CN101278054B

CN101278054B - 制造脂肪酸的方法

Info

Publication number: CN101278054B
Application number: CN2006800367033A
Authority: CN
Inventors: 加瀬实; 小松利照
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2005-10-06
Filing date: 2006-10-06
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2026-10-06
Also published as: JP2007099959A; CN101278054A; JP4694939B2

Abstract

本发明提供一种通过水解油脂制造脂肪酸的方法，其包括：通过下列方法(a)或(b)中的一种方法部分水解油脂的第一步骤，和通过另一方法进行水解的第二步骤：(a)使用固定化酶的酶水解法，该固定化酶是固定在载体上的酶，(b)高压高温水解法。提供了通过油脂的水解有效制造在构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸含量降低并具有色度降低了的良好外观的脂肪酸的方法。

Description

制造脂肪酸的方法

技术领域

本发明涉及通过水解油脂来制造脂肪酸的方法。

背景技术

脂肪酸的制造通过水解油脂来进行。作为水解油脂的方法，使用高压高温水解(JP-A-2003-113395)或酶水解(JP-A-2000-160188)。前一方法在高温高压条件下在水存在下进行并具有高生产率的优点。但是，当在该方法中使用含大量不饱和脂肪酸的原料时，在一些情况下根据条件产生大量反式不饱和脂肪酸。另一方面，后一方法在具有0至70℃的低温的反应条件下在作为催化剂的例如脂肪酶这样的酶存在下进行，因此，该方法与高压高温水解法相比，尽管不产生反式不饱和脂肪酸，但具有低生产率。

此外，高压高温水解在分解开始前的反应初始阶段具有诱导期。为了避免或缩短这种诱导时间，一种技术是首先使用1，3-位特异性脂肪酶通过酶水解将甘油酯部分水解以制备部分水解的甘油酯，然后进行高压高温水解(JP-A-8-507917)。

发明内容

本发明涉及通过水解油脂来制造脂肪酸的方法，其包括：通过下列方法(a)或(b)中的任一种来部分水解油脂的第一步骤，和通过另一方法进行水解的第二步骤：

(a)使用固定化酶的酶水解法，该固定化酶是固定在载体上的酶，

(b)高压高温水解法。

具体实施方式

最近，越来越关注食用油对健康的影响。科学研究已证实，反式不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸和胆固醇一起提高LDL(低密度脂蛋白)胆固醇水平并提高冠心病的危险。因此，希望降低食用油中的反式不饱和脂肪酸含量。

省略了除臭步骤的未精制的原料油脂在构成脂肪酸中含有1.5重量％或更少的反式不饱和脂肪酸。当原料油脂通过酶水解法被水解时，构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量不增加。但是，在这种情况下，由于原料的颜色保持不变，所得脂肪酸具有差的外观。另一方面，仅通过高压高温水解法水解未精制的原料油脂而得的脂肪酸具有良好外观，因为着色成分被分解，但构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量高。

已经发现，JP-A-8-507917中所述的方法可以缩短油脂通过高压高温水解法水解的反应时间并由此可以有效制造脂肪酸，因此，可以制造在构成脂肪酸中具有降低的反式不饱和脂肪酸含量的脂肪酸。但是，已经证实，当在通过酶水解法部分水解后通过高压高温水解法进行水解时，不一定产生具有良好色调的脂肪酸。并且已经发现，原因在于所用酶的形式。

于是，本发明提供通过油脂的水解制造脂肪酸的方法，其能够有效制造在构成脂肪酸中的反式不饱和脂肪酸含量低并具有色调降低的良好外观的脂肪酸。

在这种情形下，本发明人对在油脂的水解反应中酶水解和高压高温水解的组合进行了研究并发现，当(a)首先通过使用固定化酶(该固定化酶是固定在载体上的酶)的酶水解法部分水解油脂(第一步骤)，然后(b)通过高压高温水解法水解(第二步骤)时，可以有效生产在构成脂肪酸中具有降低的反式不饱和脂肪酸含量并具有良好外观的脂肪酸。

本发明人还发现，当(b)首先通过高压高温水解法部分水解油脂(第一步骤)，然后(a)通过使用固定化酶(该固定化酶是固定在载体上的酶)的酶水解法水解(第二步骤)时，同样可以有效生产在构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸和单酰甘油含量低并具有良好外观的脂肪酸。还发现，当以相反顺序进行该方法时，构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量降低但单酰甘油含量没有降低。

根据本发明，可以通过油脂的水解有效生产在构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸含量低并具有良好外观的脂肪酸。

在本发明中，“(a)使用固定化酶的酶水解法，该固定化酶是固定在载体上的酶”(下文简称为“酶水解”)是指，一种制备脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水并使用例如脂肪酶这样的固定化酶(该固定化酶是固定在载体上的酶)作为催化剂在低温条件下使该混合物反应。在本发明中，“(b)高压高温水解法”是指，一种制备脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水并使该混合物在高温高压条件下反应。在本发明中，“脂肪酸”不仅包括脂肪酸还包括存在甘油、单酰甘油、二酰甘油和/或三酰甘油的脂肪酸。

在本发明中，要水解的原料油脂可以是植物油脂和动物油脂。原料的具体实例包括菜籽油、葵花油、玉米油、大豆油、亚麻籽油、米糠油、红花油、棉籽油、牛脂和鱼油。除此之外，通过将上述油脂分馏或混合而获得的油脂和通过氢化或酯交换调节了脂肪酸的组成的油脂可用作原料。但是，优选未经氢化的油脂，因为可降低原料油脂中的构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量。

