CN1522301A - 含有含多不饱和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪的生产方法 - Google Patents

含有含多不饱和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含有甘油三酯的油或脂肪的生产方法，其中所说的甘油三酯的第1和第3位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有多不饱和脂肪酸，该方法包括：让可特异性作用于甘油三酯1和3－位酯键的脂酶对中链脂肪酸和原料油或脂肪的混合物进行作用，其中所说的脂酶固定在孔径为约100埃或更大的离子交换树脂载体上，所说的原料油或脂肪含有选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸中的至少一种多不饱和脂肪酸，但不含ω3系列多不饱和脂肪酸；本发明还涉及通过该方法获得的油或脂肪或甘油三酯以及这种油或脂肪或甘油三酯在食品、饲料和药物组合物中的用途。

Description

含有含多不饱和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪的生产方法
发明背景
技术领域
本发明涉及含有甘油三酯的油或脂肪，其中在所述甘油三酯的1和3位连接有中链脂肪酸，并且在甘油三酯的2位连接有至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸，本发明还涉及所述油或脂肪的生产方法以及含有这些油或脂肪的组合物。
背景技术
二十碳五烯酸(可称作“EPA”)和二十二碳六烯酸(可称作“DHA”)是具有许多生理学功能，例如对成人疾病如动脉硬化和血栓形成的预防效果；抗癌作用和增强学识获得的作用的ω3系列多不饱和脂肪酸，并且它们已经在用于特定保健用途的药物和食品中得到应用。然而，近来人们对除ω3系列多不饱和脂肪酸以外的其它多不饱和脂肪酸(例如，ω6系列和ω9系列多不饱和脂肪酸)的生理学功能的兴趣日益增加。
在人体内通过生物合成途径合成的多不饱和脂肪酸由两种代表性的系列组成，即ω3系列和ω6系列(ω表示从脂肪酸的甲基末端数第一个双键所处位置的碳原子数)。ω6系列多不饱和脂肪酸的已知实例包括亚油酸、γ-亚麻酸、双高-γ-亚麻酸和花生四烯酸。
花生四烯酸占组成重要器官(如血和肝)的脂肪酸的约10％(例如，在人血磷脂类的脂肪酸组成中，花生四烯酸占11％、二十碳五烯酸占1％并且二十二碳六烯酸占3％)，它作为细胞膜的主要构成成分参与调节膜的流动性，并且显示与人体代谢有关的各种功能。另一方面，它还起作为前列腺素的直接前体的重要作用。近来，人们把注意力特别集中在了花生四烯酸作为婴儿营养的作用，其可以作为作用于神经的内源性大麻酯(如，2-花生四烯酰单甘油和anandamide)的脂肪酸成分。虽然人类不能合成亚油酸，但在摄入植物油后，碳链的不饱和及增长经过重复，可以转化成γ-亚麻酸、双高-γ-亚麻酸和花生四烯酸。因此，如果食用了富含亚油酸的食物，在正常情况下可以合成足够量的花生四烯酸。然而，在患有成人疾病的患者、易患成人疾病的人、婴儿和老年人中，由于参与生物合成的酶的活性降低，由此导致花生四烯酸缺乏，优选直接以复合脂肪酸的油和脂肪(甘油三酯)的形式直接摄取花生四烯酸。
虽然所摄取的油和脂肪(甘油三酯)当进入小肠时一般是通过胰脂酶来水解的，但这种胰脂酶对1、3位是特异性的，能够将甘油三酯的1、3位切断，形成两个分子的游离脂肪酸，同时形成一个分子的2-单酰甘油(可称作“2-MG”)。由于这种2-MG极易溶于胆汁酸并且具有高度的吸收性，因而2-位脂肪酸一般认为是容易吸收的。除此之外，当2-MG被溶解于胆汁酸中时，它通过增加游离脂肪酸的吸收而起表面活性剂的作用。随后，游离脂肪酸和2-MG与胆固醇和磷脂类一起生物合成胆汁酸复合微胶粒，然后掺入小肠的上皮细胞中并在其中发生三酰甘油的再合成，之后以乳糜微粒的形式最终释放至淋巴中。
然而，需要花生四烯酸的人同时还具有弱的胰脂酶活性(例如，已知胰脂酶活性还随年龄的增大而降低)，而胰脂酶的活性与油/脂肪(甘油三酯)吸收的第一阶段有关，因此，这些人不能从含有花生四烯酸的食物及油和脂肪(包括微生物发酵的油和脂肪形式的含花生四烯酸的油和脂肪)中吸收足够量的花生四烯酸。
因此，其中1、3位连接有中链脂肪酸(其容易被胰脂酶所水解)并且第2位连接有花生四烯酸的甘油三酯，对需要花生四烯酸的人来说是最佳的油和脂肪(甘油三酯)。日本未审专利申请8-214891公开了一种含有甘油三酯的油或脂肪的生产方法，其中所说的甘油三酯含有多不饱和脂肪酸，其1、3-位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有多不饱和脂肪酸，但其唯一具体的描述是第2位连接有EPA或DHA的甘油三酯的生产方法，而没有具体公开第2位连接有花生四烯酸的甘油三酯的生产方法。
日本未审专利申请2000-270885公开了一种通过让脂酶对甘油三酯1、3-位进行特异性作用来生产结构脂质的方法，其中连接至目标甘油三酯第1和3-位的脂肪酸的碳原子数为12或更少，并且连接至第2-位的脂肪酸的90％或更多是多不饱和脂肪酸。这里，允许被脂酶作用的油或脂肪是，例如，其中98％或更多是EPA甘油三酯的甘油三酯，并且该甘油三酯是通过让非位置特异性脂酶对甘油和多不饱和脂肪酸或其低级醇酯进行作用同时脱水而合成的。然而，在上述方法中，需要高纯度的多不饱和脂肪酸或其低级醇酯而不是混合物，但目前还难以廉价地获得它们，因而通过前述方法来生产目标产物并不现实。
另一方面，已知一种通过发酵廉价地生产含有多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)的方法。Yuji Shimada(发酵和生物工程杂志(Journal ofFermentation and Bioengineering)，83，321-327(1997)，“德列马根霉(Rhizopus delemar)脂酶在酸解中的脂肪酸特异性”公开了一种使用这种微生物油来生产在第1和第3位连接的是辛酸的甘油三酯的方法，在该方法中，将含有25wt％花生四烯酸的微生物油(同时以可用作底物)通过1、3-位特异型脂酶发酵。然而，由于在这种微生物油中，花生四烯酸与甘油三酯相连接的位置是随机的，即使通过酶将第1和第3位的脂肪酸用辛酸差不多完全取代，所得油中1，3-辛酰-2-花生四烯酰-甘油(可称作“8A8”)的比例最大程度也不会超过原料油中2-位所连接的花生四烯酸的比例。在此情形中，与第2-位连接的花生四烯酸的比例至多25wt％，并且实际上，由于还存在其中在多个位置连接有花生四烯酸的甘油三酯，因此连接至第2-位的花生四烯酸的比例为25wt％或更少。根据Shimada等(发酵和生物工程杂志，83，321-327(1997))的报道，虽然将所得甘油三酯通过高效液相色谱进行了分析，但由于8A8、1，3-辛酰-γ-亚麻酰-甘油(可称作“8G8”)和1，3-辛酰-2-双高-γ-亚麻酰-甘油(可称作“8D8”)的保留时间是相同的，因而不能准确测得甘油三酯中8A8的比例。然而，由于8A8、8G8和8D8的总和为约20mol％，所得的甘油三酯在含有25mol％以上的8A8方面不能令人满意。
在按此方式使用微生物油作为原料油的情形中，由于花生四烯酸与甘油三酯相连接的位置是随机的，因而就必须使用具有较高含量花生四烯酸的甘油三酯作为原料，以便增加目标8A8的比例。
然而，1、3-位特异型脂酶对脂肪酸的反应活性随着碳链长度的增长以及双键数量的增加而越低。此外，当讨论脂酶的反应活性时，双键的位置、即从羧基开始计数，插入双键的碳原子的位置，也是重要的考虑因素。例如，虽然脂酶对α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)显出高度的反应活性，但对γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳二烯酸)显出极低的反应活性；并且虽然对DPAω3系列(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)显出高度的反应活性，但对DPA ω6系列(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)显出极低的反应活性。也就是说，对具有18个或更多个碳原子的ω6系列多不饱和脂肪酸而言，脂酶存在对具有3个或更多个双键的不饱和脂肪酸显出低反应活性的问题，以及对ω9系列多不饱和脂肪酸而言，脂酶存在对具有2个或更多个双键的不饱和脂肪酸显出低反应活性的问题。因此，为获得含有较高浓度目标甘油三酯的油或脂肪(其中在甘油三酯的第1、3-位连接有中链脂肪酸，并且在甘油三酯的第2位连接有至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸)，就必须使用含有较高浓度的至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸的油或脂肪作为原料油或脂肪。然而，这种油或脂肪的含量越高，反应活性就越低，并且反应产率越差。这种反应产率的降低导致形成大量未反应的甘油三酯(原料甘油三酯和其中1、3-位的脂肪酸中只有一个变成中链脂肪酸的甘油三酯)，其结果是，目标甘油三酯的比例不能得到增加。因此，强烈需要开发一种增加目标甘油三酯比例的切合实际的方法。
