肪酸甲酯含量越高，代表固定化酶的转酯化能力越强：无溶剂体系中，大豆油与甲醇摩尔比为1:1(共10g)，每克油添加25U固定化酶，30℃。

实施例1制备脂肪酶MAS1-H108A

脂肪酶MAS1-H108A的制备过程如下：

(1)菌种的活化：将MAS1-H108A-pPICZαA-PDI质粒线性化，电转至毕赤酵母X33感受态中，筛选出阳性菌株；将该毕赤酵母X33甘油菌划线于含有Zeocin的YPD固体平板，于30℃的培养箱中培养60-75h；

(2)一级种子液的制备：将得到的单菌落接种到已灭菌的含有50mL YPD液体培养基的锥形瓶中，再将锥形瓶置于温度为30℃和转速为200rpm的摇床中振荡培养18-24h，即得一级种子液；

(3)二级种子液的制备：将5mL一级种子液接入到已灭菌的100mL新鲜YPD液体培养基中，于转速为200rpm的30℃摇床中振荡培养24h；

(4)发酵罐发酵：将二级种子液按照10％接种量接到发酵罐培养基中，酵母生长阶段(即未开始诱导阶段)，其发酵条件为30-35℃，pH 5.0，600rpm；当菌体湿重达到180g/L左右时，葡萄糖消耗完，开始补加甲醇进行诱导表达，在温度为24℃和pH值为6.0的条件下，诱导培养6天，在整个发酵过程中的溶氧量均控制在20-60％之间；

(5)脂肪酶MAS1-H108A的获得：诱导结束后，将发酵液置于温度为4℃和转速为12000rpm的离心机中离心15min，用0.45μm的滤膜过滤所得的上清液，再用膜包浓缩，浓缩完后，分别利用橄榄油乳化法和考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度试剂盒测定发酵液的水解酶活和蛋白浓度，并将其保存于4℃冰箱中备用。

实施例2制备固定化脂肪酶MAS1-H108A

将脂肪酶MAS1-H108A与树脂D5753(孔径200-350nm，超大孔径，购自漂莱特公司)、Lifetech^TMECR1030M(孔径22-34nm，介孔树脂，购自漂莱特公司)、Lifetech^TMECR8285(孔径45-65nm，大孔树脂，购自漂莱特公司)、AMBERLITE^TMXAD^TM1180N(孔径30-55nm，介孔树脂，购自陶氏公司)、AB-8(孔径13-14nm，介孔树脂，购自天津津达树脂厂)固定化。发酵液经过离心、浓缩后，向100mL酶液中加入占20mL磷酸盐缓冲液，调节pH为7；并按照10,000U/g的总酶活/载体的比例加入载体，与酶液混合搅拌8h，采用布氏漏斗将固定化酶抽滤，使用磷酸盐缓冲液清洗固定化酶至滤液中无蛋白存在，沥干固定化酶并于40℃下干燥6h。即可制得固定化脂肪酶。

不同载体制备的固定化脂肪酶的酯化能力和转酯化能力如图1所示。脂肪酶MAS1-H108A与树脂D5753结合形成的固定化酶具有良好的酯化和转酯化能力，并明显高于由其他孔径较小的树脂形成的固定化酶。

实施例3使用树脂D5753与不同脂肪酶制备固定化酶

选取5种脂肪酶：脂肪酶MAS1-H108A(简写为MAS1)、CALB(来源于Candidaantarctica)、Eversa Transform 2.0(简写为ET)、RML(来源于Rhizomucor miehie)、TLL(来源于Thermomyces lanuginosus)，与树脂D5753(孔径200-350nm，超大孔径)结合制备5种固定化酶。固定化方法为酶液中加入20％磷酸盐缓冲液，调节pH为8；并按照10,000U/g的总酶活/载体的比例加入载体，与酶液混合搅拌8h，采用布氏漏斗将固定化酶抽滤，使用磷酸盐缓冲液清洗固定化酶至滤液中无蛋白存在，沥干固定化酶并于40℃下干燥6h。即可制得固定化脂肪酶。