在本发明的一个方面中，优选在从植物或动物中获得各自作为原料的油脂后，通过过滤、离心或类似方法去除油以外的固体物质。然后，在原料油脂中进一步加入水，或根据情况加入酸，并混合，优选通过离心或类似方法分离胶状组分以进行脱胶。此外，在加入碱并混合后，优选通过水洗和脱水将原料油脂脱酸。此外，优选通过使原料油脂与例如活性粘土这样的吸附剂接触并通过过滤或类似方法分离吸附剂来脱色。优选这些处理以上述顺序进行，但该顺序可以改变。除了这些外，为了去除蜡，可以对原料油脂施以冷冻(wintering)，这是在低温下分离固体物质的步骤。原料油脂也可以根据需要通过在减压下与蒸汽接触来除臭。此时，优选保持尽可能低的热历程以降低油脂的构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量。对于除臭步骤的条件，优选将温度控制至300℃或更低，更优选270℃或更低，时间优选为10hr或更短，更优选5hr或更短。

在本发明中，使用构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸含量优选为1.5重量％或更低、更优选为1重量％或更低、进一步优选为0.5重量％或更低的原料油脂以降低水解后脂肪酸的构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量。例如，优选使用未除臭油脂作为原料油脂的一部分或全部，因为可以减少构成脂肪酸中的反式不饱和脂肪酸。在此，当使用两种或更多油脂时，构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量是指这两种或更多油脂中反式不饱和脂肪酸的总量。

在高压高温水解中，原料油脂的构成脂肪酸的不饱和度越高，越容易通过加热形成反式不饱和脂肪酸。具体而言，尽管在不饱和度为1的油酸的情况下，加热几乎不会形成反式不饱和脂肪酸，但在例如亚油酸和亚麻酸这样的不饱和度为2或更高的脂肪酸的情况下，反式不饱和脂肪酸的形成明显。

考虑到生理效应，本发明的方法中所用的原料油脂的构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量优选为1.5重量％或更低，更优选0.01至1重量％，进一步优选为0.1至1重量％。原料油脂具有优选20或更大、更优选35或更大的色调C，因为显著表现出本发明的改善外观的效果。

在本发明中，“构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量”和“脂肪酸的组成”是指通过美国油化学家学会官方方法(American OilChemists’Society Official Method)Ce 1f-96(GLC法)测量样品而得的值，样品是根据日本油化学家学会(Japan Oil Chemists’Society)编辑的“标准油脂分析试验法(Standard Methods for the Analysis of Fats，Oilsand Related Materials)”中的“脂肪酸甲酯的制备(Preparation of FattyAcid Methyl Esters)(2.4.1.2-1996)”制备的脂肪酸甲酯。原料油脂或脂肪酸的“色调C”按照美国油化学家学会官方方法Ca 13e-92(洛维邦德法(Lovibond method)用5.25英寸试验池测量，并通过下式(1)计算。

色调C＝10R+Y (1)

(在该式中，R＝红色值，Y＝黄色值)

在本发明中，在油脂的酶水解中，需要使用固定化酶，其是固定在载体上的酶。在本发明的一个方面中，脂肪酶优选作为酶水解中所用的分解油脂的酶。不仅可以使用源自动物或植物的脂肪酶，还可以使用源自微生物的市售脂肪酶。分解油脂的酶的实例包括源自例如根霉菌属、曲霉菌属、色杆菌属、毛霉菌属、假单胞菌属、地丝菌属、青霉菌属和假丝酵母菌属这样的微生物的脂肪酶和诸如胰脂肪酶的动物脂肪酶。为了实现高水解速率，没有位置特异性(无规型)的脂肪酶是优选的，且源自假单胞菌属和假丝酵母菌属之类微生物的脂肪酶是优选的。

固定化载体的实例包括无机载体，例如C盐、硅藻土、高岭石、硅胶、分子筛、多孔玻璃、活性炭、碳酸钙和陶瓷、陶瓷粉末；和有机聚合物，例如聚乙烯醇、聚丙烯、壳聚糖、离子交换树脂、疏水吸附剂树脂、螯合树脂和合成吸附剂树脂。考虑到保水能力，离子交换树脂是优选的。在离子交换树脂中，多孔离子交换树脂是优选的，因为它们由于具有大表面积而可以吸附大量脂肪酶。

用作固定化载体的树脂具有优选100至1000微米、更优选250至750微米的粒径。优选地，树脂具有10至150纳米的孔径。这类树脂材料的实例包括酚醛树脂、聚苯乙烯树脂、丙烯酰胺树脂和二乙烯基苯树脂，其中酚醛树脂(例如可获自罗门哈斯(Rohm and Hass)的Duolite A-568)是优选的。

当将酶固定化时，酶可以直接吸附到载体上，但为了创造产生高活性的吸附条件，载体可以在吸附酶之前用脂溶性脂肪酸或其衍生物处理后再使用。所用的脂溶性脂肪酸的实例包括具有8至18个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链脂肪酸，其羟基可以被取代。其具体实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、蓖麻油酸和异硬脂酸。其衍生物的实例包括这些脂肪酸与一元醇或多元醇的酯、磷脂和通过在这些酯上加成氧乙烯而获得的衍生物。其具体实例包括上述脂肪酸的甲酯和乙酯、单酸甘油酯、甘油二酯、其氧乙烯加成物、聚甘油酯、山梨糖醇酯及蔗糖酯。这些脂溶性脂肪酸或其衍生物可以两种或多种结合使用。