预期ω6系列多不饱和脂肪酸--双高-γ-亚麻酸--可以显示出I型前列腺素前体的作用、抗血栓形成作用、降血压作用、抗运动障碍作用、抗炎作用、延迟的变态反应抑制作用、皮肤防护作用和抗癌作用。因此，虽然同样需要开发在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有双高-γ-亚麻酸的甘油三酯，但具有高含量双高-γ-亚麻酸的油和脂肪(甘油三酯)是未知的，并且还没有找到关于生产这种甘油三酯的方法。
已知ω9系列多不饱和脂肪酸，如5，8，11-二十碳三烯酸(20∶3 ω9系列，可称作Mead酸)和8，11-二十碳二烯酸(20∶2 ω9系列)作为结构脂肪酸之一而存在于缺乏基本脂肪酸的动物组织中。然而，它们仅以少量存在，因而它们的分离和纯化极其困难。这些多不饱和脂肪酸能够成为体内白三烯3族的前体，并且它们的生理学活性是很有前景的靶点，据报道的实例包括抗炎、抗过敏和抗风湿作用(日本未审专利申请7-41421)。因此，虽然同样需要开发在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有ω9系列多不饱和脂肪酸的甘油三酯，但具有高含量ω9系列多不饱和脂肪酸的油和脂肪(甘油三酯)是未知的，并且还没有找到关于生产这种甘油三酯的方法。
发明公开
本发明的目的是提供一种含有甘油三酯的油或脂肪，其中在所述甘油三酯的第1、3-位连接有中链脂肪酸，并且在所述甘油三酯的第2位连接有至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸，本发明还提供所述油和脂肪的生产方法以及含有这些油或脂肪的组合物。
本发明的发明人首先针对含有40wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯)的工业化生产方法进行了深入研究，以便达到生产其中在3位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有花生四烯酸的甘油三酯的含量为25mol％或更多的油或脂肪的目的，结果，通过控制培养基中碳源的浓度，意想不到地获得了含有45wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯)。
此外，为达到生产含有高含量的在第1、3-位连接有中链脂肪酸并且在第2位连接有双高-γ-亚麻酸或ω9系列多不饱和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪的目的，本发明的发明人进行了深入的研究，结果，通过使用产花生四烯酸微生物的突变株，获得了含有高含量双高-γ-亚麻酸或ω9系列多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)。
此外，为了改进酶的反应效率，本发明的发明人进行了深入的研究，结果，通过提高反应温度，意想不到地成功地改进了反应效率。
此外，本发明的发明人通过选择固定载体，成功地获得了具有高度热稳定性的固定化酶，使得在高反应温度下使用酶成为可能，由此导致本发明的完成。此外，由这些方法获得的实验室结果可以容易地扩大规模，从而供适宜于前述油或脂肪工业化生产的方法。
因此，本发明提供了一种含有甘油三酯的油或脂肪，其中在所述甘油三酯的第1-和第3-位连接有中链脂肪酸，并且在所述甘油三酯的第2位连接有至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸，本发明还提供了所述油和脂肪的生产方法以及含有这些油或脂肪的组合物。
根据本发明，可以生产例如，在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有花生四烯酸的甘油三酯的含量为25mol％或更多的油或脂肪；含有在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有双高-γ-亚麻酸的甘油三酯的油或脂肪；或者含有在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有ω9系列多不饱和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪，由于这些油和脂肪具有许多生理学功能，它们可以广泛用于特定保健用途的药物、食品等等，并且在工业上是极其有用的。
发明的最佳实施方式
本发明涉及含有甘油三酯的油或脂肪的生产方法，其中在所述甘油三酯的第1、3-位连接有中链脂肪酸并且在第2位连接有多不饱和脂肪酸，该方法通过将构成含有多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)的1、3-位的长链脂肪酸酯交换成中链脂肪酸来完成，本发明还涉及含有在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有多不饱和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪。
本发明中，为防止伴随用作原料的油或脂肪(甘油三酯)中多不饱和脂肪酸比例的增加而出现的未反应的油或脂肪(原料甘油三酯和其中1、3-位中仅有一个脂肪酸转化成了中链脂肪酸的甘油三酯)的增加所引起的反应产率的降低，酶反应的温度应当为30-50℃，并且优选40-50℃。
可以在本发明中使用的、可特异性地作用于甘油三酯1、3-位酯键的脂酶的实例包括由属于根霉属(Rhizopus)、根毛霉属(Rhizomucor)和曲霉属(Aspergillus)的微生物生产的脂酶以及猪胰脂酶。这些脂酶也可使用可商购获得的产品。可商购获得的产品的实例包括，但不限于， 德列马根霉 (Rhizopus delemar)的脂酶(Tanabe Seiyaku)、米赫根毛酶( Rhizomucor miehei)的脂酶(Novo Nordisk，Lipozyme IM)和 墨曲霉(Aspergillus niger)的脂酶(Amano Pharmaceutical，Lipase A)，以及可以使用的任何脂酶，前提条件是它对1、3-位是特异性的。
前述的脂酶是以固定在固定载体上的脂酶的形式使用，为的是给酶赋予耐热性，以便允许反应温度达到30℃或更高并且优选40℃或更高，从而提高反应效率。虽然硅藻土或陶瓷都曾用作固定载体，但在本发明中，通过对适宜于赋予耐热性的固定载体进行研究，证实孔径为约100埃或更大的多孔离子交换树脂是有效的。
本发明的发明人是通过下述方法来选择前述的固定载体的。即，使用离子交换树脂来纯化蛋白质，将蛋白质分离所基于的原理是以离子键合为基础来吸附和解吸蛋白质。通过使用这个原理，本发明的发明人推断认为可以通过将酶吸附至离子交换树脂来固定蛋白质形式的酶。亲水性树脂载体，即多糖型载体如纤维素或琼脂糖，常用于蛋白质的纯化。然而，这种亲水性能够阻碍油或脂肪的酯交换。因此，经过深入研究，结果断定被认为具有优越亲液性的聚合物型或陶瓷型树脂适合这种选择。这些离子交换树脂主要被用于水处理，以前还未曾用于酶的吸附纯化。接下来，离子交换树脂被分成阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。当将目标脂酶的基团吸附在这两种离子交换树脂上时，发现它们牢固地吸附在阳离子交换树脂上。此外，当将酶吸附至聚合物型阳离子交换树脂上时，聚合物型的离子交换树脂可以比凝胶型离子交换树脂吸附更多的酶，由此可以固定具有高活性的酶。这种聚合物型树脂的孔径可以随着由苯乙烯、乙烯基苯、苯酚、丙烯酸类、增塑剂等等组成的原料的组合而改变。由于这些阳离子交换树脂包括弱碱类型和强碱类型，因而所显示的结果是使用代表性阳离子交换树脂所进行研究的结果。
