CN101255121A - 赖氨大黄酸的制备工艺及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及赖氨大黄酸及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用，其特征是，通过水溶液中大黄酸的羧基与赖氨酸的氨基形成盐的结构，以增强大黄酸在水溶液中的溶解度；应用丙酮或无水乙醇，使赖氨大黄酸以结晶形式析出，通过分离、纯化、干燥，得到稳定的赖氨大黄酸结晶；经体外和体内实验证明，赖氨大黄酸对肿瘤细胞增殖和生长具有明显的抑制作用，有望成为一种比较理想的肿瘤治疗候选药物。

Description

赖氨大黄酸的制备工艺及其在肿瘤治疗中的应用

技术领域：

本发明涉及大黄酸与赖氨酸形成稳定的盐-赖氨大黄酸(rhein lysate)、其制备工艺和在医学领域中的应用。

背景技术：

大黄酸(Rhein，4.5-dihydroxyanthraquinone，简称RH)属单蒽核类1，8-二羟基蒽醌衍生物，是从大黄、何首乌、虎杖等多种传统中药分离提纯的有效成分。大黄酸含有二个羟基和一个羧基，极性较强，具有电化学氧化还原性质。大黄酸的药理作用主要包括：抗肿瘤、抗炎、抗菌及调解肾功能等方面。

1、抗肿瘤作用

有文献报道，大黄酸对黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、艾氏腹水癌、P₃₈₈白血病有抑制作用。其通过改变细胞及细胞骨架膜的功能，抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄入，抑制葡萄糖的磷酸化作用，并造成线粒体功能障碍，从而影响肿瘤细胞的糖代谢和耗氧量。大黄酸对人肝癌细胞和小鼠腹水癌细胞的杀伤作用主要通过抑制肿瘤细胞DNA模板，干扰DNA模板功能，从而使肿瘤细胞的生长受到明显抑制[郭美姿等，国外医学中医药分册，2002，24(3)：139-143]。大黄酸能够抑制人表皮角质形成细胞株Colo-16细胞增殖周期的G1期向S期转变，其在抑制肿瘤细胞增殖的同时也诱导肿瘤细胞的凋亡[徐丽敏等，中华皮肤科杂志，2000，21(1)：47-48]。大黄酸还能显著增加丝裂霉素(MMC)对KB(人口腔癌细胞株)细胞、BEL-7402(人肝癌细胞株)细胞和MCF-7(人乳腺癌细胞株)细胞的增殖抑制作用[黄云红等，药学学报，2001，36(5)：334-338]。大黄酸合并丝裂霉素与单独用药相比，可明显增加KB细胞的凋亡，提示大黄酸有可能作为生化调节剂应用于肿瘤联合化疗。

2、抗炎作用

大黄酸可以抑制IL-12的表达，对炎症介质白三烯的合成有较强的抑制作用。大黄酸抑制IL-1和IL-1诱导的NO的合成，最终减少关节软骨的破坏。美国FDA已经批准了大黄酸的前体药二乙酰大黄酸用于治疗关节炎[Domagala F etal，Biorheology，2006；43(3-4)：577-87]。此外，有报道称，大黄酸对胰腺炎也具有治疗作用。

3、抗菌作用

大黄酸对金黄色葡萄球菌、链球菌、淋球菌、白喉、枯草杆菌、痢疾杆菌、炭疽杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌等具有明显的抑制作用。还有报道称其对新型隐球菌、白色念珠菌、烟曲菌、须发霉等真菌有抑制作用，其最低抑制浓度为25～250μg/mL，其抑菌机制为：抑制菌体糖和糖代谢中间产物的氧化和脱氢，并与DNA结合，干扰其模板功能，抑制蛋白和核酸的合成[郭美姿等，国外医学中医药分册，2002，24(3)：139-143]。