为了使这些脂溶性脂肪酸或其衍生物与载体接触，这些脂溶性脂肪酸或其衍生物可以在水或有机溶剂中直接添加到载体上。但是，为了改进分散性，脂溶性脂肪酸或其衍生物可以暂时分散或溶解在有机溶剂中然后添加到分散在水中的载体上。有机溶剂的实例包括氯仿、己烷和乙醇。基于100重量份载体，脂溶性脂肪酸或其衍生物以优选1至500重量份、更优选10至200重量份的量使用。接触温度优选为0至100℃，更优选20至60℃。接触时间为大约5min至5hr。处理完成后的载体通过过滤收集，并可以将其干燥。干燥温度为室温至100℃。干燥可以在减压下进行。

将酶固定在载体上的温度可以根据酶的特性确定。优选酶不会失活的温度，具体而言优选0至60℃，更优选5至40℃。用于固定化的酶溶液的pH范围可以是使得酶不会变性的pH范围，并可以像温度一样根据酶的特性确定。优选地，pH值为3至9。使用缓冲液保持pH值，这类缓冲液的实例包括乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和三盐酸(tris-HCL)缓冲液。优选地，考虑到固定化效率，酶溶液具有不大于酶的饱和溶解度的充分的酶浓度。根据需要通过离心去除不溶部分而获得的上清液或通过超滤或类似方法精制的溶液也可以用作酶溶液。尽管所用酶的重量随酶的活性而变，基于100重量份载体，该重量优选为5至1000重量份，更优选10至500重量份。

为了使条件适合酶固定化后的水解反应，优选通过过滤从酶溶液中收集固定化酶并去除不必要的水，然后在不干燥的情况下，使固定化酶与作为反应基质的例如大豆油这样的油脂相接触。接触后，固定化酶中的水分含量随所用载体的类型而变，并优选基于100重量份固定化载体，为0.1至100重量份，更优选1至50重量份，进一步优选5至50重量份。在此，将固定化酶装入容器，例如柱中，可以用泵使油脂循环通过该柱，或可以将固定化酶分散在油脂中。接触温度优选为20℃至60℃，并可以根据酶的特性进行选择。接触时间为大约1至48hr。考虑到工业生产率，优选在接触完成后过滤收集固定化酶。

固定化酶的水解活性范围优选为20U/g或更大，更优选100至10000U/g，进一步优选500至5000U/g。在此，1U酶是指，在40℃下边搅拌30min边混合油脂∶水＝100∶25(重量比)的混合物进行水解时，每min产生1微摩尔游离脂肪酸的酶的水解能力。

在本发明中，在第一步骤中通过酶水解或高压高温水解进行的油脂的部分水解和在第二步骤中通过高压高温水解或酶水解进行的油脂的水解，可以分批、连续或半连续进行。可以使用填充在塔中的固定化酶或可以使用在搅拌槽中的固定化酶，但为了防止固定化酶的破坏，优选使用填充在塔中的固定化酶。部分水解的脂肪酸和水可以并流或逆流加入反应器。优选地，供入水解反应器的原料油脂酸和水预先脱气或脱氧以防止脂肪酸的氧化。

用于酶水解反应的固定化酶的量可以相应地根据酶的活性确定。基于100重量份要分解的原料油脂，固定化酶以优选0.01至30重量份、更优选0.1至20重量份、特别优选1至10重量份的量使用。此外，基于100重量份要分解的脂肪酸，以优选10至200重量份、更优选20至100重量份、进一步优选30至80重量份的量使用水。这种水可以是蒸馏水、离子交换水、脱气水、自来水或井水。这类水可以含有其它水溶性组分，例如甘油。必要时，可以使用pH3至9的缓冲液以保持酶的稳定性。

调节反应温度至优选0至70℃，更优选20至50℃，此时有效呈现酶的活性且分解产生的游离脂肪酸不结晶。优选地，反应在惰性气体存在下进行以尽可能避免与空气接触。

通过酶水解或高压高温水解进行的油脂的水解反应可以根据脂肪酸浓度来控制并在达到预定脂肪酸浓度时终止。在本发明中，“脂肪酸浓度”是指，根据“油脂产品的知识(Oil and Fat Products)”(幸书房株式会社(Saiwaishobo Ltd.))”通过测量脂肪酸的酸值和组成并通过下式(2)计算而获得的值。通过美国油化学家学会官方方法Ca 5a-40测量酸值。

脂肪酸浓度(重量％)＝x×y/56.1/10 (2)

(x＝酸值[mgKOH/g]，y＝由脂肪酸组成测定的平均分子量)

用于高压高温水解的反应器的优选实例包括配有容积7至40立方米的水解反应槽的逆流式Colgate-Emery法油脂分解塔(例如IHI制造)。对于小规模分解，可以使用市售实验室规模高压釜系统(例如日东高压株式会社(Nitto Kouatsu Co.，Ltd.)制造)作为水解反应槽。