将如下所示的含有40wt％花生四烯酸的微生物油(甘油三酯含量为95％或更多)与辛酸进行酶催化反应，并且在40℃下反应2天之后，根据甘油三酯中掺入的辛酸的量(mol％)比较酶活性程度。反应条件如下所示。
含花生四烯酸的油(SUNTGA40S) 1.33g
辛酸 2.66g
固定化酶 0.2g
在40℃下反应48小时，同时振动
(分析)
在反应完成之后，将反应液体与固定化酶分离，并且用己烷将反应液体萃取至碱性。将经过萃取的甘油三酯级分的一部分用甲醇钠甲基化，获得脂肪酸甲酯。将所得的脂肪酸甲酯通过气相色谱(GC)分析，测定辛酸甲酯的量。用作原料的含花生四烯酸的油中不含辛酸，通过酶活性掺入的辛酸可以通过GC来测定。按此方式，将酶活性表示为反应完成之后通过GC分析测得的辛酸比例的值(mol％)。
 固定化酶载体 类型 8∶0(辛酸)
 Dowex Marathon WBA 弱阳离子型，多孔的 50.9
 Dowex Marathon A 强阳离子型，凝胶 42.1
 SM-10 陶瓷 48.7
 Amberlite IRA904 强阳离子型，多孔的 33.5
 Diaion WA 10 弱阳离子型，凝胶 40.1
 Diaion WA 30 弱阳离子型，多孔的 49.8
在上表中，Dow Chemical的离子交换树脂当孔径为100-1000埃时定义为大孔性的，当孔径为100埃或更小时定义为凝胶。Mitsubishi Chemical将孔径为300埃或更大的离子交换树脂定义为大孔性的。因此，DowexMarathon WBA(商标名称，Dow Chemical)是孔径为100埃或更大的离子交换树脂。
当证实Dowex Marathon WBA(商标名称，Dow Chemical)的性能时，由于这种树脂显示出令人满意的结果，因此针对以下几个因素确认它是有效的。
1、它是孔径为100埃或更大的多孔树脂。
2、根据Dowex Marathon WBA(商标名称，Dow Chemical)和DowexMarathon A(商标名称，Dow Chemical)之间以及Diaion WA 10(商标名称，Mitsubishi Chemical)和Diaion WA 30(商标名称，Mitsubishi Chemical)之间的比较，多孔型的优点超过凝胶型的优点。
3、根据Dowex Marathon WBA(商标名称，Dow Chemical)和DowexMarathon A之间的比较，虽然固定化酶可以通过具有阳离子交换基团来制备，但当生产更优选的高度活性形式时，具有弱碱性阳离子交换基团优于具有强碱性基团。
4、由于Amberlite IRA904(商标名称，Rohm and Haas)的离子交换能力低于Dowex Marathon WBA(商标名称，Dow Chemical)，因此所得的活性更低。
基于这些因素，固定载体的优选形式不是凝胶，而是具有许多100埃或更大的孔的多孔(高度多孔性的)树脂，并且优选是具有弱碱性阳离子交换基团而不是强碱性基团、同时还具有高离子交换能力的载体。
此外，考虑到用于脂质的酶催化转化，这种载体优选具有亲液性能。由于酶反应在油或脂肪的内部发生，所以固定在孔内的酶也因为原料油或脂肪进入亲液性树脂而能够参与反应，由此增加了反应速率并且提高了反应效率。进而，由于在反应过程中对热敏感的酶与热接触的时间被缩短，以及由此导致酶寿命的延长，可以进一步说明这是提高生产率的一种适宜的方法。
前述的离子交换树脂仅仅是所举的实例，并且树脂是不断推陈出新的，在市场会出现更好的树脂。当这种改进类型的树脂变得可利用时，显然它的活性将会等于或大于Dowex Marathon WBA(商标名称，DowChemical)。
在本说明书中，虽然使用Dowex Marathon WBA(商标名称，DowChemical)作为离子交换树脂，但树脂不限于这种固定载体，而是可以使用所有的树脂，只要它们是能够赋予等于或大于前述树脂的耐热性的离子交换树脂即可。
此外，本发明的一个目的是通过使用具有耐热性的固定化酶有效地生产其中目标1、3-位上酯连接有中链脂肪酸并且第2-位上酯连接有多不饱和脂肪酸的甘油三酯而不引起反应效率的降低并同时保持位置特异性，即使是在1、3-位特异型的脂酶显示低反应活性的含有多不饱和脂肪酸的油或脂肪的情形中。因此，除选择固定载体外，还可以使用赋予耐热性的方法，它的一个实例是通过用交联剂如京尼平(genipin)交联剂处理固定化酶来赋予高程度的耐热性。
对一份固定载体来说，将固定载体悬浮于0.5-20重量份1、3-位特异型脂酶的水溶液中，随后逐渐向悬浮液中添加2-5份冷丙酮(例如，-80℃)并同时搅拌，形成沉淀物。然后，通过将此沉淀物减压干燥，制得固定化酶。作为一个更简单的方法，将0.05-0.4份的1、3-位特异型脂酶溶解于最少量的水中并且与1份固定载体混合并同时搅拌，随后减压干燥，制得固定化酶。虽然通过此方法可使约90％的脂酶固定至载体上，但是由于它在该状态时不能显出任何酯交换活性，因此可以通过在添加有1-10％水的底物(原料油或脂肪和中链脂肪酸)中预处理来最有效地活化固定化酶，并且优选在添加有1-3％水的底物中预处理，随后再在生产中使用。
取决于酶的类型，添加到反应体系中的水的量是极其重要的。如果反应体系中不含水，则酯交换反应很难进行，而如果存在大量的水，则会发生水解，由此降低甘油三酯的回收率(由于水解形成了甘油二酸酯和甘油单酸酯)。然而，在这种情形中，通过使用经过前述预处理而活化的固定化酶，添加到反应体系中的水的量不再重要，并且即使是完全无水时，酯交换反应也会有效发生。此外，通过选择酶制剂的类型，也可以取消固定化酶的水活化处理。
本发明中，起脂酶的底物作用的原料油或脂肪是指含有至少一种多不饱和脂肪酸的油或脂肪，其中所说的多不饱和脂肪酸选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸，但是不含ω3系列多不饱和脂肪酸，并且可以使用含有80wt％或更多、优选90wt％或更多并且更优选95wt％或更多甘油三酯的油或脂肪用作所说的油。
本发明通过使用具有耐热性的固定化酶来提高酶反应温度，结果，可以有效生产出目标甘油三酯，同时没有引起反应效率的降低，即使是本发明的油或脂肪中含有具有低反应活性的多不饱和脂肪酸时。因此，本发明中，即使其中至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸的总量为30wt％或更多、42wt％或更多或50wt％或更多的油或脂肪也可以使用，所述总量是相对于所述油或脂肪中脂肪酸的总量而言的。此外，具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列不饱和脂肪酸的实例包括花生四烯酸和双高-γ-亚麻酸，而具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的实例包括6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸和5，8，11-二十碳三烯酸。
此外，原料油或脂肪中的多不饱和脂肪酸的含量越高，所获得的含有甘油三酯的油或脂肪中在1、3-位连接有中链脂肪酸并且2位连接有相同多不饱和脂肪酸的甘油三酯的浓度越高。更具体说，可以使用含有15wt％或更多、优选25wt％或更多并且更优选30wt％或更多相同多不饱和脂肪酸的油或脂肪(相对于油或脂肪中脂肪酸的总量而言)。更具体说，可以使用含有25wt％或更多、优选30wt％或更多、更优选40wt％或更多、更优选45wt％或更多并且首选50wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(相对于油或脂肪中脂肪酸的总量而言)。
此外，可以使用通过微生物生产的油用于本发明的原料油或脂肪。优选使用可以生产作为甘油三酯的脂肪酸成分的至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸的微生物。