4、除以上作用外，大黄酸还对血管平滑肌的增殖有抑制作用，为其在抗动脉粥样硬化方面提供了理论支持，其可以抑制血管生成[专利申请号：02159686.7]；大黄酸还具有降糖、调脂、改善胰岛素抵抗、减少尿蛋白排泄等作用[刘凯等，中医药学刊，2004，22(9)：1732-1734]。

总之，大黄酸具有广泛的药理活性。但是，至今仍然没有应用于临床，主要原因是其水溶性极差，而且口服大黄酸会被肠道内的细菌代谢成为无活性的蒽酮类化合物[De Witte P等，Biopharm Drug Dispos，1992，13：243-53]。而解决大黄酸临床应用的关键就是提高其水溶性。尽管很多科研人员进行了不懈的努力，对大黄酸进行结构改造获得了多种活性化合物，然而其致命的缺陷-水溶性极差依然没有得到有效改善，至今仍然没有开发出用于临床的大黄酸新药。本实验室在进行大黄酸抗肿瘤研究过程中，发现并证实了赖氨酸能够增加大黄酸在水中的溶解度，进而合成了大黄酸赖氨酸盐，并开展了一系列生物学实验研究。

本发明所涉及的赖氨大黄酸(rhein lysate)新化合物，迄今尚未见有国内外的相关报道。

本发明的目的之一是，提供一种赖氨大黄酸(rhein lysate)新化合物；

本发明的目的之二是，提供一种赖氨大黄酸(rhein lysate)新化合物的制备方法；

本发明的目的之三是，提供赖氨大黄酸(rhein lysate)新化合物在临床上的应用。

发明内容：

本发明提供了赖氨大黄酸盐新化合物，其结构如式1所示：

本发明所述的赖氨大黄酸盐是一种紫色结晶状物质，分子式为C₂₁H₂₂N₂O₈，分子量为430，其特征是大黄酸的羧基与赖氨酸的氨基结合形成稳定盐的结构，水中溶解度为1.35g，紫外检测在230nm和260nm处出现两个矮峰，HPLC检测在2.035分钟时出现吸收峰，峰高为299760，曲线下面积为2686418，曲线下面积百分比为82.94％，红外色谱检测出现明显的氨盐峰(2937.0cm^-1)和羧基离子强峰(1583.6cm^-1和1398.9cm^-1)。

本发明还提供了赖氨大黄酸的制备方法，其工艺步骤是：

向反应瓶内加入适量水，称取一定量大黄酸投入反应瓶，加入磁力搅拌子搅拌均匀，再向反应瓶中缓慢加入赖氨酸适量，搅拌，直到反应液变得澄清透明为止；反应温度控制在25～35℃之间，反应时间在4～48小时范围内；将反应瓶放入冰水混合物中搅拌，并缓慢滴加丙酮或者无水乙醇，滴加时间控制在20～40分钟，直至溶液出现紫色结晶，停止加入丙酮或者无水乙醇析晶；加入的析晶溶液丙酮或无水乙醇的量为整个反应体积的60～90％之间；将反应液放入-80～0℃的冰箱析出晶体，析晶24～48小时，然后把反应液倒出，负压干燥反应瓶，反应瓶干燥后再放入干燥器继续干燥4小时，刮下反应瓶上的晶体，通过抽虑或者离心的方法对结晶产物进行分离，用丙酮或者无水乙醇洗涤数次，直至洗液无色，采用室温负压干燥或者室温干燥器内进行干燥。干燥产物通过紫外分光光度计、高效液相色谱(HPLC)、红外色谱法进行结构鉴定。