在本发明的方法中，描述了包括通过(a)酶水解法部分水解的第一步骤的方法。

考虑到工业生产率、良好的外观和防止生成反式不饱和脂肪酸，油脂通过酶水解法部分水解直至脂肪酸具有优选20至90重量％、更优选25至85重量％、进一步优选30至80重量％的浓度。在部分水解后，构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量优选为0至1.5重量％，更优选0至1重量％，进一步优选0至0.7重量％。优选地，用于高压高温水解的部分水解脂肪酸中总氮量小以使通过高压高温水解法水解的脂肪酸的色调更好。总氮量优选为2ppm或更少，更优选1.5ppm或更少，进一步优选0.1至1.5ppm。出于相同考虑，与要被酶水解的原料中的总氮量相比，已经被酶水解的油的总氮量的升高优选为50重量％或更少，更优选20重量％或更少，进一步优选0至15重量％。

在本发明的方法中，当油脂在第一步骤中通过酶水解法部分水解时，随后必须通过高压高温水解法进行水解(第二步骤)。在本发明中，高压高温水解在下列反应条件下进行。

在第二步骤的高压高温水解中，优选在100重量份部分水解脂肪酸中加入10至250重量份水，由此在200至270℃的温度和2至8MPa的压力条件下进行水解0.1至6hr。考虑到工业生产率和脂肪酸的脱色以及防止生成反式不饱和脂肪酸，温度优选为210至265℃，更优选215至260℃。出于相同考虑，在100重量份部分水解脂肪酸中加入的水量更优选为15至150重量份，进一步优选20至120重量份。出于相同考虑，压力更优选为2至7MPa，进一步优选2.5至6MPa。出于相同考虑，反应时间更优选为0.2至5hr，进一步优选0.3至4hr。

用于第二步骤的油脂的高压高温水解的部分水解脂肪酸可以直接使用，但脂肪酸和水相也可以根据需要通过诸如静置分离或离心的方法进行分离。此外，可以根据需要通过离心或水洗去除分布在油相中的甘油以进行精制。

通过第二步骤的高压高温水解进行的油脂的水解反应可以根据上式(2)所示的脂肪酸浓度来控制并在达到预定脂肪酸浓度时终止。在水解反应完成后，优选通过诸如静置分离或离心的方法分离脂肪酸和水相。可以根据需要通过离心、水洗或类似方法去除分布在油相中的甘油以进行精制。

在本发明的方法中，在油脂的水解反应中，在100重量份原料油脂中各加入0.01至30重量份固定化酶和10至200重量份水以通过在0至70℃的酶水解来进行部分水解(第一步骤)，然后在如上所述的第二步骤中在100重量份部分水解脂肪酸中加入10至250重量份水以在200至270℃的温度和2至8MPa的压力条件下进行水解0.1至6hr。相应地，可以以提高的工业生产率获得具有良好外观以及在构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸含量低的脂肪酸。

在本发明的方法中，现在描述包括通过(b)高压高温水解法部分水解的第一步骤的方法。

在第一步骤的高压高温水解中，优选在100重量份油脂中加入10至250重量份水，由此在200至270℃的温度和2至8MPa的压力条件下进行水解0.1至6hr。考虑到工业生产率和脂肪酸的脱色以及防止生成反式不饱和脂肪酸，温度优选为210至265℃，更优选215至260℃。出于相同考虑，在100重量份油脂中加入的水量更优选为15至150重量份，进一步优选20至120重量份。出于相同考虑，压力更优选为2至7MPa，进一步优选2.5至6MPa。出于相同考虑，反应时间更优选为0.2至5hr，进一步优选0.3至4hr。

油脂在高温高压条件下的水解反应可以根据脂肪酸浓度来控制并在达到预定脂肪酸浓度时终止。在此，“脂肪酸浓度”通过上式(2)确定。

考虑到工业生产率、良好外观和防止生成反式不饱和脂肪酸和单甘油酯，油脂在第一步骤中通过高压高温水解法部分水解直至脂肪酸具有优选0.5至90重量％、更优选1.5至85重量％、进一步优选20至70重量％的浓度。在部分水解后，部分水解脂肪酸具有优选35或更小、更优选1至30、进一步优选5至25的色调C，构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸的含量优选为0至1.5重量％，更优选0.1至1.2重量％，进一步优选0.2至0.7重量％。此外，单甘油酯的含量优选为1至20重量％，更优选1至15重量％，进一步优选3至10重量％。

在本发明的方法中，当油脂在第一步骤中通过高压高温水解法部分水解时，随后必须在第二步骤中通过酶水解法进行水解。

在本发明的一个方面中，当在第二步骤中通过酶水解法进行油脂的水解时，为了有效利用酶活性，优选使用固定化酶，其是固定在载体上的酶，尽管也可以使用酶粉末。优选使用担载在固定化载体上的脂肪酶作为固定化酶。

在本发明中，在第二步骤中油脂通过酶水解法的水解在下列反应条件下进行。

用于酶水解反应的固定化酶的量可以相应地根据酶活性确定。基于100重量份要分解的脂肪酸，以优选0.01至30重量份、更优选0.1至15重量份、进一步优选0.2至10重量份的量使用固定化酶。此外，基于100重量份要分解的脂肪酸，以优选10至200重量份、更优选20至100重量份、进一步优选30至80重量份的量使用水。该水可以是蒸馏水、离子交换水、自来水或井水。这类水可以含有其它水溶性组分，例如甘油。必要时，可以使用pH3至9的缓冲液以保持酶的稳定性。