五种固定化脂肪酶的酯化能力和转酯化能力如图2所示。与其他脂肪酶相比，脂肪酶MAS1-H108A与树脂D5753所制备的固定化酶具有突出的酯化能力和转酯化能力，并明显高于由其他来源的脂肪酶制备的固定化酶。

实施例4由树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶的有机溶剂耐受性

测定由树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶在有机溶剂中的稳定性时，将固定化酶放入pH 7的磷酸盐缓冲液中，加入甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮，使有机溶剂终浓度为50％(v/v)，置于37℃孵育2h，并测定固定化酶的酯化活力。有机溶剂对该固定化酶活力的影响用相对酶活力表示，以未加入有机溶剂的固定化酶测定的酶活力定为100％，结果如图3所示。该固定化酶对甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮均表现出良好的耐受性。

实施例5不同温度下，由树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化潲水油与甲醇反应制备生物柴油

以潲水油为原料油，分别选取20、25、30、35、40、45、50、55℃，使用固定化酶催化原料油与甲醇反应制备生物柴油：油与甲醇共10g，原料油与甲醇摩尔比为1:2.5，每克油添加25U固定化酶，反应6h。反应结果如图4，20-55℃下，均可将潲水油高效转换为生物柴油，脂肪酸甲酯含量高于95％，酸价低于2mg/g，其中25-45℃的范围内，酸价低于1mg/g。

实施例6树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化潲水油制备生物柴油：1kg级放大反应和批次反应

以潲水油为原料，使用固定化酶催化原料油与甲醇反应制备生物柴油：油与甲醇共1kg，原料油与甲醇摩尔比为1:3，每克油添加25U固定化酶，35℃，反应6h。每批反应结束后将固定化酶过滤出，并倒回原反应器，加入原料继续反应。反应结果如图5所示，在1kg规格的酶促反应体系中，反应20批次，固定化酶可以稳定、高效的将潲水油转换为生物柴油，脂肪酸甲酯含量为95-98％，酸价低于2mg/g。

实施例7树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化大豆油脱臭馏出物制备生物柴油

以大豆油脱臭馏出物为原料油，使用固定化酶催化原料油与甲醇反应制备生物柴油：油与甲醇共10g，原料油与甲醇摩尔比为1:2.5，每克油添加25U固定化酶，40℃，反应6h。反应结果为：脂肪酸甲酯含量为96.9％，酸价为1.2mg/g。

实施例8树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化地沟油制备生物柴油

以地沟油为原料油，使用固定化酶催化原料油与甲醇反应制备生物柴油：油与甲醇共10g，原料油与甲醇摩尔比为1:2.5，每克油添加25U固定化酶，35℃，反应6h。反应结果为：脂肪酸甲酯含量为97.5％，酸价为0.87mg/g。

实施例9树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化棕榈油制备生物柴油

以棕榈油为原料油，使用固定化酶催化原料油与甲醇反应制备生物柴油：油与甲醇共10g，原料油与甲醇摩尔比为1:2.5，每克油添加25U固定化酶，50℃，反应6h。反应结果为：脂肪酸甲酯含量为94.7％，酸价为2.3mg/g。

实施例10树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化微藻油脂制备生物柴油

以微藻油脂为原料油，使用固定化酶催化原料油与甲醇反应制备生物柴油：油与甲醇共10g，原料油与甲醇摩尔比为1:3，每克油添加25U固定化酶，25℃，反应6h。反应结果为：脂肪酸甲酯含量为97％，酸价为0.5mg/g。

实施例11树脂D5753与脂肪酶MAS1-H153A构建的固定化酶催化猪油制备生物柴油

以猪油为原料油，使用固定化酶催化原料油与甲醇反应制备生物柴油：油与甲醇共10g，原料油与甲醇摩尔比为1:2.5，每克油添加25U固定化酶，45℃，反应6h。反应结果为：脂肪酸甲酯含量为96.7％，酸价为0.7mg/g。

实施例12树脂D5753与脂肪酶MAS1-H108A构建的固定化酶催化潲水油分别与甲醇、乙醇反应制备脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯

以潲水油为原料油，使用固定化酶催化原料油分别与甲醇、乙醇反应制备脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯，结果如图6所示：油与甲醇共10g，原料油与甲醇、乙醇摩尔比均为1:1.5，每克油添加25U固定化酶，35℃，反应12h。反应结果为：该固定化酶催化甲醇解反应中，反应6h脂肪酸甲酯含量为95.1％，反应10h脂肪酸甲酯含量为98.1％，酸价为0.85mg/g；该固定化酶催化乙醇解反应中，反应6h脂肪酸乙酯含量为89.27％，反应10h脂肪酸乙酯含量为92.7％，酸价为3.7mg/g。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种固定化脂肪酶及其制备方法和在生物柴油中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Thr Ser Arg Gly

1 5 10 15

Trp Asn Asp Tyr Ser Cys Lys Pro Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val

20 25 30

Val Leu Val His Gly Thr Phe Gly Asn Ser Ile Asp Asn Trp Leu Val

35 40 45

Leu Ala Pro Tyr Leu Val Asn Arg Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp

50 55 60

Tyr Gly Gln Leu Pro Gly Val Pro Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Ile

65 70 75 80

Asp Lys Ser Ala Glu Gln Leu Asp Val Phe Val Asp Lys Val Leu Asp

85 90 95

Ala Thr Gly Ala Pro Lys Ala Asp Leu Val Gly Ala Ser Gln Gly Gly

100 105 110

Met Met Pro Asn Tyr Tyr Leu Lys Phe Leu Gly Gly Ala Asp Lys Val

115 120 125

Asn Ala Leu Val Gly Ile Ala Pro Asp Asn His Gly Thr Thr Leu Leu

130 135 140

Gly Leu Thr Lys Leu Leu Pro Phe Phe Pro Gly Val Glu Lys Phe Ile

145 150 155 160

Ser Asp Asn Thr Pro Gly Leu Ala Asp Gln Val Ala Gly Ser Pro Phe

165 170 175

Ile Thr Lys Leu Thr Ala Gly Gly Asp Thr Val Pro Gly Val Arg Tyr

180 185 190

Thr Val Ile Ala Thr Lys Tyr Asp Gln Val Val Thr Pro Tyr Arg Thr

195 200 205

Gln Tyr Leu Asp Gly Pro Asn Val Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu

210 215 220

Cys Pro Val Asp Leu Ser Glu His Val Ala Ile Gly Thr Ile Asp Arg

225 230 235 240

Ile Ala Phe His Glu Val Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ala Arg Ala Thr

245 250 255

Pro Thr Thr Cys Ala Ser Val Ile Gly

260 265

Claims

1.一种固定化脂肪酶在制备生物柴油中的应用，其特征在于，将脂肪酶MAS1-H108A与载体固定化，所述脂肪酶MAS1-H108A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述载体为疏水非极性树脂D5753，其孔径≥200 nm；

以所述固定化脂肪酶为催化剂，原料油与短链醇直接进行反应，原料油与短链醇的摩尔比为1:1-1:8，酶添加量为15-60 U/g底物，反应温度为20-55℃，反应时间4-10 h，制得生物柴油。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用物理吸附法制备固定化脂肪酶。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备脂肪酶MAS1-H108A酶液；

（2）酶液经过离心、浓缩后，向酶液中加入磷酸盐缓冲液；加入载体，与酶液混合搅拌进行固定化，取出固定化载体，将固定化酶抽滤，使用磷酸盐缓冲液清洗固定化酶至滤液中无蛋白存在，经干燥，即制得固定化脂肪酶。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酶液按照10,000- 50,000U/g的总酶活/载体的比例添加；所述固定化的时间为6-12 h。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述酶液的体积浓缩5-20倍，得到水解酶活为5,000 - 50,000 U/mL的酶液，再加入占酶液体积10-200 % v/v的磷酸盐缓冲液，调节pH为6-9。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述载体还进行如下预处理：将载体依次用乙醇、盐酸、氢氧化钠和缓冲液浸泡，以去除树脂大孔中的气泡和残留物；所述干燥是30-60℃下干燥2-8 h。

7.根据权利要求1或2或3或4所述的应用，其特征在于，所述反应温度为25-50℃；所述短链醇为甲醇、乙醇。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应温度35-40℃。