由于大黄酸不溶于水，可以通过观察大黄酸沉淀的消失来控制反应中赖氨酸加入量，所以本发明所采用反应流程的特点是先加入大黄酸，然后缓慢加入赖氨酸使沉淀溶解，加入的大黄酸与赖氨酸的摩尔比在1∶2～1∶4之间。继续反应4～48小时目的是为了使反应生成的结晶充分完全。在进行结晶析出赖氨大黄酸时，要缓慢加入丙酮或者无水乙醇，因为加入过快会导致主要析出产物为大黄酸。加入丙酮或者无水乙醇的量为整个反应体积的60～90％，最佳丙酮的量在70～80％之间。加入丙酮或者无水乙醇的速度和比例是反应成功的关键步骤，一般在20～40分钟加完为宜。将反应液放入-80～0℃的冰箱的目的是为了能够析出更多结晶。最佳的析晶温度控制在-40～-20℃之间。本发明所提供的反应产物赖氨大黄酸水溶性佳，在水中的溶解度为1.35g。大黄酸在无水乙醇中微溶，可以用无水乙醇对结晶进行反复的洗涤，本发明采用洗涤，离心，再洗涤，再离心，最后干燥的工艺进行结晶的纯化。

采用本发明合成出的赖氨大黄酸纯度高，晶体稳定性好，不加任何稳定剂就可以达到作为商品使用和储存的目的。

本发明通过生物学实验研究，还提供了赖氨大黄酸在临床治疗中的应用。

体外研究结果表明，赖氨大黄酸对体外培养的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3细胞增殖有明显的抑制作用，对HER-2高表达的SKBR-3细胞作用更明显；通过MTT方法研究发现，赖氨大黄酸能够协同紫杉醇、诺维苯、阿霉素、甲氨喋呤发挥抑制肿瘤细胞增殖作用；通过Western blot方法研究发现，赖氨大黄酸对p-EGFR、p-HER-2、HER-2蛋白的表达有明显的抑制作用，并且通过抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，抑制肿瘤细胞增殖。

体内研究结果表明，赖氨大黄酸对小鼠H₂₂肝癌和MCF-7裸小鼠移植瘤模型肿瘤生长有明显的抑制作用。此外研究还发现，赖氨大黄酸可以协同紫杉醇抑制肿瘤生长，并且具有大黄酸所具有的药理活性如抗炎、抗菌及调解肾功能等作用。

本发明的优点与积极效果在于，采用所述赖氨大黄酸的制备工艺，解决了产物稳定性及水溶性的最大技术难题，而且由于工艺简单，成本低廉，符合环保要求，利于批量生产，从而为使其尽快推上临床创造了良好条件。