用于第二步骤的油脂的酶水解反应的部分水解脂肪酸可以直接使用，但可以根据需要通过诸如静置分离或离心的方法分离脂肪酸和水相。此外，可以通过离心、水洗或类似方法去除分布在油相中的甘油以进行精制。

第二步骤的通过酶水解进行的油脂的水解反应可以根据上式(2)所示的脂肪酸浓度来控制并在达到预定脂肪酸浓度时终止。在水解反应完成后，优选通过诸如静置分离或离心的方法分离脂肪酸和水相。此外，可以通过离心、水洗或类似方法去除分布在油相中的甘油以进行精制。

在本发明的方法中，在油脂的水解反应中，在100重量份油脂中加入10至250质量份水以在200至270℃的温度和2至8MPa的压力条件下进行部分水解0.1至6hr(第一步骤)，然后在100重量份部分水解脂肪酸中各加入0.01至30重量份固定化酶和10至200重量份水以如上所述在0至70℃下进行水解。由此，可以以提高的工业生产率获得具有良好外观以及具有降低的反式不饱和脂肪酸和单酰甘油含量的脂肪酸。

实施例

A.在第一步骤中使用方法(a)并在第二步骤中使用方法(b)的方法的研究

[制造固定化酶的方法]

将50gDuolite A-568(可获自Rohm & Hass)在500mL0.1N氢氧化钠水溶液中搅拌1hr。随后，用500mL蒸馏水洗涤1hr并用500mL500mM磷酸盐缓冲液使pH值保持恒定(pH7)2hr。此后，每2hr用500mL50mM磷酸盐缓冲液使pH值保持恒定(pH7)两次。随后，过滤收集载体并用250mL乙醇置换30min。过滤后，向其中加入250mL含50g蓖麻油酸的乙醇，并将蓖麻油酸吸附到载体上30min。此后，过滤收集载体并用250mL50mM磷酸盐缓冲液(pH7)洗涤4次以去除乙醇，并过滤收集载体。然后，使载体与1000mL10％市售脂肪酶的10％溶液(可获自Amano Enzyme Inc.的脂肪酶AY“Amano”30G)接触，其作用于油脂4hr以将酶固定在载体上。然后进行过滤以收集固定化酶并用250mL50mM乙酸盐缓冲液(pH7)洗涤以去除未固定的酶或蛋白质。这些步骤均在20℃下进行。由酶溶液在固定化后的残留活性和酶溶液在固定化前的活性之间的差异确定固定化比率为95％。随后，向其中加入200g除臭大豆油，将混合物在40℃下搅拌2hr，并过滤分离除臭大豆油以提供固定化酶。由此获得的固定化酶用作为实际用于反应的基质的未除臭大豆油洗涤3次并在使用之前过滤。

[原料油脂]

使用表1中所示的未除臭大豆油作为原料油脂。通过下述方法测量甘油酯组成。

[测量甘油酯组成的方法]

将10mg样品和0.5mL三甲基甲硅烷化剂(可获自Kanto ChemicalCo.，Inc.的“甲硅烷化剂TH”)装入样品瓶中。将该瓶密封并在70℃下加热15min。向其中加入1.0mL蒸馏水和2.0mL己烷，在混合后，通过气相色谱法(GLC)分析己烷层。

装置：Hewlett Packard制造的型号6890

柱：DB-1HT(可获自J&W Scientific)7米

柱温：初始＝80℃，最终＝340℃

升温速率：10℃/min，在340℃下保持20min

检测器：FID，温度＝350℃

注射部分：分流比＝50∶1，温度＝320℃

样品注射量：1μL

载气：氦气，流速＝1.0mL/min

[总氮量的测量]

在10mL量瓶中称入5g未除臭大豆油和部分水解脂肪酸并通过总痕量氮分析器测量用甲苯调节了的样品的总氮量。

使用各种浓度的吡啶/甲苯溶液作为标准溶液。

装置：Mitsubishi Chemical Corporation制造的型号TN-05总痕量氮分析器

温度：入口800℃/催化剂900℃

所用气体和流速：氧气600mL/min

氦气/氧气Sub 100/100mL/min

时间：氦气30秒/氧气120秒

样品注射量和注射速率：50μL，1.0μL/秒

[表1]

	脂肪酸浓度[重量％]	色调C10R+Y	总氮[ppm]	反式不饱和脂肪酸[重量％]	甘油[重量％]	MAG[重量％]	DAG[重量％]	TAG[重量％]
									未除臭大豆油	0.1	52	1.2	0.0	0.0	0.0	1.7	98.3
样品A	36.2	57	1.2	0.0	0.0	2.3	18.3	43.2
									样品B	61.3	56	1.2	0.0	0.0	2.6	16.5	19.6
样品C	35.4	59	1.5	0.0	0.0	2.5	20.1	42.0
									样品D	38.5	61	2.1	0.0	0.0	2.9	25.4	33.2

MAG：单酰甘油

DAG：二酰甘油

TAG：三酰甘油

[使用固定化酶的酶水解]

