CN105886492A - 一种固定化脂肪酶及其制备方法和在催化合成甘油酯型pufa中的应用 - Google Patents

一种固定化脂肪酶及其制备方法和在催化合成甘油酯型pufa中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化脂肪酶及其制备方法和在催化合成甘油酯型PUFA中的应用，所述脂肪酶为来源于放线菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化载体为XAD1180树脂。其制备方法，包括以下几个步骤：(1)将XAD1180树脂依次用乙醇、酸和碱浸泡，以去除树脂大孔中的气泡和残留物；(2)在pH 6.0‑9.0的磷酸盐缓冲液中，将MAS1脂肪酶与处理好的XAD1180树脂按25～150mg/g树脂比例混合静置，即制得固定化脂肪酶。本发明使用的固定化脂肪酶，相对于游离脂肪酶具有更佳稳定性，可重复性，节约了生产成本；同时酯化效率到达99.31％，而PUFA甘油三酯含量达到92.26％。

Description

一种固定化脂肪酶及其制备方法和在催化合成甘油酯型PUFA中的应用
技术领域
本发明涉及一种固定化脂肪酶的制备及其在催化合成高含量甘油酯型PUFA中的应用技术。
背景技术
多不饱和脂肪酸(PUFA)一般是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，主要来源于海产鱼油及植物油脂。目前研究表明具有重要生理活性的PUFA主要有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(AA)、十八碳四烯酸(SDA)、α-亚麻酸(ALA)、γ-亚麻酸(GLA)等。其具有降低人体血液粘稠度，改善血液微循环，降低血中胆固醇和甘油三酯等生理调节功能，目前日益受到关注。
甘油酯型的PUFA相对于其他形式PUFA(主要是乙酯型和游离脂肪酸型)具有稳定性强容易被人体吸收，是保健品和药品的最佳产品形式，具有更高的商业价值。相对于化学法合成甘油酯型的PUFA，酶法催化合成方法具有反应条件温和，特异强及环境友好等优点。但目前文献报道的大部分脂肪酶均表现出Sn-1,3位特异性脂肪酶，鲜有非特异性脂肪酶。在实际应用中，由于产物的反馈抑制作用导致PUFA酰基供体的转化率不高、甘油酯中甘油三酯含量低的问题。虽然可以通过延长反应时间或者提高酶添加量来提高产物的量，但会导致生产成本的提高。
发明内容
针对现有甘油酯型PUFA制备方法酶催化效率低、底物转化率不高、甘油酯中甘油三酯含量低的问题，本发明提供了一种固定化脂肪酶的制备及其在催化合成高含量甘油酯型PUFA中的应用技术。本发明中所用的放线菌Streptomyces的脂肪酶MAS1是一种位置非特异性的脂肪酶，而其固定化形式，提高了它的使用频率和寿命，反应的酯化率达到99.31％，甘油三酯含量为92.26％，且结合到甘油三酯中PUFA含量达到92.26％。
本发明为了达到上述目的，通过以下技术方案实现：
一种固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶为来源于放线菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化载体为XAD1180树脂。
所述固定化脂肪酶的制备方法，包括以下几个步骤：
(1)将XAD1180树脂依次用乙醇、酸和碱浸泡，以去除树脂大孔中的气泡和残留物；
(2)在pH 6.0-9.0的磷酸盐缓冲液中，将MAS1脂肪酶与处理好的XAD1180树脂按25～150mg/g树脂比例混合静置，即制得固定化脂肪酶。
所述MAS1脂肪酶与XAD1180树脂按50-75mg/g树脂比例混合。
所述磷酸盐缓冲液pH为8.0。
所述MAS1脂肪酶与磷酸盐缓冲液的体积比为1：1。
步骤(1)中每一步浸泡后均用水反复清洗至中性后，才进行下一步的处理。
所述乙醇、酸和碱分别为95％乙醇，5％盐酸和2％氢氧化钠，浸泡时间分别为24小时，4小时，4小时。
所述固定化脂肪酶在催化合成甘油酯型PUFA中的应用。具体为，利用所述固定化脂肪酶为催化剂，PUFA的酰基供体与甘油进行反应，甘油与PUFA的摩尔比为1：(1-5)，酶添加量为112.5-225U/g底物，反应温度为50-70℃，反应时间0-24h。
优选地，所述反应温度为65℃，最佳酶添加量为150U/g底物，甘油与PUFA的最佳摩尔比为1:3。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明使用的脂肪酶MAS1为非位置特异性脂肪酶，避免了普通脂肪酶在催化反应中所遇到的转化效率不高、PUFA甘油三酯含量低等问题，其酯化效率达到99.31％，PUFA甘油三酯含量达到92.26％，而常用Novozym 435在相同条件下酯化效率为82.16％，甘油三酯含量只有47.26％。
(2)本发明使用的固定化脂肪酶，相对于游离脂肪酶具有更佳稳定性，可重复性，节约了生产成本。
附图说明
图1为起始pH值(a)和酶/树脂比率(b)对酶固定化效率的影响图。
图2为固定化MAS1脂肪酶催化反应效果图，(a)温度的影响，(b)加酶量的影响，(c)甘油与PUFA摩尔比的影响。
图3为固定化MAS1脂肪酶(a)与Novozym435(b)催化合成PUFA甘油酯效率比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
固定化脂肪酶MAS1的制备
1.1固定化树脂的前处理及筛选
10g XAD1180/DA201/HP20/HP2MGL/AB8五种大孔吸附树脂分别依次用30mL 95％乙醇，5％盐酸和2％氢氧化钠各处理24h,4h,4h，每步处理后，上清液滤掉，用蒸馏水反复多次洗，直到上清液的pH值为7.0为止，才进行下一步的处理，最后树脂用20mmol/L不同pH值的缓冲液浸泡4h,将滤干后的树脂置于4℃冰箱中保存备用。用乙醇和酸碱浸泡树脂的目的分别是为了赶出大孔中的气泡和除去大孔中残留的单体和化合物。