具有生产花生四烯酸能力的微生物的实例包括 被孢霉属(Mortierella)、耳霉属(Conidiobolus)、 腐霉属(Pythium)、 疫霉属(Phytophthora)、 青霉属 (Penicillium)、 枝孢属(Cladosporium)、 毛霉属(Mucor)、 镰孢属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、 红酵母属(Rhodotorula)、 虫霉属(Entomophthora)、刺孢囊霉属(Echinosporangium)和 水霉属(Saprolegnia)。属于 被孢霉属 (Mortierella)被孢霉亚属(Mortierella)的微生物包括 长形被孢霉 (Mortierella elongata)、 微小被孢霉(Mortierella exiqua)、 喜湿被孢霉 (Mortierella Hygrophila)和 高山被孢霉(Mortierella alpina)。这些菌株的具体实例包括 长形被孢霉Mortierella elongata IF08570、 微小被孢霉 Mortierella exiqua IF08571、 喜湿被孢霉Mortierella Hygrophila lF05941和 高山被孢霉Mortierella alpina IF08568、ATCC16255、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70和CBS754.68。
所有这些菌株都可以从日本大阪财团法人发酵研究所(IFO)、美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)和真菌菌种保藏中心(Centrralbure voor Schimmelcultrres，CBS)无限制地获得。除此之外，也可以使用长形被孢霉Mortierella elongata SAM0219菌株(NIBH保藏号FERM P-8703)(NIBH保藏号FERM BP-1239)，该菌株是由本发明的研究人员从土壤中分离出来的。
为培养本发明中所用的微生物菌株，可以将微生物菌株的孢子或菌丝体或者通过预先培养微生物菌株所获得的预培养物液体接种于液体或固体培养基中。当使用液体培养基时，一般使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露糖醇等作为碳源，但并不只限于这些。可以使用的氮源的实例包括天然氮源，如蛋白胨、酵母提取物、麦胚抽提物、牛肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米淀粉stiplica、大豆蛋白、脱脂大豆和棉籽残余物以及有机氮源，如尿素，和无机氮源，如硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵。除此之外，必要时可以使用无机盐，如磷酸盐、硫酸镁、硫酸铁和硫酸铜以及维生素等作为痕量营养源。关于这些培养基成分没有特别的限制，前提条件是它们的浓度不能损害微生物的生长。就实际而言，氮源的浓度一般来说应当为0.1-40wt％，优选1-25wt％。所添加的氮源的初始量一般是0.1-10wt％，并且优选0.1-6wt％，并且氮源可以在培养的过程中添加。
使用被孢霉属被孢霉亚属微生物来工业化生产含有花生四烯酸的油和脂肪的方法是已知的(“通过高山被孢霉Mortierella alpina 1S-4提高花生四烯酸的生产”，J.Am.Oil Chem.Soc.，75，1501-1505页(1998)，“无机物添加对高山被孢霉Mortierella alpina 1S-4生长形态和花生四烯酸生产的影响”，J.Am.Oil Chem.Soc.，75，1815-1819页(1998))。然而，由于花生四烯酸相对于脂肪酸总量的比例最大是45wt％，优选原料油和脂肪中存在45wt％或更多的花生四烯酸，以便通过酶法生产本发明的含有25mol％或更多、优选30mol％或更多8A8的油或脂肪(甘油三酯)。增加花生四烯酸比例的一种有效手段是减少培养基中的碳源。当减少培养基中的碳源时，微生物会同化所积累的油和脂肪，并且由于首先同化饱和的脂肪酸，使得甘油三酯中花生四烯酸的比例最终得到增加。尽管这类手段在理论上是可行的，但在现实中，由于甘油三酯的同化，所产生的含有高含量花生四烯酸的油和脂肪(甘油三酯)的量是极少的，使得这种方法作为用于提供反应底物的生产方法是完全不切实际的。因此，本发明的发明人，通过控制培养基中的碳源，成功地工业化生产出了含有45wt％或更多花生四烯酸的油和脂肪(甘油三酯)。培养由生物生长阶段及油和脂肪积累阶段组成，其中生物生长阶段从培养过程的第2-4天开始延续，油和脂肪积累阶段从培养过程的第2-4天以后开始延续。碳源的初始浓度应当是1-8wt％并且优选2-4wt％，应当仅仅在生物生长阶段及油和脂肪积累阶段的早期逐渐增加碳源，并且连续添加的碳源的总量应当是2-20wt％，并且优选5-15wt％。此外，通过根据氮源的初始浓度添加一定量的氮源，使在生物生长阶段逐渐添加的碳源的量在培养过程的第7天及之后、优选在培养过程的第6天及之后、并且更优选在培养过程的第4天及之后培养基中的碳源浓度变成0，建立了工业化生产具有45wt％或更多目标花生四烯酸含量的油或脂肪的方法。
虽然产花生四烯酸微生物的培养温度随着所用的微生物而不同，但应当是5-40℃并且优选20-30℃，并且在使微生物于20-30℃下生长之后，应当继续在5-20℃下培养，以便生产不饱和脂肪酸。通过按此方式控制温度，可以使所形成的脂肪酸中多不饱和脂肪酸的比例增加。培养基的pH是4-10，并且优选是5-9，并且培养通过通气搅拌培养、摇床培养或静置培养来进行。培养通常要进行2-30天，优选5-20天并且更优选5-15天。
除控制培养基中碳源的浓度外，作为增加含花生四烯酸的油和脂肪中的花生四烯酸比例的另一种手段，也可以通过将含有花生四烯酸的油和脂肪选择性水解来获得具有高含量花生四烯酸的油和脂肪。由于用于此选择性水解的脂酶不具有针对甘油三酯的位置特异性，并且水解活性的降低与双键的数量成正比，因而被水解的是脂肪酸的酯键而不是多不饱和脂肪酸的酯键。由于在所得多不饱和脂肪酸偏甘油酯之间出现酯交换反应，因而所得的甘油三酯具有增加含量的多不饱和脂肪酸(“花生四烯酸的强化：用假丝酵母属(Candida)cylindracea脂酶选择性水解得自被孢霉属的单细胞油”，J.Am.Oil Chem.Soc.，72，1323-1327页(1998))。按此方式，可以使用通过对含花生四烯酸的油或脂肪进行选择性水解而获得的具有高含量花生四烯酸的油或脂肪作为本发明的原料油或脂肪。可以用作本发明的原料油或脂肪的是那些花生四烯酸含量为25wt％或更多、优选30wt％或更多、更优选40wt％或更多、更优选45wt％或更多并且首选50wt％，或更多的那些，并且不限于通过本说明书所述方法获得的油或脂肪。
此外，本发明还能够使用含有双高-γ-亚麻酸或ω9系列多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)作为原料油或脂肪。
本发明的发明人早已开发出有效生产含有双高-γ-亚麻酸的油或脂肪(甘油三酯)的方法(日本未审专利申请5-91887)。此外，就有效生产含有ω9系列多不饱和脂肪酸(例如，6，9-十八碳二烯酸(18∶2 ω9)、8，11-二十碳二烯酸(20∶2 ω9)或5，8，11-二十碳三烯酸(20∶3 ω9))的油或脂肪(甘油三酯)的方法而言，本发明的发明人早已开发出通过使用其中Δ12不饱和酶受到抑制或缺失的突变株来生产含有ω9系列多不饱和脂肪酸的油或脂肪的方法，其中所说的突变株通过对属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物进行突变处理而获得(日本未审专利申请5-91888、日本未审专利申请10-57085和日本未审专利申请5-91886)。然而，关于通过使用含有多不饱和脂肪酸的油或脂肪作为原料油或脂肪来生产其中1、3-位连接有中链脂肪酸并且2位连接有多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)却没有任何描述，本发明是第一次对其进行了生产。此外，还可以使用其中双高-γ-亚麻酸或ω9系列多不饱和脂肪酸的比例得到增加的油或脂肪作为原料油或脂肪，其中使双高-γ-亚麻酸或ω9系列多不饱和脂肪酸的比例得到增加是通过使用控制培养基中碳源浓度的方法或者使用通过选择性水解含花生四烯酸的油或脂肪来获得具有高含量花生四烯酸的油或脂肪的方法(该方法用于增加含花生四烯酸的油或脂肪中花生四烯酸的比例)实现的。
可以使用选自6-12碳原子的脂肪酸的中链脂肪酸作为本发明中所用的中链脂肪酸。具有6-12个碳原子的中链脂肪酸的实例包括辛酸和癸酸，以及它们的低级醇酯及含有6-12碳原子的脂肪酸作为组成脂肪酸的油和脂肪，并且它们可以呈任何形式。