通过使用固定化酶的酶水解将表1中所示的未除臭大豆油水解。通过使反应溶液循环通过装有固定化酶的酶柱和基质循环容器来进行水解反应。

将20.0g干基的用未除臭大豆油洗过的固定化酶(水解活性2960U/g)装入配有夹套的不锈钢酶柱(内径22mm，高145mm)。通过使用丙酮和己烷去除附着到配有夹套的不锈钢酶柱中填充的批料的固定化酶上的油并在减压下脱水来测定干基的固定化酶的初始重量。

将900g未除臭大豆油和540g蒸馏水装在配有夹套的150mm内径的3L容积的基质循环容器中，并将混合物在搅拌(半圆叶片Φ90mm×H25mm，600r/min)的同时混合并加热至40℃。在此期间，用氮气置换配有夹套的基质循环容器中的气相以形成氮气氛。

在将基质加热至40℃后，将配有夹套的基质循环容器中的基质使用液体供给泵以55mL/min的流速从上部供给到配有夹套的不锈钢酶柱中。反应溶液从配有夹套的不锈钢酶柱的底部回到配有夹套的基质循环容器中以开始分批循环反应。反应开始1hr后，将整个反应溶液从配有夹套的基质循环容器中提取到3L烧杯中。在40℃下在氮气氛下静置120min以去除水相，从而提供样品A。将部分样品A取样并离心(5000×g，10min)以去除水相。然后在70℃下在400Pa真空下将所得部分水解脂肪酸完全脱水10min，然后分析。

进而，将用于制备样品A的装有固定化酶的配有夹套的不锈钢酶柱用未除臭大豆油洗涤。然后，在与样品A的情况相同的条件下启动分批循环反应。反应开始3hr后，将整个反应溶液从配有夹套的基质循环容器中抽取到3L烧杯中，并在40℃下在氮气氛下静置120min以去除水相，从而提供样品B。在与样品A的情况相同的处理后分析样品B。作为所得部分水解脂肪酸的分析结果，总氮量与未除臭大豆油中相同并且在固定化酶中没有发生酶的脱离。

[使用脂肪酶粉末的酶水解]

通过使用脂肪酶粉末(可获自Amano Enzyme Inc.的脂肪酶AY“Amano”30G)的酶水解将表1中所示的未除臭大豆油水解。将1300g未除臭大豆油和750g蒸馏水装在3000mL容积四颈烧瓶中。将混合物在搅拌(半圆叶片Φ90mm×H25mm，300r/min)的同时混合并加热至40℃。在此期间，用氮气置换3000mL容积四颈烧瓶中的气相以形成氮气氛。在密封状态下在氮气氛下在40℃搅拌(半圆叶片Φ90mm×H25mm，300r/min)的同时，向其中加入整个混合物，其中将3.9g脂肪酶粉末(可获自Amano Enzyme Inc.的脂肪酶AY“Amano”30G)溶解在30g蒸馏水中以在搅拌的同时启动分批反应。反应开始0.6hr后，将整个反应溶液从3000mL容积四颈烧瓶中抽取到3L烧杯中。在40℃下在氮气氛下静置120min以去除水相，从而提供样品C。在与样品A的情况同样进行处理后分析样品C。

[使用粒状脂肪酶的酶水解]

通过使用粒状脂肪酶(可获自Novozymes A/S的Lipolase 100T)的酶水解将表1中所示的未除臭大豆油水解。将1300g未除臭大豆油和750g蒸馏水装在3000mL容积的四颈烧瓶中。将混合物在搅拌(半圆叶片Φ90mm×H25mm，300r/min)的同时混合并加热至45℃。在此期间，用氮气置换3000mL容积的四颈烧瓶中的气相以形成氮气氛。在密封状态下在氮气氛下在45℃搅拌(半圆叶片Φ90mm×H25mm，300r/min)的同时，向其中加入整个混合物，在该混合物中将2.0g粒状脂肪酶(可获自Novozymes A/S的Lipolase 100T)溶解在30g蒸馏水中，以在搅拌的同时启动分批反应。反应开始43hr后，将整个反应溶液从3000mL容积的四颈烧瓶中抽取到3L烧杯中。在40℃下在氮气氛下静置120min以去除水相，从而提供样品D。在与样品A的情况同样进行处理后分析样品D。

[部分水解的脂肪酸和未除臭大豆油的高压高温水解]

在Nitto Kouatsu Co.，Ltd.制造的分批型高压釜系统(容积2.2L，设计压力10MPa，设计温度300℃，材料TB480H)中，使用表1中所示的样品A至D(它们是部分水解的脂肪酸和未除臭大豆油)作为原料进行高压高温水解。将700g各原料和350g蒸馏水装在高压釜系统中并将高压釜系统密封。然后，使用氢气在5.0MPa压力下进行气密试验以验证高压釜系统中没有泄漏，并用氮气置换空气。随后，在600r/min下搅拌的同时，将温度升至240℃，这是反应温度。升温至240℃所花的时间为40min，最终压力为3.2MPa。达到240℃后，相应地从取样口收集反应溶液，用氮气密封并在遮光状态下迅速冷却至25℃。然后将反应溶液离心(5000g，5min)以去除水相，将脂肪酸相在70℃下在400Pa真空下脱水5min。测量酸值并计算脂肪酸浓度。在脂肪酸具有85重量％浓度时终止水解并将反应溶液冷却至50℃。冷却至50℃所花的时间为50min。将整个水解脂肪酸从高压釜系统中抽取到2L烧杯中，并在40℃下在氮气氛下静置120min以去除水相。进而，在离心(5000g，30min)去除水相后，将所得物装在2000mL容积四颈烧瓶中，并在70℃下在400Pa真空下在搅拌(半圆叶片Φ90mm×H25mm，300r/min)的同时将脂肪酸完全脱水30min并分析。获得表2中所示的脂肪酸样品E至I。