附图说明：

图1赖氨酸、大黄酸、赖氨大黄酸紫外吸光度分析图

其中：1-赖氨大黄酸；2-大黄酸；3-赖氨酸；

图2HPLC图谱

其中：A-赖氨酸；B-大黄酸；C-赖氨大黄酸；

图3赖氨酸红外色谱图

其中：赖氨酸氨基的特征峰出现在3361.8cm^-1处；

图4大黄酸红外色谱图

其中：大黄酸羧基的特征峰出现在1693.2cm^-1处；

图5赖氨大黄酸红外色谱图

其中：赖氨大黄酸的氨盐特征峰出现在2937.0cm^-1处；

羧基离子强峰出现在1583.6cm^-1和1398.9cm^-1两处；

图6赖氨大黄酸抑制乳腺癌细胞增殖图

其中：

-MCF-7细胞；

-SKBR-3细胞；

-MDA-MB-231细胞；

图7赖氨大黄酸对表皮生长因子和MAPK通路影响的Western Blot图

其中：0、10、20、40、80、160-赖氨大黄酸的剂量、单位μmol/L；

      1-EGFR蛋白表达水平；2-HER-2蛋白表达水平；

      3-k-Ras蛋白表达水平；4-MEK蛋白表达水平；

      5-ERK蛋白表达水平；6-ACTIN蛋白表达水平；

      7-EGFR蛋白磷酸化水平；8-HER-2蛋白磷酸化水平；

      9-c-Raf蛋白表达水平；10-MEK蛋白磷酸化水平；

      11-ERK蛋白磷酸化水平；12-ACTIN蛋白表达水平；

图8赖氨大黄酸抑制由紫杉醇引起的酪氨酸激酶活性增加Western Blot图

其中：A-空白组；B-紫杉醇10^-9mol/L剂量组；C-紫杉醇10^-8mol/L剂量组；

D-紫杉醇10^-7mol/L剂量组；E-紫杉醇10^-8mol/L剂量组；F-紫杉醇10^-8mol/L和赖氨大黄酸80μmol/L剂量联合组；

G-紫杉醇10^-7mol/L和赖氨大黄酸80μmol/L剂量联合组；H-紫杉醇10^-6mol/L和赖氨大黄酸80μmol/L剂量联合组；

1-EGFR蛋白磷酸化水平；2-EGFR蛋白表达水平；3-MEK蛋白表达水平；

4-MEK蛋白磷酸化水平；5-k-Ras蛋白表达水平；6-c-Raf蛋白表达水平；

7-c-Raf蛋白磷酸化水平；8-ERK蛋白磷酸化水平；9-ACTIN蛋白表达水平；

具体实施方式：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例一>：赖氨大黄酸的制备1

将20mg大黄酸(购自南京青泽医药科技开发有限公司)加入到50ml茄形瓶中，并向茄形瓶中加入一个搅拌子和5ml双蒸水，在磁力搅拌器上搅拌5分钟，然后称取30mg赖氨酸(购自北京科海军舟生物科技中心)，分批缓慢加入到茄形瓶中，边加入边观察大黄酸溶解情况，加入时间控制在30分钟，加完30mg赖氨酸后，反应液中的大黄酸全部溶解，搅拌4个小时，温度控制在32℃。待溶液反应4个小时后把茄形瓶放入冰浴中，缓慢地向反应液中加入丙酮，大约6滴/分钟，边滴加边观察反应液的变化。观察到溶液出现紫色晶体析出，停止加入丙酮，此时加入丙酮为16.6ml，加入时间30分钟，然后把茄形瓶放入4℃冰箱中过夜，次日观察到瓶壁上析出了一层紫色晶体，倒出反应液于一个新的茄形瓶中备用，将此反应瓶真空干燥，用刮刀刮下结晶，并用无水乙醇清洗3次，每次采用离心的方法除去洗液，三次洗涤后，洗液几乎无色。将产物在干燥器中干燥过夜，称重得产物5.3mg。在干燥器中保存备用。然后将保留的反应液放入-20℃冰箱中过夜，次日同样观察到紫色晶体析出，按照上面分离纯化的方法得产物2.6mg。继续再将反应液放入-40℃冰箱中过夜，同样得到产物1.8mg。最终共得到产物9.7mg，产率为48.5％。

<实施例二>：赖氨大黄酸的制备2

将20mg大黄酸加入到50ml茄形瓶中，并向茄形瓶中加入一个搅拌子和5ml双蒸水，在磁力搅拌器上搅拌5分钟，然后称取30mg赖氨酸，分批缓慢加入到茄形瓶中，边加边观察大黄酸溶解情况，加入时间控制在40分钟，加完30mg赖氨酸后，反应液中的大黄酸全部溶解，搅拌过夜，温度控制在32℃。反应24小时后缓慢的向反应液中加入丙酮，大约6滴/分钟，边滴加边观察反应液的变化，观察到溶液出现紫色晶体析出，此时加入丙酮为16ml，加入时间30分钟，再继续向反应液中缓慢加入丙酮，紫色晶体逐渐增多，加入20ml丙酮后停止加入，然后把茄形瓶放入-40℃冰箱中过夜，次日观察到瓶壁上析出了一层很厚的紫色晶体，倒出反应液，把反应瓶真空干燥，用刮刀刮下结晶，并用无水乙醇清洗3次，每次采用离心的方法除去洗液，三次洗涤后，洗液几乎无色。把产物置于干燥器中干燥过夜并保存备用，称重得产物16.8mg，产率为84％。