虽然通过使用具有耐热性的固定化酶(其中不发生活性的退化)提高反应温度使本发明的反应产率得到了最大程度的增加，但是通过重复进行前述的酯交换反应，可以进一步增加反应产率。更具体说，在使固定化酶对原料油或脂肪和中链脂肪酸的混合物进行作用之后，从反应产物中回收固定化酶(具有耐热性的脂酶)，随后通过超精馏或用碱性己烷萃取除去游离的脂肪酸，然后向所得的油或脂肪中添加中链脂肪酸，通过让前面回收的固定化酶对中链脂肪酸进行作用获得反应产物。使用这种方法的结果是反应效率得到增加，并且可以获得含有80wt％或更多其中中链脂肪酸连接在1、3-位甘油三酯的油或脂肪。关于前述步骤的反应次数没有限制，并且可以进行多次这样的反应，只要酶没有丧失活性即可。
本发明的酶反应可以间歇式或连续式进行，前提条件是可以获得其中在1、3位连接有中链脂肪酸并且2位连接有多不饱和脂肪酸的甘油三酯。此外，在间歇式反应的情形中，固定化脂酶可以回收并且重复使用，只要它没有丧失活性即可。
为获得含有其中在1、3位连接有中链脂肪酸并且2位连接有多不饱和脂肪酸的目标甘油三酯的油(甘油三酯)，首先将固定化酶从反应产物中分离出来，之后将在酯交换过程中断开的1、3-位所连接的脂肪酸分离出来，然后将过量的反应底物形式的中链脂肪酸从反应由或脂肪中分离出来。可以使用的去除所说脂肪酸和中链脂肪酸的方法包括碱性脱氧、蒸汽蒸馏、真空超精馏、柱色谱、溶剂萃取或它们的任何组合。此外，在大型工业化规模生产的情形中，从大体积的油和脂肪中去除所说的脂肪酸和中链脂肪酸时，优选通过超精馏来除去之。
在按此方式去除游离脂肪酸后，所得油的甘油三酯含量为95wt％或更多，并且甘油三酯的含量可以通过利用超精馏等方法除去油中所存在的百分之几的甘油二酸酯和甘油单酸酯来得到进一步增加。除此之外，如果必要的话，也可以进行常规的油精制处理，并且其实例包括脱氧、脱胶、脱色和脱臭。
本发明的油和脂肪的实例包括，含有30-90mol％、优选30-80mol％、更优选45-80mol％并且首选60-80mo1％甘油三酯的油和脂肪，其中在甘油三酯的1、3-位连接有中链脂肪酸，并且在甘油三酯的2位连接有至少一种选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸的多不饱和脂肪酸，并且连接至第2位的多不饱和脂肪酸的实例包括花生四烯酸、双高-γ-亚麻酸、6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸和5，8，11-二十碳三烯酸。油和脂肪的具体实例包括，含有25mol％或更多、优选30mol％或更多并且更优选40mol％或更多在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有花生四烯酸的甘油三酯的油和脂肪；含有5mol/％或更多、优选10mol％或更多并且更优选20mol％或更多在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有双高-γ-亚麻酸的甘油三酯的油和脂肪；及含有5mol％或更多、优选10mol％或更多并且更优选20mol％或更多在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有5，8，11-二十碳三烯酸的甘油三酯的油和脂肪。
前述的本发明的油和脂肪，例如含有25mol％或更多在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有花生四烯酸的甘油三酯的油和脂肪；含有在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有双高-γ-亚麻酸的甘油三酯的油和脂肪；或者含有在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2位连接有ω9系列多不饱和脂肪酸的甘油三酯的油和脂肪，具有无限可能性的用途，并且可以用作食品、饮料、化妆品和药物的原料或添加剂。就本发明油和脂肪的用途和用量而言，没有任何限制。
例如，食品组合物的实例不仅包括普通食品，而且还包括功能型食品、营养补充型食品、新生儿(pronatis)配方食品、婴儿配方食品、儿童食品、怀孕期间食用的食品和老年人食品。含有油和脂肪的食品的实例包括，本身含有油和脂肪的天然食物，如肉、鱼和坚果；制备期间加入油和脂肪的食物，如汤；使用油或脂肪作为加热介质的食物，如炸面圈；油类食物，如奶油；加热过程中添加油和脂肪的加工食品，如曲奇饼以及在最终加工过程中喷洒或涂布油和脂肪的食物，如硬质饼干。此外，油和脂肪还可以添加到农用食物制品、发酵食物制品、牲畜食物制品、海产品食物制品或不含油和脂肪的饮料中。此外，还可以是功能型食品和药物的形式，其实例包括经肠营养素、粉剂、颗粒剂、锭剂、药剂、混悬剂、乳液、糖浆剂和其它加工形式。
下面将通过实施例对本发明作更详细的解释。然而，本发明不限于这些实施例。
实施例1
(通过固定化1、3-位特异型脂酶来赋予耐热性)
将100g离子交换树脂载体(Dowex Marathon WBA，Dow Chemical)悬浮于80ml德列马根霉(Rhizopus delemar，Talipase Powder，TanabeSeiyaku有限公司)的12.5％水溶液中，接着减压干燥，获得固定化脂酶。此外，将25g陶瓷载体形式的不同固定载体(SM-10，NGK)悬浮于100ml德列马根霉(Rhizopus delemar，Talipase Powder，Tanabe Seiyaku有限公司)的10％水溶液中，接着逐渐添加300ml冷丙酮(-80℃)并同时搅拌，形成沉淀。然后将此沉淀减压干燥，获得固定化脂酶。
接下来，让4g含有40wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％甘油三酯，SUNTGA40S，Suntory有限公司)、8g辛酸、600mg前述固定化脂酶和240μl水在30℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。待反应完成之后，取出反应液体获得活化的固定化脂酶。
将这种活化的固定化脂酶用于以下实施例2、3、4、5和7中。
实施例2
(固定化酶长期反应后的酶稳定性)
将0.48g固定化酶(德列马根霉Rhizopus delemar脂酶，载体：DowexMarathon WBA或SM-10)添加到4g含有25wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％以上的甘油三酯，SUNTGA40S，Suntory有限公司)和8g辛酸的混合物(底物)中，并且使其在30℃下反应48或72小时并同时搅拌(130rpm)，接着从反应产物中取出反应油或脂肪，添加新的底物并且重复同样的反应80天。在这种长期反应之后，将与前述相同的底物添加到回收的固定化酶中，并且使其在30℃下反应48小时，随后在反应完成时用碱性己烷萃取从反应油或脂肪中萃取出甘油三酯。通过GC分析测定甘油三酯中所掺入的辛酸(8∶0)和甘油三酯中所掺入的花生四烯酸，以便测定固定化酶的活性。表1中显示了GC分析值的辛酸比例(在脂肪酸组成中的比例：mol％)作为反应活性(酶活性)，同时表1中还显示了GC分析值的花生四烯酸的比例(在脂肪酸组成中的比例：mol％)作为残基特异性。由于固定化脂酶将SUNTGA25第1、3-位的脂肪酸酯交换成辛酸，因而将保留在甘油三酯中的花生四烯酸的量认为是连接在甘油三酯2-位上的花生四烯酸的量。
                       表1
    固定化酶载体     反应活性辛酸(mol％)     残基特异性花生四烯酸(mol％)
    SM-10     36.9     19.9
    Dowex Marathon WBA     44.5     18.5
根据这些结果，说明Dowex Marathon WBA是优越的。也就是说，与SM-10相比，即使是在长期反应之后，Dowex Marathon WBA也没有显示出反应活性的降低，并且位置特异性与SM-10相当。因此，可以容易地断定Dowex Marathon WBA在热稳定性方面是有效的。
实施例3
(使用含有25wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％以上的甘油三酯，SUNTGA25，Suntory有限公司)和含有40wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％以上的甘油三酯，SUNTGA40S，Suntory有限公司)作为原料油生产8A8[酶反应处理重复三次])