[表2]

	反应时间[hr]	脂肪酸浓度[重量％]	色调C10R+Y	反式不饱和脂肪酸[重量％]	甘油[重量％]	MAG[重量％]	DAG[重量％]	TAG[重量％]
									样品E(原料：未除臭大豆油)	3.0	85.4	24	2.2	0.0	6.4	7.3	0.9
样品F(原料：A)	1.0	85.9	23	0.7	0.0	5.4	7.4	1.3
									样品G(原料：样品B)	0.5	87.2	24	0.4	0.0	4.4	7.2	1.1
样品H(原料：样品C)	1.0	87.8	27	0.8	0.0	4.8	6.4	1.0
									样品I(原料：样品D)	1.0	87.0	43	0.9	0.0	5.1	6.8	1.1

从表2中清楚看出，当通过使用固定化酶的酶水解将原料油脂部分水解以使脂肪酸浓度为20至90重量％然后在高温高压条件下将所得物水解时，可以制备不仅在构成脂肪酸中具有低反式不饱和脂肪酸含量还具有良好外观的脂肪酸(样品F、G)。相反，已经表明，尽管在通过使用脂肪酶粉末或粒状脂肪酶的酶水解将原料油脂部分水解然后在高温高压条件下水解而获得的脂肪酸(样品H、I)中，构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸含量低，但该脂肪酸具有差的外观。还表明，尽管仅通过在高温高压条件下水解原料油脂而得的脂肪酸(样品E)具有良好外观，但构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸含量高。进而，从表1和表2中清楚看出，当通过酶水解法部分水解的脂肪酸具有小的总氮量时，在高温高压条件下水解的脂肪酸具有低色调C。

B.在第一步骤中包含方法(b)并在第二步骤中包含方法(a)的方法的研究

[制造固定化酶的方法]

将50gDuolite A-568(可获自Rohm & Hass)在500mL0.1N氢氧化钠水溶液中搅拌1hr。随后，用500mL蒸馏水洗涤1hr并用500mL500mM磷酸盐缓冲液使pH值保持恒定(pH7)2hr。此后，每2hr用500mL50mM磷酸盐缓冲液(pH7)使pH值保持恒定两次。随后，过滤收集载体并用250mL乙醇置换30min。过滤后，向其中加入250mL含50g蓖麻油酸的乙醇，并将蓖麻油酸吸附到载体上30min。此后，过滤收集载体并用250mL50mM磷酸盐缓冲液(pH7)洗涤4次以去除乙醇，并过滤收集载体。然后，使载体与1000mL市售脂肪酶的10％溶液(可获自AmanoEnzyme Inc.的脂肪酶AY“Amano”30G)接触4hr以将酶固定在载体上，上述脂肪酶作用于油脂。然后进行过滤以收集固定化酶并用250mL50mM乙酸盐缓冲液(pH7)洗涤以去除未固定的酶或蛋白质。这些步骤均在20℃下进行。由酶溶液在固定化后的残留活性和酶溶液在固定化前的活性之间的差异确定固定化比率为95％。随后，向其中加入200g大豆油，将混合物在40℃下搅拌2hr，并过滤分离大豆油以提供固定化酶。用作为实际用于反应的基质的部分水解脂肪酸洗涤由此获得的固定化酶并在使用之前过滤。

[原料油脂]

使用表3中所示的未除臭大豆油作为原料油脂。通过与上述相同的方法测量甘油酯组成。

[表3]

样品	脂肪酸浓度[重量％]	色调C	反式不饱和脂肪酸[重量％]	甘油[重量％]	MAG[重量％]	DAG[重量％]	TAG[重量％]
								未除臭大豆油	0.1	41	0.0	0.0	0.0	1.1	98.9

MAG：单酰甘油

DAG：二酰甘油

TAG：三酰甘油

[高压高温水解]

将原料油脂从底部连续供给到油-水对流高压热水分解装置中并从顶部向其中连续供给水。供给量为基于100重量份原料油脂供给50重量份水。在此阶段，分解塔中的平均停留时间(hr)(塔体积(m³)/(原料油脂的流速(m³/hr)+水的流速(m³/hr)))为大约4hr。在该装置中通过高压热水(5.0MPa，240℃)加热原料油脂。相应地从沿着油-水对流高压热水分解装置分布的取样口收集反应溶液，用氮密封并在遮光状态下冷却至25℃。然后将反应溶液离心(5000g，30min)以去除水相，将脂肪酸相在70℃在400Pa真空下脱水30min以提供样品J至N。每一脂肪酸的分析值显示在表4中。

[表4]

样品	脂肪酸浓度[重量％]	色调C	反式不饱和脂肪酸[重量％]	甘油[重量％]	MAG[重量％]	DAG[重量％]	TAG[重量％]
								J	90.6	19	1.9	0.0	4.2	5.2	0.0
K	78.6	20	1.0	0.1	7.1	11.7	2.6
								L	47.2	21	0.4	0.4	7.3	21.7	23.3
M	1.7	27	0.0	0.0	0.1	2.2	95.9
								N	92.0	18	2.0	0.0	3.1	4.9	0.0