<实施例三>：赖氨大黄酸的制备3

将20mg大黄酸加入到50ml茄形瓶中，并向茄形瓶中加入一个搅拌子和5ml双蒸水，在磁力搅拌器上搅拌5分钟，然后称取30mg赖氨酸，分批缓慢加入到茄形瓶中，边加边观察大黄酸溶解情况，加入时间控制在30分钟，加完30mg赖氨酸后，反应液中的大黄酸全部溶解，搅拌过夜，温度控制在30℃。反应24小时后缓慢的向反应液中加入无水乙醇，大约6滴/分钟，边滴加边观察反应液的变化，观察到溶液出现紫色晶体析出，此时加入无水乙醇为17.6ml，加入时间30分钟，再继续向反应液中缓慢加入无水乙醇，紫色晶体逐渐增多，加入22ml无水乙醇后停止加入，然后把茄形瓶放入-40℃冰箱中过夜，次日观察到瓶壁上析出了一层很厚的紫色晶体，倒出反应液，把反应瓶真空干燥，用刮刀刮下结晶，并用无水乙醇清洗3次，每次采用离心的方法除去洗液，三次洗涤后，洗液几乎无色。置产物于干燥器中干燥过夜并保存备用，称重得产物14.8mg，产率为74％。

<实施例四>：通过紫外分光光度计进行结构鉴定

分别配制赖氨酸1mg/mL水溶液，产物100μg/mL水溶液，大黄酸62.5μg/mL甲醇溶液，测定溶液在不同波长的吸光度。结果发现，赖氨酸在230nm和260nm处出现两个尖峰，而产物的两个尖峰变为两个很小的矮峰。此外，大黄酸在350nm～500nm范围内出现一个宽峰，而产物没有此峰。从总体来看，产物吸光度曲线比较平滑，而大黄酸吸光度曲线比较陡峭(图1)。从图上观察，产物的吸光度曲线与赖氨酸吸光度曲线差别明显。通过三种物质的吸光度结果来看，产物不是大黄酸也不是赖氨酸，而是新的化合物。

<实施例五>：通过HPLC法进行结构鉴定

分别配制大黄酸1mg/mL甲醇溶液，赖氨酸1mg/mL水溶液，产物1mg/mL水溶液。在Waters Delta 600高效液相色谱仪上，使用C₁₈100A 5μm 4.6×250nm Waters色谱柱，流动相为乙睛∶0.05％TFA(55∶45)，流速0.8ml/min，检测波长254nm。结果表明，产物在2.035分钟时出现吸收峰，峰高为299760，曲线下面积为2686418，曲线下面积百分比为82.94％。赖氨酸在2.147分钟时出现吸收峰，峰高3190，曲线下面积36058，曲线下面积百分比为87.62％。可以看出，产物虽然与赖氨酸出峰时间比较接近，分别为2.035分钟和2.147分钟，但是产物的峰高和曲线下面积是赖氨酸的100倍左右。由此可以判断，产物不是赖氨酸。由大黄酸的HPLC结果可以发现，大黄酸的出峰时间在14.727分钟，峰高为127325，曲线下面积为2121370，曲线下面积百分比为97.63％，由此可以判断，产物也不是大黄酸，而是新的化合物(图2)。根据反应物和反应条件，初步推断为赖氨大黄酸。

<实施例六>：通过红外色谱法进行结构鉴定

与大黄酸和赖氨酸的色谱图相比，新产物不存在游离氨基峰(3600～3250cm^-1)，出现明显的氨盐峰(2937.0cm^-1)，出现羧基离子强峰(1583.6cm^-1和1398.9cm^-1)，游离羧基峰(1693.2cm^-1)消失(图3、4、5)。由此可以推断，应用此种方法所得结晶产物为赖氨大黄酸。