将28g SUNTGA25和SUNTGA40S、56g辛酸和4.8g固定化酶(德列马根霉Rhizopus delemar脂酶，载体：Dowex Marathon WBA)在30℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。在去除了固定化脂酶的反应油中，存在有在酯交换过程中断开的原料油(甘油三酯)1、3-位所连接的脂肪酸及中链脂肪酸形式的过量反应底物，通过碱性己烷萃取除去这些脂肪酸，获得经过一次处理的油。将12g经过一次处理获得的油、24g辛酸和1.8g固定化酶在30℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。通过与前述相同的处理除去中链脂肪酸等，获得经过两次处理的油。然后，将3g经过两次处理获得的油、8g辛酸和0.6g固定化酶在30℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。通过与前述相同的处理除去中链脂肪酸等，获得经过三次处理的油。
使用SUNTGA25或SUNTGA40S作为原料油时的反应液体的脂肪酸组成(mol/％)示于表2和3中。
                               表2  原料油：SUNTGA25
8∶0  16∶0  18∶0  18∶1  18∶2  18∶3ω6  18∶3ω3  20∶3  20∶4  22∶0  24∶0
原料油 -  14.89  6.15  13.90  23.81  2.10  2.29  2.95  23.47  1.70  3.40
一次处理 48.66  2.71  1.18  7.27  14.62  2.01  1.01  2.58  16.61  0.40  0.23
两次处理 58.72  0.91  0.38  6.25  12.90  1.81  0.81  2.38  14.13  0.10  0.23
三次处理 63.80  0.56  0.22  5.71  11.95  1.86  0.72  2.09  11.69  -  0.11
                       表3  原料油：SUNTGA40S
8∶0  16∶0  18∶0  18∶1  18∶2  18∶3ω6  18∶3ω3  20∶3  20∶4  22∶0  24∶0
原料油 -  13.65  6.01  15.07  7.30  3.59  0.21  4.50  37.70  2.03  3.74
一次处理 45.46  2.48  1.16  8.16  5.51  3.31  -  3.82  26.16  0.50  0.79
两次处理 56.72  0.85  0.39  6.98  4.92  2.85  -  3.47  21.80  0.22  0.26
三次处理 60.75 0.51 0.21 6.45 4.68 2.69 - 3.25 19.29 0.14 0.11
由于连接至甘油三酯中的脂肪酸的组成按mol％表示，因此如果原料油1、3-位的所有脂肪酸均被酯交换成辛酸，则辛酸将是66.6％。因此，重复反应的结果使得辛酸的比例增加至60％。
实施例4
(8A8的分析方法)
在使用1、3-位特异性脂酶将原料油1、3-位连接的脂肪酸酯交换成中链脂肪酸的方法中所报道的反应使用的是鱼油或TGA-25(SUNTGA25，Suntory有限公司)作为原料油。然而，在这两种反应中，评价是根据按照实施例3所示反应所获得的油(甘油三酯)中的脂肪酸组成(mol％)变化来进行的，并且由于没有分析其中1、3-位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有多不饱和脂肪酸的甘油三酯，因而不可能确定发明是否得到实现。在本实施例中，为使本发明得到清楚阐述，使用8A8作为实例来说明分析方法，其是本发明的目标化合物之一。
通过将高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)联合进行定量测定，来测定8A8。
[HPLC分析方法]
柱：反相柱(Cosmosil 4.6×250mm 5C18-MS)
溶剂：丙酮/乙腈(1∶1)，1ml/分钟
分析时间：55分钟
柱加热炉温度：40℃
检测器：差示折光检测器(比色皿温度：40℃)
样品：注射5μl溶解于氯仿中的油(甘油三酯)的10％溶液
[GC分析方法]
柱：Frontier Ultra ALLOY UA-17-15M-0.1F(15m×0.25mm×0.1μm)
柱温：260℃-(1℃/分钟)-290℃-(10℃/分钟)-390℃(5分钟)
分析时间：45分钟
注射口温度温度：310℃
检测器温度：370℃(氢电离检测器)
载气：氦
线速度：40cm/分钟
样品：注射1μl溶解于己烷中的油(甘油三酯)的1％溶液
当将其中1、2、3-位连接有任意脂肪酸的原料油的甘油三酯表示为XXX(X＝任意脂肪酸)时，酯交换有一个辛酸的甘油三酯变成XX8并且酯交换有两个辛酸的甘油三酯变成8X8。还可以是其中8X8中第2-位的脂肪酸经过分子内位移而形成88X的甘油三酯，并且在此情形中，酯交换进一步导致形成888。
在HPLC分析中，甘油三酯可以在分子种类的水平上进行分离(然而，AAP(其中1、2-位连接有花生四烯酸并且第3-位连接有棕榈酸的甘油三酯)和APA(其中1、3-位连接有花生四烯酸并且第2-位连接有棕榈酸的甘油三酯)无法区分并且显示相同的保留时间)。这种HPLC分析可以计算888、8X8、XX8和XXX的比例。然而，尽管8X8分子种类组中存在有目标8A8，但是遗憾的是由于8A8、8D8和8G8都显示相同的保留时间，因而无法区分它们。
在GC分析中，可以区分用HPLC无法区分的8A8、8D8和8G8(此外，还可以区分8A8和88A)。然而，尽管可以检测888、8X8和XX8，但由于发生了分解，因而无法检测XXX。
因此，通过将HPLC分析和GC分析联合，便可以计算出甘油三酯中8A8的比例。
当对实施例3的经过三次处理的油进行分析时，获得下面的结果。
  油中8X8的比例(mol％)   油中8A8的比例(mol％)
SUNTGA25经过3次处理后获得的油     92.5％     18.9％
SUNTGA40S经过3次处理后获得的油     80.3％     27.5％
按此方式，通过8A8的分析首次发现了本发明的显著效果。
实施例5
(使用SUNTGA40S作为原料油来生产8A8，酶反应温度40℃)
将1g SUNTGA40S、2g辛酸和0.2g固定化酶(德列马根霉Rhizopusdelemar脂酶，载体：Dowex Marathon WBA)在40℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。在去除固定化脂酶之后，反应油中存在有在酯交换过程中断开的原料油(甘油三酯)1、3-位所连接的脂肪酸及过量反应底物形式的中链脂肪酸，并且使用与实施例3相同的方法将这些脂肪酸除去，获得经处理的油。所得经处理的油的脂肪酸组成(mol％)示于表4中。此外，还显示了使用实施例3的SUNTGA40S作为原料油的经过一次处理的油作为30℃反应温度的对照。
                                           表4
    8∶0     16∶0     18∶0     18∶1     18∶2     18∶3ω6     18∶3ω3     20∶3     20∶4     22∶0     24∶0
30℃ 45.46 2.48 1.16 8.16 5.51 3.31 - 3.82 26.16 0.50 0.79
    40℃     51.77     1.93     1.22     3.85     6.86     2.32     -     2.78     26.57     0.61     1.30
将反应温度从30℃提升至40℃的结果，辛酸的取代率从45.46％增加至51.77％并且反应活性得到增强。
实施例6
(生产含有45wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯))