将脂肪酶MAS1酶液50mg/g树脂、等体积的20mM pH8磷酸盐缓冲液和用相应pH值预处理后的树脂按照一定比例混匀，200rpm，30℃水浴振荡吸附一定时间，抽滤分离载体和上清液，并用相应pH值的缓冲液冲洗固定化酶，再将洗净后的固定化酶于40℃真空干燥8h后，分别测定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，结果如表1所示。蛋白吸附量的测定采用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)。固定化脂肪酶MAS1的酯化活力的测定参照诺维信标准分析方法进行。
表1固定化树脂的筛选
由表1可知，以XAD1180树脂为载体的固定化脂肪酶具有最大的蛋白吸附量(106.08mg/g)、最高的酯化酶活(2510.06U/g)和比酶活(～23.66U/mg蛋白)，接着是以DA201树脂为载体的固定化酶表现出的特性仅次于XAD1180树脂。虽然AB-8树脂对脂肪酶MAS1的最大吸附量只有67.93mg/g，但其酯化酶活和比酶活与HP20和HP2MGL树脂接近。说明低蛋白吸附量并不意味着低酯化酶活和比酶活。因此，在后续的实验中，选择XAD1180树脂作为固定化MAS1脂肪酶的最佳载体。
1.2最适固定化缓冲液pH值
固定化条件为：MAS1脂肪酶/载体比为50mg/g树脂，酶液与20mmol/LpH6.0-9.0的磷酸盐缓冲液体积比为1：1，200rpm,30℃水浴振荡吸附一定时间，抽滤分离载体和上清液，并用相应pH值的缓冲液冲洗固定化酶，再将洗净后的固定化酶于40℃真空干燥8h后，分别测定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，结果如图1所示。
从图1a可以看出，固定化酶的蛋白吸附量在pH6-9范围内没有明显的变化。固定化酶的酯化活性和比酶活均随着pH值的增加，先上升后下降，在pH8时，固定化MAS1获得最大的酯化活力(2712.96U/g)和比活力(26.35U/mg)。在固定化过程中，pH值的变化会影响酶的构象，或促进酶的沉淀(等电点)。因此，选择pH8为脂肪酶MAS1的最佳固定化缓冲液pH值。
1.3最佳酶/载体比的确定
固定化条件为：MAS1脂肪酶/载体比为25，50，75，100,150mg/g树脂，酶液与20mmol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液体积比为1：1，200rpm，30℃水浴振荡吸附一定时间，抽滤分离载体和上清液，并用pH8.0的缓冲液冲洗固定化酶，再将洗净后的固定化酶于40℃真空干燥8h后，分别测定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，结果如图1所示。
由图1b可知，随着酶/载体比的增加，固定化酶的蛋白吸附量逐渐增加，而其酯化活力和比酶活的变化趋势则不一样。当酶/载体比从25mg/g增加到75mg/g时，固定化酶的酯化活性和比酶活均逐渐增加；当酶/载体比为75mg/g树脂时，酯化酶活和比酶活均达到最大值，分别为2731.67U/g和27.34U/mg；然而，随着酶/载体比的进一步增加，酯化活性和比酶活均下降。可能是因为当酶添加量过高时，酶分子在树脂表面发生了多层吸附，产生了一定的空间位组，使底物分子与酶活性中心的定位和接近受到影响，对酶活性产生一定的抑制作用，从而导致固定化酶的酯化活性和比活力下降。因此，树脂XAD1180吸附脂肪酶MAS1的最适酶/载体比为75mg/g。
综述所述，固定化脂肪酶MAS1选择树脂XAD1180为最适载体时的最佳固定化条件为：缓冲液pH＝8，最适酶/载体比为75mg/g。
实施例2
固定化脂肪酶MAS1催化酯化反应合成富含n-3PUFA的甘油三酯
10g底物(甘油与PUFA摩尔比为1:1,1:2,1:3,1:4,1:5)置于250mL具塞三角瓶中，按照酶活单位添加一定量的脂肪酶(750U,1125U,1500U,1875U,2250U)，置于不同温度(50℃,55℃,60℃,65℃,70℃)的恒温振荡器中抽真空反应24h，转速为200rpm，于不同的反应时间取样，HPLC分析反应混合物的组成，GC分析TAG的脂肪酸组成，并与相同条件下相同酶活单位的Novozym 435催化的酯化反应作对比。
由图2(a)可知，在甘油与n-3PUFA的摩尔比为1:3，750U固定化酶的条件下，当温度在50-65℃的范围内，固定化脂肪酶MAS1催化甘油与n-3PUFA反应的酯化率和TAG含量均随着温度的增加而逐渐增加；在温度为65℃时，酯化率和TAG含量均获得最大值，分别为75.60％和65.29％；再提高温度，酯化率和TAG含量反而下降了。
由图2(b)可知，在甘油与n-3PUFA的摩尔比为1:3，温度为65℃的条件下，当酶添加量从750U增加到1500U时，酯化率从75.60％增加到95.01％；继续增加酶添加量，酯化率稍微下降。TAG含量的变化趋势与酯化率相同，此时TAG含量为89.37％。
由图2(c)可知，在1500固定化酶和温度为65℃的条件下，随着甘油含量的增加，酯化率和TAG含量逐渐增加；当甘油与n-3PUFA的摩尔比为1:3时，TAG含量获得最大值，为90.84％，此时酯化率为98.77％。继续增加甘油的含量，酯化率变化不明显，TAG含量下降，此时甘油与n-3PUFA的摩尔比为1:1，酯化率达到最大，为99.59％。
综上所述，固定化脂肪酶MAS1催化甘油和n-3PUFA反应的最优条件为：甘油：n-3PUFA＝1:3(mol/mol)，65℃,1500U固定化酶。
在甘油与n-3PUFA的摩尔比为1:3，1580U固定化脂肪酶MAS1，温度为65℃的条件下，固定化MAS1催化甘油与n-3PUFA反应24h，用HPLC分析不同取样时间点的甘油酯组成，GC分析TAG中各种脂肪酸组成，并与相同条件下相同酶活单位的Novozym 435催化的酯化反应作对比，结果如图3所示。
由图3可知，在相同的反应条件下，固定化MAS1和目前文献报道催化甘油与PUFA反应最好的商品化酶Novozym435相比，固定化MAS1(a)催化该反应的酯化率达到99.31％，基本可实现n-3PUFA的完全转化，其中TAG含量高达92.26％，DAG含量为6.8％，MAG含量为0.23％，接近天然鱼油的甘油酯组成。而Novozym435(b)催化该反应酯化率仅为82.16％，与文献报道基本一致，明显低于固定化MAS1，其中TAG含量仅为47.26％，DAG含量为33.31％，MAG含量为1.41％。