[通过酶水解法进行的水解(1)]

将样品J至M(其是部分水解脂肪酸)和表3中所示的未除臭大豆油通过使用固定化酶的酶水解法水解。将5g(干重量)用样品J至M或未除臭大豆油洗过的各固定化酶(水解活性2700U/g)称入300mL容积四颈烧瓶中。向其中加入100g相应样品J至M或未除臭大豆油和60g蒸馏水。在密封状态下在40℃下在氮气氛下搅拌(半圆叶片Φ60mm×H15mm，250r/min)的同时，连续反应直至脂肪酸具有93重量％或更高的浓度。将反应溶液离心(5000g，30min)以去除水相和固定化酶，然后将脂肪酸相在70℃下在400Pa真空下脱水30min以提供脂肪酸(样品O至S)。每一脂肪酸的分析值(在使用固定化酶的情况下)显示在表5中。对于每一样品，通过水解J获得O，通过水解K获得P，通过水解L获得Q，通过水解M获得R，并通过水解未除臭大豆油获得S。

[表5]

样品	反应时间(h)	脂肪酸浓度[重量％]	色调C	反式不饱和脂肪酸[重量％]	甘油[重量％]	MAG[重量％]	DAG[重量％]	TAG[重量％]
									O(原料：J)	0.5	93.8	20	1.9	0.0	0.4	3.9	1.9
P(原料：K)	1.5	93.8	20	1.0	0.0	0.4	3.4	2.4
									Q(原料：L)	3.0	93.1	22	0.4	0.0	0.4	4.0	2.6
R(原料：M)	6.0	93.2	28	0.0	0.0	0.5	4.2	2.1
									S(原料：未除臭大豆油)	6.0	93.0	48	0.0	0.0	0.5	5.3	1.2

[通过酶水解法进行的水解(2)]

将部分水解脂肪酸样品J至M和表1中所示的未除臭大豆油通过使用酶粉末的酶水解法水解。将100g样品J至M或未除臭大豆油和55g蒸馏水称入300mL容积四颈烧瓶中。向其中加入整个混合物，在该混合物中将0.1g脂肪酶OF(来自柱状假丝酵母(Candida cylindracea)，可获自Meito Sangyo Co.，Ltd.)溶解在5g蒸馏水中。在密封状态下在40℃下在氮气氛下搅拌(半圆叶片Φ60mm×H15mm，250r/min)的同时，连续反应直至脂肪酸具有93重量％或更高的脂肪酸浓度。将反应溶液离心(5000g，30min)以去除水相和存在脂肪酶粉末的中间层，然后将脂肪酸相在70℃下在400Pa真空下脱水30min以提供脂肪酸(样品T至X)。每一脂肪酸的分析值(在使用酶粉末的情况下)显示在表6中。对于每一样品，通过水解J获得T，通过水解K获得U，通过水解L获得V，通过水解M获得W，并通过水解未除臭大豆油获得X。

[表6]

样品	反应时间(h)	脂肪酸浓度[重量％]	色调C	反式不饱和脂肪酸[重量％]	甘油[重量％]	MAG[重量％]	DAG[重量％]	TAG[重量％]
									T(原料：J)	0.2	94.0	22	1.9	0.0	0.5	3.0	2.5
U(原料：K)	2.0	93.9	22	1.0	0.0	0.2	3.0	2.9
									V(原料：L)	6.0	93.7	23	0.4	0.0	0.4	3.2	2.7
W(原料：M)	7.0	93.0	29	0.0	0.0	0.4	3.5	3.1
									X(原料：未除臭大豆油)	7.0	93.0	48	0.0	0.0	0.5	3.8	2.7

从表3至表6中清楚看出，当原料油脂在高温高压条件下部分水解以使脂肪酸浓度为0.5至90重量％然后用脂肪酶将所得物水解时，可以制备不仅在构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸和单酰甘油含量低而且还具有良好外观的脂肪酸(样品P、Q、R、U、V、W)。

相反，已经表明，尽管仅通过在高温高压条件下水解原料油脂获得的脂肪酸(样品N)具有良好外观，但构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸和单酰甘油含量高。还已经表明，尽管通过在高温高压条件下部分水解原料油脂以使脂肪酸浓度为90重量％或更高然后用脂肪酶水解而得的脂肪酸(样品O、T)具有良好外观且单酰甘油含量低，但构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸含量高。

此外，已经表明，尽管在仅通过原料油脂的酶水解反应获得的脂肪酸(样品S、X)中，构成脂肪酸中反式不饱和脂肪酸和单酰甘油的含量低，但这些脂肪酸具有差的外观。

Claims

1.一种制造脂肪酸的方法，其特征在于，

通过水解油或脂制造脂肪酸，该方法包括：

通过高压高温水解法部分水解油或脂的第一步骤，和

通过使用固定化酶的酶水解法进行水解的第二步骤，

其中，所述固定化酶是固定在载体上的酶，在第一步骤中将高压高温水解进行至脂肪酸具有1.5至85重量％的浓度。

2.根据权利要求1所述的制造脂肪酸的方法，其特征在于，

在第一步骤中被进行部分水解反应的油或脂在构成脂肪酸中含有1.5重量％或更少的反式不饱和脂肪酸。