使用高山被孢霉Mortierella alpina CBS754.68作为产花生四烯酸的微生物，将1000L含有2％葡萄糖、6％食用大豆蛋白、0.3％KH2PO4、0.05％MgCl2·6H2O、0.05％CaCl2·2H2O和0.1％大豆油的培养基(pH6.0)放入2000L通气搅拌培养罐中，并且在温度26℃、空气流速1.0vvm、搅拌速率80rpm且罐内压1.0kg/cm2G的条件下开始通气搅拌培养。依次在培养的第1和2天添加5％葡萄糖，第3天添加4.5％葡萄糖并且第4天添加1.5％葡萄糖。此外，第3天将温度降至21℃并且在此温度下继续培养。第7天葡萄糖耗尽，并且继续培养直至第16天。培养16天期间花生四烯酸的比例达到61wt％，并且所产生的量(以花生四烯酸计)保持在12g/L。此外，由于在培养的第13天，花生四烯酸的比例已达到60wt％，因而足以缩短培养的期限。过滤回收所得的微生物并且萃取出油或脂肪，得到含有55wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯)(可称作SUNTGA55)。
实施例7
(使用SUNTGA55作为原料油来生产8A8，酶反应温度40-41℃[连续式反应])
将10g固定化酶(德列马根霉Rhizopus delemar脂酶，载体：DowexMarathon WBA)填充至夹套式玻璃柱(1.8×12.5cm，体积：31.8ml)，并且通过让由SUNTGA55和辛酸以1∶2比例组成的混合油以恒定流速流经柱子来进行连续式反应。此外，将柱温设定至40-41℃。前述连续式反应的流速和反应效率以所得油中存在的辛酸和花生四烯酸的mol％来显示(表5)
                      表5
    8∶0(辛酸)   20∶4(花生四烯酸)
    SUNTGA55     0   57.00
    流速(ml/h)     8∶0(辛酸)   20∶4(花生四烯酸)
    2.2     53.82   30.03
    3.9     52.06   31.51
    5.6     46.87   36.69
    8.4     42.48   40.17
    12.6     36.69   44.10
    17.6     31.24   47.04
    26.4     25.27   49.38
    38.7     20.03   51.21
根据表5中所示的结果，使用3.5-5.5ml/h的流速连续92天进行反应。结果示于表6。
                       表6
    反应的天数     8∶0(辛酸)   20∶4(花生四烯酸)
    1     49.60     34.32
    2     53.00     31.22
    10     51.75     32.87
    20     50.10     34.61
    35     48.15     36.08
    50     46.73     37.37
    70     46.44     37.43
    80     43.90     39.43
    92     41.43     40.99
即使在40-41℃的条件下，酶活性也没有突然降低并且连续生产进行了92天。
收集这种连续式反应所获得的油，并且在第92天时，通过分子超精馏去除被反应所断开的脂肪酸和反应底物形式的中链脂肪酸，并且按照实施例4的方法测定油中的8A8和888的比例，发现它们分别达到了40.1mol％和7.31mol％。
使用与实施例1不同的固定载体制备的固定化酶(德列马根霉Rhizopus delemar脂酶，载体：陶瓷载体(SM-10))进行类似的连续式反应，但是由于这种固定化酶的耐热性程度低，因而在反应开始后第30天获得的油中，辛酸的mol％为32.4％。此外，当按照实施例4的方法测定油中的888的比例时，发现它达到11.6mol％。
由此可见，即使使用具有高比例多不饱和脂肪酸的油作为反应原料，只要使用本发明的具有耐热性的固定化酶，就可以实现实际水平的生产，同时不会出现反应效率降低。此外，由于888的比例明显很低，因而还清楚地说明了酶的位置特异性得到了充分的保持，即使是在提高了反应温度的情况下。
实施例8
(使用含双高-γ-亚麻或ω9系列多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)作为原料油或脂肪酸，在40-41℃酶反应温度下生产在1、3-位连接有中链脂肪酸并且在2-位连接有双高-γ-亚麻酸或ω9系列不饱和脂肪酸的甘油三酯[间歇式反应])
本发明的发明人开发了含有双高-γ-亚麻酸或ω9系列多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)的生产方法。含双高-γ-亚麻酸的油或脂肪(甘油三酯)通过使用具有产花生四烯酸能力并且具有低Δ5不饱和活性的微生物(例如，高山被孢霉Mortierella alpina SAM1860突变株(NIBH保藏号FERMP-3589))，按照日本未审专利申请5-91887中所述的方法来获得；含ω9系列多不饱和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)通过培养具有产ω9系列多不饱和作脂肪酸能力的微生物(例如，高山被孢霉Mortierella alpina SAM1861突变株(NIBH保藏号FERM P-3590))，按照日本未审专利申请5-91888中所述方法来获得；含有Mead酸的油或脂肪(甘油三酯)通过按照日本未审专利申请10-57085所述的方法对具有产花生四烯酸能力的微生物进行突变处理来获得。通过培养其中Δ12不饱和活性被降低或缺失并且至少Δ6不饱和活性和/或增链活性得到增强的突变株[例如，高山被孢霉Mortierella alpinaSAM2086(NIBH保藏号FERM P-15766)]，通过培养能够在添加Δ5不饱和酶抑制剂的培养基中生产ω9系列多不饱和脂肪酸的微生物，或者在向培养过所说微生物的培养物液体中添加Δ5不饱和酶抑制剂之后进行附加培养，按照日本未审专利申请5-91886中所述的方法，可以获得含有8，11-二十碳二烯酸的油或脂肪(甘油三酯)。
将1g含有44wt％双高-γ-亚麻酸的油或脂肪(可称作“SUNTGD”)、1g含有16wt％8，11-二十碳二烯酸的油或脂肪(可称作“SUNTG20∶2”)或1g含有24wt％5，8，11-二十碳三烯酸的油或脂肪(可称作“SUNTGM”)、2g辛酸和0.2g固定化酶(德列马根霉Rhizopus delemar脂酶，载体：DowexMarathon WBA)混合，并且在40℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。在去除固定化脂酶的反应油中，存在有在酯交换过程中断开的原料油或脂肪(甘油三酯)1、3-位所连接的脂肪酸及过量反应底物形式的中链脂肪酸，然后使用与实施例3相同的方法将这些脂肪酸除去，获得经处理油或脂肪。在所得的油或脂肪中，1，3-辛酰-2-双高-γ-亚麻酰-甘油、1，3-辛酰-2-8，11-二十碳二烯酰-甘油或1，3-辛酰-2-5，8，11-二十碳三烯酰-甘油的比例分别为34％、14％或26％。
此外，在本实施例中，将固定化酶按照与实施例1相同的方法，使用4g原料油或脂肪、8g辛酸、600mg前述固定化脂酶和240μl水来活化。
实施例9
(应用于奶粉)
通过将0.3g实施例7获得的含有40.1wt％8A8的甘油三酯混入奶粉中，制备具有增强的花生四烯酸吸收性的奶粉。
实施例10
(应用于脂肪输注剂)
在添加了400g实施例7获得的含有40.1wt％8A8的甘油三酯、48g纯化蛋黄卵磷脂、20g油酸、100g甘油和40ml 0.1N氢氧化钠并且用匀化器分散之后，加入注射用蒸馏水使体积达到4升。然后用高压喷雾乳化器进行乳化，制成脂质乳液。将200ml这种脂质乳液的等分试样添加至塑料袋中，然后将塑料袋通过高压蒸汽在121℃下灭菌20分钟，得到脂肪输注剂。
实施例11
(京尼平交联剂在固定化1、3-位特异型脂酶中的应用)
将100g离子交换树脂载体(Dowex Marathon WBA：Dow Chemical)悬浮于80ml德列马根霉(Rhizopus delemar，Talipase Powder，TanabeSeiyaku有限公司)的12.5％水溶液中并且轻微搅拌2小时，然后加入8ml京尼平的5％水溶液，之后在室温下连续轻微搅拌6小时。随后，逐渐添加240ml冷丙酮(-80℃)并同时搅拌，形成沉淀。然后将该沉淀减压干燥，获得固定化酶。
将4g SUNTGA40S、8g辛酸、600mg前述固定化脂酶和240μl水的混合物在30℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。在反应完成之后，取出反应液体，获得活化的固定化酶。
实施例12