Claims (10)

1.一种固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶为来源于放线菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化载体为XAD1180树脂。
2.权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)将XAD1180树脂依次用乙醇、酸和碱浸泡，以去除树脂大孔中的气泡和残留物；
(2)在pH 6.0-9.0的磷酸盐缓冲液中，将MAS1脂肪酶与处理好的XAD1180树脂按25～150mg/g树脂比例混合静置，即制得固定化脂肪酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述MAS1脂肪酶与XAD1180树脂按50-75mg/g树脂比例混合。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液pH为8.0。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述MAS1脂肪酶与磷酸盐缓冲液的体积比为1：1。
6.根据权利要求2或3或4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中每一步浸泡后均用水反复清洗至中性后，才进行下一步的处理。
7.根据权利要求2或3或4或5所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇、酸和碱分别为95％乙醇，5％盐酸和2％氢氧化钠，浸泡时间分别为24小时，4小时，4小时。
8.权利要求1所述固定化脂肪酶在催化合成甘油酯型PUFA中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用所述固定化脂肪酶为催化剂，PUFA的酰基供体与甘油进行反应，甘油与PUFA的摩尔比为1：(1-5)，酶添加量为112.5-225U/g底物，反应温度为50-70℃，反应时间0-24h。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述反应温度为65℃，酶添加量为150U/g底物，甘油与PUFA的摩尔比为1:3。
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