<实施例七>：赖氨大黄酸的体外细胞毒性实验：

采用MTT方法进行体外细胞毒性实验，结果表明，赖氨大黄酸对MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖抑制作用，IC₅₀分别为95、80、110μmol/L。这与用DMSO作为溶剂，采用MTT方法测得的大黄酸对上述细胞的IC₅₀值相同，说明赖氨大黄酸与大黄酸具有相同的体外抑制肿瘤细胞增殖作用(图6)。研究同时发现，赖氨大黄酸与紫杉醇或者诺维苯联合应用，可以抑制MCF-7乳腺癌细胞系增殖，二者的协同作用非常显著CDI≤0.70(表1、2)。另外，在SKBR-3乳腺癌细胞系，赖氨大黄酸与阿霉素或者甲氨喋呤联合应用，在某些剂量也出现了很好的协同抑制肿瘤细胞增殖作用CDI＜0.85(表3、4)。

表1赖氨大黄酸与诺维苯联合应用对MCF-7乳腺癌细胞增殖的抑制作用。

注：表内数值是用药组与对照组比较的相对吸光度值，其中括号内为CDI值。

表2赖氨大黄酸与紫杉醇联合应用对MCF-7乳腺癌细胞增殖的抑制作用。

注：表内数值是用药组与对照组比较的相对吸光度值，其中括号内为CDI值。

表3赖氨大黄酸与阿霉素联合应用对SKBR-3乳腺癌细胞增殖的抑制作用。

注：表内数值是用药组与对照组比较的相对吸光度值，其中括号内为CDI值。

表4赖氨大黄酸与甲氨喋呤联合应用对SKBR-3乳腺癌细胞增殖的抑制作用。

注：表内数值是用药组与对照组比较的相对吸光度值，其中括号内为CDI值。

<实施例八>：赖氨大黄酸抑制EGFR家族酪氨酸激酶活性实验

赖氨大黄酸能抑制表皮生长因子受体家族EGFR和HER-2的酪氨酸激酶活性，并且抑制HER-2蛋白的表达，而对EGFR蛋白表达没有影响。进一步研究发现，其通过抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖(图7)。赖氨大黄酸抑制由紫杉醇引起的表皮生长因子受体家族EGFR的酪氨酸激酶活性增加，以及引起的Ras-Raf-MEK-ERK信号通路激活，从而抑制耐药细胞的产生(图8)。

<实施例九>：赖氨大黄酸的体内抗肿瘤活性研究

(一)、赖氨大黄酸抑制小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长：

1材料与方法

1.1药品与试剂：98％的大黄酸，分子量284，棕黄色粉末，购自南京青泽医药科技开发有限公司，常温干燥保存，临用时以氯化钠注射液溶解与稀释。赖氨酸(solarbio)，购自北京科海军舟生物科技中心。

1.2动物：昆明小鼠，体重18～22g雌雄各半。购自北京维通利华公司。

1.3赖氨大黄酸对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长的抑制作用：取小鼠腹腔悬液传代的肝癌H₂₂细胞，每只小鼠腋窝皮下接种200万个细胞(0.2ml)。实验按照体重随机分为6组，对照组、赖氨大黄酸50mg/kg组、赖氨大黄酸100mg/kg组、紫杉醇10mg/kg组、紫杉醇10mg/kg组+赖氨大黄酸50mg/kg组、紫杉醇10mg/kg组+赖氨大黄酸100mg/kg组，每组10只，雌雄各半。给药方案：从腋窝接种肿瘤后24小时开始腹腔给药，紫杉醇每周给药一次，共给予两次，赖氨大黄酸隔天给药一次，共给予10天，对照组每天腹腔注射等体积的生理盐水，停药一天，然后处死小鼠称体重，分离肿瘤称瘤重。

2结果：

单独腹腔注射赖氨大黄酸抑制小鼠肝癌H₂₂模型肿瘤生长，50mg/kg、100mg/kg赖氨大黄酸的肿瘤生长抑制率分别为33％和39％，与紫杉醇联用协同抑制肿瘤生长，50mg/kg、100mg/kg赖氨大黄酸与紫杉醇协同指数CDI值分别为0.68和0.83。(表5)

表5赖氨大黄酸对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长抑制作用(x±s)