(通过在1、3-位特异型脂酶的活化中使用京尼平交联剂来增强耐热性)
将4.8g实施例1和11中所获得的固定化酶(德列马根霉Rhizopusdelemar脂酶，载体：Dowex Marathon WBA)、28g SUNTGA40S和56g辛酸在30℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。从反应产物中取出反应油或脂肪，接着添加新的底物并且在30℃、40℃、50℃和60℃下反应480小时并同时搅拌(130rpm)。
随后，从反应产物中取出反应油或脂肪，并且按与前述相同的方式添加新的底物，接着在30℃下反应48小时并同时搅拌(130rpm)。
表7将实施例1获得的固定化德列马根霉Rhizopus delemar酶在各温度下保持480小时后8∶0(辛酸)的转化率
保持温度 保持480小时之前 保持480小时之后   活性保留率(％)
    30     43％     54％     102
    40     52％     52％     95
    50     54％     48％     89
    60     50％     33％     66
表8将实施例11获得的固定化德列马根霉Rhizopus delemar酶在各温度下保持480小时后8∶0(辛酸)的转化率
保持温度 保持480小时之前 保持480小时之后   活性保留率(％)
    30     51％     50％     98
    40     49％     50％     1 02
    50     54％     50％     93
    60     50％     44％     88
结果，用京尼平处理过的固定化酶在60℃下保持480小时之后，仍意想不到地保留了其初始活性的88％。
实施例13
以表4的分析结果为基础，在使用含有25％花生四烯酸的SUNTGA25(Suntory有限公司)作为原料的情形中，酶反应之后的油中8A8的比例为18.9％。此外，当使用高含量花生四烯酸的SUNTGA40S(含有40％花生四烯酸的甘油三酯，Suntory有限公司)作为原料时，获得27.5％8A8的油。
对酶的固定化进行研究以增加酶反应后油中8A8的比例。固定化用的载体是离子交换树脂的多孔树脂(Dowex Marathon WBA)，酶固定化过程中的载荷量可以在一定范围内改变。因此，按照实施例1，在酶的固定化过程中，固定化与实施例1相同量、两倍量和一半量的酶，来制备固定化酶。分别使用这些固定化酶，按与实施例2相同的方式，将0.48g各固定化酶添加至作为原料的SUNTGA40S和8g辛酸的混合油中，并且在30℃下搅拌(130rpm)反应72小时。
表9显示了固定化酶中所含的脂酶的量与反应完成之后油中8A8的比例之间的关系。即使用SUNTGA40S(与实施例4所用的相同的原料)重复了三次酶反应，油中的8A8的比例仅为27.5％。相反，在表9所示固定化酶(使用实施例1的两倍量)的情形中，油或脂肪中的8A8的比例能够增加至38.9％，尽管只进行了一次反应。
                      表9
    固定化酶的酶含量*     油中8A8的比例(mol％)
         21.0
    1     25.6
    2     38.9
*酶含量是以每100g实施例1的固定化酶中10g Talipase粉末为基础，并且按这个量的倍数来表示。

Claims (23)

1、一种含有甘油三酯的油或脂肪的生产方法，其中所说的甘油三酯的第1和第3位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有多不饱和脂肪酸，该方法包括：让可特异性作用于甘油三酯1、3-位酯键的脂酶对中链脂肪酸和原料油或脂肪的混合物进行作用，其中所说的原料油或脂肪含有选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸中的至少一种多不饱和脂肪酸，但不含ω3系列多不饱和脂肪酸；其中，使用固定在离子交换树脂载体上的脂酶，所说的离子交换树脂载体是多孔性的并且孔径为约100埃或更大。
2、权利要求1的生产方法，其中重复进行如下步骤来获得反应产物：让固定化脂酶对原料油或脂肪和中链脂肪酸的混合物进行作用，从反应产物中回收固定化酶，除去游离的脂肪酸获得反应油或脂肪，向所说的油或脂肪中添加中链脂肪酸并且让前面回收的固定化脂酶对其进行作用以便获得反应产物。
3、权利要求1或2的生产方法，其中让固定化脂酶在40℃或更高的反应温度下进行作用。
4、权利要求1-3任一项的生产方法，其中原料油或脂肪中存在的选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸中的至少一种多不饱和脂肪酸的总量相对于所说油或脂肪中脂肪酸的总量为30wt％或更高。
5、权利要求1-4任一项的生产方法，其中具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸是花生四烯酸或双高-γ-亚麻酸，并且具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸是6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸或5，8，11-二十碳三烯酸。
6、权利要求1-5任一项的生产方法，其中中链脂肪酸是游离中链脂肪酸、中链脂肪酸的低级醇酯或含有中链脂肪酸作为组成脂肪酸的油或脂肪的形式。
7、权利要求1-6任一项的生产方法，其中中链脂肪酸是具有6-12个碳原子的脂肪酸。
8、权利要求7的生产方法，其中具有6-12个碳原子的中链脂肪酸是辛酸和/或癸酸。
9、权利要求1-8任一项的生产方法，其中原料油或脂肪是含有15wt％或更多相同多不饱和脂肪酸的油或脂肪，以所说油或脂肪中脂肪酸的总量计。
10、权利要求1-8任一项的生产方法，其中原料油或脂肪是含有25wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪，以所说油或脂肪中脂肪酸的总量计。
11、权利要求1-10任一项的生产方法，其中原料油或脂肪是通过微生物生产的。
12、权利要求1-10任一项的生产方法，其中原料油或脂肪是从属于被孢霉属的微生物中提取的。
13、权利要求12的生产方法，其中属于被孢霉属的微生物是属于被孢霉亚属的微生物。
14、一种油或脂肪或甘油三酯，其中含有30-90mol％在甘油三酯的第1、3-位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有选自具有18个或更多个碳原子和3个或更多个双键的ω6系列多不饱和脂肪酸及具有18个或更多个碳原子和2个或更多个双键的ω9系列多不饱和脂肪酸中的至少一种的多不饱和脂肪酸的甘油三酯。
15、权利要求14的油或脂肪或甘油三酯，其中与第2位连接的多不饱和脂肪酸是选自6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸和5，8，11-二十碳三烯酸中的至少一种多不饱和脂肪酸。
16、一种含有25mol％或更多甘油三酯的油或脂肪或甘油三酯，其中所说甘油三酯的第1、3-位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有花生四烯酸。
17、一种含有5mol％或更多甘油三酯的油或脂肪或甘油三酯，其中所说甘油三酯的第1、3-位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有双高-γ-亚麻酸。
18、一种含有5mol％或更多甘油三酯的油或脂肪或甘油三酯，其中所说甘油三酯的第1、3-位连接有中链脂肪酸并且第2位连接有5，8，11-二十碳三烯酸。
19、一种食品组合物，含有按照特定营养要求共混的权利要求14-18任一项的油或脂肪或甘油三酯。
20、权利要求19的食品组合物，其中所说的食品组合物是功能型食品、营养补充型食品、新生儿配方食品、婴儿配方食品、儿童食品、怀孕期间食用的食品或老年人食品。
21、一种动物饲料，含有共混的权利要求14-18任一项的油或脂肪或甘油三酯。
22、一种治疗性营养食品，含有权利要求14-18任一项的油或脂肪或甘油三酯，并且根据情况，与适宜于口服、肠道或非肠道施用的中性载体共混。
23、一种药物组合物，含有至少一种权利要求14-18任一项的油或脂肪或甘油三酯。
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