注：*与对照组比较P＜0.01；△与紫杉醇组比较P＜0.01。

(二)、赖氨大黄酸抑制MCF-7裸鼠移植瘤模型肿瘤生长以及与紫杉醇的协同作用：

1.料与方法

1.1药品与试剂：98％的大黄酸，分子量284，棕黄色粉末，购自南京青泽医药科技开发有限公司，常温干燥保存，临用时以氯化钠注射液溶解与稀释。赖氨酸(solarbio)，购自北京科海军舟生物科技中心。

1.2动物：BALB/c小鼠，体重18～22g雌性。购自北京维通利华公司。

1.3赖氨大黄酸对MCF-7裸小鼠移植瘤模型肿瘤生长抑制作用：体外培养的MCF-7细胞，接种于BALB/c裸小鼠左侧腋窝皮下，每只小鼠腋窝皮下接种500万个细胞(0.2ml)。待肿瘤长到1×1×1cm³时取出，切成1×1×1mm³然后分别接种于小鼠左侧腋窝皮下，接种1周后根据肿瘤大小随机分组，生理盐水组、紫杉醇10mg/kg组、赖氨大黄酸50mg/kg组、赖氨大黄酸100mg/kg组、紫杉醇10mg/kg+赖氨大黄酸50mg/kg组、紫杉醇10mg/kg+赖氨大黄酸100mg/kg组。给药方案：紫杉醇和赖氨大黄酸均采用腹腔注射给药，紫杉醇每周给药一次，共给药2次，赖氨大黄酸每周给药2次，共给药4周，停药1周，然后处死小鼠取出肿瘤，称小鼠体重和瘤重，每周测量2次小鼠肿瘤体积，每周称量一次小鼠体重。

2结果：

单独腹腔注射赖氨大黄酸抑制MCF-7裸鼠移植模型肿瘤生长，50mg/kg、100mg/kg赖氨大黄酸的肿瘤生长抑制率分别为31％和46％，100mg/kg赖氨大黄酸与紫杉醇联合应用协同抑制肿瘤生长，协同作用指数CDI值为0.67(表6)。

表6赖氨大黄酸对小鼠移植性乳腺癌肿瘤生长抑制作用(x±s)

注：*与对照组比较P＜0.05；△与紫杉醇组比较P＜0.05。

Claims (6)

1、一种赖氨大黄酸新化合物，其结构如式(1)所示：

其特征是，所述化合物为一种紫色结晶状物质，分子式为C₂₁H₂₂N₂O₈，分子量为430，系大黄酸的羧基与赖氨酸的氨基结合形成的稳定盐的结构。

2、制备如权利要求1所述赖氨大黄酸的方法，其步骤是：

先向反应瓶中加入一定量的水，再分别投入大黄酸、赖氨酸，根据大黄酸溶解情况，控制赖氨酸的加入量，反应温度25～35℃，反应时间4～48小时；将反应瓶放入冰水混合物中搅拌，缓慢滴加丙酮或无水乙醇，滴加时间控制在20～40分钟，丙酮或无水乙醇占整个反应体系的60～90％；将反应液置入-80～0℃冰箱析出晶体，析晶24～48小时，收集结晶并用无水乙醇对结晶进行反复洗涤，负压干燥，阴凉，保存备用。

3、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，在水溶液中加入大黄酸与赖氨酸的摩尔比为1∶2～1∶4。

4、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，反应温度为32℃，反应时间为24小时，结晶析晶时，滴加丙酮或者无水乙醇的速度为6滴/分钟，丙酮或者无水乙醇占整个反应体系的80％，在赖氨大黄酸结晶析出时，温度控制为-40℃。

5、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，通过抽虑或者离心的方法对结晶产物进行分离，用丙酮或者无水乙醇对结晶产物进行反复洗涤纯化，直至洗液无色，采用室温负压干燥或者室温干燥器内进行干燥。

6、权利要求1所述赖氨大黄酸盐在制备肿瘤治疗药物中的应用。

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